專利名稱：維生素b12介導的gcsf及epo口腔釋放系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明背景本發(fā)明涉及治療物質(zhì)粒細胞集落刺激因子(GCSF)和促紅細胞生成素(EPO)的口腔釋放，它通過將含有連接到維生素B12(VB12)或其類似物上的該物質(zhì)的配合物給藥。更具體地，本發(fā)明涉及合成這些配合物的方法以及加大每個VB12載體分子釋放GCSF或EPO的量的方法。
口腔釋放體系是已知的，當前發(fā)明者之一進行的近期研究工作(描述于PCT申請WO87/02251(PCT/AU86/0299))，其通過將活性物質(zhì)連接到至少一個載體分子(VB12或其類似物)上，可以通過將VB12連接到固有因子(IF)上利用自然VB12吸收系統(tǒng)將所得配合物從腸腔轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng)。一旦釋放人血清或淋巴引流系統(tǒng)，該配合物基本保留了原活性物質(zhì)的生物活性。
與所有的蛋白質(zhì)、肽和其它大的生物活性分子一樣，在目前還沒有GCSF或EPO的口腔釋放的方法。口服給藥的途徑是釋放藥學活性藥劑最優(yōu)選的方式，而且任何一種能使這些蛋白質(zhì)經(jīng)口服進入人體的方法都會有一個大而有價值的市場。通過在VB12和GCSF或EPO之間形成配合物而使其成為可能。
本發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及在VB12類似物和GCSF或EPO之間形成配合物以保持配合物中VB12對固有因子(IF)的顯著的親合力，同時保持了配合物中GCSF或EPO的顯著的生物活性。本發(fā)明也涉及合成這些配合物的方法?？赏ㄟ^利用間隔化合物在VB12部分與GCSF或EPO之間共價連接而至少部分實現(xiàn)此目的。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明的一方面是提供一種包括至少一種連接至少一個載體分子(VB12或VB12類似物)的活性物質(zhì)，其中載體在脊椎動物宿主中吸收和轉(zhuǎn)運VB12所必需的進行結合反應的能力及活性物質(zhì)的活性都基本保持。這是通過在GCSF和選自VB12或VB12類似物的載體之間提供一種配合物而實現(xiàn)的，其中GCSF和載體通過一個雙自由基間隔物共價連接，該配合物能以高度的親合力連接到固有因子上，同時保持GCSF的生物活性。
配合物優(yōu)選具有V-X-A-Y-Z的通式，其中V是保持IF親合力的載體分子VB12或其類似物(包括衍生物)，Z是選自EPO或GCSF的活性物質(zhì)，A是不同組成和長度的間隔臂，X是將V連接到A上的官能團，Y是將Z連接到A上的官能團。選擇官能團X的性質(zhì)、其連接V的位點以及間隔臂A的性質(zhì)以加大配合物IF的親合力。選擇官能團Y、其連接Z的位點以及間隔臂A的性質(zhì)以最大程度地維持Z的生物活性。
優(yōu)選的X選自-NHNH-，-NH-，-O-，-S-，-SS-或-CH2-。A優(yōu)選是一個任意取代的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1- 50亞烷基、環(huán)烯或芳基，直鏈中一個或多個碳原子可被N、O或S任意取代，并且其中任意選擇的取代基選自羰基、羧基、羥基、氨基和其它基團。Y優(yōu)選是一個在間隔物鏈A和蛋白質(zhì)Z之間的共價鍵，其中Y選自-NHCO-，-CONH-，-CONHNHCO-，-N＝N-，-N＝CH-，NHCH2-，-NHN＝CH-，-NHNHCH2-，-SS-，-SCH2-，-CH2S-，-NHCRNH-[其中R＝O，S或NH2]，-COO-，-OCO-，并且Z是GCSF或EPO。
本發(fā)明中，術語“活性物質(zhì)”(即Z)包括粒細胞集落刺激因子(GCSF)或促紅細胞生成素(EPO)所有的或部分的類似物、同系物、衍生物或者結合體。
載體是VB12或VB12類似物。VB12類似物包括具有固有因子連接活性的VB12(鈷胺素)的任何變體或衍生物。優(yōu)選的VB12類似物包括水合鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素、羥基鈷胺素、氰基鈷胺素、N-碳酰苯胺和5-甲氧芐基氰基鈷胺素[(5-MeO)CN-Cb1]，以及所有上述物質(zhì)的去二甲基、一乙基酰胺及甲酰胺類似物。其它類似物包括烷基鈷胺素，其中烷基鏈通過直接CoC共價鍵連接到可啉環(huán)上。其它類似物包括氯鈷胺素、亞硫酸鈷胺素、硝基鈷胺素、硫氰酸鈷胺素、苯并咪唑(例如5，6-二氯苯并咪唑、5-羥基苯并咪唑、三甲基苯并咪唑)氰鈷胺素的衍生物以及腺苷氰基鈷胺素[(Ade)CN-Cb1]、鈷胺素內(nèi)酯、鈷胺素內(nèi)酰胺以及VB12或其類似物的N-酰苯胺、乙酰胺、一元羧酸和二元羧酸的衍生物。
優(yōu)選的VB12衍生物包括VB12的一元、二元和三元羧酸衍生物或丙酰胺衍生物。載體也可包括用鋅或鎳代替鈷的VB12的類似物。VB12或其類似物的可啉環(huán)可被任何不影響其連接IF的取代基所取代，并且VB12或其類似物的這些衍生物是本發(fā)明的一部分。具有可與間隔化合物反應的官能團的VB12或其類似物的其它衍生物也是本發(fā)明的一部分。
優(yōu)選配合物包括通過二硫鍵連接到VB12的(二硫吡啶基丙酰胺)十二烷胺[DTP-十二烷胺]衍生物上的GCSF。
本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案提供了一種制備含有通過二硫鍵連接VB12的(二硫吡啶基丙酰胺)十二烷基環(huán)庚基己胺衍生物(DTP-十二烷胺VB12的長鏈類似物，其對固有因子表現(xiàn)出高度親合力)的GCSF的配合物的方法。
本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案提供了一種制備含有通過二硫鍵連接VB12的(二吡啶基丙酰胺)十二烷基碳酰胺甲基衍生物的GCSF的配合物的方法，其中間隔物通過軸向CoC鍵連接VB12。
本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案提供了一種制備含有至少一種活性化合物(其通過間隔物連接至少一個載體分子)的配合物的方法，載體分子是VB12或其類似物，其中載體在脊椎動物宿主中吸收和轉(zhuǎn)運VB12所必需的進行結合反應的能力及活性物質(zhì)的活性都基本保持，該方法包括一個或多個以下步驟a)活性物質(zhì)和載體以及間隔化合物反應形成配合物；b)活性物質(zhì)和間隔物反應，然后其產(chǎn)物與載體反應形成配合物；c)載體和間隔物反應，然后其產(chǎn)物與活性物質(zhì)反應形成配合物；d)按照(a)、(b)或(c)的方法，但是在前一步附加一步化學修飾載體和/或活性物質(zhì)，在載體和/或活性物質(zhì)上得到一個可與間隔化合物反應的官能團；e)按照(a)、(b)、(c)或(d)的方法，但是在進行進一步反應前附加一步活性化合物或載體與聚合物載體的反應。優(yōu)選聚合物載體同時連接到載體(或間隔物-載體)和活性物質(zhì)或(間隔物-活性物質(zhì))上。
例如，可通過下述方法利用“e”VB12的“e”單酸形成這些配合物(i)通過弱酸水解氰鈷胺素制備VB12的單酸衍生物并純化一級水解產(chǎn)物；(ii)修飾e-單酸而得到通過間隔臂連接eVB12環(huán)的末端官能團；(iii)將官能化的eVB12衍生物偶合到活性物質(zhì)上的羧酸酯、胺、硫醇、羥基、酚基、醛或酮基團上或者其它原有或被化學引入的適當官能團上?？蛇x擇在其骨架末端具有適當官能團的間隔化合物，或者如果必要，可通過一般的化學合成反應將這些官能團引入。
本發(fā)明也包括聚合物載體的化學修飾以引入能直接與間隔化合物反應或與連接有活性物質(zhì)的間隔化合物反應的官能團。所得的聚合物-活性物質(zhì)中間體含有活性物質(zhì)的許多分子，并且該中間體適于與載體偶合而得到能擴大活性物質(zhì)釋放的配合物。
本發(fā)明也涉及肽和蛋白質(zhì)中未反應硫醇的修飾的一般方法，特別是那些不正常與溶于含水溶劑的試劑接觸的硫醇，因為其隱埋在蛋白質(zhì)的疏水部位。如果需要，接著將這些修飾的肽和蛋白質(zhì)進行標記。
本發(fā)明也包括一種通式為V′-X-A-Y′的試劑，其中V′是VB12或VB12類似物，其通過VB12可啉環(huán)的羧酸酯側基或者通過中心鈷原子連接X，或連接到VB12分子引入的官能團上，或者v′是一個標記物，其中“標記物”是指通過視覺或儀器方法可檢測的任何物質(zhì)。標記物可包括發(fā)色團、催化劑、熒光化合物、化學發(fā)光化合物、放射性同位素、膠體金屬及非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、抗體或抗原、生物素、抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素、膠乳顆粒、脂質(zhì)體或其它含有信號產(chǎn)生物質(zhì)的囊泡等等。
X選自-NHCO-，-CONH-，-CONHNHCO-，-N＝N-，-N＝CH-，-NHCH2-，-NHN＝CH-，-NHNHCH2-，-SS-，-SCH2-，-CH2S-，-NHCRNH-[R是O，S或NH2]，-COO-，-OCO-；A是一個任意取代、飽和或不飽和、支鏈或直鏈的C1-50亞烷基、環(huán)烯或芳基，鏈中一個或多個碳原子可被N、O或S任意取代，并且其中任意選擇的取代基選自羰基、羧基、羥基、氨基或其它基團；Y′是一個能與硫醇反應得到穩(wěn)定共價鍵的官能團，包括碘乙?；?、溴乙?；?、氯乙酰基、馬來酰亞氨基、3-羧基-4-硝基苯基二硫基或2-吡啶二硫基，以及類似基團。
在此描述的配合物可以利用本領域熟知的載體和/或賦形劑制成藥用或獸用組合物。用于本發(fā)明的適當?shù)乃幬飫┬蛯嵗枋鲇谌鏡emington′s Pharmaceutical Sciences(MackPublishing Company，第10版，在此引為參考)。組合物可以是膠囊、片劑、緩釋劑型、酏劑、凝膠劑、膏劑、腸溶包衣劑或其它本領域熟知的的適當劑型。
本發(fā)明的配合物及組合物可給需要用GCSF或EPO治療的人或動物體給藥。給藥模式對本發(fā)明并不關鍵，可包括非腸道(靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或器官內(nèi)注射)、口服、透皮、陰道、肛腸或其它本領域熟知的給藥途徑。本發(fā)明的配合物或化合物的治療有效劑量是為特定疾病提供治療。有效量視所治療疾病的性質(zhì)、醫(yī)生或獸醫(yī)的診斷及其它例如受治療者的年齡、體重和/性別等因素而定。只是作為一個實例，根據(jù)本發(fā)明，配合物組合物的有效量可含有1ng至10g的本發(fā)明的配合物。
本發(fā)明也涉及所述配合物用于藥物的制備，并且用于對GCSF或EPO敏感病癥的治療。實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方法實施例材料VB12由Rousell-Uclaf獲得。GCSF和EPO從Amgen獲得。1-乙基-3-(二甲氨基丙基)碳化二亞胺·HCl(EDAC·HCl)由Biorad獲得。3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)及6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺]己酸琥珀酰亞胺酯(LC-SPDP)由Pierce Chemical Co.獲得。所有其它試劑從Fluka獲得。
實施例1VB12-GCSF配合物制備3類VB12-GCSF配合物a)通過一個酰胺鍵共軛，該酰胺鍵由碳化二亞胺(EDAC)介導將氨基末端的eVB12衍生物偶合到GCSF的C-末端或GCSF的羧酸酯側鏈而形成。b)通過一個二硫鍵共軛，該二硫鍵由硫醇插入反應在GCSF的17位Cys將游離硫醇插入eVB12的(二硫吡啶基丙酰胺)末端衍生物的二硫鍵中形成。c)通過一個酰肼共軛，該酰肼由EDAC-介導將酰肼末端的eVB12衍生物偶合到GCSF的C-末端或GCSF的羧酸酯側鏈而形成。1.1 單羧酸-VB12“e”異構體的制備和純化將單羧酸維生素B12的“e”異構體(以前叫做d異構體，但是由Anton與其合作者重新命名為e異構體(1980J.Am.Chem.Soc.1022215))通過Dowex 1×2色譜及用乙腈的0.1％TFA梯度展開的半制備C-18 RP-HPLC從鈷胺素酸水解中形成的b和d異構體中分離。1.2 eVB12氨基衍生物的制備許多eVB12的氨基衍生物通過將e異構體與下述物質(zhì)反應而制備i)1，2-二氨基乙烷ii)1，6-二氨基己烷iii)1，12-二氨基十二烷iv)1，3-二氨基-2-羥基丙烷
v)1，6-二氨基-3，4-二硫代己烷(a.k.a.胱胺)所有的反應都在pH6.5進行，使用對e異構體20倍摩爾過量的二胺及20倍摩爾過量的EDAC。一個代表性的反應是，將135mg eVB12溶于蒸餾水(6ml)中，加入1.2ml 1.0M二胺，pH6.5。然后加入無水EDAC(270mg)，反應混合液在室溫下放置過夜。
通過在半制備C-4柱上進行反相色譜純化所有的氨基衍生物，使用含0.1％TFA的5-100％乙腈梯度。洗脫下來的物質(zhì)通過S-瓊脂糖色譜進一步純化。用0.1M HCl洗脫氨基衍生物，隨后萃取入苯酚中，在苯酚相中加入二氯甲烷后反萃取入水中。然后通過冷凍干燥從水相中回收氨基-eVB12衍生物。1.3 2-氨基乙基-eVB12與GCSF的共軛將2-氨基乙基-eVB12(26.5mg，18μmol)的2ml GCSF(6mg/ml，0.63μmol)溶液冷卻至4℃。加入一等分新制的EDAC溶液(100mg/ml，120μl，63μmol)。24小時后，在4℃加入第2等分新制的EDAC溶液。反應在4℃進行共48小時，然后通過交聯(lián)葡聚糖G-50上，以2.5％乙酸洗脫進行色譜分離將未反應的2-氨基乙基-eVB12從共軛物和聚集體中分離。1.4 胱胺基-eVB12與GCSF的共軛將鹽酸胱胺基-eVB12(30mg，20μmol)的2.5ml GCSF(6mg/ml，0.80μmol)溶液在4℃用一等分新制的含水EDAC溶液(20mg/ml，75μl，8μmol)處理。4.5小時、7小時和24小時后，另外加入等分的新制EDAC溶液(20mg/ml，75μl，8μmol)。反應在48℃進行共48小時，然后通過交聯(lián)葡聚糖G-50上，以2.5％乙酸洗脫進行色譜分離將未反應的氨基-eVB12從共軛物中分離。1.5 氨基乙基-eVB12的3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺衍生物的制備通過將SPDP與下述物質(zhì)反應制備氨基-eVB12的二硫吡啶基衍生物i)2-氨基乙基-eVB12ii)6-氨基己基-eVB12iii)12-氨基十二烷基-eVB12一個代表性的反應是，將末端氨基-eVB12溶于50mg/ml0.1M的PO4緩沖液(pH7.5，含有0.1M NaCl)中。將SPDP溶于50mg/ml丙酮中，并且將800μl該溶液加到氨基-eVB12中。于室溫反應過夜后，將DTP-氨基-eVB12通過RP-HPLC在半制備C4柱上純化，然后冷凍干燥。1.6 DTP-氨基-eVB12與GCSF的共軛最初與AMGEN的談話表明，他們發(fā)現(xiàn)不可能用標準硫醇修飾劑來修飾未變性GCSF中的游離半胱氨酸。最初用DTP-氨基乙基-eVB12的實驗表明，在沒有胍存在時可能獲得約20％用VB12取代的GCSF；在4M胍存在下，這一水平可升至＞80％。因此可確定，如果將一個較長的間隔物用于共軛，在沒有胍存在時利用DTP-氨基-eVB12接近游離的硫醇是可能的。
第二系列的實驗中，將GCSF與DTP-氨基乙基、DTP-氨基己基和DTP-氨基十二烷基-eVB12在有或沒有4M胍的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH4.0)存在下反應。
用不同DTP-氨基-eVB12-間隔物配合物取代GCSF的程度如下表所示表1間隔物 胍+胍DTP-氨基乙基37.5％89.3％DTP-氨基己基45.5％95.2％DTP-氨基十二烷基100.0％ 100.0％從表1可看出，利用長鏈的十二烷基-間隔物可以不使用胍而共軛GCSF中隱埋的硫醇。
最初試圖用eVB12的吡啶基二硫代丙酰胺-氨基乙基衍生物共軛GCSF中的游離硫醇基，在沒有胍存在下只獲得約20-40％低度的共軛。加入4M胍(終濃度)將共軛效率提高至80％以上。制備長鏈的、更疏水的eVB12衍生物，吡啶基二硫代丙酰胺-十二烷基eVB12在4℃24小時后得到100％取代的GCSF而不需要加入胍。在此反應中硫醇互換化學的應用證明是有利的，因為在可降低GCSF進行自發(fā)聚集程度的pH值下eVB12的共軛化是出乎意料的成功。共軛物質(zhì)的色譜分離導致共軛物從游離eVB12中的基線分離。
這種類型的方法可普遍應用于發(fā)展可檢測、定量和/或修飾蛋白質(zhì)及肽中硫醇基的試劑，這些蛋白質(zhì)和肽在此認為是化學惰性的。1.7 擴大DTP-氨基十二烷基-eVB12與GCSF的共軛隨著DTP-十二烷基-間隔物共軛的最初成功，將反應如下擴大在2.5mlGCSF(6mg/ml；15mg)中加入1.6ml DTP-氨基十二烷基-eVB12(10mg/ml的2.5％乙酸溶液)。該反應在4℃進行48小時，然后通過在交聯(lián)葡聚糖G-25上，以2.5％乙酸洗脫進行色譜將未反應的eVB12從共軛物中分離。用YM10膜在AMICON正壓池中沉淀、濃縮含有GCSF的部分，并且用無菌蒸餾水滲析72小時。1.8 DTP-十二烷基環(huán)庚基己基-eVB12試劑的制備盡管DTP-十二烷基-eVB12可有效地與GCSF反應得到一個穩(wěn)定的、確定特征的配合物，但該物質(zhì)具有低IF親合力(約原始eVB12的2-3％)。通過合成一個DTP-十二烷胺基-eVB12的加長間隔物類似物來制備提高IF親合力的配合物。合成這一類似物使用相同的SPDP化學通過GCSF的半胱氨酸共軛，但是用一個較長的間隔臂連接eVB12。正如所預料，其得到的共軛物的IF親合力顯著高于通過GCSF與DTP-十二烷基-eVB12制備的共軛物的IF親合力(見表2)。
這一間隔物通過eVB12的e-羧酸酯與下列物質(zhì)的連續(xù)反應而制備i)1，6-二氨基己烷和EDAC(得到6-氨基己基eVB12)ii)辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)(得到單琥珀酰亞胺基環(huán)庚基己基-eVB12)iii)1，12-二氨基十二烷(得到12-氨基十二烷基環(huán)庚基-eVB12)即所得間隔物(大于2倍氨基十二烷基-eVB12的長度)用SPDP在末端氨基衍生化，并通過如下描述的方法偶合GCSF。1.9 DTP-十二烷基環(huán)庚基己基-eVB12與GCSF的偶合將DTP-十二烷基環(huán)庚基己基-eVB12溶液(9mg，7μmol)用乙酸(100μl)提取，并用水稀釋至1ml。將此溶液加入5ml冷卻至4℃的GCSF溶液(4mg/ml，0.5μmol)中。于4℃放置反應混合液144小時，然后用標準方法處理。1.10 eVB12羧酸酯的酰肼衍生物的制備制備兩個eVB12羧酸酯的酰肼衍生物以通過與EDAC反應偶合GCSF的羧基。所用的兩個酰肼衍生物及其(簡寫)化學結構為a)酰肼基-eVB12(＝eVB12-CONHNH2)b)己二酰-酰肼基-eVB12(＝eVB12-CONHNHCO(CH2)4CONHNH2)1.10i酰肼基-eVB12這一試劑通過兩步合成制備，其包括將叔丁基carbazate偶合到eVB12羧酸酯上，隨后除去tBoc基團而得到游離的酰肼。 1.10ii己二酰-酰肼基-eVB12這一試劑通過將EDAC加入到該酸和20倍過量的己二酰酰肼的混合液中從eVB12羧酸一步制備而得。
EDAC-介導的酰肼基-eVB12類似物偶合到GCSF羧酸酯支鏈很容易進行，與相應的氨基eVB12衍生物與GCSF的共軛相比僅需要極少量的eVB12衍生物和EDAC。這用酰肼的相對堿性(pKa2.6)與胺(pKa8-9)相比較很容易解釋。在發(fā)生GCSF偶合的pH(4-5)，酰肼eVB12衍生物主要以活性的、非質(zhì)子化的形式存在，而氨基-eVB12衍生物則主要以非活性的、質(zhì)子化形式存在。
所用的偶合反應為 eVB12-[spacer]-CONHNHCO-GCSF1.11酰肼-eVB12與GCSF的共軛將酰肼eVB12(8.9mg，6.5μmol)溶液的5mlGCSF溶液(4mg/ml，1.05μmol)冷卻至4℃，加入一等分EDAC溶液(50mg/ml，40μl，10μmol)。5小時后，加入相同等分的新制EDAC溶液并將反應混合液于4℃放置過夜。通過在交聯(lián)葡聚糖G-50上，以2.5％乙酸洗脫進行色譜分離將共軛物從未反應的eVB12及其它試劑中除去。1.12己二酰酰肼基-eVB12與GCSF的共軛將己二酰酰肼基eVB12(10mg，6.6μmol)溶液的3mlGCSF溶液(4mg/ml，0.64μmol)冷卻至4℃，加入一等分EDAC溶液(50mg/ml，40μl，10μmol)。5小時后，加入20μl等分的新制EDAC溶液(50mg/ml，20μml，5μmol)并將反應混合液于4℃放置過夜。通過在交聯(lián)葡聚糖G-50上，以2.5％乙酸洗脫進行色譜分離將共軛物從未反應的eVB12及其它試劑中除去。1.13聚-GCSF-HPMA-eVB12配合物的制備可合成兩個N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物作為與GCSF和eVB12結合及衍生化的聚合物骨架。非生物降解的聚合物骨架(HPMA-GG)可通過HPMA與N-異丁烯酰基-N-甘氨酸甘氨酰對硝基苯基酯的游離基共聚作用而合成。生物降解的聚合物(HPMA-FALG)可利用Rejmanova及其合作者的方法[Rjmanova，P，Obereigner，B and Kopecek，J，1981Makromol Chem 1821899-1915]通過HPMA與N-異丁烯?；拾滨１交滨Ａ涟滨８拾彼釋ο趸椒吁サ挠坞x基共聚作用而合成。為了將GCSF和eVB12結合到聚合物上，聚合物首先與10摩爾過量的氨基十二烷基-eVB12及二硫代吡啶基十二烷基環(huán)庚基-己胺(1∶10摩爾∶摩爾)混合物反應過夜。未反應的硝基苯基酯通過加入1-氨基-2-丙醇進行氨解。修飾后的聚合物通過在瓊脂糖6B上進行色譜而純化。將二硫代吡啶基十二烷基環(huán)庚基己基修飾的eVB12-取代的聚合物溶液溶于2.5％乙酸中，并與GCSF反應。反應混合液在4℃放置144小時，然后GCSFeVB12-取代的聚合物通過在瓊脂糖6B上進行色譜而純化。第2部分eVB12-EPO配合物制備3類eVB12-EPO配合物(a)通過一個酰胺鍵共軛，該酰胺鍵由EDAC-介導將氨基eVB12衍生物偶合到EPO的C-末端、EPO天冬氨酸/谷氨酸殘基的羧酸酯側鏈或EPO碳水化合物部分的唾液酸殘基的羧酸酯基而形成。(b)通過一個酰肼鍵共軛，該酰肼鍵由EDAC-介導將酰肼-eVB12衍生物偶合到EPO天冬氨酸/谷氨酸殘基的羧酸酯側鏈或EPO碳水化合物部分的唾液酸殘基的羧酸酯基而形成。(c)通過一個在酰肼基-eVB12衍生物和醛基(由高碘酸氧化EPO的碳水化合物殘基形成)之間的腙鍵共軛。2.12-氨基乙基-eVB12與EPO的共軛將2-氨基乙基-eVB12(8mg，5.7μmol)與EPO(27mg/ml，200μl，0.18μmol)的混合液冷卻至4℃，加入一等份EDAC溶液(10mg/ml，100μl，5μmol)。反應混合液于4℃放置64小時，最后通過在交聯(lián)葡聚糖-75柱上進行篩析色譜而純化。用含有Tris(pH7.5，10mM；NaCl，100mM)的緩沖液洗脫得到純化的EPO-eVB12配合物。2.2胱胺基-eVB12與EPO的共軛將6-氨基-3，4-二硫代己基酰胺-eVB12(12mg，8.1μmol)與EPO(13.5mg/ml，500μl，0.23μmol)的混合液冷卻至4℃，加入一等份EDAC溶液(10mg/ml，250μl，13μmol)。反應混合液于4℃放置48小時，最后通過在交聯(lián)葡聚糖-75柱上進行篩析色譜而純化。用含有Tris(pH7.5，10mM)/NaCl(100mM)的緩沖液洗脫得到純化的EPO-eVB12配合物。2.3 EADC-介導的酰肼-eVB12與EPO的共軛將酰肼VB12(10mg，7.3μmol)溶液的7ml EPO溶液(2.6mg/ml，0.6μmol)冷卻至4℃，加入一等份EDAC溶液(20mg/ml，50μl，5μmol)。5小時后，加入第二份新制的EDAC溶液(10mg/ml，25μl，1.3μmol)，反應混合液于4℃放置過夜。通過在G-50柱上進行篩析色譜將共軛物純化。用含有Tris(pH7.5，10mM；NaCl，100mM)的緩沖液洗脫得到純化的EPO-eVB12配合物。2.4 EAAC-介導的己二肼-酰肼-eVB12與EPO的共軛將己二肼-酰肼-eVB12(11mg，7.3μmol)溶液的4ml EPO溶液(2.6mg/ml，0.35μmol)冷卻至4℃，加入一等份EDAC溶液(10mg/ml，100μl，5μmol)。反應混合液于4℃放置過夜。通過在G-50柱上進行篩析色譜將共軛物純化。用含有Tris(pH7.5，10mM)/NaCl(100mM)的緩沖液洗脫得到純化的EPO-eVB12配合物。2.5 高碘酸介導的酰肼-eVB12與EPO的共軛將含水EPO溶液(6.4mg/ml，1.56ml，0.33μmol)冷卻至4℃，加入新制的高碘酸鈉溶液(25mM，360μl)。在4℃輕輕攪拌該溶液15分鐘，加入1，2-亞乙基二醇(5μl)將過量的高碘酸驟冷。該溶液用31 pH5.6，10mM的NaOAc緩沖液滲析過夜。將酰肼-eVB12(7.5mg，5μmol)的蒸餾水(200μl)溶液加至氧化的EPO溶液中，于4℃放置反應混合液7小時。通過在G-75交聯(lián)葡聚糖上進行篩析色譜(SEC)將共軛物從未反應的酰肼中分離。用含有Tris(pH7.5，10mM)/NaCl(100mM)的緩沖液洗脫得到純化的EPO-eVB12配合物。2.6 聚-EPO-HPMA-eVB12的制備可合成兩個N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物作為與EPO和eVB12結合及衍生化的聚合物骨架。非生物降解的聚合物骨架(HPMA-GG)可通過HPMA與N-異丁烯?；?N-甘氨酸甘氨酰對硝基苯基酯的游離基共聚作用而合成。生物降解的聚合物(HPMA-GFALG)可利用Rejmanova及其合作者的方法[Rejmanova，P，Obereigner，B and Kopecek，J，1981Makromol Chem 1821899-1915]通過HPMA與N-異丁烯?；拾滨１交滨Ａ涟滨８拾彼釋ο趸椒吁サ挠坞x基共聚作用而合成。為了將EPO和eVB12結合到聚合物上，將聚合物與10摩爾過量的氨基十二烷基-eVB12及6-(3-酰肼基丙酰胺)-1-氨基-3，4-二硫代己烷(1∶10摩爾∶摩爾)混合物反應過夜。未反應的硝基苯基酯通過加入1-氨基-2-丙醇進行氨解。修飾后的聚合物通過在瓊脂糖6B上進行色譜而純化。通過加入EDAC將EPO共價連接到6-(3-酰肼基丙酰胺)-1-氨基-3，4-二硫代己烷修飾的eVB12-取代的聚合物上。反應混合液在4℃放置18小時，然后EPO-eVB12-取代的聚合物通過在瓊脂糖6B上進行色譜而純化。
實施例3選擇適當長度和官能度的雙基間隔物以使所得GCSF或EPOeVB12配合物具有最佳的固有因子(IF)親合力。作為實例，下表所示改變間隔物的長度和官能度對不同配合物及VB12衍生物的結果。
實施例中所指的不同eVB12類似物及配合物的IF親合力示于表2中。特別地，在GCSF-二硫代丙酰胺[12-氨基十二烷基酰胺]-eVB12(在1.7中制備)和GCSF-二硫代丙酰胺[12-氨基十二烷基-環(huán)庚基-己基酰胺]-eVB12(在1.9中制備)中，IF親合力有顯著增加。這種IF親合力的增加可能是由于后者配合物中間隔臂長度的增加。
表2VB12類似物及配合物的相對固有因子親合力eVB12類似物或配合物IF親合力eVB12羧酸酯 35％2-氨基乙酰胺eVB1248％6-氨基己酰胺eVB1291％12-氨基十二烷酰胺eVB1274％12-氨基十二烷基-環(huán)庚基-己基酰胺-eVB1282％二硫代丙酰胺[2-氨基乙酰胺]-eVB126％二硫代丙酰胺[6-氨基己酰胺]-eVB127％二硫代丙酰胺[6-氨基己酰胺]-eVB1211％GCSF-二硫代丙酰胺[1 2-氨基十二烷酰胺]-eVB123％GCSF-二硫代丙酰胺-12-氨基十二烷基-環(huán)庚基-己基酰胺eVB1228％酰肼基-eVB12100％己二肼二酰肼基-eVB1244％GCSF-?；ｋ禄?eVB1210％GCSF-?；鵞己二肼二酰肼]-eVB127％EPO-?；ｋ禄?eVB126％EPO-酰基[己二肼二酰肼基]-eVB1211％IF親合力由eVB12衍生物相對于天然的、未修飾的VB12的親合力的百分比表示。
按照條約第19條的修改17.權利要求12的配合物，其中所述EPO與一種藥用聚合物共價相連。
18.權利要求17的配合物，其中的聚合物選自葡聚糖、菊粉、纖維素、淀粉及其衍生物、硫酸軟骨素、聚[N-α-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺]及其衍生物、苯乙烯-馬來酐共聚物、二乙烯基醚-馬來酐共聚物、聚賴氨酸、聚(谷氨酸)、聚(羥丙基谷氨酰胺)、聚(乳酸)、PEG與賴氨酸或其它氨基酸通過共價鍵形成的水溶性聚氨基甲酸乙酯及支鏈多肽。
19.權利要求17的配合物，其中所述藥用聚合物在人或動物體內(nèi)可生物降解。
20.一種在EPO和選自維生素B12或維生素B12類似物的載體之間制備配合物的方法，其包括將一種或兩種所述載體和EPO與具有末端活性基團的雙基間隔物反應形成載體/連接物和/或EPO連接物中間體，然后將各種組分一起反應得到EPO和所述載體的配合物，其中各組分通過所述間隔物共價連接。
21.權利要求20的方法，其中在衍生化前將EPO和/或所述載體修飾而得到至少一個能形成化學鍵的官能團。
22.權利要求20的方法，其中所述載體通過酰胺鍵、?；ｋ骆I、亞胺鍵或腙鍵共價連接到EPO上。
23.一種用于檢測蛋白質(zhì)或肽的隱埋硫醇基的方法，所述方法包括使用如維生素B12(或其類似物)或更一般的能通過視覺或者儀器方法檢測的標記物的配合物，其與一個雙基間隔物共價連接，所述間隔物具有能與所述蛋白質(zhì)或肽中的游離硫醇形成共價鍵的末端活性基團。
24.權利要求23的方法，其中所述間隔物具有1-50個原子的骨架。
25.權利要求23的方法，其中所述試劑具有通式V′-X-A-Y′其中，V′是維生素B12或維生素B12類似物，其通過VB12可啉環(huán)的羧酸酯側基或者通過中心鈷原子與X連接，或連接到VB12分子引入的官能團上，或者v′是一個通過視覺或儀器方法可檢測標記物；X選自-NHCO-，-CONH-，-CONHNHCO-，-N＝N-，-N＝CH-，-NHCH2-，-NHN＝CH-，-NHNHCH2-，-SS-，-SCH2-，-CH2S-，-NHCRNH-，[R是O，S或NH2]，-COO-，-OCO-；A是一個任意取代的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-50亞烷基、環(huán)烯或芳基，鏈中一個或多個碳原子可被N、O或S任意取代，并且其中任意選擇的取代基選自羰基、羧基、羥基、氨基或其它基團；Y′是一個能與硫醇反應得到穩(wěn)定共價鍵的官能團。
26.權利要求25的方法，其中Y′選自碘乙?；?、溴乙?；?、氯乙?；ⅠR來酰亞氨基、3-羧基-4-硝基苯基二硫基或2-吡啶二硫基。
27.權利要求23的方法，其中所述標記物選自發(fā)色團、催化劑、熒光化合物、化學發(fā)光化合物、放射性同位素、膠體金屬及非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、抗體或抗原、生物素、抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、膠乳顆粒、脂質(zhì)體或其它含有信號產(chǎn)生物質(zhì)的囊泡。
28.一種藥用組合物，其含有與藥用載體或賦形劑任意結合的一種權利要求1至8或者12至19的配合物。
29.一種對用GCSF或EPO治療敏感的患者治療的方法，其包括對所述患者給予治療有效量的權利要求1至8或12至19任意一項中的配合物，或者權利要求28的組合物。
30.使用權利要求1至8或12至19任意一項中的配合物生產(chǎn)藥物的用途。
31.使用權利要求1至8或12至19任意一項中的配合物生產(chǎn)藥物的用途。
權利要求
1.一種在GCSF和含有維生素B12和維生素B12類似物的載體(所述GCSF和所述載體通過雙基間隔物共價連接)之間形成的配合物，所述配合物能以高度親合力連接固有因子而保持GCSF的生物活性。
2.權利要求1的配合物，其中所述載體通過GCSF的Cys-17的二硫鍵、酰胺鍵、?；ｋ骆I、亞胺鍵或腙鍵共價連接到GCSF上。
3.權利要求1的配合物，具有通式V-X-A-Y-Z其中V是維生素B12或維生素B12類似物或者衍生物，其通過VB12可啉環(huán)的羧酸酯側基或通過中心鈷原子與X連接或者與VB12分子引入的官能團連接；X選自-NHNH-，-NH-，-O-，-S-，-SS-或-CH2-；以及A是任意一個取代的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-50亞烷基、環(huán)烯或芳基，直鏈中一個或多個碳原子可被N、O或S任意取代，并且其中任意選擇的取代基選自羰基、羧基、羥基、氨基和其它基團；Y是一個在A和Z之間的共價鍵，其中Y選自-NHCO-，-CONH-，-CONHNHCO-，-N＝N-，-N＝CH-，-NHCH2-，-NHN＝CH-，-NHNHCH2-，-SS-，-SCH2-，-CH2S-，-NHCRNH-，[R是O，S或NH2]，-COO-，-OCO-，并且Z是GCSF。
4.權利要求1的配合物，其中所述維生素B12類似物選自氰鈷胺素(CN-Cb1)、水合鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素、羥基鈷胺素、(5-甲氧芐基)氰基鈷胺素[(5-MeOBz)CN-Cb1]；上述物質(zhì)的去二甲基、一乙酰胺及甲酰胺類似物；烷基鏈通過直接CoC共價鍵連接到可啉環(huán)上的烷基鈷胺素；氯鈷胺素、亞硫酸鈷胺素、硝基鈷胺素、硫氰酸鈷胺素、苯并咪唑衍生物(包括5，6-二氯苯并咪唑、5-羥基苯并咪唑、三甲基苯并咪唑)；腺苷氰基鈷胺素[(Ade)CN-Cb1]、鈷胺素內(nèi)酯、鈷胺素內(nèi)酰胺；VB12或其類似物的N-酰苯胺、乙酰胺、一元羧酸和二元羧酸的衍生物；VB12的一元、二元和三元羧酸衍生物；以及用鋅或鎳代替鈷的VB12類似物。
5.權利要求1的配合物，其中所述維生素B12類似物是一種其可啉環(huán)被一個不影響結合固有因子的取代基取代的類似物。
6.權利要求1的配合物，其中所述GCSF與一種藥用聚合物共價相連。
7.權利要求6的配合物，其中的聚合物選自葡聚糖、菊粉、纖維素、淀粉及其衍生物、硫酸軟骨素、聚[N-α-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺]及其衍生物、苯乙烯-馬來酐共聚物、二乙烯基醚-馬來酐共聚物、聚賴氨酸、聚(谷氨酸)、聚(羥丙基谷氨酰胺)、聚(乳酸)、PEG與賴氨酸或其它氨基酸通過共價鍵形成的水溶性聚氨基甲酸乙酯及支鏈多肽。
8.權利要求6的配合物，其中所述藥用聚合物在人或動物體內(nèi)可生物降解。
9.一種制備在GCSF和選自維生素B12或維生素B12類似物的載體之間的配合物的方法，其包括將一種或兩種所述載體和GCSF與具有末端活性基團的雙基間隔物反應形成載體/連接物和/或GCSF連接物中間體，然后將各種組分一起反應得到GCSF和所述載體的配合物，其中各組分通過所述間隔物共價連接。
10.權利要求9的方法，其中在配合物形成前將GCSF和/或所述載體修飾而得到至少一個能形成化學鍵的官能團。
11.權利要求9的方法，其中所述載體通過GCSF的Cys-17的二硫鍵、酰胺鍵、?；ｋ骆I、亞胺鍵或腙鍵共價連接到GCSF上。
12.一種在EPO和含有維生素B12或維生素B12類似物的載體之間形成的配合物，其中所述EPO和所述載體通過雙基間隔物共價連接，所述配合物能以高度親合力連接固有因子而保持EPO的生物活性。
13.權利要求12的配合物，其中所述載體通過酰胺鍵、?；ｋ骆I、亞胺鍵或腙鍵共價連接到EPO上。
14.權利要求12的配合物，具有通式V-X-A-Y-Z其中V是維生素B12或維生素B12類似物或者衍生物，其通過VB12可啉環(huán)的羧酸酯側基或通過中心鈷原子與X連接或者與引入VB12分子的官能團連接；X選自-NHNH-，-NH-，-O-，-S-，-SS-或-CH2-；并且A是任意一個取代的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-50亞烷基、環(huán)烯或芳基，直鏈中一個或多個碳原子可被N、O或S任意取代，并且其中任意選擇的取代基選自羰基、羧基、羥基、氨基和其它基團；Y是一個在A和Z之間的共價鍵，其中Y選自-NHCO-，-CONH-，-CONHNHCO-，-N＝N-，-N＝CH-，-NHCH2-，-NHN＝CH-，-NHNHCH2-，-SS-，-SCH2-，-CH2S-，-NHCRNH-，[R是O，S或NH2]，-COO-，-OCO-，并且Z是EPO。
15.權利要求12的配合物，其中所述維生素B12類似物選自氰鈷胺素(CN-Cb1)、水合鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素、羥基鈷胺素、5-甲氧芐基(氰基)鈷胺素[(5-MeOBz)CN-Cb1]；上述物質(zhì)的去二甲基、一乙酰胺及甲酰胺類似物；烷基鏈通過直接CoC共價鍵連接到可啉環(huán)上的烷基鈷胺素；氯鈷胺素、亞硫酸鈷胺素、硝基鈷胺素、硫氰酸鈷胺素、苯并咪唑(氰基)鈷胺素衍生物(包括5，6-二氯苯并咪唑、5-羥基苯并咪唑、三甲基苯并咪唑)；腺苷氰基鈷胺素[(Ade)CN-Cb1]、鈷胺素內(nèi)酯、鈷胺素內(nèi)酰胺；VB12或其類似物的N-酰苯胺、乙酰胺、一元羧酸和二元羧酸的衍生物；VB12的一元、二元和三元羧酸衍生物或者eVB12的丙酰胺衍生物；以及用鋅或鎳代替鈷的VB12類似物。
16.權利要求12的配合物，其中所述維生素B12類似物是一種其可啉環(huán)被一個不影響結合固有因子的取代基取代的類似物。
17.權利要求12的配合物，其中所述EPO與一種藥用聚合物共價相連。
18.權利要求17的配合物，其中的聚合物選自葡聚糖、菊粉、纖維素、淀粉及其衍生物、硫酸軟骨素、聚[N-α-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺]及其衍生物、苯乙烯-馬來酐共聚物、二乙烯基醚-馬來酐共聚物、聚賴氨酸、聚(谷氨酸)、聚(羥丙基谷氨酰胺)、聚(乳酸)、PEG與賴氨酸或其它氨基酸通過共價鍵形成的水溶性聚氨基甲酸乙酯及支鏈多肽。
19.權利要求17的配合物，其中所述藥用聚合物在人或動物體內(nèi)可生物降解。
20.一種在EPO和選自維生素B12或維生素B12類似物的載體之間制備配合物的方法，其包括將一種或兩種所述載體和EPO與具有末端活性基團的雙基間隔物反應形成載體/連接物和/或EPO連接物中間體，然后將各種組分一起反應得到EPO和所述載體的配合物，其中各組分通過所述間隔物共價連接。
21.權利要求20的方法，其中在衍生化前將EPO和/或所述載體修飾而得到至少一個能形成化學鍵的官能團。
22.權利要求20的方法，其中所述載體通過酰胺鍵、酰基酰肼鍵、亞胺鍵或腙鍵共價連接到EPO上。
23.一種用于檢測蛋白質(zhì)或肽的隱埋硫醇基的試劑，所述試劑包括維生素B12(或其類似物)或更一般的能通過視覺或者儀器方法檢測的標記物的配合物，其與一個雙基間隔物共價連接，所述間隔物具有能與所述蛋白質(zhì)或肽中的游離硫醇形成共價鍵的末端活性基團。
24.權利要求23的試劑，其中所述間隔物具有1-50個原子的骨架。
25.權利要求23的試劑，具有通式V′-X-A-Y′其中，V′是維生素B12或維生素B12類似物，其通過VB12可啉環(huán)的羧酸酯側基或者通過中心鈷原子與X連接，或連接到VB12分子引入的官能團上，或者v′是一個通過視覺或儀器方法可檢測標記物；X選自-NHCO-，-CONH-，-CONHNHCO-，-N＝N-，-N＝CH-，-NHCH2-，-NHN＝CH-，-NHNHCH2-，-SS-，-SCH2-，-CH2S-，-NHCRNH-，[R是O，S或NH2]，-COO-，-OCO-；A是一個任意取代的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-50亞烷基、環(huán)烯或芳基，鏈中一個或多個碳原子可被N、O或S任意選取代，并且其中任意選擇的取代基選自羰基、羧基、羥基、氨基或其它基團；Y′是一個能與硫醇反應得到穩(wěn)定共價鍵的官能團。
26.權利要求25的試劑，其中Y′選自碘乙酰基、溴乙酰基、氯乙?；?、馬來酰亞氨基、3-羧基-4-硝基苯基二硫基或2-吡啶二硫基。
27.權利要求23的試劑，其中所述標記物選自發(fā)色團、催化劑、熒光化合物、化學發(fā)光化合物、放射性同位素、膠體金屬及非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、抗體或抗原、生物素、抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、膠乳顆粒、脂質(zhì)體或其它含有信號產(chǎn)生物質(zhì)的囊泡。
28.一種藥用組合物，其含有與藥用載體或賦形劑任意結合的一種權利要求1至8或者12至19的配合物。
29.一種對用GCSF或EPO治療敏感的患者治療的方法，其包括對所述患者給予治療有效量的權利要求1至8或12至19任意一項中的配合物，或者權利要求28的組合物。
30.使用權利要求1至8或12至19任意一項中的配合物生產(chǎn)藥物的用途。
31.使用權利要求1至8或12至19任意一項中的配合物生產(chǎn)藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了VB
文檔編號C07K17/08GK1126436SQ94192684
公開日1996年7月10日 申請日期1994年5月24日 優(yōu)先權日1993年5月24日
發(fā)明者G·J·羅素-瓊斯, S·W·韋斯特伍德 申請人:澳州生物科技公司