本發(fā)明屬于動物基因工程，具體涉及提供一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、金魚起源于中國，擁有1000多年的歷史，是活的化石和文化名片，其因形態(tài)各異、顏色多樣而深受世界人民的喜愛。近年來，國外依靠先進(jìn)的養(yǎng)殖和育種技術(shù)，在金魚產(chǎn)業(yè)上給我們造成了很大的壓力，而且金魚行業(yè)面臨著創(chuàng)新能力低、不易飼養(yǎng)、抗病能力弱和從業(yè)人員水平偏低等諸多問題，金魚品種的創(chuàng)新是保持其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本動力，是迫在眉睫需要解決的問題，因此外源基因的整合有望實(shí)現(xiàn)金魚品種的創(chuàng)新，但是目前在金魚上沒有很好的技術(shù)手段。

2、轉(zhuǎn)座子(transposon)作為一類能在基因組中發(fā)生位置移動的dna片段，其獨(dú)特的轉(zhuǎn)座機(jī)制為基因整合提供了新的思路和方法，特別是在動物基因轉(zhuǎn)移和基因功能研究中，已經(jīng)展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價(jià)值。常用的dna轉(zhuǎn)座子包括sleeping?beauty(sb)、piggybac(pb)和tol2等，這些轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)各具特色，如sb轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有高效、隨機(jī)整合的特點(diǎn)，而pb轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)則允許長達(dá)100kb的dna插入到“aatt”序列中，且這些序列優(yōu)先定位于哺乳動物基因組的常染色質(zhì)區(qū)域。

3、現(xiàn)有技術(shù)在金魚基因組中挖掘出tgf2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，說明金魚基因組也是適合轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)發(fā)揮作用的，但是該系統(tǒng)由于金魚本身還有轉(zhuǎn)座酶，會造成外源整合片段的不穩(wěn)定跳躍，所以只適合用于其他物種的基因整合。研究表明在金魚上最早利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的是利用tol2系統(tǒng)在草金魚上進(jìn)行基因整合研究，但檢出率只有17.3％，不太能滿足金魚外源基因整合的需求。

4、zb轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一類最新發(fā)現(xiàn)的，在斑馬魚中具有較高活性的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，該系統(tǒng)顯示出在哺乳動物細(xì)胞和小鼠中的強(qiáng)大活性，但是在魚類中的運(yùn)用較少，而且現(xiàn)有技術(shù)存在的問題有(1)采用線性化質(zhì)粒陽性率通常低于10％，可遺傳率低于1％，(2)采用昆蟲piggybac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因金魚，其陽性率極低(小于1％)，(3)采用tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，陽性率可達(dá)17％，但是tol2轉(zhuǎn)座酶較大，不易制備高質(zhì)量的capped?mrna，(4)采用tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，引入的外源片段長度在10kb以上效率就會非常低下，(5)采用金魚tgf2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可使熒光率達(dá)到80％以上，但是因?yàn)榻痿~本身存在tgf2轉(zhuǎn)座酶，會使構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因品系發(fā)生基因跳躍，造成品系不穩(wěn)定的問題。因此開發(fā)一套能夠在金魚基因組中實(shí)現(xiàn)高效外源基因整合的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，大大提高了zb轉(zhuǎn)座子的有效性和應(yīng)用范圍，高效實(shí)現(xiàn)金魚基因組外源基因的高效整合，對于金魚創(chuàng)新育種至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、要解決的技術(shù)問題：針對上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法及其應(yīng)用，步驟如下：轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建、zb轉(zhuǎn)座子酶的制備、轉(zhuǎn)基因顯微注射和熒光信號檢測。本發(fā)明利用來源于斑馬魚的zb轉(zhuǎn)座子構(gòu)建p-minizb質(zhì)粒，提供最小的空載體序列滿足不同外源基因克隆的需求，有利于外源片段最大限度的組裝，并且轉(zhuǎn)座酶通過金魚密碼子偏好性優(yōu)化，在蛋白的n端和c端重組核定位信號，有利于外源dna片段的編碼定位整合，不僅可以提高外源基因的整合率和可遺傳率，還能夠降低金魚同源轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座酶發(fā)生基因跳躍的概率，具有操作便捷、高轉(zhuǎn)化率、高穩(wěn)定性、高精準(zhǔn)度等特點(diǎn)，可應(yīng)用于多個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，為魚類轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究和利用提供新的思路和方法。

2、技術(shù)方案：一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，包括以下步驟：

3、s1.zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的構(gòu)建：運(yùn)用pcr技術(shù)克隆目的基因dna片段，整合到p-minizb通用型轉(zhuǎn)基因載體骨架質(zhì)粒上，制得zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒；

4、s2.zb轉(zhuǎn)座酶rna的制備：運(yùn)用pcr技術(shù)克隆zb?transposase-co?final序列，加帽優(yōu)化，制得zb轉(zhuǎn)座酶rna；

5、s3.混合體系的制備：zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和zb轉(zhuǎn)座酶rna混合均勻，制成混合體系；

6、s4.轉(zhuǎn)基因顯微注射：采用人工授精的方法收集受精卵，向受精卵的每個(gè)胚胎顯微注射混合體系，制得顯微注射的胚胎；

7、s5.熒光檢測：利用熒光顯微鏡檢測熒光表達(dá)情況。

8、進(jìn)一步的，所述步驟s1中p-minizb通用型轉(zhuǎn)基因載體骨架質(zhì)粒含有zb轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂，且轉(zhuǎn)座臂間具有多克隆位點(diǎn)，其質(zhì)粒圖譜見圖1。

9、進(jìn)一步的，所述步驟s1中目的基因dna片段的整合方式包括酶切酶連和無縫克隆。

10、進(jìn)一步的，所述步驟s2中zb?transposase-co?final序列如seq.id.no.1所示。

11、進(jìn)一步的，所述步驟s3中zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的濃度為50-100ng/μl，zb轉(zhuǎn)座酶rna的濃度為100-200ng/μl。

12、進(jìn)一步的，所述步驟s4中混合體系的注射量為2-4nl。

13、上述任一項(xiàng)所述的方法在金魚的創(chuàng)新育種中的應(yīng)用，其應(yīng)用流程圖見圖2。

14、有益效果：

15、1.本發(fā)明中構(gòu)建zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒所用的p-minizb通用型轉(zhuǎn)基因載體骨架質(zhì)粒，含有zb轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂，轉(zhuǎn)座臂之間引入方便分子克隆的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座壁較短，基礎(chǔ)質(zhì)粒大小只有3kb左右，提供最小的空載體序列滿足不同外源基因克隆的需求，有利于外源片段最大限度的組裝，可整合的外源片段大小可達(dá)10kb。

16、2.本發(fā)明中所應(yīng)用的zb轉(zhuǎn)座酶經(jīng)過金屬密碼子偏好性優(yōu)化，在n端和c端重組核定位信號(nls)，便于與zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒之間的精準(zhǔn)識別，并且轉(zhuǎn)座酶比較小，方便體外轉(zhuǎn)錄高質(zhì)量的rna，具有毒性小、表達(dá)高的特點(diǎn)。

17、3.本發(fā)明基于斑馬魚來源的zb活性轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與優(yōu)化修飾后的zb轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行金魚外源dna片段的高效整合，不僅具有轉(zhuǎn)基因效率高，整合率可達(dá)60-90％，可遺傳率可達(dá)30％、簡便高效、高精準(zhǔn)度的優(yōu)點(diǎn)，還能夠克服金魚內(nèi)源轉(zhuǎn)座系統(tǒng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因品系發(fā)生基因跳躍而造成品系不穩(wěn)定的問題，從而高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，最大程度地提高zb轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的有效性和應(yīng)用范圍，為魚類的相關(guān)功能基因研究和基因創(chuàng)新育種提供新的方法和思路。

技術(shù)特征：

1.一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，其特征在于，所述步驟s1中p-minizb通用型轉(zhuǎn)基因載體骨架質(zhì)粒含有zb轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂，且轉(zhuǎn)座臂間具有多克隆位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，其特征在于，所述步驟s1中目的基因dna片段的整合方式包括酶切酶連和無縫克隆。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，其特征在于，所述步驟s2中zb?transposase-co?final序列如seq.id.no.1所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，其特征在于，所述步驟s3中zb轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的濃度為50-100ng/μl，zb轉(zhuǎn)座酶rna的濃度為100-200ng/μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)現(xiàn)外源dna片段高效基因組整合的方法，其特征在于，所述步驟s4中混合體系的注射量為2-4nl。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法在金魚的創(chuàng)新育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種實(shí)現(xiàn)外源DNA片段高效基因組整合的方法及其應(yīng)用，步驟如下：轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建、ZB轉(zhuǎn)座子酶的制備、轉(zhuǎn)基因顯微注射和熒光信號檢測。本發(fā)明利用來源于斑馬魚的ZB轉(zhuǎn)座子構(gòu)建p?miniZB質(zhì)粒，提供最小的空載體序列滿足不同外源基因克隆的需求，有利于外源片段最大限度的組裝，并且轉(zhuǎn)座酶通過金魚密碼子偏好性優(yōu)化，在蛋白的N端和C端重組核定位信號，有利于外源DNA片段的編碼定位整合，不僅可以提高外源基因的整合率和可遺傳率，還能夠降低金魚同源轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座酶發(fā)生基因跳躍的概率，具有操作便捷、高轉(zhuǎn)化率、高穩(wěn)定性、高精準(zhǔn)度等特點(diǎn)，可應(yīng)用于多個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，為魚類轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究和利用提供新的思路和方法。

技術(shù)研發(fā)人員：何小鎮(zhèn),劉釔良,施浩文,施伯林
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南通瑞蝶生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9