本發(fā)明涉及生物，特別涉及dna納米球裝載方法。

背景技術(shù)：

1、dna?nanoball?sequencing(dna?nanoball，dnb測(cè)序)，是一種高通量測(cè)序技術(shù)，可以用于測(cè)定生命體全基因組序列的排列與組成。該技術(shù)核心在于將基因組dna片段環(huán)化成單鏈環(huán)狀dna后，通過滾環(huán)擴(kuò)增(rolling?circle?amplification，rca)技術(shù)，使環(huán)狀單鏈dna形成由首尾相連的多個(gè)拷貝的單鏈dna，并在溶液中自由折疊成納米球結(jié)構(gòu)，即dna納米球(dnb)。dna納米球由于自身所帶負(fù)電荷的相互排斥，可減少dnb個(gè)體之間的相互作用，使dnb個(gè)體間相互獨(dú)立?；赿na?nanoball的矩陣列測(cè)序技術(shù)使得每個(gè)矩陣點(diǎn)的dnb具有至少幾百個(gè)拷貝數(shù)，這些拷貝聚集在一起產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào)，由此可以測(cè)序獲得dnb的測(cè)序結(jié)果。然而，測(cè)序過程中的loading過程試劑種類多，步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，室溫自然引物雜交耗時(shí)效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供的dna納米球裝載方法，提高了dnb?loading效率、簡(jiǎn)化了post-loading流程但不降低dnb?post-loading質(zhì)量、提高了引物雜交效率。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了dlb，其ph為4.8且鉀離子濃度為1531～1593mm。

4、本發(fā)明還提供了上述dlb在提高dna納米球裝載效率中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明還提供了裝載dna納米球的方法，包括：取含phi29的試劑與經(jīng)氨基化的測(cè)序芯片接觸，不需孵育，再取含dna納米球的溶液與所述測(cè)序芯片接觸，孵育5min，完成裝載；

6、所述含phi29的試劑包括上述dlb；

7、所述含dna納米球的溶液包括上述dlb。

8、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法中所述含phi29的試劑包括50μl?h2o、50μl?dnb制備緩沖液、2μl?phi29和33μl上述dlb。

9、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法中，在孵育5min之后、完成裝載之前，還包括清洗所述測(cè)序芯片的步驟。

10、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法中清洗所述測(cè)序芯片的步驟包括：

11、步驟(1)：取pwb清洗所述測(cè)序芯片，不需孵育；

12、步驟(2)：取dcb清洗所述測(cè)序芯片，不需孵育；

13、步驟(3)：取sb1清洗所述測(cè)序芯片；

14、且：

15、不包括多次取dcb清洗所述測(cè)序芯片的步驟；

16、不包括取reb清洗所述測(cè)序芯片的步驟；

17、不包括取paw清洗所述測(cè)序芯片的步驟；。

18、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法包括：

19、所述pwb的體積包括200μl；和/或

20、所述dcb的體積包括100μl；和/或

21、所述sb1的體積包括250μl；和/或

22、所述清洗的流速包括100μl/min。

23、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法中，在清洗所述測(cè)序芯片之后、完成裝載之前，還包括所述測(cè)序芯片與引物結(jié)合的步驟。

24、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法中，所述結(jié)合的條件為55℃?1min，30℃?1min。

25、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述方法中，所述結(jié)合中所述引物的流速為100μl/min。

26、本發(fā)明的dna納米球裝載方法有如下效果：

27、本方案所確定的新的dlb配方，以及dnb?loading、post-loading和primer雜交方法，可以在20min內(nèi)完成芯片準(zhǔn)備工作，并可滿足bic、fit、esr等數(shù)據(jù)指標(biāo)。

28、1.加入phi29?priming，使phi29與芯片氨基表面預(yù)先結(jié)合，可以提高dnb?loading效率；

29、2.簡(jiǎn)化post-loading流程，但保證必要步驟的保留，不降低dnb?post-loading質(zhì)量；

30、3.利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的生化原理，改進(jìn)primer雜交的流程，提高雜交效率。

技術(shù)特征：

1.dlb，其特征在于，ph為4.8且鉀離子濃度為1531～1593mm。

2.如權(quán)利要求1所述的dlb在提高dna納米球裝載效率中的應(yīng)用。

3.裝載dna納米球的方法，其特征在于，包括：取含phi29的試劑與經(jīng)氨基化的測(cè)序芯片接觸，不需孵育，再取含dna納米球的溶液與所述測(cè)序芯片接觸，孵育5min，完成裝載；

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述含phi29的試劑包括50μlh2o、50μl?dnb制備緩沖液、2μl?phi29和33μl如權(quán)利要求1所述的dlb。

5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，在孵育5min之后、完成裝載之前，還包括清洗所述測(cè)序芯片的步驟。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，清洗所述測(cè)序芯片的步驟包括：

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括：

8.如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在清洗所述測(cè)序芯片之后、完成裝載之前，還包括所述測(cè)序芯片與引物結(jié)合的步驟。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合的條件為55℃1min，30℃1min。

10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合中所述引物的流速為100μl/min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及DNA納米球裝載方法。本發(fā)明提供了提高DNA納米球裝載效率以及裝載DNA納米球的方法。本發(fā)明通過加入phi29priming，使phi29與芯片氨基表面預(yù)先結(jié)合，提高DNB?loading效率；簡(jiǎn)化post?loading流程，但保證必要步驟的保留，不降低DNB?post?loading質(zhì)量；利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的生化原理，改進(jìn)primer雜交的流程，提高雜交效率。

技術(shù)研發(fā)人員：徐訊,許軍強(qiáng),章文蔚,陳奧,趙杰,廖莎,傅德豐,何琳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳華大生命科學(xué)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9