專利名稱：鮑魚多糖的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多糖的提取方法，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到多糖、蛋白質(zhì)與核酸一樣是涉及生命活動(dòng)本質(zhì)的三類生物大分子之一。多糖是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，又稱多聚糖，它不僅是人體生命必需的成分，而且也存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，并參與多種生命功能活動(dòng)。進(jìn)年來，發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)人體具有增強(qiáng)免疫功能，還有抗癌、抗輻射、抗炎、降血糖等生理活性，因此受到廣泛關(guān)注和重視。
目前，國(guó)內(nèi)外研究較多的是食用、藥用菌多糖，隨著對(duì)多糖研究的深入，人們也逐漸把目光轉(zhuǎn)向動(dòng)物多糖，尤其是海洋動(dòng)物多糖的研究，也日益成為科研工作者研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。由于鮑魚生長(zhǎng)期長(zhǎng)，在海洋的高鹽、高壓、低溫這種特殊環(huán)境中生活，身體中富集了大量生理活性物質(zhì)。近年來，有研究從鮑魚中分離和純化能高效抑制鼻咽癌細(xì)胞的純多糖。大量研究論文報(bào)道也顯示鮑魚多糖具有很好的抗腫瘤活性和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。中國(guó)醫(yī)藥資訊網(wǎng)(http//www.yy2000.com)載文稱，鮑魚多糖、紫菜多糖已證明有抗腫瘤、防治心血管疾病作用，這種藥用的研究正在繼續(xù)，將會(huì)取得更多、更好的效果。然而，從動(dòng)物中提取多糖的研究較少，至于從海洋動(dòng)物中提取多糖的研究更是鳳毛麟角。從鮑魚身上有效提取鮑魚多糖的研究則還未見報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種工藝方法，以去殼鮑魚整體、鮑魚腹足、鮑魚臟器為原料，有效地提取鮑魚多糖。
本發(fā)明的技術(shù)方案是鮑魚經(jīng)原料的處理、提取、醇沉、干燥而得鮑魚多糖。具體工藝步驟為一、原料處理原料鮑魚可用新鮮的，也可用冷凍品，還可以用干燥品。處理時(shí)可分鮑魚肉整體(不分腹足和臟器)、鮑魚的腹足和臟器。鮑魚的腹足和臟器也可單獨(dú)提取鮑魚多糖。
取新鮮的或解凍的鮑魚，洗凈去殼得到鮑魚肉整體，也可以分離得到鮑魚腹足和臟器，可以分別或混勻加入5～10倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿待用；干燥品是是帶殼冷凍鮑魚，緩化5～10分鐘，去殼，得到鮑魚肉整體，也可以分離得到鮑魚的腹足和臟器，將其分別或混勻凍干或烘干、粉碎，其粒度為在100目以下，待用。
二、鮑魚多糖的提取提取鮑魚多糖的方法采用水浸提法、堿液提取法、超聲波提取法和酶提取法，還可以酶與前三種方法相結(jié)合，以提高得率。
1、水浸提法向漿料或干粉中加入重量10～50倍的水，混勻，在20～80℃的溫度下，浸提2～6小時(shí)后，離心分離，得到離心上清液和不溶物。不溶物再加10～40倍的水，在20～80℃的溫度下，浸提2～6小時(shí)后再次離心分離，合并兩次所得的上清液，待用。
2、堿液提取法向漿料或干粉中加入重量10～50倍的水，混勻，加入0.5mol/L的NaOH或KOH溶液，調(diào)pH為8～9，在20～60℃的溫度下，浸提2～6小時(shí)后，離心分離得到上清液和不溶物。不溶物再加10～40倍的水，保持PH為8～9，重復(fù)上述操作1～2次，合并所得的上清液，用酸中和待用。
3、超聲波提取法將原料處理中得到的鮑魚漿料或鮑魚干粉，加鮑魚量10～50倍的水，用20～30KHZ超聲波處理10～60分鐘，離心分離得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加10～40倍的水，再用超聲波處理10～60分鐘，離心分離得到上清液和不溶物。合并兩次所得的上清液。
4、酶提取法酶提取法是鮑魚漿料或鮑魚干粉加水，用酶在所用酶適宜的pH值和溫度等條件下進(jìn)行酶解，所用的酶可以是單一酶、雙酶、復(fù)合酶或自溶酶，也可與上述提取法相接合，均可達(dá)到提取目的。所述的單一酶、雙酶、復(fù)合酶的品種為胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等。
(1)單、雙、復(fù)合酶酶解法1)單酶酶解法經(jīng)處理后的原料加鮑魚量10～50倍的水?dāng)嚢杌旌?，?mol/L HCl調(diào)pH為1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在35～50℃攪拌酶解2～5小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離的上清液合并待用。其它品種酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等)的酶解操作上同上，只是用堿液或酸液調(diào)到所用酶適宜的范圍。
2)雙酶酶解法經(jīng)處理后的原料加鮑魚量10～50倍的水?dāng)嚢杌旌希?mol/L HCl調(diào)pH為1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在20～60℃攪拌酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液調(diào)pH為7～9，加入溶液重量0.05～3.00％的胰蛋白酶，在20～60℃水浴中攪拌酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離的上清液合并待用。
3)復(fù)合酶酶解法將原料處理中得到的鮑魚漿料或鮑魚干粉，加鮑魚量10～50倍的水，用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液調(diào)pH為7～9，加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，添加量為溶液重量的0.05～3.00％，三種酶的比例為1.0∶0.1～1.0∶0.1～1.0，在20～60℃的溫度下，酶解1～6小時(shí)后，用酸調(diào)pH7，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離的上清液合并待用。
(2)結(jié)合提取法1)自溶與外源酶相解合法(1)自溶可以用下述任一方法進(jìn)行自溶①鮑魚漿料加重量10～50倍水，用紫外線照射10～30分鐘，用0.06～0.08mol/L NaCl在pH為7.0～7.5、30～50℃下使其利用自身酶自溶；②將鮑魚漿料加鮑魚量10～50倍水置入無菌酶罐中，在pH6.0～7.5、常溫下自溶6～8小時(shí)；③將鮑魚漿料加10～50倍水置入無菌酶罐中，在pH6.0～7.5下，0～4℃自溶24～48小時(shí)。(2)外源酶酶解將上述自溶的溶液用6mol/L的HCl調(diào)pH為1～5，加入溶液重量0.3～0.5％的胃蛋白酶，于40～60℃酶解1～2小時(shí)，酶解后調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離的上清液合并待用。
2)水提和雙酶結(jié)合法將原料處理中得到的鮑魚漿料或鮑魚干粉，加鮑魚量10～50倍的水，在20～80℃浸提2～6小時(shí)；用6mol/L HCl調(diào)pH為1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在20～60℃攪拌酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液調(diào)pH為7～9，加入0.05～3.00％的胰蛋白酶，在20～60℃水浴中攪拌酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離的上清液合并待用。
上述操作由于兩種酶水解時(shí)需要pH值不同，所以分前后兩次酶解；如果兩種酶需要pH值相同則可同時(shí)加兩種酶，一次酶解即成。如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解時(shí)需要pH值相同，均為7～9，就可以在這一pH值下同時(shí)加其中兩種酶。
3)超聲波和單酶結(jié)合法將原料處理中得到的鮑魚漿料或鮑魚干粉，加鮑魚量10～50倍的水，用20～30KHZ超聲波處理10～60分鐘，離心分離得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加10～40倍的水，用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液調(diào)pH為7～9，加入木瓜蛋白酶，添加量為溶液重量的0.05～3.00％，20～60℃酶解1～6小時(shí)后，用酸調(diào)pH7，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀還可加10～40倍水重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離的上清液合并待用。
從上述操作可以看出，超聲波、堿液、水提和單酶、雙酶以及復(fù)合酶結(jié)合都是可行的，僅僅是調(diào)整酶的最適合的pH值以及酶的添加量。
上述所有離心分離均為3000～6000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心10分鐘左右的操作。
三、鮑魚多糖的濃縮將上述所得的離心上清液，真空濃縮至多糖含量為1.5～3.0％。
四、鮑魚多糖的醇沉向濃縮液中加入3～4倍體積的95％乙醇，在0～4℃的溫度下，醇沉12～16小時(shí)左右。
五、鮑魚多糖的離心醇沉后的多糖，高速離心10分鐘左右，得到的沉淀即鮑魚多糖。
六、鮑魚多糖的干燥鮑魚多糖的干燥可以用如下任一方法均可達(dá)到目的1、將純化得到的離心不溶物，在50～60℃的溫度下，真空干燥，得到干燥的鮑魚多糖。
2、將純化得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.05～1.10左右，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥設(shè)備入口溫度160～180℃，出口溫度50～60℃，得到干燥的鮑魚多糖。
如果需要，還可將上述得到的鮑魚多糖，用粉碎機(jī)粉碎至160目以下。
用本發(fā)明的方法提取的鮑魚多糖為棕色粉末，多糖提取率為20％～40％(干品比)，多糖含量為6～18％，易溶于熱水，微溶于冷水?？稍谑称沸袠I(yè)廣泛應(yīng)用。如果再進(jìn)一步純化、脫蛋白，多糖含量可達(dá)40％～60％，可以廣泛應(yīng)用于藥品行業(yè)。
本發(fā)明所具有的特點(diǎn)是1.工藝合理，開創(chuàng)了從鮑魚體內(nèi)(除殼外)提取鮑魚多糖的工藝路線，極大限度地將鮑魚多糖提取出來；2.在提取工藝上，廣泛地研究并確定了多種有效的提取方法；3.由于鮑魚多糖的藥用用途的研究不斷深入，其藥用價(jià)值逐漸升值，本發(fā)明為提高其經(jīng)濟(jì)效益提供了技術(shù)基礎(chǔ)；4.除殼以外的鮑魚體都用作提取原料，特別是可以利用鮑魚的腹足和臟器提取多糖，既充分利用資源又無廢料排放；5.本發(fā)明中，采用了海洋生物的自溶技術(shù)，可以大大節(jié)約外源酶的使用量，降低成本。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1取鮑魚整體1000克，加水5000克，用組織搗碎機(jī)勻漿，加入25000克水，攪拌均勻，在50℃的溫度下，浸提5小時(shí)后，高速離心，得到上清液和沉淀。將沉淀加入25000克水，攪拌均勻，在80℃的溫度下，浸提3小時(shí)后，高速離心，得到上清液和沉淀。合并所得的上清液。將上清液真空濃縮至多糖含量為3％(苯酚硫酸法檢測(cè))；向濃縮液中加入3倍體積的95％乙醇21000毫升，在4℃的溫度下，醇沉16小時(shí)，高速離心10分鐘左右，得到離心不溶物。將此不溶物在60℃的溫度下，真空干燥，得到干燥的鮑魚粗多糖61.6克。用粉碎機(jī)粉碎至160目以下。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為8.1％。
實(shí)例2取凍干的鮑魚整體粉1000克，加水50000克，攪拌均勻，向其中加入0.1N氫氧化鈉溶液，調(diào)PH為9，在20℃的溫度下，浸提6小時(shí)后，用6mol/L HCl中和至pH為7，高速離心，得到上清液和沉淀。向沉淀加水30000克，攪拌均勻，向其中加入0.5mol/L的NaOH溶液，調(diào)PH為8，在80℃的溫度下，浸提3小時(shí)后，用6mol/L HCl中和至pH為7，高速離心，得到上清液和沉淀。合并所得的上清液。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將此不溶物在50℃的溫度下，真空干燥，得到干燥的鮑魚粗多糖298克。用粉碎機(jī)粉碎至160目以下。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為9.3％。
實(shí)例3取鮑魚腹足1000克，處理如同實(shí)例1，用20KHZ超聲波處理60分鐘，高速離心，得到離心上清液和沉淀。將沉淀加入25000克水，用27KHZ超聲波處理20分鐘，高速離心，得到離心上清液和沉淀。合并所得的上清液。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將此不溶物在50℃的溫度下，真空干燥，得到干燥的鮑魚多糖粗65.2克。用粉碎機(jī)粉碎至160目以下。其多糖含量為8.8％。
實(shí)例4取鮑魚腹足1000克，處理如同實(shí)例1，向其中加入0.5mol/L的NaOH溶液，調(diào)pH為8，加入900克胰蛋白酶(酶活力2500u/mg)，在37℃的溫度下，酶解5小時(shí)后，用6mol/L HCl調(diào)pH為7左右，5分鐘升溫至100℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心，得到上清液和和沉淀。將沉淀加入25000克水，向其中加入0.5mol/L的KOH溶液，調(diào)PH為8，加入150克胰蛋白酶(酶活力2500u/mg)，在50℃的溫度下，酶解2小時(shí)后，用6mol/L HCl調(diào)pH為7左右，5分鐘升溫至90℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心，得到上清液和和沉淀。合并所得的上清液。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.07，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度160℃，出口溫度50℃，得到干燥的鮑魚多糖43.2克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為14.8％。
實(shí)例5取鮑魚腹足干粉1000克，加入50000克水，攪拌均勻，用6mol/L HCl調(diào)pH為3，加入1500克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在50℃水浴中攪拌酶解2小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L KOH液調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水30000克，加入500克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃水浴中攪拌酶解4小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；離心分離的上清液合并待用。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.06，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度160℃，出口溫度50℃，得到干燥的鮑魚多糖236克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為13.9％。
實(shí)例6取鮑魚腹足干粉1000克，加鮑魚量50000克水，攪拌均勻，加入1000克的中性蛋白酶(酶活力為100u/mg)，在40℃水浴中攪拌酶解5小時(shí)，2分鐘升溫至90℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水30000克，加入150克的中性蛋白酶(酶活力為100u/mg)，在40℃水浴中攪拌酶解3小時(shí)，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀。合并所得的上清液。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.1，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度180℃，出口溫度60℃，得到干燥的鮑魚多糖225.5克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為14.2％。
實(shí)例7取鮑魚腹足干粉1000克，加鮑魚量40000克水，攪拌均勻，用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為8.5，加入600克木瓜蛋白酶(酶活力為1200u/mg)，在50℃水浴中攪拌酶解4小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用6mol/L HCl液調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水35000克，攪拌均勻，用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為9.0，加入175克木瓜蛋白酶(酶活力為1200u/mg)，在35℃水浴中攪拌酶解3小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用6mol/L HCl液調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至90℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；合并所得的上清液。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.1，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度170℃，出口溫度55℃，得到干燥的鮑魚多糖234克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為15.2％。
實(shí)例8取鮑魚臟器1000克，加水5000克，用組織搗碎機(jī)勻漿，加入25000克水，攪拌均勻，用6mol/L HCl調(diào)pH為1，加入900克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在35℃水浴中攪拌酶解2小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為9，加入300克胰蛋白酶(酶活力2500u/mg)，在55℃水浴中攪拌酶解4小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水10000克，重復(fù)上述步驟1次，離心分離的上清液合并待用。余下操作如實(shí)例7，得到干燥的鮑魚多糖50.2克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為8.4％。
實(shí)例9取鮑魚整體1000克，處理如同實(shí)例1，向其中加入0.5mol/L的KOH溶液，調(diào)pH為7，加入300克木瓜蛋白酶(酶活力為1200u/mg)、100克中性蛋白酶(酶活力為100u/mg)和100克胰蛋白酶(酶活力為2500u/mg)，在37℃的溫度下，酶解6小時(shí)后，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫(20℃)，高速離心，得到上清液和沉淀。沉淀加水20000克，向其中加入0.5mol/L的KOH溶液，調(diào)pH為7，加入200克木瓜蛋白酶(酶活力為1200u/mg)、50克中性蛋白酶(酶活力為100u/mg)和20克胰蛋白酶(酶活力為2500u/mg)，在50℃的溫度下，酶解4小時(shí)后，調(diào)pH為7左右，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫(20℃)，高速離心，得到上清液和沉淀。離心分離的上清液合并待用。余下操作如實(shí)例7，得到干燥的鮑魚多糖50.9克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為14.6％。
實(shí)例10取鮑魚整體1000克，處理如同實(shí)例1，將得到的漿液，用紫外線照射30分鐘，用濃度為0.06mol/l的Nacl在PH7.5，50℃下自溶，獲得的自溶液用6mol/LHCl調(diào)pH至5，加入150克胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃下酶解2小時(shí)。調(diào)PH為7，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心，得到離心上清液和和沉淀。將沉淀加入25000克水，用6mol/L HCl調(diào)pH至5，加入80克胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在60℃的溫度下，酶解1小時(shí)后，用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為7左右，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心，得到上清液和和沉淀。合并所得的上清液。余下操作同實(shí)例1。得到干燥的鮑魚粗多糖51.3克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為14.6％。
實(shí)例11取鮑魚整體1000克，處理如同實(shí)例1，將得到的漿液，用紫外線照射10分鐘，用濃度為0.08mol/l的Nacl在PH 7，30℃下自溶。余下操作同實(shí)例10。得到干燥的鮑魚粗多糖50.9克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為14.4％。
實(shí)例12取鮑魚臟器1000克，處理如同實(shí)例1，將得到的漿液放入無菌酶解罐中，調(diào)pH為6，常溫自溶8小時(shí)；然后將獲得的自溶液用6mol/L HCl調(diào)pH至3，加入30克胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃下酶解2小時(shí)。調(diào)PH為7，3分鐘升溫至90℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心，得到離心上清液和和沉淀。余下操作同實(shí)例10。得到干燥的鮑魚粗多糖66.2克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為6.5％。
實(shí)例13取鮑魚臟器1000克，處理如同實(shí)例1，將得到的漿液放入無菌酶解罐中，調(diào)pH為7.5，常溫自溶6小時(shí)。將上述自溶的溶液用6mol/L HCl調(diào)pH為5，加入溶液重量100克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，于40℃酶解1～2小時(shí)，酶解后調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀，沉淀加水重復(fù)上述步驟1次，離心分離的上清液合并待用。余下操作同實(shí)例10。得到干燥的鮑魚粗多糖64.8克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為6.8％。
實(shí)例14取鮑魚腹足1000克，處理如同實(shí)例1，50℃浸提3小時(shí)，用6mol/L HCl調(diào)pH為3，加入150克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃水浴中攪拌酶解5小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為7～9，加入100克的胰蛋白酶，在.55℃水浴中攪拌酶解2小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水重復(fù)上述步驟1次，離心分離的上清液合并待用。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.08，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度170℃，出口溫度55℃，得到干燥的鮑魚多糖50.3克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為16.1％。
實(shí)例15取鮑魚腹足1000克，處理如同實(shí)例1，用20KHZ超聲波處理60分鐘，離心分離得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加25000克水，用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為8.0，加入500克木瓜蛋白酶(酶活力為1200u/mg)，酶解4小時(shí)后，用6mol/L HCl調(diào)pH為7，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀。合并上清液。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.08，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度180℃，出口溫度50℃，得到干燥的鮑魚多糖49.2克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為15.8％。
實(shí)例16取鮑魚腹足1000克，處理如同實(shí)例1，用30KHZ超聲波處理30分鐘，離心分離得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加25000克水，用6mol/L HCl調(diào)pH為3，加入100克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃水浴中攪拌酶解5小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液調(diào)pH為7～9，加入80克的胰蛋白酶，在.55℃水浴中攪拌酶解2小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，5分鐘升溫至95℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離，得上清液和沉淀。離心分離的上清液合并待用。濃縮、醇化、離心如實(shí)例1。將得到的離心不溶物，用水稀釋至比重為1.10，進(jìn)行噴霧干燥，入口溫度180℃，出口溫度55℃，得到干燥的鮑魚多糖58.2克。用苯酚硫酸法檢測(cè)，其多糖含量為17.4％。
權(quán)利要求
1.鮑魚多糖的提取方法，包括鮑魚經(jīng)原料處理、提取、濃縮、醇沉、干燥的工藝步驟而得產(chǎn)品；其中所述原料處理是去殼整體鮑魚肉用組織搗碎機(jī)破壁，加5～10倍水勻漿；所述提取是將經(jīng)處理好的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆?，?0～60℃下浸提1～6小時(shí)，離心分離得不溶物和上清液，不溶物加10～30倍水，重復(fù)1～2次上述操作，上清液合并；所述濃縮是將提取所得清液濃縮至含糖1.5～3.0％；所述醇沉是加濃縮液3～4倍體積的95％乙醇，在0～4℃下放置12～16小時(shí)，離心分離，得不溶物即鮑魚多糖；所述干燥是將醇沉所得鮑魚多糖50～60℃真空干燥而得到產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述原料處理是從去殼整體鮑魚肉分離得到鮑魚腹足和臟器，可以分別或混勻加入5～10倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述原料處理是去殼整體鮑魚肉、分離得到鮑魚的腹足和臟器分別或混勻凍干或烘干、粉碎，其粒度為在100目以下而成的干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆?，?0～30KHZ超聲波處理10～60分鐘，離心分離得不溶物和上清液加10～30倍水，重復(fù)1～2次上述操作，上清液合并。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆?，用NaOH或KOH調(diào)整其pH值8～9，在20～60℃提取1～6小時(shí)，離心分離得不溶物和上清液，加10～30倍水，再次用NaOH或KOH調(diào)整其pH值8～9，重復(fù)1～2次上述操作，上清液合并，用HCl中和至中性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆颍肏Cl調(diào)整其pH值2～5，加溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，攪拌均勻，在20～60℃處理1～6小時(shí)，速升溫90～98℃滅酶10分鐘，速冷至20～30℃，離心分離得不溶物和上清液，上清液用NaOH或KOH調(diào)整其pH為中性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆?，用NaOH或KOH調(diào)整其pH值8～9，加溶液重0.05～3.00％的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，攪拌均勻，在20～60℃處理1～6小時(shí)，速升溫90～98℃滅酶10分鐘，速冷至20～30℃，離心分離得不溶物和上清液，上清液用NaOH或KOH調(diào)整其pH為中性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆?，用NaOH或KOH調(diào)整其pH值8～9，加溶液重量0.05～3.00％的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，其兩比為1∶0.01～1.0，攪拌均勻，在20～60℃處理1～6小時(shí)，速升溫90～100℃滅酶10分鐘，速冷至20～30℃，離心分離得不溶物和上清液，上清液用Hcl中和至中性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將原料處理后得到的鮑魚原料，加10～50倍的水，用HCl調(diào)pH1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃水浴中攪拌酶解1～6小時(shí)，同時(shí)保持pH在上述范圍內(nèi)；再用NaOH或KOH調(diào)pH7～9，加入溶液重量的0.05～3.00％胰蛋白酶，在20～60℃水浴中攪拌酶解1～6小時(shí)，同時(shí)保持pH在上述范圍內(nèi)；酶解后調(diào)pH為7左右，2～5分鐘升溫至90～100℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心得不溶物和上清液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料加10～50倍水?dāng)嚢杌旌暇鶆颍肗aOH或KOH調(diào)pH為7～9，加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，添加總量為溶液重量的0.05～3.00％，三種酶的比例為1∶0.01～1∶0.01～1，在20～60℃的溫度下，酶解1～6小時(shí)后，調(diào)pH為7左右，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫(20℃)，高速離心得不溶物和上清液。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將經(jīng)處理的鮑魚原料的漿液，用紫外線照射10～30分鐘，用濃度為0.06～0.08mol/l的NaCl在PH7～7.5，溫度為30～50℃，使其利用自身的酶自溶；用6摩爾/升HCl調(diào)pH至1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小時(shí)；調(diào)PH為7左右，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心10分鐘左右得不溶物和上清液。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將鮑魚內(nèi)臟的漿液放入無菌酶解罐中，于pH6～7.5、常溫自溶6～8小時(shí)；用HCl調(diào)pH至1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小時(shí)，調(diào)PH為7左右，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心10分鐘左右，得到不溶物和上清液。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將鮑魚內(nèi)臟的漿液放入無菌酶解罐中，于pH6～7.5、于0～4℃溫度下自溶24～48小時(shí)；用HCl調(diào)pH至1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小時(shí)；調(diào)PH為7左右，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘內(nèi)冷卻至室溫，高速離心10分鐘左右，得不溶物和上清液。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將原料處理后的鮑魚原料，加鮑魚量10～50倍的水，在20～80℃浸提3～6小時(shí)；用HCl調(diào)pH為1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；再用0.5mol/LNaOH或KOH液調(diào)pH為7～9，加入0.05～3.00％的胰蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離得不溶物和上清液。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將原料處理后的鮑魚原料，加鮑魚量10～50倍的水，在20～80℃浸提3～6小時(shí)；用NaOH或KOH液調(diào)pH為7～9，加入溶液重量0.05～3.00％的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的兩兩組合，在20～60℃水浴中攪拌酶解1～6小時(shí)，水解時(shí)保持上述pH值；酶解后用酸調(diào)pH為中性，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離得不溶物和上清液。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取是將原料處理后的鮑魚原料，加鮑魚量10～50倍的水，用20～30KHZ超聲波處理10～60分鐘，離心分離得到上清液和不溶物；向不溶物中再添加15～25倍的水，用0.5mol/LNaOH或KOH液調(diào)pH為7～9，加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或其兩兩組合，添加量為溶液重量的0.05～3.00％，在20～60℃酶解1～6小時(shí)后，用酸調(diào)pH7，2～5分鐘升溫至90～98℃滅酶10分鐘，5分鐘冷至室溫，離心分離得不溶物和上清液；得上清液和沉淀；沉淀加水重復(fù)上述步驟1～2次，離心分離得上清液。
17.根據(jù)權(quán)利要求6～15中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述提取中離心分離所得的不溶物加10～40倍水，重復(fù)提取1～2次，離心分離所得的全部上清液合并。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述干燥是將醇沉所得鮑魚多糖在50～60℃下真空干燥。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述鮑魚多糖的提取方法，其特征在于所述干燥是將純化醇沉所得鮑魚多糖用水稀釋至其比重為1.05～1.10，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥裝置出、入口溫度分別為50～60℃和160～180℃。
全文摘要
鮑魚多糖的提取方法，是將鮑魚去殼取肉(包括內(nèi)臟)，用組織搗碎機(jī)破壁，加水混合均勻于20～80℃浸提2～6h，離心分離，不溶物再次加水重復(fù)提取1～2次，上清液合并。濃縮提取液至含糖1.5～3.0％，加3～4倍體積的95％乙醇，0～4℃下醇沉12～16h，離心后真空法或噴霧法干燥得產(chǎn)品。提取還可以用加堿提取、超聲波提取、酶提取。酶提取可以用單一酶、雙酶、復(fù)合酶、自溶酶和復(fù)合法提取。酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶等。本發(fā)明開創(chuàng)了從鮑魚(特別是其腹足和臟器)提取鮑魚多糖的工藝路線，有效地將鮑魚多糖提取出來。由于鮑魚多糖的藥用用途的研究不斷深入，本發(fā)明為其進(jìn)一步開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1749280SQ200510047409
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者朱蓓薇, 李冬梅, 殷紅玲, 董秀萍, 宋玉, 李鋮鋮, 姜丹 申請(qǐng)人:大連輕工業(yè)學(xué)院