專利名稱：制備分枝型聚乙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種制備分枝型聚乙二醇的方法。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多具有生物活性的多肽，蛋白質(zhì)，酶被人們用于臨床治療。然而這些生物大分子在直接應(yīng)用于人體時存在著一些缺陷。這些缺陷包括1.快速排除，2.生物降解，3.引起免疫反應(yīng)等等。因此，蛋白質(zhì)特別是藥用蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾至今仍然是一個熱門的研究領(lǐng)域。許多天然及合成的分子正在被用做化學(xué)修飾。聚乙二醇這種合成的分子由于其生物相容性，對人體無毒，具有能夠降低被修飾物的抗原性等優(yōu)點被廣泛用于蛋白質(zhì)，多肽，酶甚至一些小分子藥物的修飾。
聚乙二醇(PEG)是一種水溶性的聚合物。當(dāng)與蛋白質(zhì)(還有多肽，酶及其他生物活性分子)共價結(jié)合時，聚乙二醇能夠彌補這些蛋白質(zhì)分子本身的不足，擴大其潛在的應(yīng)用。與未修飾的蛋白質(zhì)對照物相比，PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物的這種改良了的藥理學(xué)性質(zhì)激發(fā)了人們開發(fā)這種結(jié)合物作為制劑的熱情。例如，PEG-腺苷脫氨酶已獲得FDA的批準(zhǔn)；PEG修飾的細(xì)胞因子已被制成，并且PEG修飾的GM-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)顯示了兩種不相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)性質(zhì)。在研究中人們發(fā)現(xiàn)，PEG對生物活性物質(zhì)的修飾效果與所使用的PEG分子的分子量及特定的修飾度相關(guān)。一般說來，所用的PEG的分子量越大，修飾度越高，PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物的抗原性越小，排除時間越長，但同時結(jié)合物的生物活性會降低。這種生物活性的降低主要是由于過度修飾造成的。為了解決這個問題，人們合成了分枝型PEG分子。用分枝型PEG修飾蛋白質(zhì)，與直鏈PEG分子相比，在修飾度相同的情況下，連接的PEG分子量則會成倍增加。這種增加相對于直鏈PEG來說，具有兩個優(yōu)點1.擴大結(jié)合物分子大小，延長體內(nèi)排除時間，2.分枝型PEG能夠更有效地阻遏水解酶類和抗體與蛋白質(zhì)-PEG結(jié)合物的接觸，避免被水解和引起免疫反應(yīng)。因此，在擁有相同的修飾度的情況下，分枝型PEG的修飾效果要比直鏈PEG好得多。
分枝型PEG的合成由于起始物的不同有幾種不同的合成途徑1.起始物為mPEG-OH，其合成路線為 缺陷在于所用試劑昂貴，合成步驟多；2.起始物為mPEG-CHO，其合成路線為 缺陷在于產(chǎn)率很低，產(chǎn)物難分離；3.起始物為mPEG-COOH，其合成路線為 缺陷在于雖然產(chǎn)率較高，但反應(yīng)條件較難控制；上述合成方法的上述缺陷造成分枝型聚乙二醇的產(chǎn)品價格昂貴，在很大程度上限制了分枝型聚乙二醇在研究和實踐中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服上述制備分枝型聚乙二醇的方法存在的諸多缺陷，而提供一種新的制備分枝型聚乙二醇的方法。
分枝型聚乙二醇具有單個可活化官能團，在結(jié)構(gòu)上是兩個PEG-COOH分子對于賴氨酸分子的二取代產(chǎn)物，其分子為 本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的制備分枝型聚乙二醇的方法，其工藝步驟如下1)制備氨基酸乙酯鹽酸鹽將氨基酸溶于無水乙醇，在攪拌條件下通入干燥的氯化氫氣體至飽和，加熱回流使氨基酸溶解，將此溶液放置過夜；然后減壓蒸餾除去過量的乙醇和氯化氫；最后用無水乙醚，進行賴氨酸乙酯鹽酸鹽的結(jié)晶；再經(jīng)過濾，洗滌，干燥得到賴氨酸乙酯鹽酸鹽淡黃色晶體；2、制備羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇將mPEG溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化錳，均勻混合后，室溫下攪拌過夜；過濾除去催化劑，通過減壓蒸去溶劑得到中間氧化產(chǎn)物；將得到的中間氧化產(chǎn)物溶于體積比為3％過氧化氫水溶液，反應(yīng)24小時后，通過Bio-Rad AG1*2樹脂柱，除去中性物質(zhì)，再用0.02M HCl洗脫，得到羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇；3、制備分枝型聚乙二醇1)將步驟1所得的氨基酸乙酯鹽酸鹽與步驟2所得的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以1∶2-4的摩爾比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入過量的三乙胺，二環(huán)己基碳二亞胺，氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)24小時后，過濾除去所生成的二環(huán)己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀產(chǎn)物；將得到的白色粉末狀產(chǎn)物溶于1N NaOH，加入氯化鈉，反應(yīng)1-2小時后，用鹽酸將溶液調(diào)至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取至少3次，將萃取所得的有機相合并，并用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸餾濃縮，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀的物質(zhì)。
2)將上述所得產(chǎn)物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50層析柱進行以水為洗脫液的洗脫分離，每管10毫升收集組分；將相對于分枝型聚乙二醇的組分合并，濃縮，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇結(jié)晶，得到純化的分枝型聚乙二醇；所述的氨基酸為L-賴氨酸、二氨基或多氨基有機酸；所述的mPEG為分子量是750-10000之間的聚合物。
本發(fā)明的方法制備的分枝型聚乙二醇可用于修飾蛋白質(zhì)等生物大分子，也可修飾小分子藥物及其他表面。
本發(fā)明具有以下特點1、發(fā)明基于多肽合成中接肽原理，只需保護賴氨酸的羧基，不需要活化的氨基和羧基；2、反應(yīng)在室溫進行，不需控制pH值；3、所用原料和試劑價格便宜；4、反應(yīng)在有機相中進行；5、產(chǎn)率高，可達(dá)65％。


附圖1為本發(fā)明制備方法的步驟1所得產(chǎn)物賴氨酸酯鹽酸鹽的薄板層析圖譜；樣品1為賴氨酸酯鹽酸鹽，樣品2為賴氨酸；層析條件固定相為硅膠G60；展開劑為正丁醇/甲醇(7/3)；顯色劑為茚三酮；附圖2為本發(fā)明制備方法的步驟1所得產(chǎn)物賴氨酸酯鹽酸鹽的紅外譜圖；其特征吸收為1740.94cm-1(酯羰基的吸收)；3422.24(-N-H的吸收)；附圖3為本發(fā)明制備方法的步驟2所得產(chǎn)物的紅外譜圖；其特征吸收為1745.50cm-1(酸羰基的吸收)；附圖4為本發(fā)明制備方法的步驟3所得產(chǎn)物的MALDI-TOF譜圖；附圖5為本發(fā)明制備方法的步驟3所得產(chǎn)物的GPC譜圖附圖6為本發(fā)明制備方法的目的產(chǎn)物的1H NMR譜圖；具體實施方式
實施例1，用本發(fā)明的方法制備一種分枝型聚乙二醇，其步驟為1、制備賴氨酸乙酯鹽酸鹽將L賴氨酸溶于無水乙醇，在攪拌條件下通入干燥的氯化氫氣體至飽和，加熱回流使L-賴氨酸溶解，將此溶液放置過夜；然后減壓蒸餾除去過量的乙醇和氯化氫；最后用無水乙醚，進行賴氨酸乙酯鹽酸鹽的結(jié)晶；再經(jīng)過濾，洗滌，干燥得到賴氨酸乙酯鹽酸鹽淡黃色晶體；2、制備分子量為5000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇將mPEG5000溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化錳，均勻混合后，室溫下攪拌過夜；過濾除去催化劑，通過減壓蒸去溶劑得到中間氧化產(chǎn)物；將得到的中間氧化產(chǎn)物溶于體積比為3％過氧化氫水溶液，反應(yīng)24小時后，通過Bio-Rad AG1*2樹脂柱，除去中性物質(zhì)，再用0.02M HCl洗脫，得到分子量為5000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇；3、制備純化的分枝型聚乙二醇1)將步驟1所得的賴氨酸乙酯鹽酸鹽與步驟2所得的分子量為5000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以1∶2的摩爾比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入過量的三乙胺，二環(huán)己基碳二亞胺，氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)24小時后，過濾除去所生成的二環(huán)己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀產(chǎn)物；將得到的白色粉末狀產(chǎn)物溶于1N NaOH，加入氯化鈉，反應(yīng)1-2小時后，用鹽酸將溶液調(diào)至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取3次，將萃取所得的有機相合并，并用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸餾濃縮，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀的物質(zhì)；MALDI-TOF(圖3)譜圖表明此產(chǎn)物是分子量為5000的羧甲基化的單甲氯聚乙二醇和分子量為10000的羧甲基化的單甲氯聚乙二醇的混合物；GPC譜圖表明分枝型PEG的產(chǎn)率為61％；2)將上述所得產(chǎn)物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50層析柱進行以水為洗脫液的洗脫分離，每管10毫升收集組分；將相對于分枝型聚乙二醇的組分合并，濃縮，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇結(jié)晶，得到純化的目的產(chǎn)物分枝型聚乙二醇。
目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)可通過MALDI-TOF(圖3)譜圖和1H NMR(圖6)證實。實施例2，用本發(fā)明的方法制備一種分枝型聚乙二醇，其步驟為1、制備賴氨酸乙酯鹽酸鹽將L賴氨酸溶于無水乙醇(1∶8的摩爾比)，在攪拌條件下通入干燥的氯化氫氣體至飽和，加熱回流使L-賴氨酸溶解，將此溶液放置過夜；然后減壓蒸餾除去過量的乙醇和氯化氫；最后用無水乙醚，進行賴氨酸乙酯鹽酸鹽的結(jié)晶；再經(jīng)過濾，洗滌，干燥得到賴氨酸乙酯鹽酸鹽淡黃色晶體；2、制備分子量為2000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇將25克的mPEG2000溶于干燥的二氯甲烷中，加入20克活化的二氧化錳，均勻混合后，室溫下攪拌過夜；過濾除去催化劑，通過減壓蒸去溶劑得到中間氧化產(chǎn)物；將得到的中間氧化產(chǎn)物溶于體積比為3％過氧化氫水溶液，反應(yīng)24小時后，通過Bio-Rad AG1*2樹脂柱，除去中性物質(zhì)，再用0.02M HCl洗脫，得到分子量為2000的羧甲基化的單甲氯聚乙二醇；3、制備純化的分枝型聚乙二醇1)將步驟1所得的賴氨酸乙酯鹽酸鹽與步驟2所得的分子量為2000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以1∶4的摩爾比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入過量的三乙胺，二環(huán)己基碳二亞胺，氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)24小時后，過濾除去所生成的二環(huán)己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀產(chǎn)物9.5克；將得到的白色粉末狀產(chǎn)物溶于1N NaOH，加入氯化鈉，反應(yīng)1-2小時后，用鹽酸將溶液調(diào)至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取5次，將萃取所得的有機相合并，并用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸餾濃縮至50毫升后，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀的物質(zhì)9.0克；MALDI-TOF(圖3)譜圖表明此產(chǎn)物是分子量為2000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇和分子量為4000的羧甲基化的單甲氯聚乙二醇的混合物；GPC譜圖表明分枝型PEG的產(chǎn)率為61％；2)將上述所得產(chǎn)物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50層析柱進行以水為洗脫液的洗脫分離，每管10毫升收集組分；將相對于分枝型聚乙二醇的組分合并，濃縮，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇結(jié)晶，得到純化的目的產(chǎn)物分枝型聚乙二醇。
目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)可通過MALDI-TOF(圖3)譜圖和1H NMR(圖6)證實。實施例3，用本發(fā)明的方法制備一種分枝型聚乙二醇，其步驟為1、制備賴氨酸乙酯鹽酸鹽將L賴氨酸溶于無水乙醇，在攪拌條件下通入干燥的氯化氫氣體至飽和，加熱回流使L-賴氨酸溶解，將此溶液放置過夜；然后減壓蒸餾除去過量的乙醇和氯化氫；最后用無水乙醚，進行賴氨酸乙酯鹽酸鹽的結(jié)晶；再經(jīng)過濾，洗滌，干燥得到賴氨酸乙酯鹽酸鹽淡黃色晶體；2、制備分子量為750的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇將mPEG750溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化錳，均勻混合后，室溫下攪拌過夜；過濾除去催化劑，通過減壓蒸去溶劑得到中間氧化產(chǎn)物；將得到的中間氧化產(chǎn)物溶于體積比為3％過氧化氫水溶液，反應(yīng)24小時后，通過Bio-Rad AG1*2樹脂柱，除去中性物質(zhì)，再用0.02M HCl洗脫，得到分子量為750的羧甲基化的單甲氯聚乙二醇；3、制備純化的分枝型聚乙二醇1)將步驟1所得的賴氨酸乙酯鹽酸鹽與步驟2所得的分子量為5000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以1∶2的摩爾比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入過量的三乙胺，二環(huán)己基碳二亞胺，氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)24小時后，過濾除去所生成的二環(huán)己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀產(chǎn)物；將得到的白色粉末狀產(chǎn)物溶于1N NaOH，加入氯化鈉，反應(yīng)1-2小時后，用鹽酸將溶液調(diào)至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取3次，將萃取所得的有機相合并，并用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸餾濃縮，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀的物質(zhì)；MALDI-TOF(圖3)譜圖表明此產(chǎn)物是分子量為750的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇和分子量為15000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇的混合物；GPC譜圖表明分枝型PEG的產(chǎn)率為61％；2)將上述所得產(chǎn)物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50層析柱進行以水為洗脫液的洗脫分離，每管10毫升收集組分；將相對于分枝型聚乙二醇的組分合并，濃縮，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇結(jié)晶，得到純化的目的產(chǎn)物分枝型聚乙二醇。
目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)可通過MALDI-TOF(圖3)譜圖和1H NMR(圖6)證實。
實施例4，用本發(fā)明的方法制備一種分枝型聚乙二醇，其步驟為1、制備賴氨酸乙酯鹽酸鹽將L賴氨酸溶于無水乙醇，在攪拌條件下通入干燥的氯化氫氣體至飽和，加熱回流使L-賴氨酸溶解，將此溶液放置過夜；然后減壓蒸餾除去過量的乙醇和氯化氫；最后用無水乙醚，進行賴氨酸乙酯鹽酸鹽的結(jié)晶；再經(jīng)過濾，洗滌，干燥得到賴氨酸乙酯鹽酸鹽淡黃色晶體；2、制備分子量為10000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇將mPEG10000溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化錳，均勻混合后，室溫下攪拌過夜；過濾除去催化劑，通過減壓蒸去溶劑得到中間氧化產(chǎn)物；將得到的中間氧化產(chǎn)物溶于體積比為3％過氧化氫水溶液，反應(yīng)24小時后，通過Bio-Rad AG1*2樹脂柱，除去中性物質(zhì)，再用0.02M HCl洗脫，得到分子量為10000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇；3、制備純化的分枝型聚乙二醇1)將步驟1所得的賴氨酸乙酯鹽酸鹽與步驟2所得的分子量為10000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以1∶2的摩爾比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入過量的三乙胺，二環(huán)己基碳二亞胺，氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)24小時后，過濾除去所生成的二環(huán)己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀產(chǎn)物；將得到的白色粉末狀產(chǎn)物溶于1N NaOH，加入氯化鈉，反應(yīng)1-2小時后，用鹽酸將溶液調(diào)至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取4次，將萃取所得的有機相合并，并用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸餾濃縮，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀的物質(zhì)；
MALDI-TOF(圖3)譜圖表明此產(chǎn)物是分子量為10000的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇和分子量為20000的分支型聚乙二醇的混合物；GPC譜圖表明分枝型PEG的產(chǎn)率為61％；2)將上述所得產(chǎn)物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50層析柱進行以水為洗脫液的洗脫分離，每管10毫升收集組分；將相對于分枝型聚乙二醇的組分合并，濃縮，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇結(jié)晶，得到純化的目的產(chǎn)物分枝型聚乙二醇。
目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)可通過MALDI-TOF(圖3)譜圖和1H NMR(圖6)證實。
權(quán)利要求
1.一種制備分枝型聚乙二醇的方法，其工藝步驟如下1)制備氨基酸乙酯鹽酸鹽將氨基酸溶于無水乙醇，在攪拌條件下通入干燥的氯化氫氣體至飽和，加熱回流使氨基酸溶解，將此溶液放置過夜；然后減壓蒸餾除去過量的乙醇和氯化氫；最后用無水乙醚，進行賴氨酸乙酯鹽酸鹽的結(jié)晶；再經(jīng)過濾，洗滌，干燥得到賴氨酸乙酯鹽酸鹽淡黃色晶體；2)制備羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇將mPEG溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化錳，均勻混合后，室溫下攪拌過夜；過濾除去催化劑，通過減壓蒸去溶劑得到中間氧化產(chǎn)物；將得到的中間氧化產(chǎn)物溶于體積比為3％過氧化氫水溶液，反應(yīng)24小時后，通過Bio-Rad AGi*2樹脂柱，除去中性物質(zhì)，再用0.02M HCl洗脫，得到羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇；3)制備純化的分枝型聚乙二醇(1)將步驟1所得的氨基酸乙酯鹽酸鹽與步驟2所得的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以1∶2-4的摩爾比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入過量的三乙胺，二環(huán)己基碳二亞胺，氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)24小時后，過濾除去所生成的二環(huán)己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀產(chǎn)物；將得到的白色粉末狀產(chǎn)物溶于1N NaOH，加入氯化鈉，反應(yīng)1-2小時后，用鹽酸將溶液調(diào)至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取至少3次，將萃取所得的有機相合并，并用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸餾濃縮，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末狀的物質(zhì)；(2)將上述所得產(chǎn)物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50層析柱進行以水為洗脫液的洗脫分離，每管10毫升收集組分；將相對于分枝型聚乙二醇的組分合并，濃縮，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇結(jié)晶，得到純化的分枝型聚乙二醇。
2.按權(quán)利要求1所述的制備分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于，所述的氨基酸為L-賴氨酸、二氨基或多氨基有機酸。
3.按權(quán)利要求1所述的制備分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于，所述的mPEG為分子量是750-10000之間的聚合物。
全文摘要
本發(fā)明提供的制備分枝型聚乙二醇的方法，步驟如下先分別制備氨基酸乙酯鹽酸鹽和羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇，將其均勻混配后，再依次加入TEA，DCC，NHS，反應(yīng)得到的產(chǎn)物脫保護后，再經(jīng)過凝膠過濾分離，即可得到分枝型聚乙二醇，分枝型聚乙二醇應(yīng)用廣泛，即可修飾蛋白質(zhì)等大分子，也可修飾小分子藥物及表面；本發(fā)明的方法簡單，易操作，而且只需保護賴氨酸的羧基，不需要活化的氨基和羧基；反應(yīng)在室溫進行，不需控制pH值；所用原料和試劑價格便宜；產(chǎn)率高達(dá)65％左右。
文檔編號C08G65/34GK1461762SQ02120740
公開日2003年12月17日 申請日期2002年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月30日
發(fā)明者蘇志國, 何明磊 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所