本發(fā)明屬于生物，涉及黃脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（don）的降解。

背景技術(shù)：

1、真菌毒素是由各種真菌產(chǎn)生的有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它們對(duì)糧食儲(chǔ)存以及食品和飼料加工業(yè)的安全構(gòu)成相當(dāng)大的威脅。此外，霉菌毒素還對(duì)食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。食品和飼料中的真菌毒素污染已成為一個(gè)重大的全球性問題。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（fao）統(tǒng)計(jì)，全球超過25%的谷物受到真菌毒素的污染。歐洲食品安全局（european?food?safety?authority）進(jìn)行的約50萬份分析和一項(xiàng)大型真菌毒素全球調(diào)查的數(shù)據(jù)表明，污染率實(shí)際上高達(dá)60-80%。食用受霉菌毒素污染的食物可對(duì)人類和動(dòng)物造成各種慢性和急性健康后果，目前真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，don）由于其高致病率、“三致”毒性以及對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的負(fù)面影響，引起公眾的極大關(guān)注。

2、don主要由禾谷鐮刀菌等鐮刀菌屬產(chǎn)生，屬于b型單端孢霉烯族，主要在小麥、玉米、水稻等谷類作物中積累，不僅能造成糧食質(zhì)量降低，還能夠?qū)ψ魑锂a(chǎn)生多種毒害作用，極低劑量即可引起多種植物枯萎、蔫黃、壞死等癥狀，并且還會(huì)在谷物食品啤酒和醬油以及動(dòng)物源產(chǎn)品肉、蛋、奶類中存在不同程度的殘留，造成嚴(yán)重的食品安全問題。don對(duì)谷物的污染程度居全球鐮刀菌毒素之首，具有生殖、腸道、細(xì)胞和免疫毒性，這些毒素在谷物磨粉、加工及加熱處理過程中難以被破壞，可在食物鏈中長(zhǎng)期富集。動(dòng)物長(zhǎng)期食用被don污染的飼料會(huì)引起嘔吐、厭食、惡心及免疫調(diào)節(jié)紊亂等癥狀，人體攝入don污染的食物會(huì)導(dǎo)致頭痛、貧血、惡心、腹痛、免疫力下降及神經(jīng)紊亂等病理反應(yīng)。因此有效控制和消減don對(duì)糧食和飼料的污染尤為重要和迫切。

3、目前許多方法包括生物、化學(xué)和物理方法，已被用于從谷物和飼料中解毒霉菌毒素，但物理解毒方法特異性差，解毒效果不穩(wěn)定，例如公開號(hào)cn104777252a的申請(qǐng)，通過輻照對(duì)don進(jìn)行降解，該實(shí)驗(yàn)僅能證明輻照可以產(chǎn)生新的物質(zhì)，但是降解效率并不存在優(yōu)勢(shì)；化學(xué)解毒存在營(yíng)養(yǎng)流失、實(shí)施困難、易受二次污染等問題；例如公開號(hào)cn108579772a通過復(fù)合納米材料進(jìn)行光催化降解。近年來，生物解毒因其高效、周期短、安全性高、特異性強(qiáng)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。越來越多的研究人員開始關(guān)注以微生物或其酶為基礎(chǔ)的生物方法，例如公開號(hào)為cn102406100a的申請(qǐng)利用地衣芽孢桿菌菌粉進(jìn)行降解；酶解毒可以避免微生物的潛在毒性以及原料和感官特性變化帶來的危害。因此，持續(xù)挖掘新的降解酶，以獲取性質(zhì)更為優(yōu)越的降解酶，在真菌毒素降解領(lǐng)域具有必要性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶、工程菌及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明第一個(gè)目的是提供了一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶（脫氫酶deddh），其蛋白選自以下任一種：

4、（1）序列如seq?id?no.1所示的氨基酸序列的蛋白；

5、（2）如seq?id?no.1所示的氨基酸序列經(jīng)過插入、缺失或突變一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且仍具有（1）中蛋白功能的蛋白；

6、（3）序列如seq?id?no.1所示的氨基酸序列的蛋白與促進(jìn)該蛋白表達(dá)、分泌到胞外或純化的蛋白組成的蛋白。

7、進(jìn)一步的，上述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶為脫氫酶deddh（genbank：wp_286717872.1），該降解酶具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。

8、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼上述don降解酶deddh的基因，其優(yōu)化密碼子后編碼基因序列如seq?id?no.2所示。

9、本發(fā)明第三個(gè)目的是提供了攜帶有don降解酶基因的工程菌株。

10、進(jìn)一步提供了上述工程菌的制備方法，步驟為：構(gòu)建含有上述編碼基因的重組載體，通過熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，獲得工程菌。

11、優(yōu)選的，上述重組載體的中間載體為pet-28a(+)；大腸桿菌菌株為表達(dá)菌株bl21（de3）。

12、本發(fā)明第四個(gè)目的是提供了利用上述工程菌制備don降解酶制劑的方法，所述方法包括：利用上述工程菌株在含卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至od600=0.6-0.8，加iptg誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生蛋白，經(jīng)離心去上清，破碎菌體后的上清液經(jīng)ni-nta純化后，得到純化的目的蛋白deddh，用30?kda超濾管對(duì)其進(jìn)行濃縮并去除蛋白溶液中的咪唑，即得到don降解酶制劑。

13、優(yōu)選的iptg的終濃度為0.4?mm。

14、本發(fā)明第五個(gè)目的是提供上述don降解酶的應(yīng)用，即don降解酶deddh、編碼基因、重組載體、工程菌在降解don中的應(yīng)用。

15、優(yōu)選的，本申請(qǐng)發(fā)明的don降解酶deddh在輔因子為pqq時(shí)，30℃，ph?8條件下對(duì)don降解率最高為90.1%；輔因子為pms時(shí)，30℃，ph?8條件下對(duì)don降解率最高為88.1%；輔因子為dcpip時(shí)，40℃，ph?8條件下對(duì)don降解率最高為96.2%。該酶在降解don時(shí)必須依賴加入ca2+和氫受體才能發(fā)揮最大活性。

16、本發(fā)明具有以下有益效果：

17、1、本申請(qǐng)公開了一種高效降解don的脫氫酶deddh，并構(gòu)建了表達(dá)該酶的工程菌。本發(fā)明的don降解酶deddh在輔因子為pqq時(shí)，30℃，ph?8條件下對(duì)don降解率最高為90.1%；輔因子為dcpip時(shí)，40℃，ph?8條件下對(duì)don降解率最高為96.2%。本發(fā)明挖掘到的酶顯示其在高效處理don污染方面具有潛在的應(yīng)用前景，對(duì)食品和飼料產(chǎn)品中真菌毒素污染具有重大意義。

18、2、本申請(qǐng)的don降解酶拓展了don降解酶的生物資源庫。deddh在較寬的溫度和ph范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的降解效果，在20~40℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出70%以上的催化活性，在電子受體為dcpip時(shí)，deddh在ph?6~10范圍內(nèi)保持了85%以上的酶活性。deddh高效降解don的能力表明其在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶，其蛋白選自以下任一種：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3.編碼權(quán)利要求1或2所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其經(jīng)密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5.含有權(quán)利要求3-4任一項(xiàng)所述的編碼基因的重組載體。

6.含有權(quán)利要求5所述的重組載體的工程菌。

7.利用權(quán)利要求6所述的工程菌制備don降解酶制劑的方法，其特征在于，步驟為：將工程菌接種至含卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至od600=0.6-0.8，加入iptg誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生蛋白，經(jīng)離心、超聲破碎、ni-nta純化、超濾濃縮得到同時(shí)降解don降解酶制劑。

8.利用權(quán)利要求7所述的方法制備的don降解酶制劑。

9.權(quán)利要求1或2所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶、權(quán)利要求3或4所述的基因、權(quán)利要求6所述的工程菌或權(quán)利要求8所述的don降解酶制劑在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：利用權(quán)利要求1或2所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶、權(quán)利要求3或4所述的基因、權(quán)利要求6所述的工程菌或權(quán)利要求8所述的don降解酶制劑降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時(shí)，需添加ca2+和氫受體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的降解，特別是指一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶、工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的DON降解酶DeDDH在輔因子為PQQ時(shí)，30℃，pH?8條件下對(duì)DON降解率最高為90.1%；輔因子為DCPIP時(shí)，40℃，pH?8條件下對(duì)DON降解率最高為96.2%。本發(fā)明挖掘到的酶顯示其在高效處理DON污染方面具有潛在的應(yīng)用前景，對(duì)食品和飼料產(chǎn)品中真菌毒素污染具有重大意義。

技術(shù)研發(fā)人員：謝巖黎,劉俊霞,李曉,賈航,楊玉輝,馬衛(wèi)賓,李倩,田園
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河南工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9