專利名稱：一種通用的載藥系統及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領域，尤其是涉及給藥技術領域。利用本發(fā)明的載藥系統可以將目前已有的或將來面世的蛋白質或多肽藥物進行升級換代，解決目前蛋白質或多肽藥物所面臨的在體內半衰期較短的難題。本發(fā)明制備方法簡便，適于大規(guī)模生產，適于制備目前所有的多肽蛋白類藥物。
背景技術：
長期以來蛋白質藥物已成功廣泛用于臨床治療，許多蛋白質藥物為一些疾病提供了有效和獨特的治療效果。然而，由于蛋白質藥物本身蛋白質結構的特殊性，人體能非常有效地對進入體內的蛋白質藥物進行降解和清除。不同的蛋白質藥物由于其分子大小和結構的差異，它們在人體內被降解清除的速率各異1。因此，蛋白質藥物在體內的半衰期受制于機體對這種蛋白質的清除降解效應。由于蛋白質藥物在體內半衰期短，為了達到有效的治療效果，往往采用高劑量或多次、長時間用藥，這樣一方面會增加其毒副作用，同時也給患者用藥帶來極大的不便。為了延長蛋白質藥物在體內的半衰期，從而增強其藥物的治療效果，人們希望能延緩機體對蛋白質藥物的降解清除作用。首先有人對蛋白質藥物分子本身進行修飾，從而改變機體蛋白質降解清除系統對蛋白質藥物的識別和蛋白酶分解作用2_3。例如，為了改善 IFN-α的藥代動力學，減少用藥頻率，有些制藥公司將α-干擾素與約12KD或30KD的聚乙二醇(PEG)分子共價結合在一起制備了半合成的α-干擾素藥物，稱之為聚乙二醇化干擾素(Pegglated IFN)。雖然這種聚乙二醇化干擾素可發(fā)揮α -干擾素的抗病毒生物學活性， 并且可顯著延長α-干擾素在體內的半衰期。但是這種聚乙二醇化修飾可明顯降低α-干擾素的特異性生物學比活性。同時，其半衰期延長的效果也與其結合的聚乙二醇分子的組成和結合位置有關4_5。白蛋白是血漿中的主要蛋白質，它可以與水分子、離子(如Ca2+、Na+和K+)結合，也可以與脂肪酸、激素和藥物結合。它的主要功能就是維持血漿膠體滲透壓。白蛋白在體內半衰期較長，同時它可以與一些藥物分子結合，因此，它是一種理想的藥物載體分子。它可對藥物分子提供保護作用，避免被機體過早降解清除掉，這樣可以延長藥物在體內的半衰期。例如，Andersen等人將葡萄球菌G蛋白的白蛋白功能結合區(qū)(albumin bindingdomain, ABD)與Fc受體融合在一起組成一融合蛋白。該融合蛋白可與血液中的白蛋白特異性結合，并且FC受體在體內的的半衰期大大延長。將人表皮生長因子受體2 (HER2)與ABD—起制成融合蛋白也有相同的效果6。因此，將生物或化學藥物與白蛋白結合在一起可以顯著的延長藥物在體內的半衰期，從而達到增強藥物治療效果，以及改善藥物劑量和病人用藥的適應程度。在本發(fā)明中，我們利用抗人白蛋白的單克隆抗體與白蛋白特異性結合的特點，將蛋白藥物與該抗體的特異性白蛋白結合功能區(qū)(domains)融合在一起制成融合蛋白。這樣將該融合蛋白特異性導向(targetting)與人白蛋白結合，從而達到延長蛋白藥物在人體內的半衰期和提高蛋白藥物的治療效果。在該發(fā)明中我們發(fā)現了一株能穩(wěn)定、高效、特異性地分泌與人白蛋白進行結合的抗體的雜交瘤細胞株(保藏號為CCTCC-C 2010111)。我們經 PCR技術獲得其DNA編碼序列，再經分子生物學技術構建表達HSA抗體Vh的原核表達工程菌BL21/pETa (32+)-HSA (其保藏號為CCTCC-M 2010288)。我們以該表達載體作為蛋白及多肽類藥物的載藥系統，首先選擇與α 1-干擾素的編碼序列進行融合表達，獲得表達HSA抗體 Vh 和 IFN 的融合蛋白 BL21/pETa (32+) -IFN-Fab (HSA)，簡稱 IFN-Fab (HSA)。采用我們獨特的生化分離純化方法從大腸桿菌裂解物中得到高純度的IFN-Fab(HSA)融合蛋白。體外實驗證明該融合蛋白與IFN-α 1有相同的抗病毒作用。將該融合蛋白注射到大鼠體內其半衰期比單用IFN- α 1延長6-12倍。單獨IFN- α 1和VH抗體功能區(qū)蛋白混合物一起注射不能延長IFN-α 1的半衰期。這說明IFN-Fab(HSA)融合蛋白在具有IFN-α 1的抗病毒生物學活性同時，它在體內的半衰期顯著延長，從而其臨床治療作用比IFN-α 1本身有明顯的優(yōu)勢。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種新型通用載藥系統及其制備方法。本發(fā)明的技術原理本發(fā)明利用一種能與正常人體內血漿中的白蛋白結合的基因工程抗體Vh作為載體，制作出一種通用的載藥系統。用基因工程手段將目前已有的某些蛋白質或多肽藥物進行融合表達，用于蛋白多肽類藥物的升級改造，在保證藥物藥效的同時，可以延長藥物在體內的半衰期。本發(fā)明的技術方案一方面，本發(fā)明提供了針對人血清白蛋白的抗體Vh片段，其特征在于所述片段是保藏號為CCTCC-C 2010111的雜交瘤細胞株所產生的抗體的Vh片段。保藏號為CCTCC-C 2010111，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年 11月10日，分類命名為雜交瘤細胞株1C1。另一方面，本發(fā)明提供了乂11片段，其特征在于所述片段的氨基酸序列由SEQ IDNO 4所示核苷酸序列編碼。再一方面，本發(fā)明提供了升級蛋白質或多肽藥物的方法，其特征在于將能與白蛋白特異性結合的抗體Vh與所述蛋白質或多肽藥物進行融合表達，從而形成融合蛋白，優(yōu)選地，所述能與白蛋白特異性結合的是CCTCC-C 2010111的雜交瘤細胞株所產生的抗體的Vh 片段，更優(yōu)選地，所述能與白蛋白特異性結合的VH片段由SEQ ID NO :4所示核苷酸序列編碼；其中所述的蛋白質或多肽類藥物可以是干擾素或其他。另一方面，本發(fā)明提供了根據上述方法所獲得的融合蛋白。另一方面，本發(fā)明提供了表達融合蛋白的基因工程表達載體，特征在于所述融合蛋白包含保藏號為CCTCC-C 2010111的雜交瘤細胞株所產生的抗人血清白蛋白HSA抗體的 Vh片段，保藏號為CCTCC-C 2010111，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年11月10日，分類命名為雜交瘤細胞株1C1，所述載體是BL21/ pETa(32+)-HSA基因工程表達載體(其保藏號為CCTCC-M 2010288)，保藏號為CCTCC-M 2010288，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年11 月 10 日，分類命名為 Escherichia coli BL21/pETa(32+)-HAS。另一方面，本發(fā)明還提供了一種生產蛋白質或多肽的融合蛋白藥物的方法，其特征在于所述方法包括將編碼所述蛋白質或多肽的核苷酸序列克隆至上述基因工程表達載體中，并表達融合蛋白。首先制備針對人血清白蛋白的單克隆抗體，然后通過基因工程手段擴增獲得針對人血清白蛋白抗體的Vh基因序列，將該基因序列克隆到質粒pETa(32+)表達載體，轉化至大腸桿菌BL21表達菌，通過篩選獲得能特異性分泌針對人HSA抗體Vh蛋白的大腸桿菌 BL21/pETa (32+) -HSA，通過競爭抑制試驗、IP等證實該抗體Vh蛋白能特異性與HSA結合；將目前已有的某些蛋白質或多肽藥物與BL21/pETa(32+)-HSA進行融合表達，純化該融合表達蛋白，進行動物試驗，比較通過該新型通用載藥系統改造的蛋白質或多肽藥物與未改造的蛋白質或多肽藥物在生物體內藥效和半衰期長短。制備方法按照以下步驟進行1.制備特異性針對HSA的雜交瘤細胞株(其保藏號為CCTCC-C 2010111)；2.利用RT-PCR技術以HSA雜交瘤細胞株RNA為模板獲得特異性針對HSA的抗體 Vh基因序列，克隆至PMD-18T載體，經測序鑒定后再克隆至PETa (32+)表達載體；3.經轉化至大腸桿菌BL21表達菌，通過篩選獲得能特異性分泌針對人HSA抗體Vh 的大腸桿菌 BL21/pETa(32+)-HSA(英文名 Escherichia coliBL21/pETa (32+) -HSA))基因工程表達菌(其保藏號為CCTCC-M 2010288)；4.常規(guī)發(fā)酵擴增，IPTG誘導后，經超聲破碎收集菌體上清。再經HIS親和層析柱進行層析，獲得能特異性針對HSA抗體Vh蛋白；5.通過競爭抑制試驗、IP等證實該抗體Vh蛋白能特異性與HSA結合；我們將已成功建立的大腸桿菌 BL21/pETa(32+)-HSA(Escherichia coli BL21/pETa(32+) -HSA))基因工程載藥表達系統，通過基因工程技術與目前已有的某些蛋白質或多肽藥物進行融合表達；6.動物實驗測試比較通過該新型通用載藥系統改造的蛋白質或多肽藥物與未改造的蛋白質或多肽藥物在生物體內藥效和半衰期長短。具體技術路線圖參見圖1。主要創(chuàng)新點表現在以下兩個方面(1)通過基因工程手段將能與白蛋白特異性結合的抗人白蛋白抗體Vh片斷作為載體與蛋白質多肽藥物融合表達，不但不影響藥物的藥效，同時其半衰期比常規(guī)的蛋白質/ 多肽藥物在體內延長約12倍；(2)該載體為一種通用載體，可以用于目前所有蛋白質多肽類藥物的升級改造。


圖1是本發(fā)明的具體路線圖。圖2是保藏細胞株ICl (保藏號=CCTCC-C 2010111)染色體圖。圖3. Western-blot正常人外周血清經SDS-PAGE電泳、轉移至PVDF膜，1 % Casein 封閉；加入純化的1 5000稀釋的HSA的雜交瘤細胞株(保藏號CCTCC-M 2010111)腹水， 37°C、2小時；1 1000稀釋的Biotion標記的羊抗小鼠IgG，37°C、l小時；1 1000稀釋的 Str印tavidin37°C、l 小時；DAB 顯色。圖4是RT-PCR圖，可見368bp處出現一條帶。圖5和圖6分別是實施例2中所述的測序步驟得到的序列和測序峰圖。圖7是純化pMD-18T載體質粒用SacI、HindIII (選用M buffer)進行雙酶切，電泳純化后連接入pET32a (+)，經轉化至大腸桿菌DH5 α中，提取質粒進行瓊脂糖電泳圖。圖8是插入pETa (32+)表達載體的插入片段序列圖。圖9是BL21/pETa (32+) -HSA基因工程載藥表達系統蛋白的誘導表達圖 (SDS-PAGE)。從左至右的泳道分別是Marker、0. lmol/L上清夜、0. lmol/L沉淀、0. 2mol/L 上清夜、0. 2mol/L沉淀、0. 5mol/L上清夜、0. 5mol/L沉淀、lmol/L上清夜、lmol/L沉淀、未誘導上清液以及未誘導沉淀。圖10是HIS親和層析純化示意圖。圖11是BL21/pETa(32+)-HSA基因工程載藥表達系統蛋白-特異性針對HSA抗體 VH純化蛋白純化前后的SDS-PAGE電泳圖。從左至右的泳道分別為Marker、純化前、純化后。圖12.免疫沉淀試驗的Western-bolt圖。從左至右的泳道分別為Marker、 GST-HSA-Vh、GST。圖中可見GST-HSA-Vh泳道出現一分子量約6800da的顯色條帶；GST泳道未出現。圖13是HSA抗體Vh表達蛋白競爭抑制曲線圖。圖14是插入融合表達載體的IFNAl的DNA序列。圖15是BL21/pETa (32+)-IFN-Fab (HSA)蛋白質多肽類藥物的融合表達、純化和鑒定結果，表達蛋白分子量約57kd。從左至右的泳道分別為Marker、純化前、純化后。圖16是HSA-IFN融合蛋白藥代動力學比較圖。
具體實施例方式實施例1針對人血清白蛋白特異性單克隆抗體的制備7_9]1)免疫小鼠流程取濃度為20% 的商品化人血清白蛋白(HSA)Iy 1(200 μ g)，0.0Imo l/L、pH7. 2PBS 500μ 1、福氏佐劑500μ 1，磁力攪拌器充分混勻乳化，使成油包水的乳糜狀(放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài))。具體操作如下a.初次免疫取HSA加福氏完全佐劑乳化后，于小鼠四肢及背部皮下多點注射小鼠 100 μ g/0. 5ml/ 只；b.第二次免疫間隔兩周后劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下多點注射小鼠；c.第三次免疫兩周后同第二次免疫，再次皮下多點注射小鼠。(大約一周后采血測其效價)；d.加強免疫檢測血清效價大于1 10000，取100 μ g/0. 5ml不加佐劑直接腹腔
注射；2)免疫脾細胞的制備加強免疫3天后，無菌取脾細胞，制備脾細胞懸液，具體操作如下a.脫臼法處死小鼠；
b.將小鼠放于75%酒精中浸泡消毒后，以無菌剪刀剪開其腹部取出脾臟，置于無菌的含少量培養(yǎng)液(1640培養(yǎng)液)的平皿中不銹鋼篩網上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數；c.冰浴上收集脾細胞懸液，離心去上清；d.將沉淀用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液再次離心洗滌；e.加入新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液，計數脾細胞。3)骨髓瘤細胞的制備保存于_196°C液氮罐中，融合前大約一周復蘇骨髓瘤細胞SP2/0、增殖、傳代。融合時取對數生長期(即培養(yǎng)15h 20h)的骨髓瘤細胞，用吸管吹打收集細胞懸液，洗滌計數。4)飼養(yǎng)細胞的制備具體操作如下a.脫臼處死小鼠，75%酒精浸泡消毒IOmin ；b.用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔；c.用注射器將4 5ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)液注入腹腔，用手指輕揉按摩腹部， 仍用該注射器回抽腹腔液體，移入離心管；d. 1000r/min 離心 lOmin，去上清；e.用含20%小牛血清(NCS)的RPMI-1640培養(yǎng)液混懸，調整細胞數4X 105/ml ；f.用Iml吸管將細胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ 1，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所得飼養(yǎng)細胞即可供細胞融合和克隆化之用。5)細胞融合流程細胞融合的基本步驟是將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞混合后，在PEG的作用下使兩種細胞彼此融合，將融合后的細胞適當稀釋，分置含飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。具體操作如下a.將經預先處理好的骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1 5的比例混合，在50ml塑料離心管內用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm/min，8min ；b.棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動；c.將37°C水浴中保溫的50% PEG (分子量4000)0. 8ml，緩慢滴入離心管，Imin內加完，邊滴邊搖；d.加預熱的不完全培養(yǎng)液，每隔2分鐘分別加入lml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml和10ml,
終止PEG作用。e.離心，800rpm/min，6min。f.棄上清，先用約6ml含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)輕輕混懸細胞；g.用無菌吸管將融合后細胞懸液加入含有預先接種了飼養(yǎng)細胞的96孔板， 100μ 1/孔，37°C下5% CO2孵箱培養(yǎng)。6) HAT篩選雜交瘤—般在融合24小時后，加次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT，Sigma,美國)選擇培養(yǎng)液。用時將Iml加入50ml含20%小牛血清的完全培養(yǎng)液中。由于脾細胞在體外培養(yǎng)條件下只能存活幾天，不影響雜交瘤細胞生長；而骨髓瘤細胞由于在葉酸抑制劑氨基喋呤存在時無法合成嘌呤環(huán)和胸腺嘧啶甲基而不能合成DNA，同時又因為它是HGPRT—和 TK_的缺陷型，無法利用培養(yǎng)液中的HGPRT和TK來合成DNA，因此骨髓瘤細胞在這種培養(yǎng)液中無法存活。這樣最后能在HAT培養(yǎng)液中存活的就只有雜交瘤細胞了，因為它具有兩種親代細胞的染色體，可以產生原來脾細胞所具有的HGPRT，又從骨髓瘤細胞中獲得了在細胞培養(yǎng)基中長期生存繁殖的能力。當HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)一周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)一周，改用一般培養(yǎng)液。通過選擇性培養(yǎng)而獲得的雜交細胞系中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/5面積時，即可開始檢測特異性抗HSA抗體，篩選出所需要的高分泌的雜交瘤細胞系。7)雜交瘤細胞的克隆化融合細胞呈克隆生長，經有限稀釋后每孔加入1個細胞。依據ELISA法檢測篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗HSA抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆。具體操作如下a.制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前準備)；b.收集陽性孔細胞的計數，并調節(jié)細胞數至10個細胞/ml，每孔加入細胞懸液 100μ 1 ；c.培養(yǎng)4 5天后，補加完全培養(yǎng)液200 μ 1/孔;d.第8 9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗HSA抗體檢測。8)抗HSA單克隆抗體腹水的制備篩選出的陽性抗HSA雜交瘤細胞株IC1應及早進行抗HSA單克隆抗體的大量制備。 本實驗采用的是小鼠腹腔接種法，在小鼠體內接種抗HSA雜交瘤細胞，制備腹水。具體操作如下a.腹腔注射液體石蠟于BALB/C鼠，0. 5ml/只；b. 1 2周后，同法對上述小鼠進行腹腔注射1 X IO6個雜交瘤細胞；c.接種細胞7 10天后可產生腹水，此時小鼠腹部明顯隆起，手觸有波動感，用 16號針頭采集腹水；d.將收集到的腹水4°C低溫1500r/min離心30min，收集上清。9)抗HSA單克隆抗體的純化腹水特異性抗HSA抗體的濃度較抗血清中的高，純化效果好。本實驗采用的是飽和硫酸銨沉淀法，具體操作如下a.配制飽和硫酸銨溶液(SAS)將767g(NH4)2S04邊攪拌邊慢慢加到1升蒸餾水中。用氨水調到PH 7.4 ；b.沉淀將小鼠腹水用生理鹽水等體積稀釋，緩慢邊加邊攪拌加入等體積的SAS 到上清液中，終濃度為1 l(v/v)；置4°C過夜，使蛋白質充分沉淀，次日取出，于4°C冷凍離心，棄上清，沉淀物用生理鹽水復溶至2倍腹水體積，再次緩慢邊加邊攪拌加入1倍體積的SAS ；如此，反復一次；沉淀物用生理鹽水，復溶，于4°C冷凍離心，收集上清；c.透析取上述處理后的上清轉移至透析袋中，用O.Olmol/L、pH7.4PBS透析 (4°C )，期間更換換透析緩沖液數次，以徹底除去硫酸銨，衲氏試劑檢測無NH4+ ；d.將收集到的透析液離心，收集上清液用PEG-20000濃縮，裝入瓶中，加保護劑， 4°C冰箱保存。10) Protein-G親和層析純化抗HSA抗體(略)11)抗體的效價、染色體鑒定見(圖2)、特異性鑒定見(圖3)實施例2針對人血清白蛋白的抗體Vh基因序列的克隆、鑒定及表達按實驗室分子生物學技術常規(guī)，以實施例1中得到的抗人血清白蛋白(HSA)的雜交瘤細胞株 RNA 為模板，5，-GT GGC GGA GGA TCC GAG GTG MAG CTK SffS GAGTC-3，(SEQ ID NO 1)為上游引物，5，-TGA GGA GAC KGT GAS HRff GGT CCC-3，(SEQ ID NO 2)為下游引物， 通過RT-PCR(見圖4)擴增獲得特異性針對HSA單克隆抗體的Vh基因序列，克隆至pMD_18T 載體，經測序鑒定(見圖5或SEQ IDNO :3，以及圖6)及雙酶切鑒定(見圖7)后，再將目的序列(見圖8，或SEQ IDNO 4)插入pETa(32+)表達載體的SacI、HindIII酶切位點之間；轉化至大腸桿菌DH5ci進行質粒鑒定、純化、擴增；將鑒定得到的陽性質粒再轉化至大腸桿菌 BL21中，常規(guī)挑選等最終建立大腸桿菌BL21/pETa(32+)-HSA(英文名Escherichia coli BL21/pETa(32+)-HSA)表達工程菌，即BL21/pETa (32+)-HSA基因工程載藥表達系統。實施例3BL21/pETa(32+)-HSA基因工程載藥表達系統蛋白的誘導表達具體實施步驟1)將最終建立大腸桿菌 BL21/pETa(32+)-HSA(英文名EscherichiacoliBL21/ pETa (32+) -HSA)表達工程菌，即BL21/pETa (32+)-HSA基因工程載藥表達系統工程菌。常規(guī)接種至5ml LB培養(yǎng)基，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)活化6小時；2)將活化細菌，轉種至含100 μ g/ml氨芐青霉素的500ml LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)至0D600至0. 6，加入0. 5mmol/L IPTG，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，誘導表達4小時;3)培養(yǎng)結束，收集細胞沉淀，生理鹽水洗滌3次，加入IOml含1 μ g/mlAprotinin, Leup印tin，100 μ g/ml PMSF 細胞裂解液；4)冰浴超聲破碎，超聲5s、停10s、40次；5) 4 "C、10000RPM 離心沉淀；6)收集上清，備用；7)經SDS-PAGE(見圖9)鑒定證實，表達良好。實施例4BL21/pETa(32+)-HSA基因工程載藥表達系統蛋白的純化取實施例3 表達蛋白，先用 0. 02mol/L、pH 7. 4 7. 6PBS+0. 5mol/LNaCl 平衡，經 0. 22 μ m孔徑針頭濾器過濾后，利用HIS親和層析柱(Chelating)進行純化；具體過程參見圖10所示流程圖。獲得能特異性針對HSA抗體VH純化蛋白，參見圖11。實施例5BL21/pETa(32+)-HSA基因工程載藥表達系統與HSA特異性結合的驗證1.利用純化的特異性針對HSA抗體Vh蛋白具有GST融合蛋白特性，進行免疫沉淀試驗，具體實施方案1)取 20 μ 1 GST-Beads 用 0. 01mol/L、PH7. 2、PBS 緩沖液離心洗滌三遍；2)棄上清，用Iml 0. Olmol/L、PH7. 2、PBS緩沖液懸浮沉淀物并等分成兩份，其中一份加入特異性針對HSA抗體VH純化蛋白10 μ 1，另一份加入GST 10 μ 1 ；3)用振蕩器振蕩混合(緩慢)，4°C過夜；4)用PBS_Tween20離心洗滌三次；5)1% Casein 于 37°C封閉 1 小時；6)用PBS_Tween20離心洗滌三次；7)將沉淀物用0. 5ml 0. 01mol/L、PH7. 2,PBS緩沖液懸浮，同時加入10 μ 1正常人
血清；8) 37°C振蕩器振蕩混合2小時；9)用PBS-Tween 20離心洗滌三次；10)分別向沉淀物中加入 50 μ 1 IX SDS-PAGE Buffer ；11)水浴煮沸5分鐘；12)常規(guī)上樣，進行Western-bolt，結果見圖12。圖中可看到GST-HSA-VH泳道出現一分子量約6800da的顯色條帶；GST泳道未出現。表明針對HSA的抗體VH蛋白可與HSA 特異性結合。2.利用ELISA進行競爭抑制試驗1)HSA用0.05mol/L、pH 9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋為100ng/ml，加入ELISA板中， 100 μ 1/孑L ；2)置4 °C濕盒過夜；3)次日棄上清，每次拍干，PBS-Tween20洗滌三次；4)加入 Casein，37°C、l 小時；5)棄上清，拍干;6)加入梯度稀釋的VH表達蛋白50μ 1 (濃度分別為:1、0·5、0·25.......Ug/
ml);同時加入1 2500稀釋的ICl腹水50μ 1 ；7)37°C、1 小時;8)棄上清，PBS-Tween20洗滌三次，拍干；9)加入 1 5000 稀釋的 HRP-羊抗鼠 IgG 100 μ 1 ；10)37°C、1 小時;11)棄上清，PBS-Tween20洗滌三次，拍干；12)TMB顯色，測定0D450值，并繪制抑制曲線，結果見圖13。實施例6BL21/pETa (32+)-IFN-Fab (HSA)(簡稱 IFN-Fab(HSA))基因工程載藥表達系統與蛋白質多肽類藥物的融合表達、純化和鑒定1)通過擴增 DH5 α /pETa (32+) -HSA 及 DH5 α /pETa (32+)-IFN 表達菌，分別提取質粒。分別經HindIII及EcoR I進行雙酶切，經膠回收獲得DH5 α/pETa(32+)-HSA表達載體及IFN基因片段(插入序列見圖14或SEQ IDNO :5)。經連接轉化后獲得DH5 α / pETa (32+)-IFN-Fab (HSA)融合表達載體。再經擴增提取表達質粒，轉化至大腸桿菌BL21獲得BL21/pETa(32+)-IFN-Fab (HSA)表達菌。具體過程同實施例3，進行蛋白質多肽類藥物的融合表達、純化和鑒定(見圖15)。2)取純化的BL21/pETa(32+)-IFN-Fab (HSA)融合表達蛋白用細胞病變法檢測其抗病毒活性，具體方法參照2010版《中國生物制品鑒定規(guī)程》，附錄XC，干擾素生物學活性測定法(細胞病變抑制法)1103O結果抗病毒比活性彡8. 5X 108IU/mg。實施例7BL21/pETa (32+) -IFN-Fab (HSA)(簡稱 IFN-Fab (HSA))載藥表達系統-蛋白質多肽融合蛋白藥物的動物試驗1)取純化后的BL21/pETa (32+)-IFN-Fab (HSA)融合表達蛋白和IFNAl蛋白藥物腹腔分別注射體重約20g昆明小鼠，每組各五只，每只注射IOyg;2)分別于注射前和注射后 15、30、60、90、120、180、360、720、1440、2160、2800 分鐘
尾靜脈采血，分離血清，_20°C保存?zhèn)溆茫?)用ELISA試劑盒分別檢測檢測血清中IFN含量；4)取各組每一時間點IFN含量均值制作藥代動力學曲線(見圖16)；5)結果血藥濃度達峰時間均為約1. 5小時，消除半衰期為IFN Al約3小時，而 BL21/pETa(32+)-IFN-Fab (HSA)融合表達蛋白消除半衰期為IFN Al約36小時；6)綜上所述，動物試驗效果比較發(fā)現BL21/pETa (32+)-IFN-Fab (HSA)載藥表達系統_蛋白質多肽融合蛋白藥物較IFN Al蛋白藥物半衰期延長約12倍。參考文獻1. Reid, R.E. :Peptide and Protein Drug Analysis. Marcel Dekker, Inc.20002.Shibata,H et al =Molecules 10 =162,20053. Fro kjaer，S&Otzen，D，E. :Nat. Rev. Drug. Discov. 4 :298, 20054. Shepherd, J. et al :Health Technol Assess. 8 1,20045. Taliani, G.et al :G. et al =Gastroenterol. 130 =1098,20066. Andersen, J. T. et al :J Biol Cheal. 286 :5324，20107.蔡美英等，分泌抗人聚白蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及其應用?！度A西醫(yī)大學報》1989,20(02) 134 136。8.封平等，重組IL-I受體拮抗劑單克隆抗體的鑒定。華西醫(yī)大學報，1997 ；13(2) 94 95。9.抗人乳腺癌單克隆抗體AF9的制備及鑒定。華西醫(yī)大學報，1994 ；25 (4) :380 383。10.《中華人民共和國藥典》2010版第三部，生物制品鑒定規(guī)程，《附錄XC干擾素生物活性測定法》附錄71 72。
權利要求
1.針對人血清白蛋白的抗體Vh片段，其特征在于所述片段是保藏號為CCTCC-C 2010111的雜交瘤細胞株所產生的抗體的Vh片段。
2.根據權利要求1所述的Vh片段，其特征在于所述片段的氨基酸序列由SEQID NO 4 所示核苷酸序列編碼。
3.根據權利要求1或2所述的Vh片段的核苷酸，其特征在于所述核苷酸的序列是SEQ ID NO 4所示序列。
4.修飾蛋白質或多肽類藥物的方法，其特征在于將能與白蛋白特異性結合的短肽與所述蛋白質或多肽類藥物融合表達，從而形成融合蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述能與白蛋白特異性結合的短肽是權利要求1或2 片段。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述蛋白質或多肽類藥物是干擾素。
7.根據權利要求4-6任一項所述的方法，其特征在于所述修飾延長了所述蛋白質或多肽類藥物的半衰期。
8.根據權利要求4-7任一項的方法所獲得的融合蛋白。
9.表達融合蛋白的基因工程表達載體，特征在于所述融合蛋白包含權利要求1或2的 Vh片段，所述載體是BL21/pETa (32+) -HSA基因工程表達載體。
10.一種生產蛋白質或多肽的融合蛋白藥物的方法，其特征在于所述方法包括將編碼所述蛋白質或多肽的核苷酸序列克隆至權利要求9的基因工程表達載體中，并表達包含權利要求1或2的Vh片段的融合蛋白。
全文摘要
一種通用的載藥系統及制備方法。本發(fā)明提供了一種升級改造蛋白質或多肽藥物的方法，所述方法包括將能與白蛋白特異性結合的抗HSA抗體的VH基因與所述蛋白質或多肽藥物基因進行融合表達，從而形成融合蛋白。具體而言，所述方法包括將編碼所述蛋白質或多肽的核苷酸序列克隆至BL21/pETa(32+)-HSA基因工程表達載體中，并表達包含保藏號為CCTCC-C2010111的雜交瘤細胞株所產生的抗體的VH片段的融合蛋白。
文檔編號C07K16/18GK102199208SQ20111004895
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者周俊, 褚崢 申請人:武漢吉天朋生物科技發(fā)展有限公司