血紅蛋白的制備方法
【專利說(shuō)明】
(-)技術(shù)領(lǐng)域:
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是血紅蛋白的制備方法。
(二)【背景技術(shù)】:
[0002]以輸入全血為主要手段的傳統(tǒng)輸血方式在醫(yī)療救護(hù)方面發(fā)揮了極為重要的作用，但同時(shí)其自身也存在難以克服的各種缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在:輸入前需進(jìn)行交叉配型、存在多種病毒交叉感染的危險(xiǎn)、血源緊張、貯存期較短且需要特殊的設(shè)施。為了解決上述矛盾，人們?cè)缭?9世紀(jì)末就開始了有關(guān)紅細(xì)胞代用品的研宄。紅細(xì)胞代用品是指具有擴(kuò)充血容積、維持血管內(nèi)外滲透壓平衡并且有載氧功能，用以代替人紅細(xì)胞的各種氧載體的總稱。血液代用品的研制經(jīng)歷了從最初無(wú)載氧功能的血管擴(kuò)容劑，如:高滲鹽溶液、羥乙基淀粉溶液、明膠等到目前具有攜氧功能的各種載體溶液。目前正在研制的以血紅蛋白為基礎(chǔ)各類產(chǎn)品與全血比較具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如:來(lái)源廣泛、安全潔凈、可長(zhǎng)期保存、輸入人體前無(wú)需進(jìn)行交叉配型，特別適用于戰(zhàn)爭(zhēng)、自然災(zāi)害、以及其他突發(fā)事件中大量出血病人的急救。血紅蛋白是人體內(nèi)的物質(zhì)，它的溶液作為紅細(xì)胞代用品比化學(xué)合成物質(zhì)更具優(yōu)越性。
[0003]目前已有5家以血紅蛋白為基礎(chǔ)的產(chǎn)品完成或接近完成了III期臨床研宄，取得了明顯的進(jìn)展。然而，這些產(chǎn)品應(yīng)用于臨床時(shí)都程度不同地出現(xiàn)了諸如血管收縮、血壓升高，心臟、腎臟、肝臟等器官受損等毒副作用。一般來(lái)講，以血紅蛋白為基礎(chǔ)的產(chǎn)品的來(lái)源為血庫(kù)過(guò)期血，將紅細(xì)胞破膜后釋放出血紅蛋白，之后對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化、修飾得到制品。在破膜之后要求純化血紅蛋白中磷脂殘留量很低，否則會(huì)在后續(xù)的動(dòng)物、臨床試驗(yàn)中引起不良反應(yīng)，因此在破膜時(shí)要求將血紅蛋白盡量釋放，但膜又不能破碎，即紅細(xì)胞膜形成完整的血影細(xì)胞，而不是碎裂成碎片懸浮于血紅蛋白溶液中。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種血紅蛋白的制備方法，它針對(duì)上述情況，發(fā)明一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、高效的血紅蛋白的制備工藝。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:血紅蛋白的制備，其特征在于它包括以下步驟:
[0006]1、取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800轉(zhuǎn)的條件下離心，15-30分鐘。得到含白細(xì)胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細(xì)胞，重復(fù)上述洗滌過(guò)程3-5次以，直至上層清液基本無(wú)色，以最大限度除去紅細(xì)胞以外的其他物質(zhì)，得到潔凈壓積紅細(xì)胞。
[0007]2、取一定量的壓積紅細(xì)胞，加入等體積的滅菌高純?nèi)ルx子水進(jìn)行5-15分鐘的預(yù)脹，最后加入2倍體積的水低滲10-20分鐘，10000轉(zhuǎn)速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
(四)【具體實(shí)施方式】:
[0008]以下將通過(guò)【具體實(shí)施方式】的形式再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的【具體實(shí)施方式】，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0009]實(shí)施例1洗血
[0010]取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800轉(zhuǎn)的條件下離心，15-30分鐘。得到含白細(xì)胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細(xì)胞，重復(fù)上述洗滌過(guò)程3-5次以，直至上層清液基本無(wú)色，以最大限度除去紅細(xì)胞以外的其他物質(zhì)，得到潔凈壓積紅細(xì)胞。
[0011]實(shí)施例2預(yù)脹
[0012]取一定量的壓積紅細(xì)胞，加入等體積的滅菌高純?nèi)ルx子水進(jìn)行預(yù)脹，預(yù)脹時(shí)間定為2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30分鐘，分別于400倍顯微鏡下觀察不同預(yù)脹時(shí)間細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞的圓潤(rùn)程度確定最佳預(yù)脹時(shí)間。
[0013]實(shí)施例3低滲破膜
[0014]向預(yù)脹好的紅細(xì)胞中加入2倍體積的水低滲破膜，時(shí)間定為3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，50分鐘，分別于400倍顯微鏡下觀察不同破膜時(shí)間細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞的破裂程度、純化血紅蛋白的濃度、破膜液過(guò)濾的難易程度確定最佳破膜時(shí)間。之后再10000轉(zhuǎn)速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.血紅蛋白的制備方法，其特征在于它包括以下步驟:取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800轉(zhuǎn)的條件下離心，15-30分鐘；得到含白細(xì)胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細(xì)胞，重復(fù)上述洗滌過(guò)程3-5次以，直至上層清液基本無(wú)色，以最大限度除去紅細(xì)胞以外的其他物質(zhì)，得到潔凈壓積紅細(xì)胞；取一定量的壓積紅細(xì)胞，加入等體積的滅菌高純?nèi)ルx子水進(jìn)行預(yù)脹，最后加入2倍體積的水低滲10-20分鐘，10000轉(zhuǎn)速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白的制備方法，預(yù)脹的時(shí)間為5-15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白的制備方法，低滲破膜的時(shí)間為10-20分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及的是血紅蛋白的制備方法，其特征在于它包括以下步驟：取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，在4℃，2800轉(zhuǎn)的條件下離心，15-30分鐘。得到含白細(xì)胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細(xì)胞，重復(fù)上述洗滌過(guò)程3-5次以，直至上層清液基本無(wú)色，以最大限度除去紅細(xì)胞以外的其他物質(zhì)，得到潔凈壓積紅細(xì)胞。取一定量的壓積紅細(xì)胞，加入等體積的滅菌高純?nèi)ルx子水進(jìn)行5-15分鐘的預(yù)脹，最后加入2倍體積的水低滲10-20分鐘，10000轉(zhuǎn)速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
【IPC分類】C07K14-805, C07K1-14
【公開號(hào)】CN104804080
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510218537
【發(fā)明人】李鳳娟, 張釋元, 劉洋, 候依萍, 黃雪雪, 蔣坤
【申請(qǐng)人】天津工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日