本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

1、莽草酸(shikimic?acid)是從天然原料八角茴香中提取而來的一種單一構(gòu)型手性化合物，它是許多生物堿、吲哚衍生物、芳香氨基酸與手性藥物的合成原料，在食品和化學(xué)工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。雖然莽草酸作為研究對象已久，但也只是在禽流感疫情全球蔓延之后，羅氏公司制成了莽草酸衍生物“達(dá)菲”，莽草酸才真正的成為研究開發(fā)的熱點(diǎn)。禽流感病毒對人類健康有著嚴(yán)重的威脅，達(dá)菲是目前唯一有效的治療禽感的特效藥。莽草酸作為抗禽流感藥物達(dá)菲的重要原料，成為了許多學(xué)者致力于開發(fā)研究的對象。隨著人們對于莽草酸的不斷深入的探索，莽草酸的應(yīng)用不僅局限于作為化工原料，也可用來轉(zhuǎn)化生產(chǎn)其他化學(xué)物質(zhì)、制劑，其應(yīng)用愈來愈廣泛。

2、莽草酸除了被普遍用作香料外，在藥理功能上，可抗血栓形成從而抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成的目的，還可以起到很好的抗炎、抗病毒和抗腫瘤的作用；另外莽草酸還具有很好的鎮(zhèn)痛作用，是一種現(xiàn)代化工和醫(yī)藥合成的重要中間體。

3、相比于植物提取和化學(xué)合成莽草酸，利用微生物發(fā)酵合成法生成莽草酸的已成現(xiàn)在的新趨勢，現(xiàn)有的微生物發(fā)酵菌株存在一個(gè)明顯的問題就是發(fā)酵過程發(fā)酵液存在3-脫氫莽草酸等雜酸從而影響發(fā)酵液的品質(zhì)和提取工藝，那么如何提高莽草酸的產(chǎn)量和純度，以促進(jìn)其在化工、醫(yī)藥及其他相關(guān)領(lǐng)域的研究應(yīng)用成為微生物發(fā)酵生成莽草酸的關(guān)鍵。

4、在生物代謝過程中，莽草酸代謝只存在于植物、真菌和微生物中，是一個(gè)很關(guān)鍵的代謝途，其中莽草酸脫氫酶是催化該代謝途徑第四步的，利用還原型輔酶ii(nadph)催化3-脫氫莽草酸(dhs)生成莽草酸，在催化過程，該酶還受到發(fā)酵液中莽草酸的反饋抑制，使得3-脫氫莽草酸累積量變大，影響發(fā)酵液的質(zhì)量及提高提取生成成本。

5、綜上所述，希望找到一種新的莽草酸脫氫酶,其在一定條件下具有較高的催化3-脫氫莽草酸還原生成莽草酸的活性，使其對3-脫氫莽草酸具有較高的結(jié)合特異性，從而增加莽草酸的積累并降低產(chǎn)物中雜酸的含量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的莽草酸脫氫酶。所要解決的技術(shù)問題不限于所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明還提供一種降低含有3-脫氫莽草酸的發(fā)酵產(chǎn)物中3-脫氫莽草酸含量和/或增加所述發(fā)酵產(chǎn)物中的莽草酸含量的方法，所述方法包括將蛋白質(zhì)和所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)以提高所述發(fā)酵產(chǎn)物中3-脫氫莽草酸含量和/或增加所述發(fā)酵產(chǎn)物中的莽草酸含量；所述蛋白質(zhì)為將seq?id?no.1的第19位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸且第102位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，且保持seq?id?no.1的其他氨基酸殘基不變得到的蛋白質(zhì)。

4、上述方法中，所述發(fā)酵產(chǎn)物為用微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌得到的發(fā)酵液，所述發(fā)酵液含有3-脫氫莽草酸，所述大腸桿菌具體為hyy1458。

5、本發(fā)明還提供一種制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量的方法，所述方法包括如下步驟：

6、1)用微生物液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，收集發(fā)酵液，所述大腸桿菌為hyy1458；

7、2)將蛋白質(zhì)和所述發(fā)酵液進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物，所述反應(yīng)產(chǎn)物中的莽草酸含量高于所述發(fā)酵液，和/或所述反應(yīng)產(chǎn)物中的3-脫氫莽草酸含量低于所述發(fā)酵液；所述蛋白質(zhì)為將seq?id?no.1的第19位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸且第102位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，且保持seq?id?no.1的其他氨基酸殘基不變得到的突變蛋白質(zhì)。

8、上述方法中，所述反應(yīng)是在32℃反應(yīng)5h。所述發(fā)酵液還含有莽草酸。

9、本發(fā)明提供一種制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量的方法，包括利用蛋白質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)的物質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性或含量的物質(zhì)制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量；所述蛋白質(zhì)為將seq?id?no.1的第19位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸、第102位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，且其他氨基酸序列不變的蛋白質(zhì)。

10、本發(fā)明還提供一種重組菌，所述重組菌含有前述蛋白質(zhì)。

11、上述述重組菌中，含有前述蛋白質(zhì)的編碼基因。所述編碼基因的核苷酸序列為seqid?no.4。

12、前述蛋白質(zhì)和生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

13、本發(fā)還提供一種應(yīng)用，即前述的蛋白質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)的物質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性或含量的物質(zhì)在制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

14、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為上調(diào)或增強(qiáng)或提高前述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)或所述蛋白質(zhì)含量或活性。

15、上述應(yīng)用中，所述物質(zhì)為生物材料，所述生物材料下述任意一種：

16、b1)、編碼前述蛋白質(zhì)的核酸分子；

17、b2)、含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

18、b3)、含有b1)所述核酸分子的重組載體、或含有b2)所述表達(dá)盒的重組載體；

19、b4)、含有b1)所述核酸分子的重組微生物、或含有b2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有b3)所述重組載體的重組微生物。

20、上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列為seq?id?no.4。

21、上述應(yīng)用中，所述表達(dá)載體以pet-28a(+)為載體。所述表達(dá)載體上還包含卡那霉素抗性蛋白的編碼基因kanr，帶his標(biāo)簽。

22、上述應(yīng)用中，所述微生物為大腸桿菌bl21(ed3)感受態(tài)細(xì)胞。

23、本發(fā)還提供一種應(yīng)用，即前述生物材料在制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

24、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明的提供的莽草酸脫氫酶aroe的突變體通過其中的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，改變其對3-脫氫莽草酸的底物結(jié)合特異性，從而加強(qiáng)對底物脫氫莽草酸的親和力，減少對莽草酸的氧化反應(yīng)，提高由3-脫氫莽草酸生成莽草酸的還原反應(yīng)，最終提高莽草酸產(chǎn)量。

25、本發(fā)明的項(xiàng)目號為：基于宿主的抗感染新藥靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及新獸藥篩選2022yfd1802104。

26、保藏證明

27、菌種名稱：大腸桿菌

28、拉丁名：escherichia?coli

29、菌株編號：hyy1458

30、保藏機(jī)構(gòu)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心

31、保藏機(jī)構(gòu)簡稱：cctcc

32、地址：中國武漢武漢大學(xué)

33、保藏日期：2022年12月23日

34、保藏中心登記入冊編號：cctcc?no：m?20222036。

技術(shù)特征：

1.降低含有3-脫氫莽草酸的發(fā)酵產(chǎn)物中3-脫氫莽草酸含量和/或增加所述發(fā)酵產(chǎn)物中的莽草酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括將蛋白質(zhì)和所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)以提高所述發(fā)酵產(chǎn)物中3-脫氫莽草酸含量和/或增加所述發(fā)酵產(chǎn)物中的莽草酸含量；所述蛋白質(zhì)為將seq?id?no.1的第19位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸且第102位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，且保持seq?id?no.1的其他氨基酸殘基不變得到的蛋白質(zhì)。

2.一種制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

3.一種重組菌，其特征在于，所述重組菌含有權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌含有前述蛋白質(zhì)的編碼基因。

5.權(quán)利要求項(xiàng)1中所述的蛋白質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)的物質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性或含量的物質(zhì)在制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述調(diào)控為上調(diào)或增強(qiáng)或提高權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)或所述蛋白質(zhì)含量或活性。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述物質(zhì)為生物材料，所述生物材料為下述任意一種：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列為seq?id?no.4。

9.權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7中所述的生物材料。

10.權(quán)利要求項(xiàng)7中所述的生物材料在制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種制備莽草酸或提高莽草酸產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。前述方法包括將蛋白質(zhì)和發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)以提高所述發(fā)酵產(chǎn)物中3?脫氫莽草酸含量和/或增加所述發(fā)酵產(chǎn)物中的莽草酸含量；所述蛋白質(zhì)為將SEQ?ID?No.1的第19位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸且第102位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，且保持SEQ?ID?No.1的其他氨基酸殘基不變得到的蛋白質(zhì)。前述突變體能改變其對3?脫氫莽草酸的底物結(jié)合特異性，從而加強(qiáng)對底物脫氫莽草酸的親和力，減少對莽草酸的氧化反應(yīng)，增加由3?脫氫莽草酸生成莽草酸的還原反應(yīng)，最終提高莽草酸產(chǎn)量。

技術(shù)研發(fā)人員：黃建忠,陸玉林,郭小雷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6