專利名稱：Ix型膠原蛋白和嵌合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型人膠原蛋白、編碼這些新型膠原蛋白的多聚核苷酸序列以及這些新型蛋白在疾病的診斷和治療方面的用途。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及編碼人α3(IX)膠原蛋白及其衍生物多聚核苷酸、IX型膠原蛋白與II和/或XI型膠原蛋白亞基的融合蛋白及其衍生物、以及這些蛋白和多聚核苷酸作為診斷和治療劑的用途。
II.背景技術(shù)膠原原纖維、蛋白聚糖聚集體和糖蛋白是軟骨胞外基質(zhì)的重要組分，它們集體地抵抗關(guān)節(jié)動作時產(chǎn)生的壓力、拉力和剪切力。Heinegird和Oldberg，F(xiàn)ASEB J.32042-2051(1989)；Mayne和Brewton，軟骨退化基礎(chǔ)和臨床方面(Cartilage DegradationBasic and ClinicalAspects)(Woessner，J.F.和Howell，D.S.eds.)Marcel Dekker，Inc.，NewYork，第81-108頁(1993)。影響這些各種基質(zhì)組分的生物合成、裝配或它們之間相互作用的軟骨基質(zhì)基因突變可能為軟骨基質(zhì)退化和喪失正常軟骨功能的原因之一。人膠原蛋白突變已經(jīng)表現(xiàn)出引起一系列軟骨發(fā)育異常，嚴(yán)重程度從致命的II型軟骨成長不全到Stickler關(guān)節(jié)眼病和早發(fā)性家族性骨關(guān)節(jié)炎(由Spranger等綜述，Eur.J Pediatr.15356-65(1994)；Vikkula等，Ann.Medicine 26107-114(1994)；Prockop和Kivirikko，Annu.Rev.Biochem.64403-434(1995))。
對IX型膠原蛋白的分析證明該分子位于透明軟骨和包括玻璃體液在內(nèi)的其他組織的含有II型膠原原纖維的表面(由Brewton和Mayne綜述，胞外基質(zhì)的裝配和結(jié)構(gòu)(Extracellular Matrix Assembly andStructure)(Yurchenco，P.D.，Birk，D.E.，Mecham.R.P.，eds)AcademicPress，Inc.，San Diego，第129-170頁(1994))。IX型膠原蛋白是一異三聚體，由三個多肽亞基組成α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)，這些多肽亞基是獨特基因的產(chǎn)物，含有交替的非三股螺旋或非膠原域(NC1-4)和三股螺旋或膠原域(COL1-3)。這三個多肽亞基以a(IX)α2(IX)α3(IX)的結(jié)構(gòu)裝配為成熟的膠原蛋白分子(van der Rest和Mayne，膠原蛋白類型的結(jié)構(gòu)和功能(Structure and Function of Collagen Types)(Mayne，R.和Burgeson，R.，eds.)學(xué)術(shù)出版社，Orlando，F(xiàn)L，第195-221頁(1987)。除II型和IX型膠原蛋白外，多種來源的透明軟骨也含有顯著量的至少三種其它膠原蛋白分子，即VI、X和XI型。Thomas等，Ann.Rheumat.Diseases 53488-496(1994)；Mayne和Brewton，軟骨退化基礎(chǔ)和臨床方面(Cartilage DegradationBasic and Clinical Aspects)(Woessner，J.F.和Howell，D.S.eds.)Marcel Dekker，Inc.，New York，第81-108頁(1993)。XI型膠原蛋白與IX型膠原蛋白類似，是一異三聚體，由三個不同的多肽亞基組成，即α1(XI)、α2(XI)和α3(XI)。從牛關(guān)節(jié)軟骨中也分離出XII型和XIV型膠原蛋白。
天然IX型膠原蛋白分子高度特異性地與II型膠原蛋白分子相互作用，使得NC1、COL1、NC2、COL2和NC3域沿著膠原原纖維的表面分布。IX型膠原蛋白和II型膠原蛋白間的相互作用被由特定賴氨酸殘基形成的多個共價交聯(lián)所穩(wěn)定。參見van der Rest和Mayne，J.Biol.Chem.2631615-1618(1988)；Shimokomaki等，Ann.N.Y. Acad.Sci.5801-7(1990)；Wu等，J.Biol.Chem.26723007-23014(1992)。通過旋轉(zhuǎn)投影法可以容易地見到IX型膠原蛋白沿II型膠原原纖維表面的周期性定位，因為膠原域COL3和大球形域NC4從該原纖維的表面突出。Vaughan等，J.Cell Biol.106991-997(1988)；Shimokomaki等，Ann.N.Y.Acad.Sci.5801-7(1990)。與之對照，XI型膠原蛋白異三聚體據(jù)認(rèn)為位于該原纖維的中心部位。Mendler等，J.Cell Biol.108191-97(1989)。
人II型膠原蛋白基因和三種人XI型膠原蛋白基因的克隆和測序已有報道。完整的人II型膠原蛋白基因序列由Baldwin等報道，Biochem.J.262521-28(1989)，和由Su等報道，Nucleic Acids Res.179473(1989)。在這三種XI型膠原蛋白亞基中，據(jù)信α3(XI)鏈?zhǔn)荌I型膠原蛋白基因產(chǎn)物。Bernard等，J.Biol.Chem.26317159-66(1988)公開了號稱編碼前α1(XI)膠原蛋白的cDNA序列。編碼α2(XI)基因的序列由Kimura等報道，J.Biol.Chem.26413910-16(1989)。
編碼IX型膠原蛋白的三條鏈的基因是影響關(guān)節(jié)和/或玻璃體液的軟骨發(fā)育異常和退化性失調(diào)的優(yōu)秀候選物，因為IX型膠原蛋白在這二種組織中都是重要的結(jié)構(gòu)分子。因此，大量研究工作的目標(biāo)是克隆編碼這三種IX型膠原蛋白亞基的基因。Muragaki等，Eur.J.Biochem.192703-8(1990)提出人α1(IX)基因兩個交替轉(zhuǎn)錄物的完整cDNA序列。大多數(shù)人α2(IX)膠原蛋白cDNA由Perala等報道，F(xiàn)EBS Lett.319177-80(1993)，由Warman完成，Genomics 23158-62(1994)。直到最近才得到完整的人α3(IX)亞基序列。正如同時提交的申請(待轉(zhuǎn)讓的美國專利申請)所描述的，R.W.Brewton和R.Mayne博士已經(jīng)鑒定和記述了對應(yīng)于人α3(IX)全長度序列的特征。Brewton和Mayne的臨時申請內(nèi)包含的資料通過引用結(jié)合到本文中。
使用轉(zhuǎn)基因鼠的實驗提示IX型膠原蛋白在保持透明軟骨的完整性方面起重要的作用。表達(dá)攜帶α1(IX)鏈中一個缺失的小基因(Nakata等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.902870-2874(1993))或攜帶分裂的α1(IX)基因(Fessler等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.915070-5074(1994))的動物發(fā)生類似于人類骨關(guān)節(jié)炎的退化性關(guān)節(jié)疾病。IX型膠原蛋白在人類疾病中的重要性已被鑒別出的一個COL9A2內(nèi)的突變所證實(Muragaki等，已提交申請，(1995))，該突變導(dǎo)致跳過外顯子3從而導(dǎo)致多發(fā)性骨骺發(fā)育異常(EDM2)。
III.本發(fā)明摘要本發(fā)明涉及新型膠原蛋白衍生蛋白和編碼它們的多聚核苷酸序列。本發(fā)明也描述了由膠原蛋白合成或結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的疾病的診斷方法。
本發(fā)明的一個方面是發(fā)現(xiàn)可以制備人IX型膠原蛋白的融合蛋白，其中人IX型膠原蛋白亞基與人II型膠原蛋白和/或人XI型膠原蛋白亞基共價連接。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過將人IX型膠原蛋白亞基的多聚核苷酸編碼序列與人II型膠原蛋白和/或人XI型膠原蛋白的多聚核苷酸編碼序列在框架中連接起來，以嵌合體形式重組產(chǎn)生該融合蛋白。將此嵌合編碼序列插入一表達(dá)載體并用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。然后誘導(dǎo)該宿主細(xì)胞表達(dá)該嵌合編碼序列，因而產(chǎn)生該嵌合膠原融合蛋白。這些融合蛋白可用于治療膠原相關(guān)疾病和狀態(tài)。
本發(fā)明也部分涉及編碼本發(fā)明嵌合膠原蛋白的核苷酸序列和表達(dá)載體。
本發(fā)明也公開了與膠原蛋白產(chǎn)生或?qū)δz原蛋白自身免疫性的異常有關(guān)的疾病或狀態(tài)的治療方法。這些異?？梢詫?dǎo)致例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性聽覺疾病、由細(xì)菌或病毒感染引起的軟骨炎癥(例如萊姆病)、寄生蟲病、滑囊炎、角膜病和關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎(脊柱融合)。本發(fā)明的新蛋白質(zhì)用于與膠原蛋白相關(guān)疾病的治療方法中。
IV.附圖簡述

圖1.在非還原性8％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中重組人IX型膠原蛋白α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)異三聚體的鹽分級分離圖2.在還原性10％SDS-PAGE中重組人IX型膠原蛋白α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)異三聚體的鹽分級分離V.本發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明涉及編碼IX型膠原蛋白衍生物與II型膠原蛋白和/或XI型膠原蛋白的重組融合蛋白的多聚核苷酸和核酸序列以及這些融合蛋白。本發(fā)明也包括使用這些膠原融合蛋白治療與膠原蛋白有關(guān)的疾病和狀態(tài)的方法。
A.定義名詞“膠原蛋白亞基”指由單個基因編碼的膠原蛋白的一個亞基的氨基酸序列以及衍生物，包括缺失衍生物、保守置換等。
“融合蛋白”是一由不同蛋白的肽序列共價連接起來的蛋白。
名詞“嵌合體”或“嵌合的”指通過將二個或更多的膠原蛋白亞基的多聚核苷酸編碼序列可操作地在框架中連接并將連接的編碼序列作為單個肽鏈重組表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白。
“活性人IX型膠原蛋白”指天然的三聚體蛋白復(fù)合物，可以重組產(chǎn)生。
本文使用的短語“嚴(yán)格條件”指那些雜交條件，即(1)采用低離子強度和高溫進行清洗，例如0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS，溫度50℃；(2)在雜交過程中采用諸如甲酰胺之類的變性劑，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％(體積/體積)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5含750mMNaCl、75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸鈉緩沖液，溫度42℃；或(3)采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl，0.075M焦磷酸鈉，5×Denhardt′s溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，溫度42℃，于42℃在0.2×SSC和0.1％SDS中清洗。
按照本發(fā)明，任何編碼要求保護的融合蛋白氨基酸序列的核酸序列均可以用于產(chǎn)生指導(dǎo)該融合蛋白表達(dá)的重組分子。
本文使用與膠原蛋白有關(guān)的“純化”一詞表示所指分子的環(huán)境中實際上不存在其它生物大分子，例如多聚核苷酸、蛋白質(zhì)等等。本文使用的“純化”優(yōu)選表示存在至少95％、更優(yōu)選至少99.8％的所指生物大分子(但是水、緩沖液和其它小分子，特別是分子量小于1000道爾頓的分子可以存在)。本文中所用的“分離”一詞指一蛋白分子不僅與存在于該蛋白天然來源的其它蛋白質(zhì)分離，而且也與其它蛋白質(zhì)分離，最好指僅僅在溶劑、緩沖液、離子、或其它在同一溶液中正常存在的其它組分存在下發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。名詞“分離”和“純化”不包括存在于其天然來源之中的蛋白質(zhì)。
B.本發(fā)明的膠原融合蛋白的表達(dá)1.編碼序列按照本發(fā)明，可以用編碼IX型、II型和XI型膠原蛋白、或其功能等價物的多聚核苷酸順序，產(chǎn)生指導(dǎo)IX型膠原蛋白亞基與II型膠原蛋白和/或XI型膠原蛋白亞基的融合蛋白，或其功能等價物在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組DNA分子。這類膠原蛋白多聚核苷酸序列以及其它選擇性地與這類膠原蛋白多聚核苷酸或其互補物的至少一部分雜交的多聚核苷酸，也可以用于核酸雜交測定、Southern和Northern印跡分析等。
由于遺傳密碼的固有簡并性，編碼實際上相同或功能相同的氨基酸序列的其它DNA序列亦可用于本發(fā)明克隆和表達(dá)這些膠原蛋白的實踐之中。這類DNA序列包括在嚴(yán)格條件下可以與適當(dāng)?shù)娜四z原蛋白序列雜交的那些序列。
可以按照本發(fā)明使用的改變的DNA序列包括不同核苷酸殘基的缺失、添加或置換，它們產(chǎn)生的序列編碼相同或功能相同的基因產(chǎn)物。該基因產(chǎn)物本身在一膠原蛋白序列中可以包括氨基酸殘基的缺失、添加或置換，導(dǎo)致沉默變化從而產(chǎn)生同等功能的膠原蛋白。這類氨基酸置換可以在相關(guān)殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或兩親性質(zhì)相似的基礎(chǔ)上進行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具相似親水性值、帶有無電荷極性頭基團的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的DNA序列可以進行遺傳工程以改變該膠原蛋白編碼序列使其具有各種末端，包括但不局限于修飾該基因產(chǎn)物加工和表達(dá)的改變。例如，交替分泌信號可代替天然的人分泌信號，并且/或者采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)如定點誘變引入突變，以插入新的限制位點，改變糖基化方式、磷酸化等。另外，當(dāng)在非人體細(xì)胞中表達(dá)時，可以在任何氨基酸三聯(lián)密碼子的沉默位置修飾編碼本發(fā)明膠原蛋白的多聚核苷酸，以更好地符合特定宿主生物對密碼子的選擇性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以將膠原蛋白序列連接到異源序列上以編碼融合蛋白。例如，可以對一融合蛋白做工程改造，使其在α3(IX)膠原蛋白序列和異源蛋白序列之間有一切割位點，以使該α3(IX)膠原蛋白可以與該異源部分切開。
在一特別優(yōu)選的實施方案中，通過將編碼IX型膠原蛋白亞基或其衍生物的序列與編碼II型膠原蛋白和/或XI型膠原蛋白亞基的序列連接，構(gòu)建嵌合融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有幾種現(xiàn)成技術(shù)可以用于將IX型膠原蛋白亞基編碼序列的全部或任何部分與II型和XI型膠原蛋白的編碼序列的全部或任何部分相連接。例如，可以在適當(dāng)選擇的限制性核酸內(nèi)切酶位點將編碼序列連接起來。然而，為確保選定膠原蛋白的編碼順序連接在正確的翻譯框架中，有必要用位點特異性誘變對限制性位點進行工程改造。連接二個或多個多聚核苷酸序列的更優(yōu)越的方法是按照Ausubel等，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.，(1990)第3.17.1節(jié)所述，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和適當(dāng)設(shè)計的引物。采用該方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以以任何構(gòu)型連接二個或更多的多聚核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可以用本領(lǐng)域的已知化學(xué)方法全合成或部分合成本發(fā)明膠原蛋白的編碼序列。參見例如Caruthers等，Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7215-233(1980)；Crea和Horn，Nuc.Acids Res.9(10)2331(1980)；Matteucci和Caruthers，Tetrahedron Letters 21719(1980)；和Chow和Kempe，Nuc.Acids Res.9(12)2807-2817(1981)。或者，可以采用化學(xué)方法至少部分合成所需的膠原蛋白氨基酸序列來制備蛋白本身。例如，用固相技術(shù)合成肽，將肽從樹脂切下，用制備型高效液相色譜純化肽。(例如參見Creighton，蛋白、結(jié)構(gòu)和分子原理(Proteins，Structures And Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第50-60頁(1983)?？梢酝ㄟ^氨基酸分析或測序確認(rèn)合成肽的組成(例如埃德曼降解法；參見Creighton，蛋白，結(jié)構(gòu)和分子原理(Proteins，Structures And Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第34-49頁(1983)。
為表達(dá)本發(fā)明的膠原蛋白，將編碼該膠原蛋白或功能等價物的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即包含該插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需元件的載體。
2.表達(dá)系統(tǒng)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含本發(fā)明膠原蛋白的膠原蛋白編碼序列和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。參見例如，Maniatis等，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室，N.Y.(1989)和Ausubel等，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法(Current Protocols in MolecularBiology)，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)描述的技術(shù)。
可以使用多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)膠原蛋白編碼序列。它們包括但不限于微生物，如用重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、包含一膠原蛋白編碼序列的質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體；用包含一膠原蛋白編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌；用包含本發(fā)明膠原蛋白編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用包含一膠原蛋白序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或用包含一膠原蛋白序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動物細(xì)胞系統(tǒng)。另外，本發(fā)明的膠原蛋白可以在非人類轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)，其中可以從該轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中回收所需的膠原蛋白產(chǎn)物。這些系統(tǒng)的表達(dá)元件在其強度和專一性方面變化。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，任何適用的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子，都可以用于表達(dá)載體中。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用諸如噬菌體1的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜種啟動子)之類的誘導(dǎo)型啟動子；當(dāng)在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用諸如桿狀病毒多面體啟動子；當(dāng)在植物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用得自植物細(xì)胞基因組的啟動子(例如，熱休克啟動子；RUBISCO小亞基啟動子；葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動子)或得自植物病毒的啟動子(例如CaMV的35S RNA啟動子；TMV外殼蛋白啟動子)；當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用得自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或得自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)；當(dāng)制備包含多拷貝膠原蛋白DNA的細(xì)胞系時，可以使用帶有適當(dāng)選擇性標(biāo)記的以SV40、BPV和EBV為基礎(chǔ)的載體。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)所表達(dá)膠原蛋白的用途，優(yōu)選一些表達(dá)載體。例如，當(dāng)欲生產(chǎn)大量本發(fā)明膠原蛋白以制備抗體時，則可能所需的是指導(dǎo)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的高水平表達(dá)的載體。這類載體包括但不局限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，EMBO J.21791(1983))，其中可以將膠原蛋白編碼序列連接到該載體具有l(wèi)ac Z編碼區(qū)的框架中以產(chǎn)生雜種AS-lac Z蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.133101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.2645503-5509(1989))等等。亦可以用pGEX載體以與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白表達(dá)外源多肽?？傊?，這類融合蛋白可以是可溶性并可易于通過吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖顆粒而后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫的方法從溶胞中純化。將pGEX載體設(shè)計為含有凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶酶切位點，以使所需的克隆多肽能從GST部解釋放出來。
優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)。在酵母中，可以使用一些包含組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體。參見綜述，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第二卷，Ed.Ausubel等，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，第13章(1988)；Grant等，酵母表達(dá)和分泌載體(Expression and Secretion Vector fod Yeast)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，Ed.Wu & Grossman，學(xué)術(shù)出版社，N.Y.153516-544(1987)；Glover，DNA克隆(DNA Cloning)，第II卷，IRL出版社，Wash.，D.C.，第3章(1986)；和Bitter，酵母屬酵母中的異源基因表達(dá)(Heterologous Gene Expression in Yeast)，酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)，Eds.Berger和Kimmer，學(xué)術(shù)出版社，N.Y.152673-684(1987)；和酵母屬酵母的分子生物學(xué)(The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces)，Eds.Strathern等，冷泉港出版社，第I卷和第II卷(1982)。
用于克隆和表達(dá)本發(fā)明膠原蛋白的特別優(yōu)選的系統(tǒng)是畢赤酵母屬酵母的宿主細(xì)胞。非酵母屬酵母諸如巴斯德畢赤酵母在放大規(guī)模生產(chǎn)高產(chǎn)量的重組蛋白方面似乎有特別的優(yōu)點。另外，InvitrogenCorporation(San Diego，CA)有市售的畢赤酵母表達(dá)藥盒。
在諸如巴斯德畢赤酵母的嗜甲醇(methylotropic)酵母中有一些甲醇反應(yīng)性基因，每個這種基因的表達(dá)都由甲醇反應(yīng)調(diào)控區(qū)(也稱為啟動子)控制。任何這種甲醇反應(yīng)性啟動子都適用于本發(fā)明的實施中。特定的調(diào)控區(qū)的實例包括得自巴斯德畢赤酵母AOX1的伯醇氧化酶基因啟動子、得自巴斯德畢赤酵母AXO2的仲醇氧化酶基因啟動子、得自巴斯德畢赤酵母(DAS)的二羥丙酮合酶基因啟動子、得自巴斯德畢赤酵母的P40基因啟動子、得自巴斯德畢赤酵母的過氧化氫酶基因啟動子等等之類。
通過嚴(yán)格調(diào)控的AOX1基因啟動子可以得到在巴斯德畢赤酵母中的典型表達(dá)。參見Ellis等，Mol.Cell.Biol.51111(1985)和編號為4,855,231的美國專利。在向培養(yǎng)物中加入甲醇后可以誘導(dǎo)該啟動子產(chǎn)生高水平的重組蛋白。通過對這些細(xì)胞的后續(xù)調(diào)控，本文所述的本發(fā)明膠原蛋白基因在下述條件下得到了表達(dá)，即該重組蛋白被脯氨酰4-羥化酶充分羥基化，因此，該重組蛋白可以折疊成對該蛋白形成原纖維的正常生物學(xué)功能所必需的穩(wěn)定螺旋。
另一個特別優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)利用嗜甲醇酵母多形漢遜酵母。在甲醇中的生長導(dǎo)致誘導(dǎo)產(chǎn)生甲醇代謝的關(guān)鍵酶，即MOX(甲醇氧化酶)、DAS(二羥丙酮合酶)和FMHD(甲酸脫氫酶)。這些酶占細(xì)胞總蛋白的比例可達(dá)30-40％。編碼MOX、DAS和FMDH生產(chǎn)的基因由很強的啟動子控制，這些啟動子在甲醇里生長時被誘導(dǎo)、在葡萄糖里生長時被抑制。這三個啟動子的任何一個或全部都可以用于得到異源基因在多形漢遜酵母中高水平表達(dá)。將編碼本發(fā)明膠原蛋白的基因克隆入一個在誘導(dǎo)型多形漢遜酵母啟動子控制下的表達(dá)載體中。如果需要該產(chǎn)物分泌，將一編碼酵母分泌信號(例如釀酒酵母前原接合因子α1)序列的多聚核苷酸在框架中與本發(fā)明膠原蛋白的編碼序列融合。該表達(dá)載體最好包含一營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因，諸如URA3或LEU2，該基因可以用于互補營養(yǎng)缺陷型宿主的缺陷。
然后采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母宿主細(xì)胞。多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化的有趣和有用的特征是多達(dá)100個拷貝的表達(dá)載體自發(fā)地整合進入基因組中。在大多數(shù)情況下，整合的DNA形成了展示頭-尾布局的多體。整合的外源DNA在幾個重組菌株里甚至在非選擇條件下表現(xiàn)出有絲分裂穩(wěn)定。這種高拷貝整合現(xiàn)象進一步增加了該系統(tǒng)的高產(chǎn)率潛能。
在使用植物表達(dá)載體的情況下，編碼本發(fā)明膠原蛋白的序列的表達(dá)可以由許多啟動子的任何一個所驅(qū)動。例如，可以使用病毒啟動子如CaMV 35S RNA和19S RNA啟動子(Brisson等，Nature 310511-514(1984)，或TMV外殼蛋白啟動子(Takamatsu等，EMBO J.6307-311(1987))；或者，可以使用植物啟動子如RUBISCO小亞基啟動子(Coruzzi等，EMBO J.31671-1680(1984)；Broglie等，Science 224838-843(1984)；或可以使用熱休克啟動子如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，Mol.Cell.Biol.6559-565(1986)。可以使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等將這些構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞。這類技術(shù)的綜述參見例如Weissbach & Weissbach，植物分子生物學(xué)方法(Methods for Plant Molecular Biology)，學(xué)術(shù)出版社，NY.第VIII節(jié)，第421-463頁(1988)；和Grierson & Corey，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)，第二版，Blackie，London，第7-9章(1988)。
可以用來表達(dá)本發(fā)明膠原蛋白的另一個表達(dá)系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在一個這種系統(tǒng)中，使用苜蓿銀紋衣蛾核型多角體病毒(nuclearpolyhidrosis rvirus)(AcNPV)作為載體表達(dá)外源基因。該病毒在草地粘蟲細(xì)胞中生長?？梢园驯景l(fā)明膠原蛋白的編碼序列克隆到該病毒的非必需區(qū)(例如多面體基因)并置于AcNPV啟動子(例如多面體啟動子)的控制之下。膠原蛋白編碼基因的成功插入將導(dǎo)致多面體基因的失活并產(chǎn)生非內(nèi)涵重組病毒(例如缺失由多面體基因編碼的蛋白性外殼的病毒)。然后使用這些重組病毒感染草地粘蟲細(xì)胞，其中插入的基因被表達(dá)。(例如參見Smith等，J.Virol.46584(1983)；Smith，美國專利編號4,215,051)。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用一些基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在使用腺病毒做為表達(dá)載體的情況下，可以將本發(fā)明膠原蛋白的編碼序列與一腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體連接，例如晚期啟動子和三分前導(dǎo)序列。然后，可以將此嵌合基因通過體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必需區(qū)(例如E1或E3區(qū))會產(chǎn)生一活的并能在受感染宿主中表達(dá)膠原蛋白的重組病毒。(例如參見Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)813655-3659(1984))?；蛘?，可以使用痘苗7.5K啟動子。(參見例如Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)797415-7419(1982)；Mackett等，J.Virol.49857-864(1984)；Panicali等，Proc.Natl.Acad Sci.794927-4931(1982)。
插入的膠原蛋白編碼序列的有效翻譯也可能需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在整個膠原蛋白基因包括其起始密碼子和相鄰序列都插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的情況下，可以不需要額外的翻譯控制信號。然而，在僅插入部分膠原蛋白編碼序列的情況下，則必須提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。另外，該起始密碼子必須與膠原蛋白編碼序列的閱讀框架一致，以確保整個插入片段的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以有多種來源，包括天然和合成的。可以通過包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等增強表達(dá)的效率。(參見Bittner等，酶學(xué)方法(Methods inEnzymol.) 153516-544(1987))。
本發(fā)明膠原蛋白重組生產(chǎn)的一個優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中可以從該轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中回收所需的膠原蛋白。通過將編碼本發(fā)明膠原蛋白的DNA序列可操作地與一啟動子和其它所需或可選的能實現(xiàn)在乳腺內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列連接起來可以構(gòu)建這種系統(tǒng)。同樣，采用可在產(chǎn)生靶乳蛋白的乳腺細(xì)胞中運作的合適表達(dá)系統(tǒng)，尤其是美國專利申請08/037,728公開的表達(dá)載體，可以在靶細(xì)胞中同時產(chǎn)生所需的或可選的翻譯后酶。
為在乳汁中表達(dá)，選擇的啟動子最好來自豐富乳汁特異性蛋白之一，例如αS1-酪蛋白、或b-乳球蛋白。例如，已成功地將αS1-酪蛋白的5′和3′調(diào)控序列用于表達(dá)人乳鐵傳遞蛋白cDNA，同樣地，b-乳球蛋白啟動子已實現(xiàn)了在羊產(chǎn)乳汁細(xì)胞中表達(dá)人抗胰蛋白酶基因片段。Wright等，Biotechnology 9830-833(1991)。在轉(zhuǎn)基因山羊中，已使用乳清酸啟動子表達(dá)人組織纖溶酶原激活因子，導(dǎo)致在該轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中分泌人組織纖溶酶原激活因子。Ebert等，Biotechnology 9835-838(1991)。采用這類表達(dá)系統(tǒng)，得到了將本發(fā)明膠原蛋白分泌到乳汁中的動物。采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的方法，可以簡單地將編碼所需膠原蛋白鏈的基因連接到在所選動物物種乳腺細(xì)胞中起作用的適當(dāng)?shù)目刂菩蛄猩?。類似地?gòu)建所需翻譯后酶編碼基因的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明膠原蛋白最好作為分泌蛋白表達(dá)。當(dāng)用于表達(dá)這些蛋白的工程細(xì)胞是非人類宿主細(xì)胞時，將人膠原蛋白分泌信號肽用一更有效地被宿主細(xì)胞分泌導(dǎo)向機制識別的替代分泌信號肽取代一般更為優(yōu)越。適當(dāng)?shù)姆置谛盘栃蛄袑Φ玫讲溉閯游锘虻淖罴颜婢磉_(dá)特別重要。例如，在嗜甲醇酵母中，可以將編碼閱讀框架內(nèi)釀酒酵母a-接合因子前原序列DNA序列插到該編碼序列的氨基酸末端。該aMF前原序列是包含在aMF前體分子內(nèi)的前導(dǎo)序列，它包對蛋白水解處理和分泌必需的賴氨酸-精氨酸編碼序列(參見例如Brake等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，814642(1984))。
另外，可以選擇調(diào)控插入序列表達(dá)或以特定方式修飾和加工該基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。這類對蛋白產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可能對該蛋白的功能很重要。不同宿主細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾有特征性和特異性的機制。可以選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保對表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。為達(dá)到這個目的，可以使用擁有對初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行正確加工和對該基因產(chǎn)物進行糖基化和磷酸化的真核宿主細(xì)胞。這類哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。
另外，可以對宿主細(xì)胞進行工程改造，使其表達(dá)確保膠原蛋白分子正確加工的各種酶。例如，可以將脯氨酰4-羥化酶基因與膠原蛋白基因在宿主細(xì)胞中共表達(dá)。
為長期高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白，最好是穩(wěn)定表達(dá)。例如，可以對穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明膠原蛋白的細(xì)胞系進行工程化改造。不采用包含病毒復(fù)制起點的表達(dá)載體，而用受適當(dāng)表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點等等)控制的膠原蛋白編碼DNA和一個選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。導(dǎo)入外源DNA后，讓工程細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記賦予對選擇的抗性并使細(xì)胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合進其染色體中并生長形成細(xì)胞集落(foci)，該細(xì)胞集落隨后可以被克隆并擴增成細(xì)胞系。最好可以使用該方法對表達(dá)所需膠原蛋白的細(xì)胞系進行工程化改造。
可以使用一些選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰病毒疹胸苷激酶(Wigler等，Cell 11223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，Cell 22817(1980))基因等都可以分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞。而且，可以使用抗代謝物抗性作為以下的選擇基礎(chǔ)，dhfr，它賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 773567(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))；gpt，它賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))；neo，它賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.1501(1981))；和hygro，它賦予對潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30147(1984))。最近，已描述了其它的可選擇基因，即trpB，它使細(xì)胞利用吲哚而不是色氨酸；hisD，它使細(xì)胞利用組氨醇而不是組氨酸(Hartman和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047(1988))；和ODC(鳥氨酸脫羧酶)，它賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，即DFMO(McConlogueL.，現(xiàn)代分子生物學(xué)通訊(Current Communications in MolecularBiology)，冷泉港實驗室編輯)(1987)的抗性。
C.表達(dá)本發(fā)明膠原蛋白的轉(zhuǎn)染子或轉(zhuǎn)化子的鑒定和表達(dá)蛋白的純化可以通過至少四種常見方法鑒別包含該編碼序列并表達(dá)該生物活性基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)“標(biāo)記”基因功能出現(xiàn)與否；(c)以膠原蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)評價轉(zhuǎn)錄水平；和(d)通過免疫測定或其生物學(xué)活性檢測該基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，使用含有分別與膠原蛋白編碼序列或其部分或其衍生物同源的核苷酸序列的探針進行DNA-DNA或DNA-RNA雜交，可以探測插入該表達(dá)載體的膠原蛋白編碼序列的存在。
在第二種方法中，可以根據(jù)一定“標(biāo)記”基因功能(例如胸苷激酶活性、對抗生素抗性、氨甲蝶呤抗性、轉(zhuǎn)化表型、在桿狀病毒內(nèi)形成內(nèi)涵體等)的出現(xiàn)與否鑒定和選擇重組表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果該膠原蛋白編碼序列插入載體的某標(biāo)記基因序列內(nèi)，則可以通過缺少該標(biāo)記基因功能鑒定包含膠原蛋白編碼序列的重組細(xì)胞?；蛘撸梢詫⒛硺?biāo)記基因與該膠原蛋白序列串聯(lián)置于用于控制該膠原蛋白編碼序列表達(dá)的同一或不同啟動子的控制之下。響應(yīng)誘導(dǎo)或選擇的該標(biāo)記表達(dá)表明了該膠原蛋白編碼序列的表達(dá)。
在第三種方法中，可以通過雜交分析評價該膠原蛋白編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。例如，可以分離RNA并使用與膠原蛋白編碼序列或其特定部分同源的探針用Northern印跡法分析。或者，可以提取宿主細(xì)胞總核酸并檢測與這類探針的雜交。
在第四種方法中，可以用免疫學(xué)評價膠原蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，例如Western印跡、諸如放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫測定之類的免疫測定。
例如用層析法，將優(yōu)選分泌到培養(yǎng)基中的表達(dá)的本發(fā)明膠原蛋白純化至同質(zhì)性。在一個實施方案中，用大小排阻層析純化該重組膠原蛋白。然而，也可以使用本領(lǐng)域已知的其它純化技術(shù)，包括離子交換層析和反相層析。
D.本發(fā)明膠原蛋白和工程化細(xì)胞系的應(yīng)用1.抗體生產(chǎn)和篩選可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)該重組產(chǎn)生的膠原蛋白的表位的抗體。這類抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和用Fab片段表達(dá)文庫制備的片段。
為生產(chǎn)抗體，可以用膠原蛋白注射免疫各種的宿主動物，包括但不限于兔子、小鼠、大鼠等。根據(jù)宿主種可以使用各種佐劑增強免疫應(yīng)答，佐劑包括但不限于弗洛因德佐劑(完全和不完全)、無機凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳化劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和可能可用的人類佐劑，諸如如BCG(卡介苗)和粉刺棒狀桿菌制劑。
可以使用通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)提供生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)制備膠原蛋白的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于首先由Koehler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)(Nature，256495-497(1975))、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，Immunology Today，472(1983))；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.，802026-2030(1983)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體和癌治療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，AlanR.Liss，Inc.，第77-96頁(1985)。另外，可以使用通過將適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子基因與適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子基因一起剪接開發(fā)的生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855(1984)；Neuberger等，Nature，312604-608(1984)；Takeda等，Nature 314452-454(1985))。或者，可以使用生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)生產(chǎn)膠原蛋白特異性單鏈抗體。
可以使用已知技術(shù)制備包含缺失特定結(jié)合位點的抗體片段。例如，這種片段包括但不限可以由胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段和可以通過還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab片段。或者，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，Science 2461275-1281(1989))以快速容易地鑒定對所關(guān)注的膠原蛋白有所需特異性的單克隆Fab片段。
2.本發(fā)明膠原蛋白的治療用途本發(fā)明的另一方面是提供使用本發(fā)明膠原蛋白治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的方法。此處與某一疾病有關(guān)的名詞“治療(treatment)”或“醫(yī)治(treating)”既涉及預(yù)防也涉及減輕個體中業(yè)已存在的癥狀。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員明白一種治療不需要完全有效地防止疾病的發(fā)生或減輕與該疾病有關(guān)的癥狀。對病人而言，希望減輕任何癥狀的嚴(yán)重程度、延遲癥狀的發(fā)生或延遲癥狀嚴(yán)重性的發(fā)展。根據(jù)任何各種暗示可能發(fā)生免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的因素，例如家族史、遺傳標(biāo)記、早期癥狀之類，可以對有發(fā)生給定免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病風(fēng)險的人進行預(yù)防治療。
可以用題述方法治療的免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病包括但不限于，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性聽覺疾病、由細(xì)菌或病毒感染引起的軟骨炎癥(例如萊姆病)、寄生蟲病、滑囊炎、角膜病和關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎(脊柱融合)。本發(fā)明方法的主題包括給予有效劑量的本發(fā)明組合物(例如膠原蛋白、膠原蛋白衍生物)的步驟。用于治療特定免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的優(yōu)選組合物是IX型膠原蛋白的融合蛋白，最好是IX型膠原蛋白亞基與II型膠原蛋白和/或XI型膠原蛋白的嵌合體及其衍生物和亞基，以及在前述章節(jié)中描述的融合蛋白。在題述方法的一個優(yōu)選實施例中，給予受治療者的組合物包含不同程度糖基化的膠原蛋白。給予題述方法中給予的組合物使得活性組分(即膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物)接觸腸道的淋巴組織，例如淋巴集結(jié)或其它類似位點，以誘導(dǎo)免疫耐受。在許多可能的方法中，通過使用包含設(shè)計用于口服的題述組合物制劑，可以實現(xiàn)這種用藥，即在活性組分接觸適當(dāng)?shù)哪c道淋巴組織之前，該活性組分不會在口腔、胃或消化系統(tǒng)的其它部分中被破壞或滅活。本發(fā)明的治療方法也可以包括給予治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的其它藥物化合物(例如抗炎癥劑之類)的步驟。
題述組合物的給藥劑量可以在一寬范圍內(nèi)變化，并且將取決于各種因素，例如炎癥的嚴(yán)重性、病人年齡等，可能必需根據(jù)個體調(diào)整。每天可以給藥的膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物量的可能范圍可以從0.001mg至200mg。最好膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物的給藥量低，因此有利于通過抑制而不是克隆無反應(yīng)誘導(dǎo)免疫耐受?？梢赃m當(dāng)?shù)嘏渲坪心z原蛋白和/或膠原蛋白衍生物的藥物組合物，使得它們以單劑量單位或多劑量單位提供這些范圍內(nèi)的劑量。
本發(fā)明方法使用的誘導(dǎo)耐受的組合物的最適劑量將根據(jù)一些因素變化。此處使用的名詞“劑量(dosage)”和“劑量(dose)”，除非另行說明，可以不僅指組合物的單次給藥，而且可以用于指在選定時間內(nèi)給予的給定藥物組合物的總量并涉及多個單次給藥。影響最適劑量的因素包括選擇給予病人的一種或多種膠原蛋白分子(和/或膠原蛋白衍生物)、選定的特定粘膜結(jié)合分子、病人年齡、疾病嚴(yán)重性、該病人所患的其它疾病、配方中的惰性組分、佐劑等等。在有效治療給定免疫失調(diào)的劑量范圍可以有相當(dāng)程度的變化。同一藥物組合物的不同劑量可以通過不同機制產(chǎn)生所需的耐受效應(yīng)。盡管本發(fā)明的作用不依賴于特定的作用原理，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通過了解據(jù)信有兩種介導(dǎo)口服耐受的主要機制，會更好地理解本發(fā)明并提供額外的實施方案。通過活性細(xì)胞抑制可以介導(dǎo)口服耐受，其中調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制被耐受抗原特異性淋巴細(xì)胞的激活和增殖。另一個口服耐受誘導(dǎo)機制是克隆無反應(yīng)性，其中使具合適受體的T淋巴細(xì)胞變?yōu)椴环磻?yīng)。一般“低”劑量耐受抗原有利于活性抑制耐受，同一耐受抗原的相對“高”劑量有利于克隆無反應(yīng)性。有關(guān)口服耐受誘導(dǎo)的原理和技術(shù)的綜述參見Weiner等，免疫學(xué)年述(Annual ReviewImmunilogy)，第809-835頁，Annual Reviews(1994)。
可以將題述組合物作為藥物組合物配制，以適應(yīng)向粘膜表面給藥的一定類型，例如口服、局部給藥和吸入給藥?？诜幬镏苿┑膬?yōu)選形式是這樣一種形式，其中該組合物中的膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物與腸淋巴組織(如淋巴集結(jié))接觸。本發(fā)明組合物可以以藥物組合物的形式通過注射或吸入局部給藥、口服、鼻內(nèi)給藥，該藥物組合物包含原始化合物形式或可選地以藥學(xué)上可接受的鹽形式的膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物，與可以是固體、半固體或液體稀釋劑或可攝取膠囊的藥學(xué)上可接受的的載體相結(jié)合，這類制劑組成了本發(fā)明的另一個方面。也可以與載體材料一起使用膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物和粘膜結(jié)合膠原蛋白結(jié)合物。藥物制劑的例子是已提過的片劑、滴劑(例如滴鼻劑)、局部用藥的制劑(如軟膏劑、凝膠劑、乳膏和懸液劑、吸入用的氣溶膠、鼻腔噴霧劑、脂質(zhì)體等。通常膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物將構(gòu)成制劑的0.05-99％(重量)，或0.1-99％(重量)，例如注射用制劑構(gòu)成0.5-20％(重量)，而口服制劑構(gòu)成的0.1-50％(重量)。
為了制備含有本發(fā)明化合物的這種口服劑量單位形式的藥物制劑，可以將該活性組分與固體粉末狀載體混合，這些載體例如為乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉(諸如土豆淀粉、玉米淀粉、支鏈淀粉、昆布屬粉或柑橘屬果肉粉)、纖維素衍生物或明膠，藥物制劑也可以包括潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣或Carbowax”或其它聚乙二醇蠟，并壓縮形成片劑或糖衣丸的核心。如果需要糖衣丸，可以把核心包衣，例如用可以含有阿拉伯膠、滑石粉和/或二氧化鈦的濃縮糖溶液包衣，或者用溶于揮發(fā)性有機溶劑或有機溶劑混合物中的成膜劑包衣。可以在這些包衣中加入染料，例如以區(qū)分活性物質(zhì)的不同含量。為制備由明膠和例如作為增塑劑的甘油組成的軟明膠膠囊、或類似的封閉膠囊，可以將該活性物質(zhì)與Carbowax”或合適的油(例如芝麻油、橄欖油或花生油)混合。硬明膠膠囊可以包含該活性物質(zhì)與固體粉末載體的顆粒，這些載體例如為乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉(例如土豆淀粉、玉米淀粉或支鏈淀粉)、纖維素衍生物或明膠，也可以包含硬脂酸鎂或硬脂酸作為潤滑劑。
也可以配制本發(fā)明組合物，以便提供持久釋放。通過使用被緩慢溶解的包衣分隔的多層活性藥物，可以得到持久釋放片劑。制備持久釋放片劑的另一方法是將該活性藥物劑量分成有不同厚度包被的顆粒，并將這些顆粒與載體物質(zhì)一同壓制成片劑。也可以將膠原蛋白和/或膠原蛋白衍生物和粘膜結(jié)合膠原蛋白結(jié)合物混入由例如脂肪和蠟物質(zhì)制成的緩慢溶解的片劑，或均勻地分布在由不溶物質(zhì)(如生理惰性的槊料物質(zhì))制成的片劑里。
為獲得設(shè)計來防止活性物質(zhì)在胃液里釋放或可能分解的片劑、膠囊等口服制劑的劑量單位，可以將片劑、糖衣丸等包腸溶衣，即提供一層具有在酸性pH下不溶于胃液這類特性的抗胃液腸膜或包衣。因此，在該制劑到達(dá)腸道之后，才釋放該活性物質(zhì)。這種已知腸溶包衣的例子可以提到例如商品名為HP55和HP50、EdragitL和EudragitS銷售的乙酸鄰苯二甲酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素。
口服的液體制劑可以是酏劑、糖漿劑或懸液劑形式，例如含有約0.1-20％(重量)活性物質(zhì)的溶液、糖和作為分散劑的混合物或乙醇、水甘油、丙二醇和可選的芳香劑、糖精和/或羧甲基纖維素。
VI.實施例通過參考以下實施例會進一步理解本發(fā)明，這些實施例子僅作為本發(fā)明的例證。
A.實施例1在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)重組α3(IX)膠原蛋白亞基制備擴增得自p545質(zhì)粒和cDNA文庫克隆RB410的α3(IX)膠原蛋白cDNA編碼序列所用的PCR引物。設(shè)計引物使其在α3(IX)膠原蛋白編碼序列的5′和3′末端引入一Eco RI位點，利用一獨特的限制性位點將在這兩個克隆中找到的這兩半編碼序列連接起來。
采用Ausubel等，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法(Current Protocols inMolecular Biology)，Grene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1990)描述的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件，用引物1和引物2擴增得自p545質(zhì)粒的α3(IX)膠原蛋白編碼序列的成熟氨基末端。用引物3和引物4擴增得自上述cDNA克隆RB410的其余cDNA編碼序列，包括終止密碼子。所得的PCR產(chǎn)物用選定的獨特限制性核酸內(nèi)切酶和EcoRI消化。
指導(dǎo)在巴斯德畢赤酵母中分泌表達(dá)的市售表達(dá)載體pPIC9(Invitrogen，San Diego，CA)用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I 消化，后用牛小腸磷酸酶(Pharmacia)消化，然后在70℃熱變性5分鐘。按照實施例3描述的方法凝膠純化消化的PCR產(chǎn)物和pPIC9載體，進行三種方式連接。在轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌后，用限制分析鑒別并用市售畢赤酵母測序引物(Invitrogen，San Diego，CA)測序確認(rèn)正確連接的質(zhì)粒。
將α3(IX)畢赤酵母表達(dá)載體線性化并用于轉(zhuǎn)化亦表達(dá)脯氨酰4-羥化酶的his4巴斯德畢赤酵母菌株的球芽。在組氨酸缺陷培養(yǎng)基上鑒別轉(zhuǎn)化體，并通過在甲醇培養(yǎng)基上的緩慢生長檢測AOX1基因的缺失確認(rèn)轉(zhuǎn)化體。通過將細(xì)胞在做為唯一碳源的甲醇里生長誘導(dǎo)α3(IX)基因的表達(dá)。α3(IX)膠原蛋白亞基蛋白分泌到生長培養(yǎng)基中，接著用標(biāo)準(zhǔn)離心、過濾和層析技術(shù)純化。
B.實施例2在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)三聚體人IX型膠原蛋白用類似的方法，將產(chǎn)生α3(IX)膠原蛋白亞基的巴斯德畢赤酵母菌株進行工程化改造，使其在同一細(xì)胞中共表達(dá)α1(IX)和α2(IX)膠原蛋白亞基。
C.實施例3在草地粘蟲Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)三聚體人IX型膠原蛋白通過采用Baculogold轉(zhuǎn)染藥盒(Pharmingen)，將重組α1(IX)、α2(IX)、和α3(IX)構(gòu)建物和一修飾的苜蓿銀紋衣蛾核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染入草地粘蟲Sf9昆蟲細(xì)胞。用于構(gòu)建這三條α(IX)鏈的序列由van der Rest和Mayne公開，膠原蛋白類型的結(jié)構(gòu)和功能(Structureand Function of Collagen Types)(Mayne，R.and Burgeson，R.eds.)學(xué)術(shù)出版社，Orlando，F(xiàn)L，第185-221頁(1987)。按照Gruenwald，S.和Heitz，J.，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)步驟和方法手冊(Baculovirus ExpressionSystemsProcedures & Methods Manual)，Pharmingen，San Diego，CA(1993)描述的方法，將所得的病毒庫進行收集、擴增、和噬斑純化。
在添加10％胎牛血清(BioClear)的TNH-FH培養(yǎng)基上于27℃單層培養(yǎng)草地粘蟲Sf9昆蟲細(xì)胞。約5×106昆蟲細(xì)胞用重組人α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)構(gòu)建物和人脯氨酰4-羥化酶的αβ病毒(正在準(zhǔn)備手稿)感染。使用的IX型膠原蛋白α鏈病毒比脯氨酰4-羥化酶病毒多出2-3倍。每天向培養(yǎng)基中加入80μg/ml抗壞血酸鹽。感染72小時后除去培養(yǎng)基，用pH7.4的含0.15 NaCl和0.02M磷酸鹽的溶液清洗細(xì)胞層一次。將細(xì)胞刮入1.4ml含0.5乙酸、0.75M NaCl、10mM EDTA和1mM PMSF pH2.5的冰冷溶液中進行收獲。然后將細(xì)胞勻漿并在15000×g離心20分鐘。上清液用最終濃度為1.2M的NaCl于4℃混合樣品12小時進行沉淀。沉淀物于4℃在15000×g離心20分鐘。將得到的沉淀于4℃在500μl冷的50mM乙酸中溶解3小時。用非還原性或還原性SDS-PAGE和隨后的考馬斯亮藍(lán)染色分析15μl樣品。亦用胃蛋白酶于22℃消化該材料4小時，按照Buckner等，Anal.Biochem 110360-368(1981)描述的方法用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物，快速消化測定抗胃蛋白酶重組IX型膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。在還原性SDS-PAGE上并接著用三股螺旋膠原蛋白抗體采用Western印跡法分析所得的材料。
結(jié)果表明，人IX型膠原蛋白表達(dá)為一約300kDA的異三聚體(圖1)，由圖2所示的等量的α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)鏈組成。用蛋白酶短暫消化后，分析重組人IX型膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。重組人IX型膠原蛋白的熱穩(wěn)定性超過40℃。
D.實施例4嵌合型II/IX/XI膠原蛋白分子的克隆和表達(dá)修飾上述α3(IX)畢赤酵母表達(dá)載體，以便指導(dǎo)嵌合II型/IX型/XI型分子的表達(dá)。具體地說，將該載體從α3(IX)膠原蛋白編碼序列的5′或3′切割，并將II型膠原蛋白編碼序列插入框架。另外，可以在5′或3′或在II型和IX型膠原蛋白編碼序列之間再次切割該載體，并將XI型膠原蛋白編碼序列也插入正確的讀框中，以便表達(dá)嵌合型II/IX/XI膠原蛋白分子。用上述方法通過限制消化篩選具有所需定位的質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并通過測序確認(rèn)。
上述表明和描述之外的本發(fā)明的各種修改，從前面的描述而言對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。這類修改應(yīng)在附加的權(quán)利要求書范圍之內(nèi)。也應(yīng)理解，所有給定的核苷酸堿基對的大小是大約的，供描述之用。
本文引用的參考文獻通過全文引用結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.包含與異源肽序列連接的人IX型膠原的融合蛋白。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中該異源肽序列包含II型膠原蛋白。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中該異源肽序列包含XI型膠原蛋白。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中該異源肽序列包含II型和XI型膠原蛋白。
5.產(chǎn)生重組人融合蛋白的方法，包括(a)培養(yǎng)用表達(dá)所述融合蛋白的重組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(b)從該細(xì)胞培養(yǎng)物中回收該融合蛋白。
6.包含人重組IX型膠原蛋白的蛋白。
7.產(chǎn)生重組人IX型膠原蛋白的方法，包括(a)培養(yǎng)用表達(dá)所述IX型膠原蛋白的重組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；以及(b)從該細(xì)胞培養(yǎng)物中回收該IX型膠原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型人膠原蛋白、編碼這些新型膠原蛋白的多聚核苷酸序列以及這些新型蛋白和多聚核苷酸在診斷和治療疾病方面的用途。本發(fā)明還涉及特定膠原蛋白和衍生物,具體地說涉及Ⅸ型膠原蛋白與Ⅱ型和/或XⅠ型膠原蛋白的融合蛋白,以及將它們做為治療劑的用途。
文檔編號C07K14/00GK1207046SQ9619954
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月13日
發(fā)明者E·武奧里奧, G·馬丁, T·B·內(nèi)夫, L·阿拉－克克 申請人:菲布洛根有限公司