專利名稱：一種豬小腸抗菌肽pr39的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，屬于生物制藥技術領域。
背景技術：
近年來，豬病日益增多，尤其是藥物的濫用使很多病菌產(chǎn)生了耐藥性，一些變異毒株的出現(xiàn)更是給復雜的豬病預防增加了困難，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生很大阻礙仔豬腹瀉及各種病毒性疾病如豬瘟呼吸與繁殖綜合征等一直是養(yǎng)殖業(yè)棘手的疾病。目前，母豬和仔豬保健越來越被人們所認識，但這也是擺在人們面前的一個難題?？咕牡膽?，能夠很好地解決這個問題。 抗菌肽是生物體在抵御病原性微生物時產(chǎn)生的一類防御性小肽，是生物免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。廣泛地存在于昆蟲、植物、動物以及人體內(nèi)?？咕木哂蟹翘禺愋钥垢锾m陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、病毒的作用以及殺傷腫瘤細胞的作用，但對正常的真核細胞無毒或低毒。目前，抗菌肽廣泛應用于動物基因工程、藥物開發(fā)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等多個領域。應用抗菌肽可以促使母豬發(fā)情，增加母豬奶水，提高仔豬整齊度，減少弱豬和僵豬，預防仔豬下痢、腹瀉，同時還可以促進采食和提高生長速度。豬群出現(xiàn)疾病時，在飼料中添加抗菌肽或口服抗菌肽液，可以很快控制疾病蔓延并縮短恢復期，說明它對很多疾病有輔助治療作用，臨床上現(xiàn)在也開始應用抗菌肽預防和治療很多疾病，諸如豬瘟，豬丹毒，豬鏈球菌病，附紅細胞體病，藍耳病等，都取得了極好的效果。由于腸道組織結構復雜，雜蛋白種類繁多，目前采用的提取抗菌肽的技術，操作復雜,往往要經(jīng)過多次分離純化才能得到純化的抗菌肽,浪費成本,而且收率也不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，以解決病毒對藥物產(chǎn)生耐藥性,降低成本,提高收率。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案在于提供一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，具體步驟如下I)取豬小腸粘膜用滅菌生理鹽水沖洗；2)按照20ml/g的比例加入體積分數(shù)4-5%的乙酸冰水混合物，搗碎制勻漿；3) 90_100°C水浴 lOmin，后迅速冷卻至 0_10°C ；4)離心，取上清液置冰上超聲波裂解30s，4°C攪拌浸提，再離心，取上清液；5)將離心的沉淀物用等體積的體積分數(shù)4-5%的乙酸混合，攪拌浸提，離心，取上清液；6)合并步驟4)和步驟5)得到的上清液，調(diào)節(jié)pH=5_6. 5，離心，取上清液；7)將上清液上樣于S印hadex G2100凝膠柱層析，收集洗脫液；8)采用瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體的抗菌性，收集有抑菌作用的洗脫液，得到仔豬小腸抗菌肽PR39，真空冷凍干燥保存。
所述的S^hadex G2100層析洗脫液為O. 2mol/L乙酸鈉溶液，恒流泵的速度為30r/mino所述的離心溫度為4°C,轉速為8000r/min,時間為30min。本發(fā)明采用S^hadex G2100凝膠柱層析，與現(xiàn)有技術相比，一次性可以得到豬小腸抗菌肽PR39，去除了大分子物質(zhì)，方法簡單，節(jié)約了時間和成本，得到的豬小腸抗菌肽純
度更高。本發(fā)明采用屠宰場廢棄物的腸粘膜中提取抗菌肽，有效的利用了廢棄物，不僅減少了環(huán)境的污染，而且變廢為寶，具有良好的經(jīng)濟效益。本發(fā)明工藝簡單，成本低廉，超聲裂解是讓其中的蛋白釋放出來，采用分離柱層析去除了大多數(shù)的雜蛋白，可一次獲得純化的抗菌肽，提取率高。本發(fā)明制備的抗菌肽能克服抗生素所產(chǎn)生的耐藥性和疫苗所產(chǎn)生的副作用的缺點，對機體沒有毒害作用。
具體實施例方式實施例I本實施例提供的豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，具體步驟如下I)取豬小腸，去掉脂肪和內(nèi)容物，稱取20g小腸粘膜，用滅菌生理鹽水沖洗；2)按照20ml/g的比例加入體積分數(shù)5%的乙酸冰水混合物，經(jīng)組織搗碎機制成勻漿；3) 100°C水浴lOmin，后迅速冷卻至(TC ；4) 4 °C, 8000rpm離心30min，取上清液置冰上超聲波裂解30s，4 °C攪拌浸提，8000rpm離心30min,取上清液；5)將離心的沉淀物用等體積的體積分數(shù)5%的乙酸混合，再次攪拌浸提，8000rpm離心30min,取上清液；6)合并步驟4)和步驟5)得到的上清液,調(diào)節(jié)pH=6,8000rpm離心30min,取上清液；7)將上清液上樣于Sephadex G2100凝膠柱層析,用O. 2mol/L乙酸鈉洗脫,恒流泵的速度為30r/min,經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測后用自動收集器收集,每管I. 5mL ；8)采用瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌抗菌性，收集有抑菌作用的洗脫液，得到豬小腸抗菌肽PR39，真空冷凍干燥保存。實施例2本實施例提供的豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，具體步驟如下I)取豬小腸，去掉脂肪和內(nèi)容物，稱取20g小腸粘膜，用滅菌生理鹽水沖洗；2)按照20ml/g的比例加入體積分數(shù)4. 5%的乙酸冰水混合物，經(jīng)組織搗碎機制成勻漿；3) 90°C水浴lOmin，后迅速冷卻至5°C ；4) 4 °C, 8000rpm離心30min，取上清液置冰上超聲波裂解30s，4 °C攪拌浸提，8000rpm離心30min,取上清液；5)將離心的沉淀物用等體積的體積分數(shù)4. 5%的乙酸混合，再次攪拌浸提，8000rpm離心30min,取上清液；
6)合并步驟4)和步驟5)得到的上清液,調(diào)節(jié)pH=6. 5,8000rpm離心30min,取上
清液；7)將上清液上樣于Sephadex G2100凝膠柱層析,用O. 2mol/L乙酸鈉洗脫,恒流泵的速度為30r/min,經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測后用自動收集器收集,每管I. 5mL ；8)采用瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌抗菌性，收集有抑菌作用的洗脫液，得到豬小腸抗菌肽PR39，真空冷凍干燥保存。實施例3本實施例提供的豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，具體步驟如下I)取豬小腸，去掉脂肪和內(nèi)容物，稱取20g小腸粘膜，用滅菌生理鹽水沖洗；

2)按照20ml/g的比例加入體積分數(shù)4%的乙酸冰水混合物，經(jīng)組織搗碎機制成勻漿；3) 95°C水浴lOmin，后迅速冷卻至10°C ；4) 4 °C, 8000rpm離心30min，取上清液置冰上超聲波裂解30s，4 °C攪拌浸提，8000rpm離心30min,取上清液；5)將離心的沉淀物用等體積的體積分數(shù)4%的乙酸混合，再次攪拌浸提，8000rpm離心30min,取上清液；6)合并步驟4)和步驟5)得到的上清液,調(diào)節(jié)pH=5,8000rpm離心30min,取上清液；7)將上清液上樣于Sephadex G2100凝膠柱層析,用O. 2mol/L乙酸鈉洗脫,恒流泵的速度為30r/min,經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測后用自動收集器收集,每管I. 5mL ；8)采用瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌抗菌性，收集有抑菌作用的洗脫液，得到豬小腸抗菌肽PR39，真空冷凍干燥保存。
權利要求
1.一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，其特征在于，具體步驟如下 1)取豬小腸粘膜用滅菌生理鹽水沖洗； 2)按照20ml/g的比例加入體積分數(shù)4-5%的乙酸冰水混合物，搗碎制勻漿； 3)90-100°C水浴lOmin，后迅速冷卻至0_10°C ； 4)離心，取上清液置冰上超聲波裂解30s，4°C攪拌浸提，再離心，取上清液； 5)將離心的沉淀物用等體積的體積分數(shù)4-5%的乙酸混合，攪拌浸提，離心，取上清液； 6)合并步驟4)和步驟5)得到的上清液，調(diào)節(jié)pH=5-6.5，離心，取上清液； 7)將上清液上樣于S印hadexG2100凝膠柱層析，收集洗脫液； 8)采用瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體的抗菌性，收集有抑菌作用的洗脫液，得到豬小腸抗菌肽PR39，真空冷凍干燥保存。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，其特征在于，所述的Sephadex G2100層析洗脫液為O. 2mol/L乙酸鈉溶液，恒流泵的速度為30r/min。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，其特征在于，所述的離心溫度為4°C,轉速為8000rpm/min,時間為30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬小腸抗菌肽PR39的制備方法，具體步驟如下1)取豬小腸粘膜，沖洗；2)加入體積分數(shù)4-5%的乙酸冰水混合物，搗碎制勻漿；3)沸水浴10min，冷卻至0-10℃；4)離心，上清液超聲波裂解30s，攪拌浸提，離心，取上清液；5)沉淀物用體積分數(shù)4-5%的乙酸混合，攪拌浸提，離心，取上清液；6)合并上清液，離心，取上清液；7)將上清液上樣于Sephadex G2100凝膠柱層析，收集洗脫液；8)采用瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體的抗菌性，收集有抑菌作用的洗脫液，得到豬小腸抗菌肽PR39，真空冷凍干燥保存。本發(fā)明工藝簡單，成本低廉，去除了大多數(shù)的雜蛋白，提取率高。
文檔編號C07K14/47GK102816226SQ20121030597
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權日2012年8月23日
發(fā)明者吳紅云, 韓改會, 徐進 申請人:鄭州后羿制藥有限公司