專利名稱：抗體治療的制作方法
抗體治療相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是2003年10月8日申請(qǐng)的中國(guó)國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?00380105383. 9，國(guó)際申請(qǐng) 號(hào)為PCT/US2003/031801，發(fā)明名稱為“抗體治療”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)是遞交于2003年5月2日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/467，161的部分后續(xù)。本 申請(qǐng)還要求遞交于2002年10月11日的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US/02/32307的優(yōu)先權(quán)，而PCT/ US/02/32307則依次要求遞交于2002年10月8日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/416，531的優(yōu)選 權(quán)。
背景技術(shù)：
A.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療表達(dá)癌胚抗原(“CEA “)的癌癥，特別是甲狀腺髓樣癌(MTC)、非 甲狀腺髓樣癌(non-MTC)、結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、肺癌、乳癌和其它表達(dá)CEA的癌癥 的方法，其中所述治療是通過(guò)給藥一種包含一種與至少一種其它治療劑組合的抗體的免疫 試劑，所述的其它治療劑如另一種抗體、化學(xué)治療劑、放射劑、反義寡核苷酸、免疫調(diào)節(jié)物、 免疫偶聯(lián)物或其結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含免疫試劑和至少一種以非偶聯(lián)形式存在的治 療劑的藥物組合物。特別地，本發(fā)明涉及通過(guò)在給藥治療劑之前、同時(shí)或之后給藥III類抗 癌胚抗原(抗“CEA”)單克隆抗體(“MAb”)，特別是具有結(jié)合親和性特性和相應(yīng)的鼠III 類抗-CEA MAb的特異性的MAb，更加特別地是具有多種人抗體的抗原性和效應(yīng)子特性的人 源化的、嵌合的或人的MAbs，來(lái)治療表達(dá)CEA的癌癥的方法。在治療的方法中特別有用的 MAbs是人源化的MAbs，其中將抗CEA的鼠MAb的互補(bǔ)決定區(qū)(“CDRs”)移植入人抗體的框 架區(qū)。B.背景CEA是一種通常在許多種上皮癌癥中表達(dá)的癌胚抗原，所述上皮癌癥是那些大 多數(shù)出現(xiàn)在結(jié)腸還有在乳房、肺、胰、甲狀腺(髓型)和卵巢中的癌癥(Goldenberg等，J Natl. CancerInst. 57 :11_22 (1976)，Shively,等，Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 :355_399 (1985))。一開始CEA被認(rèn)為是結(jié)腸直腸癌的腫瘤特異性抗原(Gold等，J Exper. Med. , 122 467(1965))。但是，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它存在于多種癌、良性腫瘤和病理組織中，以及正常的人結(jié)腸 中(Shively 等，Crit. Rev. Oncol. Hemato.，2 355(1985) ；von Kleist 等，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. ,69 :2492(1972))。CEA已經(jīng)顯示通過(guò)同型和異型相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞吸 附，這接著提示了 CEA在腫瘤發(fā)生的各個(gè)方面的作用。限于甲狀腺的甲狀腺髓樣癌(MTC)是可以通過(guò)甲狀腺全部切除和中樞淋巴節(jié)解 剖而冶愈的。但是，病癥在這些病人的大約50%中復(fù)發(fā)。此外，患有不可切除的疾病或遠(yuǎn) 端轉(zhuǎn)移的病人的預(yù)后很糟，小于30%的病人存活10年(Rossi等，Amer. J Surgery, 139 554(1980) ；Samaan 等，J Clin. Endocrinol. Metab. ,67 801(1988) ；Schroder 等，Cancer, 61 :806(1988)。這些病人剩下不多的治療機(jī)會(huì)(Principles and Practice of Oncology, DeVita, Hellman 和 Rosenberg (編輯)，紐約JB Lippincott Co. 1333-1435 (1989)； Cance等，Current Problems Surgery，22 :1 (1985))?；焹r(jià)值不大而放療僅可用于控制局部疾病(Cance等；Tubiana等，Cancer，55 :2062 (1985))。因而，需要新的治療形式以控 制這種疾病。一種對(duì)癌癥治療和診斷有用的方法包括利用靶向抗體直接向腫瘤位點(diǎn)遞送治療 劑和診斷劑。在過(guò)去的十年中，已經(jīng)發(fā)展了許多腫瘤特異性抗體和抗體片段，以及將抗體 偶聯(lián)結(jié)合到如藥物的治療劑、毒素、放射性核素、如細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)劑和其它藥劑上， 并且將靶向腫瘤的偶聯(lián)物對(duì)病人給藥的方法。但是，用復(fù)合以鼠單克隆抗體(它是最常 用的對(duì)于人的靶向抗體)的藥物或放射性核素治療的病人產(chǎn)生循環(huán)性的人抗小鼠抗體 (HAMAs)，有些時(shí)候產(chǎn)生對(duì)偶聯(lián)物的抗體部位的一般性的立即的III型過(guò)敏性反應(yīng)。但是 通過(guò)由許多不同的方法令這些鼠抗體的免疫原性更少已經(jīng)使得這些問(wèn)題最小化了，所述方 法包括通過(guò)化學(xué)修飾靶向抗體，如通過(guò)將聚乙二醇偶聯(lián)到靶向抗體上(聚乙二醇化)，或通 過(guò)鑒定抗體中的抗原性位點(diǎn)并且隨后將它去除來(lái)產(chǎn)生人源化的、嵌合的或人的抗體；例如， Fab'、F(ab)2和其它代替完整的IgG使用的抗體片段。此外，已經(jīng)通過(guò)血漿去除將HAMA從 血中除去來(lái)進(jìn)行減少HAMA副作用的嘗試。還使用抑制免疫力的技術(shù)來(lái)改善外源抗體的副 作用，所述外源抗體足以允許與靶向藥劑一起進(jìn)行多次治療盡管有這些治療進(jìn)步，依然存在提供更有效的治療表達(dá)CEA的癌癥的方法的需 要。本發(fā)明提供利用抗CEA抗體，如在美國(guó)專利號(hào)5，874，540和Hansen等，Cancer, 71 3478(1993)中所介紹的III類抗CEAMAb鼠MN_14MAb，和也是在美國(guó)專利號(hào)5，874，540中 所介紹的III類抗CEA MAb的嵌合的和人源化的MN-14，以及在Primus等的美國(guó)專利號(hào) 4，818，709中所定義的NP-4，在此將所有文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。優(yōu)選地，III類抗 CEA MAb是人源化的，并且與一種治療劑，特別是一種化療劑相結(jié)合使用，以用最小的毒性 產(chǎn)生對(duì)表達(dá)CEA的癌癥有效的治療。此外，其它的抗CEA抗體，如II類MAbs，例如，MN-6 (見 Hansen 等，同上)，和 NP-3 (見 U. S. 4，818，709)，和 I 類 MAbs，如 MN-3 和 MN-15 (也見 Hansen 等，同上)提供了治療表達(dá)CEA的癌癥的有效方法。另外，這兩種組分的分別給藥提供了增 強(qiáng)的結(jié)果以及適用于個(gè)別治療方法的多用性和靈活性。發(fā)明概述本發(fā)明中所要保護(hù)的是治療甲狀腺髓樣癌和非甲狀腺髓樣癌的組合物和方法。本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案是一種至少包含至少一種抗CEA單克隆抗體(MAb)或其 片段和至少一種治療劑的組合物，所述抗CEA單克隆抗體(MAb)或其片段優(yōu)選為一種III 類抗CEA MAb或片段。優(yōu)選地，抗體片段選自F(ab' )2、Fab'、Fab、Fv和scFv。還要優(yōu)選 地，III類抗CEA MAb或其片段是嵌合性的MAb，并且其中嵌合性的MAb基本保留鼠III類 抗CEA MAb的III類抗CEA結(jié)合部位。仍然要優(yōu)選地，III類抗CEA MAb或其片段為完整 的人MAb，并且其中所述完整的人MAb基本保留鼠III類抗CEA MAb的III類抗CEA結(jié)合部 位。其它優(yōu)選的為此目的的抗CEA MAbs包括II類MAbs或其片段，它不是本文中更詳細(xì)討 論的⑶66a-d交互反應(yīng)性的。另一個(gè)實(shí)施方案包括II類MAbs或其片段，它可以與⑶66a、 b和d反應(yīng)但不與⑶66c或I類Mabs或其片段反應(yīng)，I類Mabs或其片段與⑶66a、b和d以 及⑶66c反應(yīng)(通過(guò)定義I類Mab結(jié)合⑶66c)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，III類抗CEA單克隆抗體或其片段優(yōu)選為MN-14抗 體或其片段。更加優(yōu)選地，MN-14抗體或其片段包含鼠MN-14單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū) (⑶Rs)，其中MN-14抗體的輕鏈可變區(qū)的⑶Rs包含含有氨基酸序列KASQDVGTSVA的⑶Rl ；含有氨基酸序列WTSTRHT的⑶R2 ；和含有氨基酸序列QQYSLYRS的⑶R3 ；并且III類抗CEA 抗體的重鏈可變區(qū)的CDR s包含含有TYWMS的CDRl ；含有EIHPDSSTINYAPSLKD的CDR2 ；和 含有LYFGFPWFAY的CDR3。還要優(yōu)選地，MN-14單克隆抗體與CEA反應(yīng)并且與正常的交叉反 應(yīng)抗原(NCA)和胎糞抗原(MA)不反應(yīng)。最優(yōu)選地，MN-14單克隆抗體或其片段是人源化的、 嵌合的或完整的人MN-14抗體或其片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化MN-14抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的框架區(qū) (FRs)包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14單克隆抗體的相應(yīng)FR s的取代的氨基酸。具體地，人源 化MN-14抗體或其片段優(yōu)選包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14抗體的相應(yīng)FR的氨基酸，所述氨基 酸選自

圖14A-C的鼠重鏈可變區(qū)(KLHuVhAIGA)的氨基酸殘基24 (A)、28 (D)、30 (T)、48 (1)、 49 (G), 74 (A)和94(S)。同樣地，人源化的MN-14抗體或其片段還可以包含至少一個(gè)來(lái)自所 述鼠MN-14輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)FR的氨基酸。仍然要優(yōu)選地，人源化的MN-14抗體或其片段 包含如圖13A所示的輕鏈可變區(qū)，以及圖14A-C中所示標(biāo)明為KLHuVhAIGA的重鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑選自裸抗體、細(xì)胞毒性劑、藥物、放射性核 素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療劑、免疫偶聯(lián)物、激素或其組合，優(yōu)選配制在一種可藥用的載體 中。這里還要求治療劑不是達(dá)卡巴嗪(DTIC)。本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案描述了 一種治療髓性以及非髓性甲狀腺髓樣癌的方法， 包括同時(shí)或按順序向受試者給藥治療有效量的III類抗CEA單克隆抗體或其片段以及至 少一種治療劑，并且優(yōu)選配制在一種可藥用的載體中。優(yōu)選地，抗體片段選自F(ab' )2、 Fab'、Fab、Fv和scFv。還要優(yōu)選地，III類抗CEA單克隆抗體或其片段為人源化的，其中 所述人源化的單克隆抗體基本保留了鼠III類抗CEA單克隆抗體的III類抗CEA結(jié)合特異 性。還要求III類抗CEA單克隆抗體或其片段為嵌合性的單克隆抗體，并且其中所述嵌合 性單克隆抗體基本保留了鼠III類抗CEA單克隆抗體的III類抗CEA結(jié)合特異性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，III類抗CEA單克隆抗體或其片段為MN-14抗體或其 片段。優(yōu)選地，MN-14抗體或其片段包含鼠MN-14單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)，其中 所述MN-14抗體的輕鏈可變區(qū)的⑶Rs包含含有氨基酸序列KASQDVGTSVA的⑶Rl ；含有氨 基酸序列WTSTRHT的⑶R2 ；和含有氨基酸序列QQYSLYRS的⑶R3 ；并且III類抗CEA抗體 的重鏈可變區(qū)的CDRs包含含有TYWMS的CDRl ；含有EIHPDSSTINYAPSLKD的CDR2 ；和含有 LYFGFPWFAY的CDR3。還要優(yōu)選地，MN-14單克隆抗體是人源化的、嵌合的或完整的人MN-14 抗體，與CEA反應(yīng)并且與正常的交叉反應(yīng)抗原(NCA)和胎糞抗原不反應(yīng)。還要優(yōu)選地，MN-14 抗體或其片段以100-600毫克/劑/注射的劑量進(jìn)行給藥。最為優(yōu)選地，MN-14抗體或其 片段以300-400毫克/劑/注射的劑量進(jìn)行給藥。在本發(fā)明的方法中，所述人源化MN-14抗體或其片段的輕鏈和重鏈可變區(qū)的框架 區(qū)(FRs)優(yōu)選包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14單克隆抗體的相應(yīng)FRs的氨基酸。更加優(yōu)選地， 包含至少一個(gè)來(lái)自所述鼠MN-14抗體的所述相應(yīng)FR的氨基酸的人源化MN-14抗體或其片 段選自如上面所提到的圖14A-C的鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基24、28、30、48、49、74和94。 還要優(yōu)選地，人源化的MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái)自所述鼠MN-14輕鏈可變區(qū)的 相應(yīng)FR的氨基酸。最為優(yōu)選地，人源化的MN-14抗體或其片段包含如圖13A (中間序列) 或圖22A(hMN-14)或圖23A所示的輕鏈可變區(qū)，以及圖14A-C中所示標(biāo)明為KLHuVhAIGA的 或圖22B(hMN-14)或圖23B中所示的重鏈可變區(qū)。
本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括同時(shí)或按順序地向受試者給藥治療有效量的 第二人源化的、嵌合的、人的或鼠的單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段選 自與 EGP-I、EGP-2(例如，17-1A)、IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、MUC-1、MUC-2、MUC-3、 MUC-4、PAM-4、KC4、TAG-72、EGFR, HER2/neu、BrE3、Le-Y, A3、Α33、Ep-CAM, AFP、Τη、 Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)或其它腫瘤血管 發(fā)生抗原、Ga 733、細(xì)胞粘合素、纖維結(jié)合素及其組合反應(yīng)的單克隆抗體或其片段。類似地， 這些方法可以包括同時(shí)或按順序向受試者給藥治療有效量的第二人源化的、嵌合的、人或 鼠單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段選自如上所述的I類或II類或III類抗 CEA單克隆抗體或其片段。優(yōu)選地，第二抗體或其片段既可以是裸的也可以是偶聯(lián)到一種治 療劑上的。在本文所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，治療劑選自裸抗體、細(xì)胞毒性劑、藥物、 放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療劑、CEA或非CEA抗體的免疫偶聯(lián)物、激素或其組合，優(yōu) 選配制在一種可藥用的載體中。這里還要求治療劑不是達(dá)卡巴嗪(DTIC)。優(yōu)選地，治療劑為一種選自藥物或毒素的細(xì)胞毒性劑。例如，要求具有選自抗有絲 分裂的、烷基化的、抗代謝物的、抗血管生成的、凋亡的、生物堿的、C0X-2和抗生素藥劑及其 組合的藥學(xué)特性。優(yōu)選地，藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基硫酸、亞硝基脲、三氮烯、葉酸 類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代謝物、抗生素、酶、 表鬼白毒素、鉬配位化合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、拮抗 劑、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、喜樹堿、奧沙利鉬、阿霉素和它們的類似物，及其組合。當(dāng)治療劑為微生物的、植物或動(dòng)物的毒素時(shí)，該藥劑可以選自蓖麻毒蛋白、相思豆 毒蛋白、α毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、金葡菌腸毒素Α、商陸抗病毒 蛋白、白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。在本發(fā)明的方法中還要求治療劑為選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、造 血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素及其組合。優(yōu) 選地，淋巴毒素為腫瘤壞死因子(TNF)，所述造血因子為白介素(IL)，所述集落刺激因子為 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，所素干擾素為干擾素α、β或Y，所述干細(xì)胞生長(zhǎng)因子指定 為〃 Sl 因子〃。還要優(yōu)選地，免疫調(diào)節(jié)劑包括11^-1、11^-2、11^-3、11^-6、11^-10、11^-12、11^-18、 IL-21、γ干擾素、TNF-α或其組合。在美國(guó)專利號(hào)5，120，525中介紹了在暴露于細(xì)胞毒性 劑之前、同時(shí)或之后給藥一種細(xì)胞因子，所述暴露于細(xì)胞毒性劑導(dǎo)致骨髓或造血的毒性，在 此將該專利的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。還要優(yōu)選地，治療劑為一種為色素原或染料的光敏治療劑或者一種為達(dá)卡巴嗪的 烷基化劑。還要優(yōu)選地，治療劑為具有介于20和10，OOOkeV之間能量的放射性核素。優(yōu)選地， 該放射性核素選自 125I、131I、90Y、88Y、225Ac、mLu、188Re、186Re 及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將如本文所述的一種免疫調(diào)節(jié)劑在給藥治療有效量的抗 CEA單克隆抗體或其片段之前進(jìn)行給藥或者將一種免疫調(diào)節(jié)劑在給藥治療有效量的抗CEA 單克隆抗體以及至少一種治療劑之前進(jìn)行給藥，其中這里所述的任何這些組分都優(yōu)選在一 種可藥用的載體中配制。附圖簡(jiǎn)介圖1.在單獨(dú)hMN-14、單獨(dú)DTIC或hMN_14和DTIC結(jié)合治療之后比較腫瘤大小的 圖表。圖IA顯示以25和IOOyg/劑單獨(dú)或與250 μ g hMN-14抗體一起給藥的DTIC。圖 IB顯示以50和75 μ g/劑單獨(dú)或與100 μ g hMN-14抗體一起給藥的DTIC。圖2.以131I和9°Y-MN-14進(jìn)行放射免疫治療(RAIT)之后比較腫瘤大小的圖表。圖3.比較幾種化療藥物在患有TT的小鼠中對(duì)腫瘤大小治療效果的圖表。幾種化療藥物的療效。給予患TT的小鼠阿霉素，20mg/m2 ；0、1和2天(70 μ g/劑) (O) ；DTIC，30mg/m2 ;0、1 和 2天(1.08mg/劑)(□)；阿霉素和 DTIC 如上(·)；環(huán)磷酰胺， 600mg/m2 ；0天(2. 16mg/劑)(Δ )；長(zhǎng)春新堿，4. 2 μ g/劑；0天(X)；所有四種藥物(阿霉 素、DTIC、環(huán)磷酰胺和長(zhǎng)春新堿)，以上面對(duì)于每種所述的劑量(■)；或未進(jìn)行處理( )。 各組由6-9只患有建立的TT腫瘤的裸鼠所組成。治療時(shí)的平均腫瘤體積為0. 51 士0. 33cm3。 點(diǎn)平均腫瘤大小。誤差條標(biāo)準(zhǔn)偏差，僅在符號(hào)上面顯示以便清楚。圖4.比較RAIT和9°Y標(biāo)記的抗CEA單克隆抗體ΜΝ-14的組合治療與在RAIT之后 24小時(shí)開始的4種藥物的組合對(duì)于腫瘤大小的治療效果的圖表。以9°Υ標(biāo)記的抗CEA單克隆抗體ΜΝ-14進(jìn)行的RAIT和在RAIT之后的24小時(shí)開始 的4種藥物組合的組合治療的療效?；寄[瘤的動(dòng)物未進(jìn)行處理( )；給予圖1中所述的4 種藥物方案，在第1、2和3天進(jìn)行給藥(■)；在0天給予52. 5 μ Ci的9°Υ-ΜΝ-14，隨后在第 1、2和3天給予4藥物療法(▲)；在0天給予52. 5 μ Ci的9°Υ_ΜΝ_14 ( Δ )；或在0天給予 105 μ Ci的9°Υ-ΜΝ-14 (〇).對(duì)于未處理組N = 5，在處理組中η = 9_10。治療時(shí)的平均腫 瘤體積為0.28士0.12cm3。點(diǎn)平均腫瘤大小。誤差條標(biāo)準(zhǔn)偏差，僅在符號(hào)上面顯示以便 清楚。圖5.比較RAIT加上DTIC和RAIT加上阿霉素和DTIC在患有TT小鼠中的效果的圖表。與RAIT加上阿霉素和DTIC相比，RAIT加上DTIC的效果?；糡T的小鼠未進(jìn)行處 理( )；在0天給予105 μ Ci的9°Y-MN-14 (O)；在0天給予105 μ Ci的9°Υ_ΜΝ_14，隨后在 第1、2和3天以50%的全劑量給藥阿霉素和DTIC ( A )；在0天給予105 μ Ci的90Y-MN-H, 隨后在第1、2和3天以75%的全劑量給藥DTIC(X)；或在第1、2和3天以300mg/m2給藥 全劑量的DTIC(1.08mg/劑)(□)。對(duì)于未處理組N = 5，在處理組中η = 9_10。治療時(shí)的 平均腫瘤體積為0.39士0.20cm3。點(diǎn)平均腫瘤大小。誤差條標(biāo)準(zhǔn)偏差，僅在符號(hào)上面顯 示以便清楚。圖6.比較在患有TT的異種移植小鼠中裸hMN-14治療方案與的效果的圖表。動(dòng) 物被給予TT細(xì)胞的皮下注射，并且被留下不進(jìn)行治療(A)或在第1天(B)或更遲的第11 天(C)給予靜脈內(nèi)注射0. 5mghMN-14。用裸hMN-14治療患TT小鼠的異種移植體.通過(guò)皮下注射給予動(dòng)物TT細(xì)胞，并且 留下不進(jìn)行治療㈧或在第1天⑶或更遲的第11天(C)給予靜脈內(nèi)注射0. 5mghMN-14。 在A、B和C區(qū)中的線條代表個(gè)體動(dòng)物的腫瘤體積。各個(gè)治療組的平均值示于D區(qū)申。誤差 條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且僅顯示于一個(gè)方向以便清楚。 ，未處理的；□，第1天處理 的；Δ，第11天處理的。
圖7.比較人源化的或鼠MN-14抗體在治療甲狀腺髓樣癌中的效果。給予動(dòng)物皮下注射TT細(xì)胞，并且留下不進(jìn)行治療或在之后的第1天給予靜脈內(nèi)注射MAb (0. 5mg)。
治療的特異性。動(dòng)物被給予皮下注射TT細(xì)胞，并且被留下不進(jìn)行處理或在之后的第1 天給予靜脈內(nèi)注射MAb (0. 5mg)。顯示各治療組的平均值。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差并 且僅顯示于一個(gè)方向以便清楚。 ，未處理的；□，hMN-14 ；Δ鼠MN-14 ;X，hLL2。
圖8.比較不同的hMN-14劑量在治療甲狀腺髓樣癌中的效果。在皮下注射TT細(xì)胞之 后的第1天，給予靜脈內(nèi)注射逐漸增多的hMN-14劑量。
hMN-14劑量的效果.在皮下注射TT細(xì)胞之后的第1天，給予動(dòng)物靜脈內(nèi)注射逐漸增 多的hMN-14劑量。顯示各治療組的平均值。 ，未處理的；·，0. 125mg ;〇，0. 25mg ;■， 0. 50mg ； X，1. Omg ；▲，2. Omgo誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且僅對(duì)于未處理組和接受 了 0. 50mg hMN-14的組顯示以便清楚。
圖9.在患有TT的裸鼠中比較不同治療時(shí)間的效果的圖表。
治療時(shí)間的效果。在皮下注射TT細(xì)胞之后1天(眷)、3天(▲)或7天(■)，給予 動(dòng)物靜脈內(nèi)注射0. 25mg的hMN-14，，或留下不進(jìn)行處理( )。顯示各治療組的平均值。誤 差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且僅顯示于一個(gè)方向以便清楚。
圖10.比較用hMN-14加上DTIC、單獨(dú)的DTIC、單獨(dú)的hMN-14治療患有TT的裸鼠和未 治療小鼠的圖表。
以hMN-14加上DTIC治療患TT的裸鼠·在第2、3、4、5、7、8、9、10和11,15和22天以 100 μ g/劑給予動(dòng)物腹膜內(nèi)注射hMN-14，隨后每7天注射一次(〇)；在第2、3和4天給藥 75 μ g/劑的DTIC ( ▲)；這些hMN-14和DTIC療法的組合(Δ )；或不進(jìn)行處理( )。顯 示各治療組的平均值。10只動(dòng)物/組。圖11.圖IlA和IlB顯示鼠ΜΝ-14的可變區(qū)重鏈(VH)的共有DNA序列以及由該 DNA序列編碼的氨基酸序列。⑶Rs被括于盒中。圖12.圖12Α和12Β顯示鼠ΜΝ-14的可變區(qū)輕鏈(VK)的共有DNA序列以及由該 DNA序列編碼的氨基酸序列。⑶Rs被括于盒中。圖13.圖13Α和13Β顯示鼠ΜΝ-14的可變區(qū)與人可變區(qū)NEWM VH和REI VK (圖 13Α)以及人KOL VH區(qū)(圖13Β)的比對(duì)。CDRs括入盒中，摻入人源化VH的鼠VH FRs以它 們根據(jù) Kabat 等，SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U. S. Government PrintingOffice, Washington, D. C.，1987的計(jì)數(shù)系統(tǒng)的位置進(jìn)行標(biāo)記。包括于KLHuVH中 的CDRs之外的鼠殘基用一個(gè)實(shí)心圓指示。圖14.圖14A-14C顯示在鼠和人源化MN-14VH f框架殘基(FR)之間的氨基酸序 列的比較。只顯示不同于小鼠的人FR殘基。NE麗和KOL的⑶Rs也沒(méi)有顯示。在各個(gè)FRs 中的氨基酸取代的區(qū)域以粗體進(jìn)行突出，取代位置根據(jù)Kabat等的編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行指示。將 3個(gè)⑶R括入盒中。圖15.圖15顯示踝hMN-14CEA Mab和DTIC治療在人甲狀腺髓樣癌模型中的效^ ο圖16.圖16顯示踝M1N-14CEA Mab和CPT-11治療在早期人結(jié)腸癌模型中的效^ ο圖17.圖17顯示祿hMN_14CEA Mab和CPT-Il治療在低腫瘤負(fù)擔(dān)的人結(jié)腸癌模 型中的效果。
圖18.圖18顯示在人結(jié)腸癌模型中的CPT-Il治療之前三天給予的裸hMN_14CEA Mab預(yù)治療的效果。圖19.圖19顯示在人結(jié)腸癌模型中裸hMN_14CEA Mab和CPT-Il的各種給藥順序 的比較。圖20.圖20顯示在人結(jié)腸癌模型中GM-CSF預(yù)處理對(duì)于裸hMN_14CEA Mab治療的 效果。圖21.圖21顯示在人結(jié)腸癌模型中裸hMN_14CEA Mab治療對(duì)于低CEA表達(dá)和高 (干擾素誘導(dǎo)的)CEA表達(dá)腫瘤細(xì)胞的效果的比較。圖22.圖22A和圖22B顯示人REI和KOL抗體的Vk和VH區(qū)的人、鼠和人源化序列 分別與鼠和人源化MN-14的比較。將圖22A中REIVk的人序列與鼠和人源化MN_14Vk序列 比較。實(shí)心圓指示由人REI Vk序列保留的序列。將⑶Rs括入盒中。將圖22B中KOL VH的 人序列與鼠和人源化MN-14VH序列比較。實(shí)心圓指示由REI Vk序列保留的序列。將⑶Rs 括入盒中。圖23.圖23A和23B顯示hMN-14的Vk、可變輕鏈和VH、可變重鏈序列，所述hMN-14 是一種人源化的III類抗CEA抗體。CDR區(qū)以粗體和下劃線顯示。氨基酸殘基和核苷酸按 順序編號(hào)。輕鏈可變區(qū)顯示于圖23A中，而重鏈可變區(qū)顯示于圖23B中。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述1.概述本發(fā)明提供治療的方法，其中在治療期中按順序地或同時(shí)地給藥裸抗CEA抗體或 其片段以及至少一種治療劑。該方法對(duì)于治療甲狀腺髓樣癌特別有用，但是對(duì)于治療非甲 狀腺髓樣癌、結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、胰癌、乳腺癌、肺癌、頭和頸癌、膀胱癌、子宮癌和卵巢 癌以及甚至不高水平表達(dá)CEA的癌癥也令人驚奇地有用。例如，考慮在以至少IOOng/克的 組織水平表達(dá)CEA的癌癥中進(jìn)行治療。本方法進(jìn)一步提供包含抗CEA抗體的組合物，它優(yōu) 選為III類抗CEA單克隆抗體或其抗體片段，其中抗體和治療劑彼此沒(méi)有偶聯(lián)或連接。如 本文所用的，短語(yǔ)“III類抗CEA”抗體或抗體片段意為結(jié)合CEA抗原(或CD66e)的抗體 或片段并且與正常的交叉反應(yīng)抗原(NCA)、胎糞抗原(MA)、粒細(xì)胞和CD66a-d不反應(yīng)(見， Primus等，美國(guó)專利號(hào)4，818，709，并入作為參考)。裸III類抗CEA抗體或其片段可以是 人源化的、嵌合的、人或鼠抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，裸III類抗CEA抗體或其片段 為人源化的MN-14抗體或其片段。還要求用于本發(fā)明的是沒(méi)有⑶66a_d交叉反應(yīng)性的II類Mabs。這些是與CEA結(jié) 構(gòu)域tN-AlBl、A2B2反應(yīng)的Mabs，這些結(jié)構(gòu)域與胎糞抗原反應(yīng)，但不與NCA反應(yīng)并且不與粒 細(xì)胞反應(yīng)。例如，NP-3和MN-6為在本發(fā)明中有用的II類抗CEA抗體。此外要求用于本發(fā) 明的是II類抗CEA單克隆抗體或其片段，它可以與⑶66a、b和d反應(yīng)，但不與⑶66c或I 類Mabs或其片段反應(yīng)，所述CD66c或I類Mabs或其片段與CD66a、b或d以及CD66c反應(yīng) (定義I類Mab與⑶66c結(jié)合)。令人驚奇的是，本文所述的組合物和方法還對(duì)于治療非甲狀腺髓樣癌，包括結(jié)腸 直腸癌、胰癌、乳癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌、頭和頸癌以及卵巢癌有用。由于這類形式的癌 癥比甲狀腺髓樣癌表達(dá)較少的CEA，所以出人意料的是裸III類抗CEA抗體與治療劑的結(jié)合 會(huì)對(duì)治療非甲狀腺髓樣癌有用。
裸III類抗CEA抗體殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制并不是確定地已知的并且可能包括幾種 機(jī)制。假設(shè)單獨(dú)的祿抗體或與治療劑組合可以通過(guò)阻抑其各自的抗原的生物學(xué)活性或通 過(guò)刺激天然免疫功能，如抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體介導(dǎo)的溶胞作 用來(lái)影響腫瘤的生長(zhǎng)。此外，單獨(dú)的丨課抗體或與治療劑結(jié)合可以通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞 周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管發(fā)生、抑制轉(zhuǎn)移活性和/或影響腫瘤細(xì)胞粘附來(lái)治療和 控制癌癥。事實(shí)上，本發(fā)明的抗CEA抗體或其片段可以在治療轉(zhuǎn)移灶中比治療原初癌癥更 為有效，因?yàn)檗D(zhuǎn)移灶可能對(duì)于腫瘤細(xì)胞粘附的拮抗劑更為敏感。本治療方法提供了一種治 療計(jì)劃，它可以通過(guò)允許對(duì)抗體和一種或多種不同治療劑進(jìn)行滴定提供有效治療方案來(lái)進(jìn) 行優(yōu)化以提供對(duì)個(gè)體病人最大的抗腫瘤活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，裸III類抗CEA抗體或其片段和治療劑可以與至少一種 額外的治療劑，如裸的或偶聯(lián)的人源化的、鼠的、嵌合的或人的抗體、融合蛋白或其片段一 起補(bǔ)充。例如，另一種非阻抑性的并且不結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d的III類CEA抗體或抗體 片段；非阻抑性的并且不結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d的II類抗CEA抗體或抗體片段；可以與 ⑶66a、b和d反應(yīng)但不與⑶66c反應(yīng)的II類抗CEA Mabs或其片段，與⑶66a、b或d以及 CD66c反應(yīng)的I類Mabs或其片段(通過(guò)I類抗CEA Mabs或其片段)，或針對(duì)與不同癌癥相 關(guān)的表位或抗原的抗體，可以被用作治療劑來(lái)與優(yōu)選的人源化MN-14抗體一起進(jìn)行組合治 療。如下面更加詳細(xì)介紹的，這種額外的抗體、融合蛋白或其片段可以結(jié)合CEA或另一種與 癌癥或腫瘤相關(guān)的抗原。2.定義在接下來(lái)的介紹中，使用了許多術(shù)語(yǔ)并且提供下列定義以幫助理解本發(fā)明。如本文所述的，皿是指一種全長(zhǎng)的(即，天然發(fā)生的或由正常的免疫球蛋白基 因片段重組過(guò)程所形成的)免疫球蛋白分子(例如，一種IgG抗體)或免疫球蛋白分子的 一種免疫活性(即，特異性結(jié)合)部分，比如一種抗體片段?！翱贵w片段”是抗體的一部分，如F (ab，)2、F (ab) 2、Fab，、Fv、scFv (單鏈Fv)等。不 考慮結(jié)構(gòu)，抗體片段與被完整抗體識(shí)別的相同抗原結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”還包括任何一種合成的或遺傳工程改造過(guò)的蛋白，它通過(guò)與特異 性抗原結(jié)合形成復(fù)合物而像抗體一樣發(fā)揮作用。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離 片段，如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段、其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過(guò)肽鍵進(jìn)行連接 的重組的單鏈多肽分子(“sFv蛋白”)，和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單位。 Fv片段可以以不同方式進(jìn)行構(gòu)建以產(chǎn)生多價(jià)體的和/或多特異性結(jié)合的形式。對(duì)于前者多 價(jià)體來(lái)說(shuō)，它們相對(duì)于CEA表位與一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)，反之對(duì)于多特異性形式來(lái)說(shuō)， 結(jié)合一個(gè)以上的表位(既可以是CEA的表位，也可以是針對(duì)CEA的和一種不同抗原的)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)抗體組分包括一種完全的抗體、融合蛋白及其片段。MS^通常是一種不與治療劑偶聯(lián)的完全抗體。之所以如此是因?yàn)榭贵w分子的Fc 部分提供效應(yīng)子或免疫功能，如補(bǔ)體定位和ADCC (抗體依賴的細(xì)胞毒性)，它使可以導(dǎo)致細(xì) 胞裂解的機(jī)制得以實(shí)施。然而，F(xiàn)v可能不是抗體的治療功能所必需的，但是其它機(jī)制，如凋 亡、抗血管發(fā)生、抗轉(zhuǎn)移活性、抗粘附活性如對(duì)異型和同型粘附的抑制，和對(duì)信號(hào)途徑的干 擾可以得以發(fā)揮作用并且干擾疾病的進(jìn)程。裸抗體包括多克隆和單克隆抗體及其片段，包 括鼠抗體以及某些重組抗體，如嵌合的、人源化的或人抗體及其片段。如在本發(fā)明中所定義的，“裸的”是與“未偶聯(lián)的”同義的，并且意為不與它一起給藥的治療劑相連接或偶聯(lián)。嵌合抗體是一種重組的蛋白，它含有抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)，包括來(lái)源于一個(gè) 物種，優(yōu)選為嚙齒動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和可變結(jié)構(gòu)域，而抗體分子的恒定區(qū)則 來(lái)源于人抗體的那些。對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用，嵌合抗體的恒定區(qū)可以來(lái)源于其它物種，如貓或狗。人源化抗體是一種重組蛋白，其中來(lái)源于一個(gè)物種的抗體,例如嚙齒類的抗體的 CDRs，被從嚙齒類抗體的重鏈和輕鏈中轉(zhuǎn)移到人重鏈和輕鏈可變區(qū)中?？贵w分子的恒定區(qū) 來(lái)源于人抗體的那些。人抗體是一種由轉(zhuǎn)基因小鼠所獲得的抗體，它已經(jīng)講行“工稈化”以產(chǎn)牛適應(yīng)抗 原脅迫的特異性人抗體。在本技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈位點(diǎn)元件導(dǎo)入源自胚胎干細(xì)胞系 的小鼠品系中，所述胚胎干細(xì)胞系包含靶向的內(nèi)源重鏈和輕鏈位點(diǎn)的破壞。轉(zhuǎn)基因小鼠 可以合成對(duì)人抗原特異的人抗體，并且該小鼠可以用于生產(chǎn)分泌人抗體的雜交瘤。Green 等，Nature Genet. 7 13 (1994)，Lonberg 等，Nature 368 :856 (1994)，和 Taylor 等，Int. Immun. 6 =579(1994)介紹了從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法。通過(guò)基因或染色體轉(zhuǎn)染 方法以及病毒呈現(xiàn)技術(shù)還可以構(gòu)建完整的人抗體，所有這些技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。見例 如，McCafferty等關(guān)于從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)的全部基因體外生產(chǎn)人抗 體或其片段的描述。在本技術(shù)中，將抗體可變區(qū)基因框內(nèi)克隆入絲狀噬菌體的大的或小的 外殼蛋白基因，并且在噬菌體顆粒表面上呈現(xiàn)為功能性抗體片段。由于絲狀噬菌體顆粒包 含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于該抗體功能特性的篩選還導(dǎo)致對(duì)編碼表現(xiàn)那些特性 的抗體基因的篩選。以此方式，噬菌體模仿B細(xì)胞的一些特性。噬菌體呈現(xiàn)能夠以許多格 式進(jìn)行，關(guān)于它們的綜述，見例如 Johnson 和 Chiswell，Current Opinion inStructural Biology3 :5564_571 (1993)。人抗體還可以通過(guò)體外激活的B細(xì)胞生產(chǎn)。見美國(guó)專利號(hào)5，567，610和 5，229，275，將它們的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。治療劑是一種單獨(dú)地、與抗體組分即抗體或抗體片段，或其亞片段一起同時(shí)或按 順序給藥的分子或原子，在疾病的治療中有用。治療劑的例子包括抗體、抗體片段、免疫 偶聯(lián)物、藥物、細(xì)胞毒性劑、毒素、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化合物、光敏劑或染 料、放射性同位素或放射性核素、反義寡核苷酸、免疫偶聯(lián)物或其組合。免疫偶聯(lián)物是一種與治療劑偶聯(lián)的抗體組分。合適的治療劑如上所述。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)抗體融合蛋白是一種重組牛產(chǎn)的抗原結(jié)合分子，其中兩個(gè)或 更多的相同或不同的天然抗體、單鏈抗體或具有相同或不同特異性的抗體片段部分相連。 III類抗CEA融合蛋白包含至少一個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，III類抗CEA融合蛋白是MN-14 融合蛋白。融合蛋白的效價(jià)表明融合蛋白的結(jié)合臂或位點(diǎn)具有抗原(s)或表位(s)；即單價(jià)、 二價(jià)、三價(jià)或多價(jià)的?？贵w融合蛋白的多價(jià)性意指可以利用在與抗原結(jié)合中的多重相互作 用，因而增強(qiáng)與抗原或不同抗原結(jié)合的親和力。特異性表明抗體融合蛋白能夠結(jié)合多少種 不同類型的抗原或表位；即，單特異性的、雙特異性的、三特異性的、多特異性的。利用這些 定義，天然抗體，例如IgG是雙價(jià)的，因?yàn)樗哂袃蓚€(gè)結(jié)合臂，但是為單特異性的，因?yàn)樗Y(jié) 合一種類型的抗原或表位。一種單特異性的多價(jià)的融合蛋白具有一個(gè)以上的對(duì)于相同抗原 或表位的結(jié)合位點(diǎn)。例如，單特異性的雙抗體是具有與相同抗原反應(yīng)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的融合蛋白。融合蛋白可以包含不同抗體組分或相同抗體組分的多個(gè)拷貝的多價(jià)或多特異性 組合。例如，本發(fā)明的融合蛋白可以是多特異性的，其中融合蛋白的一個(gè)臂(例如，scFv或 Fab)是靶向⑶66e的III類抗CEA mAb而融合蛋白的另一個(gè)臂來(lái)自靶向⑶66a_d的另一個(gè) CEA交叉反應(yīng)抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的雙特異性融合蛋白具有一個(gè)相對(duì)于III類CEA表位的 臂，和一個(gè)針對(duì)在粒細(xì)胞上表達(dá)的⑶66a-d表位(II類)的臂。在這些實(shí)施方案中，⑶66a-d 結(jié)合部分應(yīng)該不能夠固定補(bǔ)體或結(jié)合Fc受體以影響ADCC(它會(huì)導(dǎo)致來(lái)自粒細(xì)胞的細(xì)胞因 子的釋放)。盡管補(bǔ)體固定和ADCC是本發(fā)明裸治療方案的優(yōu)選特性，但是應(yīng)當(dāng)在與雙特異 性融合蛋白相關(guān)的本發(fā)明實(shí)施方案中避免它們。在正常的結(jié)腸細(xì)胞上NCA-50/90和CEA都 得以表達(dá)，但它們受限于正常上皮細(xì)胞的頂面，該面僅存在于結(jié)腸內(nèi)腔中，并且對(duì)注射的抗 體是不可達(dá)到的。以CEA形式從這些正常細(xì)胞中釋放的CEA或與死亡的正常細(xì)胞結(jié)合的CEA 在糞便中被除去。當(dāng)結(jié)腸癌形成時(shí)這種極化作用喪失，并且隨后NCA-50/90和CEA都在癌 細(xì)胞膜上表達(dá)，所述癌細(xì)胞膜正在入侵下面的錨定正常上皮細(xì)胞的正?；?。預(yù)期雙特異 性抗體如hMN3/hMN14與在這些入侵細(xì)胞上的CEA和NCA-50/90反應(yīng)。而且，由于NCA50/90 存在于粒細(xì)胞上，這種雙特異性預(yù)期指引粒細(xì)胞殺死入侵的結(jié)腸癌細(xì)胞。一種根據(jù)本實(shí)施 方案的更加優(yōu)選的構(gòu)建體是具有一個(gè)與NCA50/90反應(yīng)的臂和兩個(gè)僅與CEA反應(yīng)的臂的雙 特異性的三價(jià)蛋白。另一個(gè)實(shí)施方案是具有結(jié)合NCA50/90的兩條臂的雙特異性蛋白。一種優(yōu)選的也與粒細(xì)胞反應(yīng)的融合蛋白是一種雙抗體，具有針對(duì)NCA-50/90 (例 如hMN-3)的一條臂，以及針對(duì)CEA上的III類表位(hMN14)的一條臂。這些融合蛋白沒(méi) 有Fc區(qū)，所以它們不會(huì)激活細(xì)胞因子從粒細(xì)胞中的釋放。一種更加優(yōu)選的融合蛋白是具 有一條hMN-3臂和兩條hMN14臂的三抗體。這種雙抗體和三抗體的構(gòu)建在美國(guó)申請(qǐng)系 列號(hào)60/404，919 (遞交于2002年8月22日)、60/345，641 (遞交于2002年1月8日)、 60/328，835 (遞交于2001年10月15日)和60/341，881遞交于2001年12月21日)中進(jìn) 行了介紹。任何一種由hMN14/NP_3特異性的mabs制成的多特異性抗體也都是優(yōu)選的并 且可以具有一個(gè)能夠固定補(bǔ)體/激活A(yù)DCC的Fc區(qū)。例如，可以使用一種hMN14-IgGl/ [NP-3-scFv]2 ；其生產(chǎn)在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/337，756中進(jìn)行了教示。仍然是根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選類型的多特異性抗體是hMN_3MAb，它具有一個(gè)缺 乏固定補(bǔ)體/影響ADCC能力的Fc區(qū)。融合蛋白可以另外包含一種治療劑。例如，至少一種抗體或其片段，如靶向⑶66e 或其scFv或Fab的III類抗CEA mAb可以偶聯(lián)到細(xì)胞因子上，如干擾素或集落刺激因子， 如GM-CSF或G-CSF或白介素，本文對(duì)它們所有的進(jìn)行介紹。免疫調(diào)節(jié)劑是在本發(fā)明中所定義的當(dāng)呈現(xiàn)、改變、抑制或刺激身體免疫系統(tǒng)時(shí)的 治療劑。一般地，在本發(fā)明中有用的免疫調(diào)節(jié)劑刺激免疫細(xì)胞增殖或在免疫反應(yīng)級(jí)聯(lián)中變 得激活，如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和/或T細(xì)胞。如本文所述的免疫調(diào)節(jié)劑的一個(gè)例子是一種細(xì) 胞因子，它是一種細(xì)胞群落(例如，原初T淋巴細(xì)胞)在接觸特異性抗原之后釋放的大約 5_20kDa的可溶性小蛋白質(zhì)，它作為細(xì)胞之間的胞內(nèi)介質(zhì)發(fā)揮作用。如熟練的技術(shù)人員會(huì)理 解的，細(xì)胞因子的例子包括淋巴因子、單核因子、白介素和幾種相關(guān)的信號(hào)分子，如腫瘤壞 死因子(TNF)和干擾素。趨化因子是細(xì)胞因子的一個(gè)亞類。某些白介素和干擾素是刺激T細(xì)胞或其它免疫細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子的例子。I·秘，伺遍輔、λ·細(xì)λ秘單克隆抗體(MAbs)是對(duì)于特定抗原的抗體的同類群體并且該抗體僅包含一種 類型的抗原結(jié)合位點(diǎn)并且只結(jié)合抗原決定簇上的一個(gè)表位。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知的方法可以獲得對(duì)于特定抗原的嚙齒類單克隆抗體。見，例如，Kohler和Milstein， Nature256 :495 (1975)，和Coligan等(編輯)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, 2. 5. 1-2. 6. 7 頁(yè)(John Wiley 和 Sons 1991)[下文中〃 Coligan"]。簡(jiǎn)言之，單克隆抗體 可以通過(guò)用含有抗原的組合物注射小鼠、通過(guò)移除血清樣品來(lái)檢驗(yàn)抗體產(chǎn)品的存在、移除 脾以獲得B淋巴細(xì)胞、將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相融合來(lái)產(chǎn)生雜交瘤、克隆該雜交瘤、選 擇產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體的陽(yáng)性克隆、培養(yǎng)產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體的克隆以及從雜交瘤培 養(yǎng)物中分離抗體而獲得。通過(guò)許多充分建立的技術(shù)可以從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化MAbs。這種分離技術(shù) 包括使用蛋白-A瓊脂糖凝膠的親和層析法、大小排阻層析法和離子交換層析法。參見，例 如，Coligan 于 2. 7. 1-2. 7. 12 頁(yè)和 2. 9. 1-2. 9. 3 頁(yè)。還參見Baines 等，“免疫球蛋白 G(IgG) 的純化”，分子生物學(xué)的方法，第10卷，79-104頁(yè)(TheHumana Press, Inc. 1992)。通過(guò)公知的抗體生產(chǎn)方法來(lái)生產(chǎn)針對(duì)肽骨架的抗體。例如，注射在完全Freimd佐 劑中的免疫原，如(肽)n_KLH，其中KLH是鎖眼形血藍(lán)蛋白，η = 1_30，隨后向免疫活性動(dòng) 物中注射兩次相同的懸浮于不完全Freimd佐劑中的免疫原。最后給予動(dòng)物靜脈內(nèi)注射強(qiáng) 化抗原，接著在三天后收集脾細(xì)胞。隨后將收集的脾細(xì)胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞相融合 并且利用直接結(jié)合ELISA對(duì)得到的克隆的培養(yǎng)物上清液的抗肽反應(yīng)性進(jìn)行分析。利用起始 免疫原的肽片段可以分析產(chǎn)生抗體的良好特異性。利用自動(dòng)肽合成儀可以輕易地制備這些 片段。對(duì)于抗體生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，分離酶缺陷的雜交瘤以能夠篩選融合的細(xì)胞系。這種技術(shù)還能 夠用于針對(duì)一種或多種包含聯(lián)結(jié)子的螯合物，例如In (III)-DTPA螯合物來(lái)培育抗體。針對(duì) In(III)-DTPA的單克隆小鼠抗體是已知的(授予Barbet的美國(guó)專利號(hào)5，256，395)。生產(chǎn)抗體的另一種方法是通過(guò)在轉(zhuǎn)基因家畜的乳中進(jìn)行生產(chǎn)。見，例如，Colman, A.，Biochem. Soc. Symp. ,63 :141_147，1998 ；美國(guó)專利 5，827，690，在此將二者的全部?jī)?nèi)容 并入作為參考。制備兩種分別含有編碼成對(duì)的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的DNA片段的構(gòu)建 體。將DNA片段克隆入含有一個(gè)啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子序列優(yōu)選在哺乳類 上皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。例子包括但不限于來(lái)自兔、牛和羊酪蛋白基因、牛α-乳球蛋白基 因、羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸蛋白基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，插入的片段在來(lái)自哺乳 類特異性基因的同源基因組序列3’端的側(cè)翼。這提供了多聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定序 列。將表達(dá)盒共注入受精的哺乳類卵的前核中，隨后將該卵移植入受體雌體的子宮中并且 讓其孕育。出生后，通過(guò)Southern分析就兩種轉(zhuǎn)基因的存在對(duì)子代進(jìn)行篩選?？贵w要存在， 重鏈和輕鏈基因都必須同時(shí)在相同的細(xì)胞中表達(dá)。利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法就抗 體或抗體片段的存在和功能性對(duì)轉(zhuǎn)基因雌體進(jìn)行分析?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從 乳中純化抗體。在開始培育針對(duì)免疫原的抗體之后，可以將單克隆抗體的可變基因從雜交瘤細(xì)胞 中進(jìn)行克隆、測(cè)序并且隨后通過(guò)重組技術(shù)進(jìn)行制備。例如，出版物Orlandi等，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 86:3833(1989)介紹了克隆鼠免疫球蛋白可變區(qū)的一般方法，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。鼠抗體和抗體片段的人源化和嵌合化是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知 的。嵌合抗體是一種重組蛋白，它包含包括CDRs的可變區(qū)，所述CDRs源自動(dòng)物的一個(gè)物 種，如一種嚙齒類抗體，而抗體分子的其它部分，即恒定區(qū)則源自人抗體。源自人源化和嵌 合的單克隆抗體的抗體組分的使用減少了與鼠恒定區(qū)免疫原性相關(guān)聯(lián)的潛在的問(wèn)題。構(gòu) 建嵌合抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。作為一個(gè)例子，Leimg等，Hybridoma 13 469 (1994)，描述了他們是如何通過(guò)結(jié)合編碼LL2單克隆抗體的Vk和Vh結(jié)構(gòu)域的DNA序列 與各自的人k和IgGl恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域來(lái)生產(chǎn)LL2嵌合體的，所述LL2單克隆抗體是一種抗 CD22抗體。還可以通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)不同的人FR替換嵌合的MAb的可變區(qū)中的鼠FR的序列 來(lái)將嵌合的單克隆抗體(MAb)人源化。具體地，通過(guò)將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)由小鼠免疫球蛋白 的重鏈和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移到人可變區(qū)中，并且隨后取代鼠對(duì)應(yīng)部分的框架區(qū)中的人殘基來(lái) 生產(chǎn)人源化的單克隆抗體。由于簡(jiǎn)單地將小鼠CDRs轉(zhuǎn)移到人FRs中經(jīng)常導(dǎo)致抗體親和性 的減弱甚至是喪失，因此可能需要額外的修飾以便保持鼠抗體的原始親和性。這可以通過(guò) 將FR區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)人殘基用它們的鼠的對(duì)應(yīng)物進(jìn)行替換來(lái)實(shí)現(xiàn)，以便獲得一種對(duì)其 表位具有良好的結(jié)合親和性的抗體。見，例如，Tempest等，Biotechnology 9 =266(1991)和 Verhoeyen 等，Science 239 1534 (1988)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在人源化的抗CEA抗體或其片段中的一些人殘基被它 們的鼠對(duì)應(yīng)物所替換。此外，已知嵌合的抗CEA與其鼠的對(duì)應(yīng)物相比顯示結(jié)合親和性，在 人源化抗CEA MAb的起始版本中的檢測(cè)性設(shè)計(jì)，如果有的話，可以通過(guò)將嵌合的抗CEA的 輕鏈和重鏈與人源化版本的那些相混合和配對(duì)而進(jìn)行鑒定。優(yōu)選地，人源化的抗CEA抗體 為人源化的MN-14抗體，它的制備和序列在U. S. 5，874，540中進(jìn)行了介紹，將它的全部?jī)?nèi) 容并入作為參考。盡管兩種人抗體REI和NEWM是用于制備人源化的和嵌合的MN-14優(yōu)選 的抗體，還可以將來(lái)自2種或多種不同人抗體的框架序列的組合用作V1^P VK。Jones等， Nature321 522 (1986)，Riechmann 等，Nature 332 323 (1988)，Verhoeyen 等，Science239 1534 (1988)，Carter 等，Proc. Nat ‘ IAcad. Sci. USA 89 4285 (1992)，Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992)，和 Singer 等，J Immun. 150 2844(1993)介紹了人源化 MAbs 的生 產(chǎn)，特此將每一篇文獻(xiàn)都并入作為參考。另外，針對(duì)一個(gè)具體表位的人源化的、嵌合的和人 MAbs的親和性可以通過(guò)CDRs的突變得以提高，從而較低劑量的抗體與較高劑量的突變前 較低親和力的MAb —樣有效。參見例如，W00029584A1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體為人III類抗CEA單克隆抗體?？梢詮霓D(zhuǎn)基因 非人動(dòng)物中獲得抗CEA MAb或另一種人抗體。見，例如，Mendez等，Nature Genetics, 15 146-156(1997)和美國(guó)專利號(hào)5，633，425，將它們的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。例如，可以從 一只具有人免疫球蛋白位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠中回收人抗體。優(yōu)選地，抗CEA抗體為MN-14抗 體。通過(guò)滅活內(nèi)源免疫球蛋白基因和導(dǎo)入人免疫球蛋白位點(diǎn)來(lái)對(duì)小鼠體液免疫系統(tǒng)進(jìn)行人 源化。人免疫球蛋白位點(diǎn)非常復(fù)雜并且包含大量的不連續(xù)片段，它總共占了人基因組的大 約0.2%。為了確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生足夠完整的抗體，人重鏈和輕鏈位點(diǎn)的大片段必 須被導(dǎo)入小鼠基因組中。這通過(guò)一個(gè)逐步的過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)，開始是形成在胚系結(jié)構(gòu)中含有 人重鏈或輕鏈免疫球蛋白位點(diǎn)的酵母人工染色體(YACs)。由于每個(gè)插入物的大小為大約 1Mb，所以YAC構(gòu)建物需要免疫球蛋白位點(diǎn)重疊片段的同源重組。通過(guò)融合含有酵母球芽和小鼠胚胎干細(xì)胞將兩種YAC分別導(dǎo)入融合小鼠，所述兩種YAC中的一種含有重鏈位點(diǎn)，另一 種含有輕鏈位點(diǎn)。隨后將胚胎干細(xì)胞的克隆微注射入小鼠胚泡中。對(duì)得到的嵌合雄體就其 通過(guò)它們的胚系轉(zhuǎn)運(yùn)YAC的能力進(jìn)行篩選，并且與鼠抗體生產(chǎn)缺陷的小鼠一起繁殖。繁殖 兩種轉(zhuǎn)基因品系，一種含有人重鏈位點(diǎn)而另一種含有人輕鏈位點(diǎn)，產(chǎn)生了響應(yīng)免疫而生產(chǎn) 人抗體的子代。還可以通過(guò)微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移(MMTC)來(lái)將未重排過(guò)的人免疫球蛋白基因 導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中。見，例如，Tomizuka等，Nature Genetics，16 133 (1997)。在該方 法中含有人染色體的微細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞相融合。轉(zhuǎn)移的染色體被穩(wěn)定地保持，并且 成年嵌合體顯示合適的組織特異性表達(dá)。作為一種選擇，本發(fā)明的抗體或抗體片段可以源于分離自免疫球蛋白組合文庫(kù)的 人抗體片段。見，例如，Barbas 等，METHODS ACompanion to Methods in Enzymology 2 119(1991)，和 Winter 等，Ann. Rev. Immunol. 12 :433 (1994)，將它們并入作為參考。利用噬 菌體呈現(xiàn)通過(guò)工程化設(shè)計(jì)并且在大腸桿菌(E.Coli)中表達(dá)抗體片段可以克服與由B細(xì)胞 無(wú)限增殖化產(chǎn)生單克隆抗體相關(guān)聯(lián)的許多困難。為了確保高親和性單克隆抗體的回收，免 疫球蛋白組合文庫(kù)必須包含大的全部組織部分。一種典型的策略利用由免疫過(guò)的小鼠的 淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞獲得的mRNA利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。通過(guò)PCR分別擴(kuò)增重鏈和輕鏈基 因并且連接入噬菌體克隆載體。產(chǎn)生兩種不同的文庫(kù)，一種含有重鏈基因，一和含有輕鏈基 因。從每種文庫(kù)中分離噬菌體DNA，將重鏈和輕鏈序列連接在一起并且進(jìn)行包裝以形成組合 文庫(kù)。每個(gè)噬菌體都包含重鏈和輕鏈cDNAs的隨機(jī)配對(duì)，并且在大腸桿菌的感染之后指導(dǎo) 感染細(xì)胞中抗體鏈的表達(dá)。為了鑒定識(shí)別目標(biāo)抗原的抗體，將噬菌體文庫(kù)涂平板，將存在于 噬斑中的抗體分子轉(zhuǎn)移至濾器。將濾器與放射性標(biāo)記的抗原一起溫育并且隨后進(jìn)行洗滌以 除去多余的未結(jié)合的配體。在放射自顯影照片上的放射性斑鑒定了含有結(jié)合該抗原的抗體 的噬斑。可以例如，從STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla，CA)中獲得對(duì)于生產(chǎn)人免 疫球蛋白噬菌體文庫(kù)有用的克隆和表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，如在Hansen等，美國(guó)專利號(hào)5，874，540 ；Hansen等，Cancer, 71 3478(1993) ；Primus 等，美國(guó)專利號(hào) 4，818，709，和 Shively 等，美國(guó)專利號(hào) 5，081，235 中所介紹的來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，將這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。抗體片段的生產(chǎn)本發(fā)明要求III類抗CEA抗體，優(yōu)選MN-14抗體的片段的應(yīng)用。本發(fā)明的III類 抗CEA抗體或其片段并不結(jié)合粒細(xì)胞或66a-d。識(shí)別特異性表位的抗體片段可以通過(guò)已知 的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。例如，可以通過(guò)抗體的蛋白水解或通過(guò)編碼該片段的DNA在大腸桿菌中 的表達(dá)來(lái)制備抗體片段?？贵w片段是一種抗體的抗原結(jié)合部分，如F(ab' )2、Fab'、Fab、 Fv、scFv等，可以通過(guò)傳統(tǒng)方法對(duì)完整抗體進(jìn)行胃蛋白酶和木瓜蛋白酶消化而獲得。例如，可以通過(guò)用胃蛋白酶進(jìn)行酶切以提供稱作F (ab ‘ ) 2的IOOKd的片段來(lái)產(chǎn)生 從二硫鏈的剪切所得的抗體片段。該片段可以利用一種硫醇還原劑，以及任選地一種巰基 的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)一步剪切，以產(chǎn)生50Kd的Fab'單價(jià)片段?；蛘?，利用木瓜蛋白酶的酶切直接 產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。Goldenberg，美國(guó)專利號(hào)4，036，945和4，331，647 以及包含其中的參考文獻(xiàn)對(duì)這些方法進(jìn)行了介紹，這里將這些專利的全部?jī)?nèi)容并入作為 參考。
Nisonoff 等，ArchBiochem. Biophys. 89 230 (1960) ；Porter, Biochem. J 73 119(1959) ,Edelman 等，in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1，422 頁(yè)(學(xué)術(shù)出版社 1967)，禾口 Coligan 于 2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 頁(yè)。還可以使用其它剪切抗體的方法，如重鏈的分離以形成單價(jià)輕-重鏈片段，進(jìn)一 步剪切片段，或可以使用其它酶學(xué)的、化學(xué)的或遺傳學(xué)的技術(shù)，只要片段能結(jié)合被完整抗體 所識(shí)別的抗原。例如，F(xiàn)v片段包含Vh和Vl鏈的聯(lián)合。如在Inbar等，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. U. S. Α. 69:2659 (1972)中所述，這種聯(lián)合是非共價(jià)的?；蛘?，可變鏈可以通過(guò)分子間二 硫鍵連接或通過(guò)化學(xué)藥品如戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。見，例如，Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 437(1992)。優(yōu)選地，F(xiàn)v片段包含通過(guò)肽鍵連接的Vh和\鏈。通過(guò)構(gòu)建一種含有編碼通過(guò)寡核 苷酸連接的區(qū)的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因來(lái)制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(sFv)。將該 結(jié)構(gòu)基因插入一種表達(dá)載體中，隨后將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入一種宿主細(xì)胞，如大腸桿菌中。 重組的宿主細(xì)胞合成一種單鏈多肽，在兩個(gè)V區(qū)之間有一個(gè)連接肽。Whitlow等，Methods =A Companion to Methods in Enzymology，2 :97 (1991)介紹了生產(chǎn) sFvs 的方法。還見 Bird 等，Science 242 423 (1988)，Ladner 等，美國(guó)專利號(hào) 4，946，778 ；Pack 等，BioTechnology 11 1271 (1993)和 Sandhu，在前?？贵w片段的另一種形式是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR是抗體可變區(qū) 的一段，它在結(jié)構(gòu)上與抗體結(jié)合的表位相互補(bǔ)并且比可變區(qū)的其余部分更加易變。因此， ⑶R—些時(shí)候稱為高可變區(qū)。一個(gè)可變區(qū)包含三個(gè)⑶Rs。⑶R肽可以通過(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo) 抗體的⑶R的基因而獲得。這種基因例如是通過(guò)利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以合成來(lái)自抗體 生產(chǎn)細(xì)胞的RNA的可變區(qū)而進(jìn)行制備的。參見例如，Larrick等，Methods :A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991) ；Courtenay-Luck, " Genetic Manipulation of MonoclonalAntibodies, “ in MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等(編輯)，I66-I79 頁(yè)(劍橋大學(xué)出版社 I"5)；和 Ward 等，“Genetic Manipulation andExpression of Antibodies, " in MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(編輯)，137-185 頁(yè)(ffiley-Liss, Inc. 1995)。還可以使用其它剪切抗體的方法，如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段，進(jìn)一步 剪切片段，或其它酶學(xué)的、化學(xué)的或遺傳學(xué)的技術(shù)，只要片段能結(jié)合被完整抗體所識(shí)別的抗原。治療用的人源化、嵌合的和人抗CEA抗體本發(fā)明中所介紹的是利用鼠、嵌合的、人源化的和人III類抗CEA抗體或其片段進(jìn) 行治療的組合物和方法。優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其片段為MN-14抗體或其片段。本 發(fā)明的抗體可以用于治療甲狀腺髓樣癌(MTC)，以及非MTC的表達(dá)CEA的癌癥。例示性的非 MTC的表達(dá)CEA的癌癥包括結(jié)腸直腸癌、胰癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、子宮 癌、乳癌和卵巢癌。組合物本文考慮的是含有至少一種III類抗CEA單克隆抗體(MAb)或其片段以及至少一 種治療劑的組合物，所述抗體和治療劑彼此不相偶聯(lián)，并且因而作為每種組分的非偶聯(lián)形式存在于組合物中。在包含一種以上的抗體或其片段，如一種第二個(gè)III類抗CEA抗體的 組合物中，該第二個(gè)抗體為非阻抑性的(即，不會(huì)阻抑第一個(gè)III類抗CEA抗體或抗體片段 的結(jié)合)。在一個(gè)實(shí)施方案中，III類抗CEA單克隆抗體或其片段是人源化的、嵌合的或完整 的人的，其中人源化的、嵌合的，或完整的人MAb基本上保持鼠III類抗CEA MAb的III類 抗CEA結(jié)合特異性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，III類抗CEA單克隆抗體或其片段是MN-14抗體或其片 段。優(yōu)選地，MN-14單克隆抗體或其片段包含鼠MN-14單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)，其 中所述MN-14單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的⑶Rs包含含有氨基酸序列KASQDVGTSVA的⑶Rl ； 含有氨基酸序列WTSTRHT的⑶R2 ；和含有氨基酸序列QQYSLYRS的⑶R3 ；并且所述III類抗 CEA抗體的重鏈可變區(qū)的CDRs包含含有TYWMS的CDRl ；含有EIHPDSSTINYAPSLKD的CDR2 ； 和含有LYFGFPWFAY的CDR3。還要優(yōu)選地，MN-14單克隆抗體與CEA反應(yīng)并且與正常的交叉 反應(yīng)抗原(NCA)和胎糞抗原不反應(yīng)。但是，針對(duì)這些交叉反應(yīng)決定簇的抗體可以用于和CEA 特異性抗體一起進(jìn)行的組合治療，如與MN-14單克隆抗體組合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，MN-14單克隆抗體或其片段是人源化的或完整的 人MN-14抗體或其片段。人源化MN-14抗體或其片段的輕鏈和重鏈可變區(qū)的框架區(qū)(FRs) 優(yōu)選包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14單克隆抗體的相應(yīng)FRs的氨基酸。還要優(yōu)選地，人源化 MN-14抗體或其片段包含選自如上面所提到的圖14A-C的鼠重鏈可變區(qū)(KLHuVhAIGA)的 氨基酸殘基24、28、30、48、49、74和94的至少一個(gè)氨基酸。優(yōu)選的人源化重鏈可變區(qū)的 氨基酸序列還在Hansen等，美國(guó)專利號(hào)5，874，540中給出，將其全部?jī)?nèi)容并入作為參考。 還要優(yōu)選地，人源化重鏈可變區(qū)包含圖14A-C中所示的氨基酸序列，表示為KLHuVhAIG和 KLHuVhAIGAY。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái)自鼠 MN-14輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)FR的氨基酸。最為優(yōu)選地，人源化的MN-14抗體或其片段包含圖 13A或圖22k或圖23A的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種包含嵌合MN-14單 克隆抗體或其片段以及至少一種治療劑的組合物，所述抗體和治療劑彼此不相偶聯(lián)，并且 因而作為每種組分的非偶聯(lián)形式存在于組合物中。優(yōu)選地，嵌合MN-14抗體或其片段包含 圖13A或圖22A或圖23A中所示的MN-14輕鏈可變區(qū)的⑶Rs以及如圖14A-C或圖22B或 圖23B中所示的鼠MN-14重鏈可變區(qū)的⑶Rs。本文還介紹了一種包含裸鼠的、人源化的、嵌合的或人的III類抗CEA抗體或其片 段和一種治療劑，以及一種第二個(gè)裸的或偶聯(lián)的III類抗CEA抗體或其抗體片段，它是非阻 抑性的，即，不會(huì)阻抑第一個(gè)III類抗CEA抗體或其片段的結(jié)合，并且在一種可藥用的載體 中配制。換句話說(shuō)，III類抗CEA抗體或其片段對(duì)于彼此都是非阻抑性的，因而允許抗體或 其片段結(jié)合CEA(66e)。此外，本發(fā)明的III類CEA抗體或其抗體片段，以及用于組合治療中 的那些，并不結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d。與本發(fā)明的抗體片段的裸III類抗CEA抗體一起作 為裸抗體或作為免疫偶聯(lián)物的組分適于組合治療的其它III類抗體包括在Kuroki等，JP R Cancer Res. ,78(4) 386 (1987) andHammarstrom(Cancer Res. 52(8) 2329(1992))中所述 的非阻抑性抗體或其片段，它也不結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d。此外，其它的抗CEA抗體，如II類或I類抗CEA抗體，可以以裸的或偶聯(lián)的形式 用于與本發(fā)明的III類抗CEA抗體的組合中。這種可以用作組合治療的II類抗體或抗體片段是非阻抑性的并且不結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d，但是與胎糞抗原(MA)和CEA反應(yīng)。例 如，一種或多種嵌合的或人源化的II類抗CEA抗體或其片段，如MN-6或NP-3，可以與本 發(fā)明的一種III類抗CEA抗體或其片段相結(jié)合。這兩種抗體不與CD66a-d或粒細(xì)胞反 應(yīng)(Hansen 等，Cancer 1993Junl ；71 (11) :3478_85)。許多出版物公開了識(shí)別 CEA 和 CEA 基因家族不同成員的 MAbs，如 Thompson 等，J Clin. Lab. Anal. 5 :344(1991) ；Kuroki 等， J BioL Chem. 266 :11810 (1991) ；Nagel 等，Eur. J Biochem. 214 :27 (1993) ；Skubitz 等，J Immunol. 155 5382(1995) ；Skubitz 等，J. Leukoc. Biol. 60 106(1996)；和 Chen 等，Proc. Natl. Aca d. Sci. 93 14851 (1996)。而且，第二抗體或抗體片段是未偶聯(lián)(裸的)的或與至少一種治療劑(免疫偶聯(lián) 物)偶聯(lián)的?？梢酝ㄟ^(guò)間接地將一種治療劑偶聯(lián)至一種抗體組分而制備免疫偶聯(lián)物。在 Shih 等，Int. R Cancer，41 :832 (1988) ；Shih 等，Int. J Cancer, 46 1101(1990)；和 Shih 等，美國(guó)專利號(hào)5，057，313中介紹了一般的技術(shù)。一般的方法涉及將一種具有氧化的糖部 分的抗體組分與一種載體聚合物反應(yīng)，所述載體聚合物具有至少一種游離的胺功能官并且 裝填了多種藥物、毒素、螯合劑、硼衍生物或其它治療劑。這種反應(yīng)導(dǎo)致SchifT堿(亞胺) 連接，它可以通過(guò)還原成仲胺進(jìn)行穩(wěn)定化以形成最終的偶聯(lián)物。優(yōu)選地，用于治療的組合物 中的抗CEA抗體或其片段為MN-14抗體或其片段。更加優(yōu)選地，MN-14抗體或其片段是人 源化的。本發(fā)明還要求一種含有裸的人源化的、嵌合的、鼠的或人的III類抗CEA抗體或 其片段和一種治療劑，以及一種偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的第二抗體或其抗體片段。在一個(gè)實(shí)施例 中，第二抗體或其片段是非偶聯(lián)的(裸的)或偶聯(lián)到至少一種治療劑上。適于組合治療的 非I類、II類或III類抗CEA抗體和其片段包括，但不限于，與癌癥相關(guān)聯(lián)的抗體和其片 段。與癌癥相關(guān)聯(lián)的抗體和抗體片段的例子結(jié)合EGP-l、EGP-2(e. g.，17-1A)、MUC_1、MUC_2、 MUC-3、MUC-4、PAM-4、KC4、TAG-72、EGFR、HER2/neu、BrE3、Le-Y, A3、Α33、Ep-CAM、AFP、Τη、 Thoms on-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF, PlGF或其它腫瘤血管發(fā)生抗原、Ga 733、IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、細(xì)胞粘合素、纖維結(jié)合素或其組合。如上面所討論的，不結(jié) 合⑶66a-d或粒細(xì)胞的非阻抑性的II類和III類抗CEA MAbs,或者選擇性地，結(jié)合⑶66a、 b和d的II類抗CEA MAbs或者結(jié)合CD66a、b和d，以及CD66c的I類抗CEA MAbs,也可以 與III類CEA抗體組合使用。適于組合治療的其它抗體和抗體片段也包括靶向癌基因標(biāo)記 或產(chǎn)物的那些，或針對(duì)腫瘤脈管系統(tǒng)標(biāo)記，如血管發(fā)生因子、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)的抗體， 和針對(duì)某些免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的抗體，如針對(duì)CD40的抗體。方法本發(fā)明中還介紹了治療甲狀腺髓樣癌和非甲狀腺髓樣癌的方法。非甲狀腺髓樣 癌包括結(jié)腸直腸癌和任何其它表達(dá)CEA的腫瘤，如胰癌、乳癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌，某些類型 的表達(dá)可變數(shù)量的CEA的肺癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌和肝癌。在這些類型的癌癥中 CEA的水平比存在于甲狀腺髓樣癌中的要低得多，但是必要的是CEA的水平足夠高從而111 類抗CEA療法提供有效的治療。正常的結(jié)腸粘膜層具有大約100-500ng/克但是以大約 5mcg/克組織水平的表達(dá)CEA的癌適于用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行治療。例如，本文要求一種治療甲狀腺髓樣癌或非甲狀腺髓樣癌的方法，包括向受試者 同時(shí)或按順序地給藥治療上有效量的III類抗CEA單克隆抗體或其片段和至少一種治療劑，并且優(yōu)選在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。優(yōu)選地，III類抗CEA單克隆抗體或其片段 是嵌合的、鼠的、人源化的或人的，其中嵌合的、人源化的、鼠的或人的III類抗CEA MAb基 本上保留了鼠MAb的III類抗CEA抗體的結(jié)合特異性。更加優(yōu)選地，III類抗CEA抗體是人 源化的，最優(yōu)選地，是如本文和美國(guó)專利5，874，540中所述的人源化的MN-14單克隆抗體。 治療劑優(yōu)選是一種細(xì)胞毒性劑，更加優(yōu)選是一種烷基化劑，最優(yōu)選是達(dá)卡巴嗪(DTIC)。但是 在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑也可以不是DTIC。其它類別的抗腫瘤的細(xì)胞抑制劑和細(xì)胞毒 性劑，如5-氟尿嘧啶、CPT-Il (也稱為依立替康和camptosar)和奧沙利鉬也可以用于與這 些抗體的組合，特別是在結(jié)腸直腸癌的治療中。在其它的癌癥類型中，已知有效的癌癥藥物 也是與用于本文所提出的抗體治療相結(jié)合的良好候選物。本文還要求一種治療甲狀腺髓樣癌或非甲狀腺髓樣癌的方法，包括向受試者同時(shí) 或按順序給藥治療上有效量的III類抗CEA單克隆抗體或其片段和至少一種治療劑，以及 一種裸的或偶聯(lián)的第二人源化的、嵌合的、人的或鼠的單克隆抗體或其片段，并且優(yōu)選在一 種可藥用的載體中進(jìn)行配制。優(yōu)選地，第一 III類抗CEA MAb是人源化的MN-14抗體或其 片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗體或其片段是與癌相關(guān)的抗體或其片段，選自與TAG-72、 EGFR、HER2/neu、MUC1、MUC2、MUC 3、MUC4、EGP-1、EGP-2、AFP、Tn、IL-6、胰島素生長(zhǎng)因子 1， 或另一種如上所述的這類與腫瘤關(guān)聯(lián)的抗原反應(yīng)的單克隆抗體或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，第二抗體或其片段可以是一種不同的IIII類抗CEA抗體或其片段，它是非阻抑性的 并且不結(jié)合粒細(xì)胞或⑶66a-d。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗CEA抗體是一種II類抗體或其片段，如在 Hammarstrom和Kuroki中所述的那些，條件是它們不與粒細(xì)胞或CD66a_d結(jié)合。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，這種抗體包括I類Mabs或其片段，它與⑶66a、b或d以及⑶66c反應(yīng)?？贵w 和其片段可以同時(shí)或按順序地給藥或與治療劑一起給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗體或 其片段可以是裸的也可以是偶聯(lián)到一種治療劑上的。因此，本發(fā)明要求保護(hù)按順序地或同時(shí)地與一種或多種治療劑一起給藥祿的鼠 的、人源化的、嵌合的和人的抗CEA抗體和其片段，或作為多模式療法進(jìn)行給藥。在本發(fā)明 中，優(yōu)選III類抗CEA抗體，但是任何靶向腫瘤細(xì)胞的抗CEA抗體都是有用的。如本文所述 的裸III類抗CEA抗體可以顯著地提高癌細(xì)胞對(duì)于一種或多種治療劑的化學(xué)敏感性。例 如，在用一種治療劑，如CPT-11、5’ -氟尿嘧啶(5-FU)或奧沙利鉬處理之前或同時(shí)，用一種 如本文所述的裸III類抗CEA抗體MN-14處理結(jié)腸癌細(xì)胞，提高了細(xì)胞對(duì)于治療劑，如細(xì)胞 毒性藥物的反應(yīng)。另外，這些單獨(dú)用裸的III類抗CEA抗體處理或結(jié)合一種治療劑進(jìn)行處 理的治療方法可以進(jìn)一步通過(guò)給藥一種如本文所述的免疫調(diào)節(jié)劑而得到改進(jìn)，所述免疫調(diào) 節(jié)劑的給藥是在裸抗體的給藥或裸抗體與至少一種治療劑的給藥之前。本發(fā)明的多模式療法包括使用一種III類抗CEA抗體或其片段和一種治療劑的免 疫治療，補(bǔ)充以一種非偶聯(lián)的或偶聯(lián)的抗體、非偶聯(lián)的或偶聯(lián)的融合蛋白或其片段的給藥。 例如，一種非偶聯(lián)的人源化的、嵌合的、鼠的或人的MN-HMAb或其片段可以與另一種裸的 人源化的、鼠的、嵌合的或人的III類抗CEA抗體(如一種相對(duì)于CEA上不同表位的并且也 不結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d的抗體)，或一種人源化的、嵌合的、鼠的或人的III類抗CEA抗 體的免疫偶聯(lián)物相結(jié)合，所述免疫偶聯(lián)物偶聯(lián)到一種放射性同位素、化療劑、細(xì)胞因子、酶、 酶抑制劑、激素或激素拮抗劑、金屬、毒素、反義寡核苷酸(例如，反bcl-2)或其組合上。裸III類抗CEA抗體或其片段也可以與一種偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的鼠融合蛋白、人源化的、嵌合的 或人的III類抗CEA抗體相結(jié)合。但是，用于組合治療的III類抗CEA抗體彼此是非阻抑 性的并且不能結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d。優(yōu)選地，將裸III類抗CEA抗體與第二個(gè)裸的或偶聯(lián) 的抗體、融合蛋白或其片段按順序地或同時(shí)進(jìn)行給藥。還要優(yōu)選地，用于組合治療的抗體或 抗體片段之一是一種裸的人源化的MN-14抗體或其片段。此外，作為裸的或偶聯(lián)的抗體、融 合蛋白或其片段使用的第二抗體可以是一種人的、人源化的、嵌合的或鼠的II類CEA抗體 或其片段，它是非阻抑性的并且不能結(jié)合粒細(xì)胞或CD66a-d。根據(jù)本實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選的 抗體組合將包括一種缺乏效應(yīng)子功能的裸的交叉反應(yīng)性的抗CD66a-d抗體，它不激活補(bǔ)體 并且不誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放。此外，交叉反應(yīng)性的抗⑶66a_d Fab'或甚至是F(ab' )2可 能不破壞粒細(xì)胞并且可以與一種III類抗CEAMAb或一種NP-3型的II類抗CEA MAb 一起 使用。在本文所述的方法中，受試者至少接受一種裸的III類抗CEA抗體或其片段，它是 在一種治療劑之前、之后或與之一起給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種III類抗CEA抗體被用 于預(yù)處理細(xì)胞，即在治療劑之前給藥。優(yōu)選地，III類抗CEA抗體是一種MN-14抗體，如人 源化的MN-14 (hMN-14)，它在一種治療劑，如5-FU或CPT-Il之前至少1個(gè)小時(shí)進(jìn)行給藥。優(yōu)選地，治療劑為用于標(biāo)準(zhǔn)的癌癥化療中的藥物，如卵巢癌中的紫杉烷或鉬藥物、 結(jié)腸直腸癌中的氟尿嘧啶、CPT-Il和奧沙利鉬藥物，用在胰癌和其它癌癥中的吉西他濱，或 用在乳癌中的紫杉烷衍生物。C0X-2抑制劑仍然代表另一類藥劑，它在癌癥化療中與典型的 細(xì)胞毒性劑相結(jié)合而顯示活性，并且可以在本發(fā)明中以同樣的方式使用，但是結(jié)合以除了 單獨(dú)的CEA抗體之外的藥劑以及結(jié)合以其它的與癌癥關(guān)聯(lián)的抗體。優(yōu)選地，這些藥劑可以 與放射性標(biāo)記的抗體結(jié)合使用，所述放射性抗體既有CEA抗體偶聯(lián)物也有與上述種類的其 它癌關(guān)聯(lián)的抗體的放射性偶聯(lián)物。還優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其片段是MN-14抗體或 其片段。還要優(yōu)選地，MN-14抗體或其片段是人源化的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，裸III類抗CEA抗體或其片段與達(dá)卡巴嗪(DTIC)、阿霉 素、環(huán)磷酰胺或長(zhǎng)春新堿，或這些的任意組合按順序地(之前或之后)或同時(shí)地進(jìn)行給藥。 例如，DTIC和環(huán)磷酰胺可以與裸III類抗CEA抗體或其片段按順序地或同時(shí)地進(jìn)行給藥。 優(yōu)選地，抗CEA抗體或其片段是人源化的MN-14抗體或其片段。類似地，5-氟尿嘧啶結(jié)合 以單獨(dú)的亞葉酸或結(jié)合以依立替康(CPT-Il)或結(jié)合以?shī)W沙利鉬，是用于治療結(jié)腸直腸癌 的一種療法。其它合適的組合化療療法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，如單獨(dú)用奧沙利鉬， 或結(jié)合以這些其它的藥物。因此，根據(jù)所用的療法，與任何這些化療劑和裸III類抗CEA抗 體或其片段的組合療法都能夠用于治療MTC或非MTC。在甲狀腺髓樣癌中，仍然可以優(yōu)選化 療劑，如一種烷基化劑(例如，DTIC)，以及吉西他濱和其它更加新近類別的細(xì)胞毒性劑?；?療藥物和裸III類抗CEA抗體或其片段可以以任何順序或一起給藥。換句話說(shuō)，抗體和治療 劑可以同時(shí)或按順序地進(jìn)行給藥。在一個(gè)優(yōu)選的多模式療法中，在給藥一種根據(jù)本發(fā)明的 偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的抗CEA抗體、融合蛋白或其片段之前、之后或同時(shí)給藥化療藥物和裸III 類抗CEA抗體或其片段。優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其片段為人源化MN-14抗體或其片 段。一種優(yōu)選的多模式療法的治療方案給藥hMN-14和DTIC3天，僅在第7、14、21天 給藥hMN-14，并且隨后每個(gè)第21天給藥一次，持續(xù)12個(gè)月的治療期。hMN-14的劑量是
220. 5-15mg/kg體重/每次輸液，更加優(yōu)選2-8，并且依然更加優(yōu)選3_5mg/kg體重/每次輸液， 而DTIC的劑量如目前臨床應(yīng)用的優(yōu)選劑量，但是也可以給予應(yīng)用的最大優(yōu)選劑量的2/3或 更少，由此降低與藥物相關(guān)的副作用?？梢越o予重復(fù)的藥物循環(huán)，如每1-6個(gè)月，伴隨著持 續(xù)的裸抗體治療，或伴隨著放射性抗體、藥物偶聯(lián)的抗體，以及包括某些細(xì)胞因子如G-CSF 和/或GM-CSF的不同方案，調(diào)整每種劑量從而使對(duì)于病人的毒性不被治療組合所增強(qiáng)。細(xì) 胞因子生長(zhǎng)因子，如G-CSF的應(yīng)用，可以使要給藥甚至更高劑量的骨髓抑制劑，如放射性標(biāo) 記的抗體或細(xì)胞毒性藥物成為可能，并且這些方案和劑量將根據(jù)病人的疾病狀態(tài)和以往的 治療而對(duì)病人個(gè)別地進(jìn)行調(diào)整，所有的疾病狀態(tài)和以往的治療都影響骨髓狀態(tài)和對(duì)于其它 細(xì)胞毒性治療的耐受性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100-600毫克蛋白質(zhì)/劑/注射的 劑量給藥MN-14抗體或其片段。仍要優(yōu)選地，以300-400毫克蛋白質(zhì)/劑/注射的劑量給 藥MN-14抗體或其片段，優(yōu)選重復(fù)的劑量。根據(jù)許多因素，包括疾病的程度和在病人血液中 循環(huán)的CEA的量，優(yōu)選的抗體方案是每周1次或以更小的頻率進(jìn)行輸液，更小的頻率如每?jī)?周一次或甚至是每三周一次。治療劑這里所列舉的治療劑是對(duì)于分別與如本文所述的裸抗體一起給藥也有用的那些 藥劑。合適的治療劑可以選自細(xì)胞毒性劑、毒素、激素、放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療 劑(如色素原或染料)、反義寡核苷酸、免疫偶聯(lián)物、另一種裸抗體、激素，或其組合。治療 劑包括，例如化療藥物如長(zhǎng)春花生物堿和其它生物堿、蒽環(huán)霉素、表皮葉毒素、紫杉烷S、抗 代謝藥、烷基化劑、抗生素、C0X-2抑制劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成素和凋亡劑，特別是 阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜樹堿，和來(lái)自這些和其它類別的抗癌劑的其它藥劑 等。其它對(duì)于制備免疫偶聯(lián)物和抗體融合蛋白有用的癌癥化療藥物包括氮芥、烷基硫酸、亞 硝基脲、三氮烯、奧沙利鉬、葉酸類似物、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉬配位化 合物、激素、毒素(例如，核糖核酸酶、假單胞菌外毒素)等。根據(jù)要治療的腫瘤的不同，優(yōu) 選的治療劑包括DTIC、CPT-IU5-氟尿嘧啶、紫杉醇、奧沙利鉬、阿霉素、環(huán)磷酰胺和長(zhǎng)春新 堿，或其組合。合適的化療劑在 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack PublishingCo. 1995)，和在 GOODMAN AND GILMAN ' S THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS，第七版.(MacMillan Publishing Co. 1985)，以及這些出版物的修訂版本中 進(jìn)行了介紹。其它合適的化療劑，如實(shí)驗(yàn)性的藥物，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。毒素，如假單胞菌外毒素，也可以與一種裸III類抗CEA抗體或其片段一起給藥。 優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其片段是人源化的MN-14或其片段。其它在裸的III類抗CEA 抗體或其片段給藥之前、之后或同時(shí)地非偶聯(lián)給藥的合適微生物、植物或動(dòng)物毒素包括蓖 麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、金葡菌腸毒素A、商陸抗病毒蛋 白、白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。見，例如，Pastan等，Cell 47 :641(1986)，和 Goldenberg，CA-A Cancer Journalfor Clinicians 44 :43(1994)。其它 的適用于本發(fā)明的毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的并且在美國(guó)專利號(hào)6，077，499中公開， 將它的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。這些可以源自，例如動(dòng)物、植物和微生物來(lái)源，或化學(xué)地或 重組地工程化設(shè)計(jì)的。該毒素可以是一種植物的、微生物的或動(dòng)物的毒素，或其合成性的 變異體。免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子也可以對(duì)本發(fā)明的嵌合的、人源化的或人的III類抗CEA抗體或其片段非偶聯(lián)地進(jìn)行給藥。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)物”包括細(xì)胞因子、干細(xì) 胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素如腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子如白介素(例如，白介素I(IL-I)、 IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18和IL-21)、集落刺激因子(例如，粒細(xì)胞集落刺激因 子(GM-CSF)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如，干擾素α、β或 Y)、被指定為"Sl因子"的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素和血小板生成素。合適的免疫 調(diào)節(jié)劑包括 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、γ 干擾素、TNF-α 等。所以，受試者 可以接受一種裸的III類抗CEA抗體或其片段以及一種單獨(dú)給藥的細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因 子可以在裸的III類抗CEA抗體或其片段的給藥之前、同時(shí)或之后進(jìn)行給藥。由于一些抗 原也可以是免疫調(diào)節(jié)劑，CD40抗原，例如，也可以與一種裸III類抗CEA抗體或其片段聯(lián)合 給藥，在裸抗體或抗體組合的給藥之前、同時(shí)或之后進(jìn)行給藥。此外，適于治療患病組織的 放射性核素包括，但不限于，32P、33P、47Sc、59Fe、64CU、67CU、75Se、77AS、89Sr、9°Y、99Mo、105Rh^109Pd, mAg、125I、131I、142Pr、143Pr、212Pb，和 213Bi、58Co、67Ga、80mBr,99mTc,103mRh^109Pt,111In^119Sb,161Ho, 189m0s、192Ir、152Dy、211At、212Bi、223Ra、219Rn、215P0、211Bi、225AC、221Fr、217At、213Bi、88Y 和 255Fm。優(yōu)選 的放射性核素為125I、1311、9°Y、mLu和225Ac。還優(yōu)選地，放射性核素具有介于20和10，OOOkeV 之間的能量?？伤幱玫妮d體要遞送給受試者的裸鼠的、人源化的、嵌合的和人的III類抗CEA MAbs可以包含 一種或多種可藥用的載體、一種或多種其它的成分，或這些的某種組合。本發(fā)明的非偶聯(lián)的III類抗CEA抗體和其片段可以根據(jù)已知的制備藥用組合物的 方法進(jìn)行配制。優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其片段為MN-14抗體或其片段。滅菌的磷酸緩 沖液鹽水是可藥用載體的一個(gè)例子。見，例如，Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS,第 5 版(Lea&Febiger 1990)，和 Gennaro (編輯)，REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版(Mack Publishing Company 1990)，及其修訂版?？梢詫⒈景l(fā)明的非偶聯(lián)的III類抗CEA抗體和其片段配制以進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥，所 述靜脈內(nèi)給藥通過(guò)例如丸劑注射或持續(xù)輸液的方式進(jìn)行。優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其 片段為MN-14抗體或其片段。注射用的劑型可以以單位劑量形式給出，例如，與一種防腐劑 一起共存于安瓿瓶中或共存于多劑量容器中。組合物可以采用在油狀或水樣載體中的懸浮 液、溶液或乳劑的形式，并且可以包含成型劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸谑褂?前活性成分可以是粉末形式以構(gòu)成一種穩(wěn)定的載體，如滅菌的無(wú)熱原水?？梢岳闷渌乃帉W(xué)方法控制藥劑和視抗體或其片段作用的持續(xù)時(shí)間?？刂?釋放的制劑可以通過(guò)使用聚合物來(lái)復(fù)合或吸收裸抗體來(lái)制備。例如，生物相容性的聚合物 包括聚(乙烯-共-醋酸乙烯基酯)的基質(zhì)和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酐共聚物的基 質(zhì)。Sherwood等，BiolTechnology 10:1446(1992)。從這種基質(zhì)中釋放抗體或其片段的 速率依賴于免疫偶聯(lián)物或抗體的分子量、基質(zhì)內(nèi)抗體的量和分散顆粒的大小。Saltzman 等，Biophys. R 55 :163(1989) ;Sherwood等，見前。其它固體配藥形式在Ansel等， PHARMACEUTICAL D0SAGEF0RMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第 5 版(Lea&Febiger 1990)， 和 Gennaro (編輯)，REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版(Mack Publishing Company 1990)，及其修訂版中進(jìn)行了介紹。非偶聯(lián)的III類抗CEA抗體或其片段也可以以皮下方式或甚至通過(guò)其它腸胃外途徑對(duì)哺乳類給藥。而且，給藥可以是通過(guò)持續(xù)的輸液或通過(guò)單次或多次的丸劑。通常，給人 類給藥裸抗體或其片段的劑量將根據(jù)病人的年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學(xué)條件和以往 病史而變化。一般地，單次靜脈輸液在大約0. 5mg/kg-20mg/kg范圍的裸抗體或其片段的劑 量是合乎需要的，盡管根據(jù)情況要求可以給藥較低或較高的劑量。這種劑量可以如需要進(jìn) 行重復(fù)，例如每月1次持續(xù)4-10個(gè)月，優(yōu)選每?jī)芍芤淮纬掷m(xù)16周，并且更加優(yōu)選每周一次 持續(xù)8周。還可以以更少的頻率給藥，如每?jī)芍芤淮纬掷m(xù)幾個(gè)月或者以更大的頻率和/或 持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間地給藥?？梢酝ㄟ^(guò)各種腸胃外途徑給藥，適當(dāng)調(diào)整劑量和方案。為了治療的目的，向哺乳類給藥治療上有效量的III抗CEA抗體或其片段以與 未處理的對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比減小腫瘤的大小。優(yōu)選地，III類抗CEA抗體或其片段是人源化的 MN-14抗體或其片段。適于本發(fā)明的受試者通常是人，盡管還考慮非人的哺乳類或動(dòng)物受試 者。述及以“治療上有效量”來(lái)給藥抗體制品，如果給藥的量是生理上有意義的話。如果一 種藥劑的存在導(dǎo)致受體哺乳類生理上可檢測(cè)的變化，那么這種藥劑是生理上有意義的。特 定地，本發(fā)明的抗體制品是生理上有意義的，如果它的存在引起抗腫瘤反應(yīng)的話。生理上有 意義的效應(yīng)還可以是受體哺乳類中體液和/或細(xì)胞免疫的誘發(fā)。本發(fā)明進(jìn)一步包括下列編號(hào)的實(shí)施方案1. 一種包含至少一種抗CEA單克隆抗體(MAb)或其片段和至少一種治療劑的組合 物。實(shí)施方案1的組合物，其中所述抗CEA MAb為I類、II類或III類抗CEA MAb,當(dāng)所述 MAb為I類或II類MAb并且與粒細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，所述MAb是MAb的單價(jià)形式。2.實(shí)施方案1的組合物，其中所述抗CEA MAb或其片段是人源化的，并且其中所述 人源化的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA的結(jié)合特異性。3.實(shí)施方案1的組合物，其中所述抗CEA MAb或其片段是一種嵌合的MAb，并且其 中所述嵌合的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。4.實(shí)施方案1的組合物，其中所述抗CEA MAb或其片段是完整的人MAb，并且其中 所述人MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA的結(jié)合特異性。5.實(shí)施方案1的組合物，其中所述抗CEA單克隆抗體或其片段是一種MN-14抗體 或其片段。6.實(shí)施方案5的組合物，其中所述MN-14抗體或其片段包含鼠MN-14單克隆抗 體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中所述MN-14抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRs包含含有氨基酸序列 KASQDVGTSVA的CDRl ；含有氨基酸序列WTSTRHT的CDR2 ；和含有氨基酸序列QQYSLYRS的 ⑶R3?？笴EA單克隆抗體或其片段包含所述MN-14抗體的重鏈可變區(qū)的⑶Rs，所述重鏈可 變區(qū)的 CDRs 包含含有 TYWMS 的 CDRl ；含有 EIHPDSSTINYAPSLKD 的 CDR2 ；和含有 LYFGFPWFAY 的⑶R3。另外，抗CEA的單克隆抗體或其片段包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的⑶Rs。7.實(shí)施方案1的組合物，其中所述抗CEA的單克隆抗體與CEA反應(yīng)并且與正常的 交叉反應(yīng)性抗原(NCA)和胎糞抗原(MA)不反應(yīng)。8.實(shí)施方案7的組合物，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是人源化的MN-14 抗體或其片段。9.實(shí)施方案7的組合物，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是嵌合的MN-14抗 體或其片段。10.實(shí)施方案7的組合物，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是完整的人MN-14抗體或其片段。11.實(shí)施方案8的組合物，其中所述人源化MN-14抗體或其片段的輕鏈和重鏈可變 區(qū)的框架區(qū)(FRs)包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14單克隆抗體的相應(yīng)FRs的取代的氨基酸。12.實(shí)施方案11的組合物，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái) 自所述鼠MN-14抗體的所述相應(yīng)FR的氨基酸，所述氨基酸選自圖14A-C或圖22B (hMN-14) 或圖23B的鼠重鏈可變區(qū)(KLHuVhAIGA)的氨基酸殘基24、28、30、48、49、74和94。13.實(shí)施方案11的組合物，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái) 自所述鼠MN-14輕鏈可變區(qū)的所述相應(yīng)FR的氨基酸。14.實(shí)施方案8的組合物，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含如圖13A或 圖22A或圖23A中所示的輕鏈可變區(qū)，以及圖14A-C中所示標(biāo)明為KLHuVhAIGA的或圖 22B(hMN-14)或圖23B中所示的重鏈可變區(qū)。15.實(shí)施方案9的組合物，其中所述嵌合的MN-14抗體或其片段包含如圖13A中所 示標(biāo)明為MN-14V κ的輕鏈可變區(qū)和圖14A-C中標(biāo)明為麗-14VH的重鏈可變區(qū)。16.實(shí)施方案1-15任一項(xiàng)的組合物，其中所述片段選自F(ab' ) 2、Fab'、Fab、 Fv 禾口 ScFv017.實(shí)施方案1-15任一項(xiàng)的組合物，其中所述治療劑選自裸抗體、細(xì)胞毒性劑、 藥物、放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療劑、免疫偶聯(lián)物、激素、毒素、反義寡核苷酸或其組 合，任選地在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。18.實(shí)施方案17的組合物，其中所述其組合包含長(zhǎng)春新堿、阿霉素、奧沙利鉬、 CPT-11、氟尿嘧啶、DTIC和環(huán)磷酰胺。19.實(shí)施方案17的組合物，其中所述治療劑是裸抗體或免疫偶聯(lián)物。20.實(shí)施方案19的組合物，其中所述裸抗體或所述免疫偶聯(lián)物的抗體部分包 含一種人源化的、嵌合的、人的或鼠的單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段 選自與 EGP-1、EGP-2(例如，17-1A)、IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、MUC-U MUC-2、MUC-3、 MUC-4、PAM-4、KC4、TAG-72、EGFR, HER2/neu、BrE3、Le-Y, A3、Α33、Ep-CAM, AFP、Τη、 Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)或其它腫瘤血管 發(fā)生抗原、Ga 733、細(xì)胞粘合素、纖維結(jié)合素及其組合反應(yīng)的單克隆抗體或其片段。21.實(shí)施方案20的組合物，其中所述片段選自F(ab' )2、F(ab)2、Fab‘、Fab、Fv 禾口 ScFv022.實(shí)施方案1-15任一項(xiàng)的組合物，其中所述治療劑不是DTIC。23. 一種治療非甲狀腺髓樣癌的方法，包括向受試者同時(shí)或按順序地給藥治療有 效量的抗CEA抗體或其片段和至少一種治療劑，任選地在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。24.實(shí)施方案23的方法，其中所述抗CEA MAb或其片段是人源化的，其中所述人源 化的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。25.實(shí)施方案23的方法，其中所述抗CEA MAb或其片段是嵌合的MAb，其中所述嵌 合的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。26.實(shí)施方案23的方法，其中所述抗CEA單克隆抗體或其片段是MN-14抗體或其 片段。27.實(shí)施方案23的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段包含鼠MN-14單
26克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中所述MN-14抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRs包含含有氨 基酸序列KASQDVGTSVA的⑶R1 ；含有氨基酸序列WTSTRHT的⑶R2 ；和含有氨基酸序列 QQYSLYRS的⑶R3 ；所述抗CEA抗體的重鏈可變區(qū)的⑶Rs包含含有TYWMS的⑶R1 ；含有 EIHPDSSTINYAPSLKD 的 CDR2 ；和含有 LYFGFPWFAY 的 CDR3。28.實(shí)施方案27的方法，其中所述抗CEA單克隆抗體與CEA反應(yīng)并且與正常交叉 反應(yīng)性抗原(NCA)和胎糞抗原(MA)不反應(yīng)。29.實(shí)施方案28的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是人源化的MN-14 抗體或其片段。30.實(shí)施方案28的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是嵌合的MN-14抗 體或其片段。31.實(shí)施方案28的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是完整的人MN-14 抗體或其片段。32.實(shí)施方案29的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段的輕鏈和重鏈可變 區(qū)的框架區(qū)(FRs)包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14單克隆抗體的相應(yīng)FR s的取代的氨基酸。33.實(shí)施方案32的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái)自 所述鼠MN-14抗體的所述相應(yīng)FR的氨基酸，所述氨基酸選自圖14A-C標(biāo)明為KLHuVhAIGA 或圖22B(hMN-14)或圖23B的鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基24、28、30、48、49、74和94。34.實(shí)施方案32的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái)自 所述鼠MN-14輕鏈可變區(qū)的所述相應(yīng)FR的氨基酸。35.實(shí)施方案32的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含如圖13A或圖 22A(hMN-14)或圖23A中所示的輕鏈可變區(qū)，以及圖14A-C中所示標(biāo)明為KLHuVhAIGA的或 圖22B(hMN-14)或圖23B中所示的重鏈可變區(qū)。36.實(shí)施方案23-35任一項(xiàng)的方法，其中所述片段選自F(ab)2、F(ab' )2、Fab'、 Fab、Fv 禾口 scFv037.實(shí)施方案23-36任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑選自人源化的、嵌合的、人的 或鼠的單克隆抗體或其片段，所述抗體或其片段選自II類抗CEA單克隆抗體、III類抗CEA 單克隆抗體及其組合，并且以治療上有效的量同時(shí)地或按順序地進(jìn)行給藥。38.實(shí)施方案37的方法，其中所述抗體或其片段是裸的或被偶聯(lián)到另一種治療劑上。39.實(shí)施方案23-36任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑選自裸抗體、細(xì)胞毒性劑、藥 物、放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療劑、反義寡核苷酸、CEA或非CEA抗體的免疫偶聯(lián)物、 激素或其組合，任選地在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。40.實(shí)施方案39的方法，其中所述治療劑選自與EGP-1、EGP_2(例如，17-1A)、 IL-6、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、PAM-4、KC4、TAG-72、EGFR、HER2/neu、BrE3、Le_Y、A3、A33、 Ep-CAM、AFP、Tn、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、P1GF或其它腫瘤血管 發(fā)生抗原、Ga 733、IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及其組合反應(yīng)的選自人源化的、嵌合的、人 的或鼠的單克隆抗體或其片段，并且以治療上有效的量同時(shí)地或按順序地對(duì)所述受試者進(jìn) 行給藥。41.實(shí)施方案40的方法，其中所述抗體或其片段是裸的或被偶聯(lián)到另一種治療劑上。42.實(shí)施方案23-36任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑不是DTIC。43.實(shí)施方案39的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是一種藥物或毒素。44.實(shí)施方案43的方法，其中所述藥物具有選自抗有絲分裂的、烷基化的、抗代謝 物的、抗血管緊張素的、凋亡的、生物堿、C0X-2和抗生素藥劑及其組合的藥學(xué)特性。45.實(shí)施方案43的方法，其中所述藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亞 硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗 代謝物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬配位化合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲胼衍生物、腎上 腺皮質(zhì)抑制劑、拮抗劑、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、喜樹堿、阿霉素和它們的類似物，及其組合。46.實(shí)施方案43的方法，其中所述毒素為微生物的、植物的或動(dòng)物的毒素，選自蓖 麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、a毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、金葡菌腸毒 素A、商陸抗病毒蛋白、白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。47.實(shí)施方案39的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋 巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血 小板生成素及其組合。48.實(shí)施方案47的方法，其中所述淋巴毒素為腫瘤壞死因子(TNF)，所述造血因 子為白介素(IL)，所述集落刺激因子為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞 集落刺激因子(GM-CSF)，所述的干擾素為干擾素a、0或Y，所述干細(xì)胞生長(zhǎng)因子被指定 為"S1因子"。49.實(shí)施方案47的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑包括11^-1、11^-2、11^-3、11^-6、11^-10、 IL-12、IL-18、IL-21、y 干擾素、TNF-a 或其組合。50.實(shí)施方案39的方法，其中所述放射性核素具有介于20和10，OOOkeV之間的能量。51.實(shí)施方案50的方法，其中所述放射性核素選自1251、1311、9°Y、88Y、225Ac、mLu、 188Re、186Re及其組合。52.實(shí)施方案39的方法，其中所述光敏治療劑為一種色素原或染料。53.實(shí)施方案44的方法，其中所述烷基化劑為達(dá)卡巴嗪。54.實(shí)施方案53的方法，其中100-600毫克蛋白質(zhì)/劑/注射的劑量給藥所述 MN-14抗體或其片段。55.實(shí)施方案54的方法，其中300-400毫克蛋白質(zhì)/劑/注射的劑量給藥所述 MN-14抗體或其片段。56. 一種治療甲狀腺髓樣癌的方法，包括向受試者同時(shí)或按順序地給藥治療有效 量的抗CEA抗體或其片段和至少一種治療劑，優(yōu)選在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。57.實(shí)施方案56的方法，其中所述抗CEA MAb或其片段是人源化的，其中所述人源 化的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。58.實(shí)施方案56的方法，其中所述抗CEA MAb或其片段是嵌合的MAb，其中所述嵌 合的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。59.實(shí)施方案56的方法，其中所述抗CEA單克隆抗體或其片段是MN-14抗體或其 片段。
60.實(shí)施方案59的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段包含鼠MN-14單克 隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中所述MN-14抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRs包含含有氨基酸 序列KASQDVGTSVA的CDR1 ；含有氨基酸序列WTSTRHT的CDR2 ；和含有氨基酸序列QQYSLYRS 的⑶R3 ；所述III類抗CEA抗體的重鏈可變區(qū)的⑶Rs包含含有TYWMS的⑶R1 ；含有 EIHPDSSTINYAPSLKD 的 CDR2 ；和含有 LYFGFPWFAY 的 CDR3。61.實(shí)施方案60的方法，其中所述抗CEA單克隆抗體與CEA反應(yīng)并且與正常的交 叉反應(yīng)性抗原(NCA)和胎糞抗原(MA)不反應(yīng)。62.實(shí)施方案61的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是人源化的MN-14 抗體或其片段。63.實(shí)施方案61的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是嵌合的MN-14抗 體或其片段。64.實(shí)施方案61的方法，其中所述MN-14單克隆抗體或其片段是完整的人MN-14 抗體或其片段。65.實(shí)施方案62的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段的輕鏈和重鏈可變 區(qū)的框架區(qū)(FRs)包含至少一個(gè)來(lái)自鼠MN-14單克隆抗體的相應(yīng)FRs的取代的氨基酸。66.實(shí)施方案65的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái)自 所述鼠MN-14抗體的所述相應(yīng)FR的氨基酸，所述氨基酸選自圖14A-C或22B的鼠重鏈可變 區(qū)的氨基酸殘基24、28、30、48、49、74和94。67.實(shí)施方案65的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含至少一個(gè)來(lái)自 所述鼠MN-14輕鏈可變區(qū)的所述相應(yīng)FR的氨基酸。68.實(shí)施方案65的方法，其中所述人源化MN-14抗體或其片段包含如圖13A或 22A(hMN-14)或圖23A中所示的輕鏈可變區(qū)，以及圖14A-C或22B (hMN_14)或23B中所示的 重鏈可變區(qū)。69.實(shí)施方案56-68任一項(xiàng)的方法，其中所述片段選自F(ab)2、F(ab' )2、Fab'、 Fab、Fv 禾口 sFv。70.實(shí)施方案56-68任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑選自人源化的、嵌合的、人的 或鼠的單克隆抗體或其片段，所述抗體或其片段選自II類抗CEA單克隆抗體、III類抗CEA 單克隆抗體及其組合，并且以治療上有效的量同時(shí)地或按順序地進(jìn)行給藥。71.實(shí)施方案70的方法，其中所述抗體或其片段是裸的或被偶聯(lián)到另一種治療劑上。72.實(shí)施方案56-68任一項(xiàng)的方法，其中所述的治療劑選自裸抗體、細(xì)胞毒性劑、 藥物、放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、光敏治療劑、CEA或非CEA抗體的免疫偶聯(lián) 物、激素或其組合，任選地在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。73.實(shí)施方案72的方法，其中所述治療劑選自與EGP-1、EGP_2(例如，17-1A)、 MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、PAM-4、KC4、TAG-72、EGFR、HER2/neu、BrE3、Le_Y、A3、A33、 Ep-CAM、AFP、Tn、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、P1GF或其它腫瘤血管 發(fā)生抗原、Ga 733、IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及其組合反應(yīng)的選自人源化的、嵌合的、人 的或鼠的單克隆抗體或其片段，并且以治療上有效的量同時(shí)地或按順序地對(duì)所述受試者進(jìn) 行給藥。
74.實(shí)施方案73的方法，其中所述抗體或其片段是裸的或被偶聯(lián)到另一種治療劑上。75.實(shí)施方案56-68任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑不是DTIC。76.實(shí)施方案72的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是一種藥物或毒素。77.實(shí)施方案72的方法，其中所述藥物具有選自抗有絲分裂的、烷基化的、抗代謝 物的、抗血管緊張素的、凋亡的、生物堿、C0X-2和抗生素藥劑及其組合的藥學(xué)特性。78.實(shí)施方案76的方法，其中所述藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基硫酸、亞硝 基脲、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代 謝物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬配位化合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲胼衍生物、腎上腺 皮質(zhì)抑制劑、拮抗劑、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、喜樹堿、阿霉素和它們的類似物，及其組合。79.實(shí)施方案76的方法，其中所述毒素為微生物的、植物的或動(dòng)物的毒素，選自蓖 麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、a毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、金葡菌腸毒 素A、商陸抗病毒蛋白、白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。80.實(shí)施方案72的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋 巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血 小板生成素及其組合。81.實(shí)施方案80的方法，其中所述淋巴毒素為腫瘤壞死因子(TNF)，所述造血因子 為白介素(IL)，所述集落刺激因子為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或粒-巨噬細(xì)胞集落刺 激因子(GM-CSF)，所素干擾素為干擾素a、0或Y，所述干細(xì)胞生長(zhǎng)因子指定為"S1因 子〃。82.實(shí)施方案72的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑包括11^-1、11^-2、11^-3、11^-6、11^-10、 IL-12、IL-18、IL-21、y 干擾素、TNF-a 或其組合。83.實(shí)施方案72的方法，其中所述放射性核素具有介于20和10，OOOkeV之間的能量。84.實(shí)施方案83的方法，其中所述放射性核素選自1251、1311、9°Y、88Y、225Ac、mLu、 188Re、186Re及其組合。85.實(shí)施方案72的方法，其中所述光敏治療劑為一種色素原或染料。86.實(shí)施方案77的方法，其中所述烷基化劑為達(dá)卡巴嗪。87.實(shí)施方案86的方法，其中以100-600毫克蛋白質(zhì)/劑/注射的劑量給藥所述 MN-14抗體或其片段。88.實(shí)施方案87的方法，其中以300-400毫克蛋白質(zhì)/劑/注射的劑量給藥所述 MN-14抗體或其片段。89. 一種治療癌癥的方法，包括向受試者同時(shí)或按順序地給藥治療有效量的抗 CEA抗體或其片段和至少一種治療劑，任選地在一種可藥用的載體中進(jìn)行配制。90.實(shí)施方案89的方法，其中治療劑為CPT-11。91.實(shí)施方案90的方法，其中在給藥CPT-11之前給藥抗CEA抗體或其片段。92.實(shí)施方案91的方法，其中在給藥CPT-11之前3天左右給藥抗CEA抗體或其片 段。93.實(shí)施方案89的方法，其中治療劑為DTIC。
94.實(shí)施方案89的方法，其中治療劑為奧沙利鉬。95.實(shí)施方案89的方法，其中治療劑為氟尿嘧啶/左亞葉酸。96.在一種以非抗體治療劑治療癌癥的方法中，改進(jìn)包括用一種抗CEA抗體或其 片段在給藥非抗體治療劑之前預(yù)處理患癌癥的受試者。97.實(shí)施方案96的方法，其中抗CEA抗體是hMN_14。98.實(shí)施方案96的方法，其中治療劑為CPT-11。99. 一種用抗體治療癌癥的方法，包括在給藥抗體之前向患癌癥的受試者給藥一 種激活粒細(xì)胞和/或NK細(xì)胞從而增強(qiáng)抗體的效應(yīng)子功能的藥劑。100.實(shí)施方案99的方法，其中藥劑為GM-CSF。101.實(shí)施方案99的方法，其中抗體為抗CEA抗體。102.實(shí)施方案101的方法，其中抗體為hMN-14。103. 一種用抗CEA抗體或片段治療癌癥的方法，包括在給藥抗CEA抗體或片段之 前向患癌癥的受試者給藥在腫瘤細(xì)胞中能有效上調(diào)CEA表達(dá)的干擾素的量。104.實(shí)施方案103的方法，其中抗CEA抗體為hMN_14。105. 一種抗體融合蛋白，它包含至少一個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn)和至少另一個(gè)針對(duì)相同或 不同抗原的結(jié)合位點(diǎn)。106.根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，其中CEA結(jié)合位點(diǎn)與MN-14結(jié)合相同的 位點(diǎn)。107.根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，它是雙價(jià)的或三價(jià)的。108.根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，其中融合蛋白的一條臂是靶向⑶66e的 III類抗CEA mAb,并且融合蛋白的另一條臂來(lái)自另一個(gè)靶向⑶66a-d的CEA交叉反應(yīng)性抗 體。109.根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，其中結(jié)合臂是s cFv或Fab區(qū)。110. 一種根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，它是雙特異性的三價(jià)蛋白質(zhì)，包含 一條與⑶66a-d反應(yīng)的臂和兩條僅與CEA (⑶66e)反應(yīng)的臂。111. 一種根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，它是一種包含兩條結(jié)合NCA50/90的 臂的雙特異性蛋白質(zhì)。112. 一種根據(jù)實(shí)施方案105的抗體融合蛋白，它是一種包含一條結(jié)合NCA50/90的 臂和一條結(jié)合II類CEA表位的第二臂的雙抗體。113. 一種根據(jù)實(shí)施方案112的抗體融合蛋白，其中NCA50/90臂獲自hMN-3抗體而 結(jié)合III類CEA表位的第二臂獲自hMN-14。114. 一種根據(jù)實(shí)施方案113的抗體融合蛋白，其中融合蛋白缺乏阻止細(xì)胞因子從 粒細(xì)胞釋放的激活的Fc區(qū)，或者它具有一個(gè)已經(jīng)進(jìn)行過(guò)修飾以阻止補(bǔ)體固定和ADCC的Fc區(qū)。115. 一種根據(jù)實(shí)施方案114的抗體融合蛋白，它是一種包含一條hMN-3臂和兩 條hMN-14臂的三抗體。115a. —種根據(jù)實(shí)施方案104的抗體融合蛋白，它是一種包含一條 hMN-15臂和兩條hMN-14臂的三抗體。116. 一種根據(jù)實(shí)施方案104的抗體融合蛋白，包含至少一條hMN-14臂和至少一條 NP-3 臂。
117. 一種根據(jù)實(shí)施方案116的抗體融合蛋白，它包含一個(gè)Fc區(qū)以便能夠進(jìn)行補(bǔ)體 固定和ADCC的激活。118. 一種根據(jù)實(shí)施方案104的抗體融合蛋白，進(jìn)一步包含一種治療劑。119. 一種根據(jù)實(shí)施方案118的抗體融合蛋白，其中治療劑為細(xì)胞因子。120. 一種根據(jù)實(shí)施方案119的抗體融合蛋白，其中細(xì)胞因子為干擾素、集落刺激 因子或白介素。121. 一種根據(jù)實(shí)施方案120的抗體融合蛋白，其中集落刺激因子為GM-CSF或 G-CSF。通過(guò)下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，盡管不以任何方式對(duì)發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例1 材料和方法單克隆抗體和細(xì)胞系從美國(guó)典型培養(yǎng)物中心購(gòu)買了一種人甲狀腺髓樣細(xì)胞系TT。該細(xì)胞單層生長(zhǎng)于 DMEM(Life Technologies, Gaithersburg, MD)中，所述 DMEM 添加了 10%的胎牛血清、青霉 素(100U/ml)、鏈霉素(100pg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。在以胰蛋白酶、0. 2% EDTA分離 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代。MN-14是一種III類抗CEA MAb,與CEA反應(yīng)并且與正常的交叉反應(yīng)抗原NCA和胎 糞抗原不反應(yīng)(Hansen等，Cancer, 71 :3478 (1993))。這里用作陰性對(duì)照的MN-14和LL2， 抗⑶22MAb的人源化形式的構(gòu)建和特征描述之前曾進(jìn)行過(guò)介紹。(Sharkey等，CancerRes.， 55 :5935s (1995) ；Leung 等，Mol. Immunol. ,32 1416 (1995))。P3x63Ag8 (M0PC-21)是從美 國(guó)典型培養(yǎng)物中心(RockVille，MD)獲得的一種不相關(guān)的小鼠骨髓瘤IgGl。通過(guò)蛋白A層 析法純化抗體。體內(nèi)研究通過(guò)皮下注射2X108個(gè)洗滌的TT細(xì)胞在雌性nu/nu小鼠(Taconic Farms, Germantown,NY)中增殖腫瘤，所述腫瘤已在組織培養(yǎng)中進(jìn)行過(guò)增殖。將抗體經(jīng)由側(cè)尾靜脈 靜脈注射進(jìn)患腫瘤的動(dòng)物內(nèi)。注射的抗體量和給藥時(shí)間的細(xì)節(jié)在每個(gè)研究的結(jié)果部分指 出。結(jié)果作為個(gè)別動(dòng)物的腫瘤體積以及平均值士SE給出。通過(guò)每周利用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤的 長(zhǎng)度、寬度和深度來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤大小。將腫瘤體積計(jì)算為三種測(cè)量值的乘積。利用Student' s T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較以比較腫瘤的體積和生長(zhǎng)曲線下的面積。實(shí)施例2.在注射TT (人甲狀腺髓樣)腫瘤細(xì)胞后2天遞送裸hMN_14和DTIC的 組合治療在前面的研究中，在腫瘤移植2天之后，利用100 ii g和25 ii g劑量的DTIC (第2、3 和4天)和在第2天以及之后每周給予的250 u g劑量的hMN-14，與TT組合給藥裸hMN_14 和達(dá)卡巴嗪。100 ii g的DTIC劑量結(jié)合以hMN-14比兩種單獨(dú)的治療都更加有效(圖1A)。 但是，100 u gDTIC的劑量產(chǎn)生太強(qiáng)的反應(yīng)，而25 y g的劑量則無(wú)效。令人驚奇的是，單獨(dú)的 MN-14和單獨(dú)的DTIC的效果并不是加合性的。換句話說(shuō)，給定單獨(dú)用250 u g hMN-14和單 獨(dú)用100 u gDTIC治療的結(jié)果，并不會(huì)預(yù)測(cè)250 u g hMN-14和100 u gDTIC的組合會(huì)具有這 樣一種顯著的效果。見圖1A。在本研究中，如以往研究中的一樣，治療開始于TT細(xì)胞注射2天之后。在第2，3， 4,5,7,8,9,10，11，15和22天以100 u g/劑給藥hMN-14,隨后每7天給藥一次直到動(dòng)物死亡、腫瘤達(dá)到2. 0cm3或研究由于人道原因而終止。DTIC的劑量為50和75 u g/每劑，它介 于以往的研究中給予的劑量之間。在60只裸鼠中皮下注射TT細(xì)胞。注射日為星期一，第 0天。參見圖1B。結(jié)果顯示腫瘤生長(zhǎng)的顯著延遲是由單獨(dú)的MAb治療或單獨(dú)的化療引起的(圖1B)。 75 u g劑量的DTIC結(jié)合以這種hMN-14抗體的方案比兩種單獨(dú)的治療都顯著地更為有效 (p<0.02)。出乎意料的是，組合的DTIC和MAb治療不是加合性的。在第7周，與在只有 75 u gDTIC組中的1/10只小鼠和在未處理的和MAb組中的0/10只小鼠相比，在75 y g DTIC 和Mb組中的8/10只小鼠沒(méi)有明顯的腫瘤。在第7周平均腫瘤體積為0. 018 士0. 039cm3(75ii g DTIC力卩麗-14)、
0.284 + 0. 197cm3(75 u g DTI Conly)、0. 899 士 0. 545cm3 (僅有 hMN-14)禾口
1.578士0. 959cm3(未處理的)。裸抗CEA抗體和DTIC的組合治療增強(qiáng)了單獨(dú)用抗體或化 療的抗腫瘤效果，而無(wú)增長(zhǎng)的毒性。組合型治療的優(yōu)勢(shì)是令人吃驚的。服藥概沭(1)在第2天到11天，除了星期六，以lOOyg/劑/小鼠每天給藥 hMN-14。抗體治療與DTIC治療在同一天開始。在第2、3和4天以50和70iig/劑給藥 DTIC，所述劑量相應(yīng)于5%和7. 5%的MTD。只給一個(gè)療程的DTIC。組6組小鼠，每組包含10只小鼠。組1 未處理。組2.在第2、3和4天以50iig/劑給藥DTIC(星期三、星期四和星期五)。組3.在第2、3和4天以75 ii g/劑給藥DTIC.組4.在第 2、3 和 4 天 50iig/劑給藥 DTIC，加上第 2、3、4、5、7、8、9、10、11、15 和 22天的hMN-14 (100 P g/劑)，隨后每7天給藥一次直到動(dòng)物死亡，腫瘤達(dá)到2. 0cm3的體積， 或研究終止。組5.在第 2、3 和 4 天以 25 ii g/劑給藥 DTIC，加上第 2、3、4、5、7、8、9、10、11、15 和 22天的hMN-14 (100 P g/劑)，隨后每7天給藥一次直到動(dòng)物死亡，腫瘤達(dá)到2. 0cm3的體積， 或研究終止。組6.在第 2、3、4、5、7、8、9、10、11、15 和 22 天給藥 hMN-14 (確定 100 ii g/劑)，隨
后每7天給藥一次直到動(dòng)物死亡，腫瘤達(dá)到2. 0cm3的體積，或研究終止。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的存活。每周測(cè)量腫瘤和體重。方法在第二天，將2，200mg/小玻璃瓶的DTIC用19. 7ml滅菌水進(jìn)行重構(gòu)用于注 射。得到的溶液包含10mg/ml的達(dá)卡巴嗪，pH范圍為3. 0-4.0。根據(jù)需要利用該溶液進(jìn)行 下面所述的稀釋并且將剩余物以1ml的小份進(jìn)行冷凍作隨后的使用。組2和4 制備5ml 0. 5mg/ml的溶液。靜脈注射100 yl的0. 5mg/ml/小鼠溶液。組3和5 制備5ml 0. 75mg/ml的溶液。靜脈注射100 yl的0. 75mg/ml/小鼠溶 液。估計(jì)hMN-14的量。將100 u 1的lmg/ml hMN-14腹膜內(nèi)注射于組4、5和6中的小鼠中。實(shí)施例3.在人MTC異種移植模型中的放射性免疫療法研究 申請(qǐng)人:發(fā)展了 一種利用生產(chǎn)CEA和降鈣素的命名為TT的人MTC細(xì)胞系的人MTC異 體移植體，使用放射性標(biāo)記的抗CEA MAbs進(jìn)行MTC的實(shí)驗(yàn)放射性免疫療法的模型([Stein，1999&num ；82]，見附錄)。通過(guò)皮下接種2X 108個(gè)細(xì)胞在裸鼠中建立MTC腫瘤并且讓它在 注射MAb s之前生長(zhǎng)2-5周。隨后以MN-14進(jìn)行生物分布和RAIT研究，其為流式細(xì)胞計(jì) 數(shù)法顯示與TT細(xì)胞反應(yīng)。在這些研究中都利用Ag 8和Mu-9作為陰性對(duì)照MAbs。利用 0. 08g的較小腫瘤的初步研究顯示注射131I-MN-147天之后，與只有12. 6% ID/g的共注射 125I_Ag 8對(duì)照相比，注射劑量/克腫瘤的百分比(％ ID/g)是68.9%。使用更大的腫瘤(在 裸鼠中生長(zhǎng)五個(gè)星期；平均腫瘤重量=0. 404g)，在注射125I-MN-147天之后觀察到的腫瘤 的 10/^%是 12. 4%。但是，共注射的 88Y-MN-14 的 10/^%是50. 5%，或比 125I_MN_14 高 4. 1 倍。用88Y-MN-14的腫瘤與血液、肺、肝、脾和腎的比率也比用125I-MN-14的更高，而用這兩 種藥劑的腫瘤與骨的比率相等。當(dāng)利用125I-MN-14和88Y-MN-14生物分布數(shù)據(jù)來(lái)分別預(yù)測(cè) 用131I-MN-14和9°Y-MN-14的腫瘤放射劑量時(shí)，在9°Y-MN-14的MTD上遞送的放射吸收劑量 (150 u Ci)是在131I-MN-14的MTD上遞送的放射吸收劑量(275 u Ci)的1. 75倍高(4900cGy 對(duì) 2800cGy)。在該模型中的治療研究確定9°Y-MN_14是比131I-MN_14更好的治療劑。在5周大的 腫瘤中，與用131I-MN-14僅有腫瘤生長(zhǎng)延遲相比在9°Y-MN-14的MTD上見到了 5周的腫瘤生 長(zhǎng)完全抑制(圖2)。而且，當(dāng)治療較小的2周大的腫瘤時(shí)，在9°Y-MN-14的MTD上見到了平 均60%的腫瘤體積減小，伴隨著一些完全的腫瘤消退。與在未治療動(dòng)物或那些以對(duì)照MAbs 治療的MTD中的相對(duì)快速的腫瘤生長(zhǎng)相比，這些抗腫瘤效應(yīng)是非常顯著的。因而，我們的臨 床前研究顯示這種動(dòng)物模式是非常適于以抗CEA MAbs進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性RAIT的。與1311相比9°Y較長(zhǎng)的路徑長(zhǎng)度和較高能量，加上9°Y被靶細(xì)胞保持較長(zhǎng)時(shí)間的事 實(shí)導(dǎo)致了遞送給腫瘤提高的放射劑量并且因而導(dǎo)致了在等毒性下更加有效的療效。如果我 們的用殘余131I(refs)的結(jié)果可以推廣到MTC中的MN-14，那么我們可以預(yù)期殘余1311在 這里研究的大小的腫瘤中與9°Y至少同樣有效，并且很可能在處置微轉(zhuǎn)移疾病中或作為手 術(shù)后的輔助治療具有優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例4 化療對(duì)四種藥物，阿霉素、DTIC (達(dá)卡巴嗪)、環(huán)磷酰胺和長(zhǎng)春新堿，單獨(dú)地或組合地評(píng) 估它們?cè)诼闶笾蠺T MTC異種移植體生長(zhǎng)的效應(yīng)?；诿糠N藥物在臨床上以mg/m2為基礎(chǔ) 對(duì)人給藥的劑量來(lái)選擇劑量。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的存活，每周測(cè)量腫瘤的體積和體重。圖3顯示本 研究中動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)曲線。通過(guò)個(gè)別地給藥，阿霉素、DTIC和環(huán)磷酰胺產(chǎn)生了顯著的生 長(zhǎng)抑制，但長(zhǎng)春新堿沒(méi)有產(chǎn)生顯著的生長(zhǎng)抑制，盡管由DTIC引起的生長(zhǎng)延遲比其它藥物的 顯著更長(zhǎng)。對(duì)于每組加倍的大致平均時(shí)間為未處理的，1周；阿霉素，2. 5周；DTIC，7. 5周； 環(huán)磷酰胺，3周；和長(zhǎng)春新堿，1. 5周。阿霉素和DTIC的組合與單獨(dú)的兩種藥物相比提高了 效力，將加倍的平均時(shí)間增至10周。但是，與單獨(dú)的DTIC相比，阿霉素和DTIC組合的提高 的效力沒(méi)有達(dá)到95%的可信度。AUC比較的P值如下阿霉素+DTIC對(duì)阿霉素，P < 0. 01， 而阿霉素+DTIC對(duì)DTIC，P < 0. 1。4種藥物的療法將加倍的平均時(shí)間延長(zhǎng)至12周；對(duì)于阿 霉素和DTIC 二者的比較P < 0.01。個(gè)別藥物對(duì)未處理組的存活數(shù)據(jù)的時(shí)序分析僅對(duì)DTIC和環(huán)磷酰胺顯示了顯著的 差異。分別與DTIC和環(huán)磷酰胺治療組的11周和8周相比，未處理對(duì)照組的平均存活時(shí)間 為4周，并且藥物組合大于12周。如通過(guò)體重?fù)p失所測(cè)量的毒性對(duì)于所有研究組都在可接受的范圍之內(nèi)。在以所有4種藥物處理的小鼠中的治療1周之后，觀察最大重量損失，體重 損失在3-12%范圍之間。實(shí)施例5.結(jié)合放射免疫治療和化療進(jìn)行MTC的治療RAIT加4種藥物組合.通過(guò)將在未處理小鼠中的TT生長(zhǎng)與上述使用4種藥物 (阿霉素、DTIC、環(huán)磷酰胺和長(zhǎng)春新堿)療法治療的小鼠相比較，來(lái)評(píng)估把用9°Y抗CEA Mb MN-14進(jìn)行的RAIT和4種藥物組合結(jié)合起來(lái)的效果，RAIT的100%最大耐受劑量(MTD) (105 uCi)、RAIT的50% MTD,以及RAIT的50% MTD結(jié)合以4種藥物處理的那些。圖4顯 示在給予各種治療方案的小鼠中TT腫瘤的生長(zhǎng)曲線。與未治療的動(dòng)物相比，所有四個(gè)治 療組都在效力上產(chǎn)生了顯著的提高。鑒于未治療動(dòng)物中大致的平均加倍時(shí)間為1. 5周，以 4種藥物進(jìn)行的化療將平均加倍時(shí)間延長(zhǎng)至10周而單獨(dú)的RAIT分別于50%和100% MTD 時(shí)得出了 4周和8周的加倍時(shí)間。如所預(yù)期的，100% RAIT組和4種藥物治療方案組二者 都比50% RAIT組顯著地更好。最重要的是，與兩種療法相比，將50% RAIT和4種藥物方 案組合起來(lái)改善了結(jié)果，進(jìn)一步將平均加倍時(shí)間延長(zhǎng)至12. 5周。對(duì)于組合治療與4種藥物 方案的比較來(lái)說(shuō)，P < 0. 02，對(duì)于與100% RAIT的比較來(lái)說(shuō)，P < 0. 01。治療后1周的平均重量損失(nadir)對(duì)于100% RAIT和4種藥物方案來(lái)說(shuō)是9%， 但是對(duì)于組合的50% RAIT加上4種藥物方案來(lái)說(shuō)是15%。此外，在組合療法組，一只動(dòng)物 死于治療3周之后而第二只動(dòng)物有大于20%的重量損失。因而，該治療超出了哺乳類耐受 劑量。RAIT加2種藥物方案的化療還在這種MTC異種移植體模型中，評(píng)估把用9°Y抗CEA MAb MN-14進(jìn)行的RAIT和 2種藥物組合結(jié)合起來(lái)的效果，所述2種藥物組合由阿霉素和DTIC組成。各組的大致加倍 時(shí)間為未處理的，1.5周；阿霉素加DTIC，8周；RAIT的MTD，10周；結(jié)合以25-75%的2種 藥物方案的RAIT的MTD，大于12周。因而，單獨(dú)的RAIT比2種藥物方案更加有效，并且最 為顯著地，將RAIT和2種藥物方案結(jié)合起來(lái)與任一種單獨(dú)的療法相比產(chǎn)生了改善的結(jié)果。 對(duì)于結(jié)合治療與2種藥物方案的比較來(lái)說(shuō)，P < 0. 005，對(duì)于與單獨(dú)的RAIT的比較來(lái)說(shuō)，P < 0. 02。對(duì)于各組來(lái)說(shuō)治療后(nadir) 1-2周的平均重量損失為2_8%，除了 100% RAIT加 75%的2種藥物化療組在第2周時(shí)觀察到13%的重量損失以外。此外，在該組合治療組， 兩只動(dòng)物死于治療后3-4周并且一只經(jīng)歷了大于20%的重量損失。因而，向100% RAIT的 治療中加入75%劑量水平的阿霉素和DTIC超出了 MTD，而該2種藥物組合的50%與100% RAIT組合則可以被耐受。RAIT加阿霉素由于以往的出版物已經(jīng)報(bào)道過(guò)在該模型中RAIT與阿霉素的結(jié)合(Stein等，Clin CancerRes.，5 :3199s (1999) ；Behr 等，Cancer Res. 57 :5309 (1997))，可以對(duì)RAIT加阿霉素 方案作直接的比較。還對(duì)RAIT加4種藥物方案作直接的比較。與未處理的動(dòng)物相比，所有 的治療都產(chǎn)生了顯著的效力。RAIT加阿霉素的平均加倍時(shí)間為12周。在本研究中，將RAIT 的全MTD與50%的阿霉素和DTIC或4種藥物方案結(jié)合起來(lái)將平均加倍時(shí)間延長(zhǎng)至15周， 在這兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。在這些研究中觀察了對(duì)象反應(yīng)的基本數(shù)目。在 以RAIT加阿霉素治療后有3次完全反應(yīng)，2次部分反應(yīng)，并且在全部10只小鼠中，5只動(dòng)物病情穩(wěn)定至少4周。RAIT加2種藥物方案將對(duì)象反應(yīng)增至12只動(dòng)物的10次完全反應(yīng)和2 次部分反應(yīng)，而RAIT加4種藥物治療方案導(dǎo)致9只小鼠的7次完全反應(yīng)和2次部分反應(yīng)。RAIT 加 DTIC由于DTIC是在單獨(dú)給藥時(shí)最有效的化療劑，所以通過(guò)與RAIT加阿霉素和DTIC的 效力來(lái)評(píng)估RAIT加DTIC的效力。將阿霉素從治療方案中刪去對(duì)于臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)將是重 要的，以便避免該藥的額外毒性，特別是已知的心臟毒性。如圖5中所示的，兩個(gè)接受化療 結(jié)合RAIT的研究組，阿霉素和DTIC或只有DTIC，彼此大致上等同，二者都比單獨(dú)形式的治 療更有效。AUC比較的P值如下對(duì)于RAIT+DTIC對(duì)DTIC來(lái)說(shuō)P < 0. 01，對(duì)于RAIT+DTIC 對(duì)RAIT來(lái)說(shuō)P < 0. 05。分別與單獨(dú)的DTIC和RAIT 7. 5周和9周相比，RAIT加DTIC以及 RAIT加阿霉素和DTIC組的平均加倍時(shí)間分別為15. 5周和14周。因而，RAIT加DTIC的結(jié) 合形式的治療將平均加倍時(shí)間在DTIC化療之上延長(zhǎng)了 100%。通過(guò)AUC或時(shí)序分析在RAIT 加DTIC以及RAIT加阿霉素和DTIC組之間沒(méi)有觀察到顯著的差異。實(shí)施例6 用裸抗CEA單獨(dú)進(jìn)行的研究用裸hMN-I 4進(jìn)行的治療為了研究未標(biāo)記的hMN-I 4對(duì)于在裸鼠中TT腫瘤生長(zhǎng)的影響，在腫瘤細(xì)胞注射的 一天或十一天之后，通過(guò)靜脈內(nèi)給藥hMN-I 4的單一注射。圖6顯示與未處理的對(duì)照相比， 用0. 5mg hMN-14/小鼠處理的動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)曲線。未處理組包含16只動(dòng)物；兩個(gè)處理組 每組包含10只動(dòng)物。在未處理組和腫瘤注射1天后的處理組之間觀察到顯著的生長(zhǎng)延遲。 從第32天到93天觀察到平均腫瘤大小的顯著性差異(p < 0. 05)。與未處理動(dòng)物相比，在 MN-14處理組中于第32天和60天之間有腫瘤大小的64-70%的抑制。在第11天組和未 處理組的平均腫瘤大小之間沒(méi)有顯著的差異。通過(guò)在生長(zhǎng)曲線下的t檢驗(yàn)分析還見到腫瘤 生長(zhǎng)的顯著延遲。對(duì)于與腫瘤注射后1天處理的組相比較的未處理組來(lái)說(shuō)，P < 0. 05，但是 對(duì)于腫瘤注射后11天處理的組來(lái)說(shuō)并非如此。治療的特異性圖7總結(jié)了對(duì)于抗腫瘤反應(yīng)的特異性研究的結(jié)果。將裸鼠中未標(biāo)記的hMN-14對(duì)于 TT腫瘤生長(zhǎng)的效果與陰性對(duì)照人源化MAb、hLL2(抗⑶22)和鼠MN-14的效果相比較。在 TT細(xì)胞之后的一天給藥(靜脈內(nèi)地)MAbs (0. 5mg/小鼠)，隨后給予三次每周一次的0. 5mg/ 小鼠的劑量。研究15只動(dòng)物的組。在第一個(gè)研究中觀察到的緣于以0. 5mghMN-14治療的 生長(zhǎng)抑制在本研究中得到確認(rèn)。從第23天開始，觀察到在hMN-14和未處理組之間平均腫 瘤大小的顯著性差異(P < 0. 05)。在第37天用hMN-14處理的組中的平均腫瘤體積是未處 理的對(duì)照動(dòng)物的42. 7%。以鼠MN-14進(jìn)行的處理產(chǎn)生與hMN-14相似的結(jié)果。以hLL2進(jìn)行 的處理沒(méi)有放慢腫瘤生長(zhǎng)；相反在生長(zhǎng)速率上有小的(不顯著的)增長(zhǎng)。例如，與未處理的 40%和hLL2處理組的29%相比，在第37天87%的用hMN-14處理的腫瘤小于0. 5cm3。對(duì) 在生長(zhǎng)曲線以下面積的T檢驗(yàn)分析顯示在未處理組和用hMN-14或鼠MN-14處理組之間的 顯著性差異(P < 0. 05)，但是與hLL2處理的組卻沒(méi)有顯著性差異。此外，hMN-14組顯著不 同于hLL2組，但是與鼠MN-14處理的動(dòng)物卻沒(méi)有顯著的不同。劑量的效果為了研究未標(biāo)記的hMN-14的劑量對(duì)于裸鼠中TT腫瘤生長(zhǎng)的影響，對(duì)逐漸增加的 hMN-14劑量進(jìn)行了評(píng)估。在TT細(xì)胞1天后給予多個(gè)抗體劑量，隨后每周一次直到研究終止。在六只小鼠的組中每周的劑量在0. 125mg到2.0mg hMN_14/小鼠的范圍內(nèi)。在未處理 組和所有處理組之間觀察到平均腫瘤大小和生長(zhǎng)曲線以下面積的顯著性差異(圖8)。例 如，在第21天和第49天之間兩個(gè)最低hMN-14處理組中的平均腫瘤體積是未處理動(dòng)物中腫 瘤大小的27-40%。用較低劑量0. 125mg和0. 25mg進(jìn)行的處理好像比用較高劑量進(jìn)行的處 理更有效，盡管差異沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。時(shí)間測(cè)定通過(guò)變化MAb的給藥日期來(lái)評(píng)估介于TT注射和hMN_14的起始劑量之間的時(shí)間對(duì) 于裸鼠中TT腫瘤生長(zhǎng)的影響。在TT細(xì)胞之后于第1、3或7天給藥hMN-14(0. 25mg)，隨后 每周一次直到研究結(jié)束。研究7-8只動(dòng)物的組。結(jié)果總結(jié)于圖9中。在未處理組和所有三 個(gè)處理組之間觀察到平均腫瘤大小的顯著性差異(p<0.05)。但是，在未處理的小鼠和第 7天處理組之間平均腫瘤大小的差異僅僅在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，第28天是顯著的。第1天處理的 小鼠在第21-77天產(chǎn)生顯著的差異，而第3天處理的小鼠在第21-70天產(chǎn)生顯著的差異。對(duì) 生長(zhǎng)曲線以下的面積的T檢驗(yàn)分析顯示，對(duì)于在TT細(xì)胞給藥1天或3天之后用hMN-14處 理的組的顯著的生長(zhǎng)抑制，所述抑制是與未處理組相比的。該分析對(duì)于在未處理組和在第 7天處理的組之間的差異沒(méi)有達(dá)到95%的可信度限度(在第五周p = 0. 057)。實(shí)施例7 組合的裸抗CEA加DTIC對(duì)MTC的治療為了研究裸hMN-14是否能夠增強(qiáng)DTIC的效力，給予生有TT細(xì)胞的裸小鼠以 DTIC(75 y g/劑)，結(jié)合以一段未標(biāo)記的Mb的療程。在皮下注射TT細(xì)胞的開始2天，連續(xù) 3天以75 ii g/劑給藥DTIC作為一個(gè)療程。hMN-14MAb治療與第一劑DTIC開始于同一天，在 首先的兩周以100 y g/劑/天持續(xù)5天，隨后每周兩次。這些MAb療法或單獨(dú)的化療引起腫 瘤生長(zhǎng)的顯著延遲(圖10)。75 yg劑量的DTIC結(jié)合以本方案的hMN-14比兩種單獨(dú)的治 療顯著地更加有效(P < 0. 02)。7周后，與在僅有75 u gDTIC組中的1/10只和在未處理組 和只有MAb組中的0/10只相比，在75 u g DTIC+MAb組中的8/10只小鼠沒(méi)有明顯的腫瘤。 第 7 周時(shí)的平均腫瘤體積為 0. 018+0. 039cm3 (75 u g DTIC+hMN-14)、0. 284+0. 197cm3 (75 u g DTIC)、0. 899+0. 545cm3 (hMN-14) and I. 578+0. 959cm3 (未處理的)?？笴EA MAb MN_14已顯示了出乎意料的在MTC中的抗腫瘤效力，而不必偶聯(lián)到一 種細(xì)胞毒性劑上。在3周開始并且至少持續(xù)2個(gè)月，在hMN-14處理的和未處理的組之間觀 察到平均腫瘤大小的差異。用同型匹配的陰性對(duì)照MAbs進(jìn)行的處理并不放慢腫瘤的生長(zhǎng)。 這是用“裸”抗CEA MAb抑制腫瘤的第一個(gè)證據(jù)。但是，裸抗CEA MAb與DTIC的組合治療 增強(qiáng)了單獨(dú)的抗體或化療的抗腫瘤效果。組合形式治療的優(yōu)勢(shì)支持將CEA-MAb療法并入 化療方案中以進(jìn)行MTC控制。實(shí)施例8圖15顯示裸hMN-14CEA Mab和DTIC治療在甲狀腺髓樣癌模型中的效果。治療起 始于腫瘤移植2天之后。在第2、3和4天以MTD的7.5%向小鼠給藥75118的011(。在第 2-5、7-10、11、15、22天以100 iig/天給藥hMN-14，隨后每周一次。結(jié)果顯示在所有組曲線 之下的面積之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(P < 0. 05)。裸hMN-14CEA Mab治療顯示對(duì)于抑制 腫瘤生長(zhǎng)的顯著效果。相對(duì)于兩種單獨(dú)的治療，當(dāng)結(jié)合以DTIC時(shí)出現(xiàn)了令人驚奇地提高的 腫瘤生長(zhǎng)抑制水平。實(shí)施例9 在結(jié)腸癌細(xì)胞中裸抗CEA抗體治療加CPT-11或5_FU
本實(shí)驗(yàn)公開了單獨(dú)的以及結(jié)合以化療的人源化的、裸抗CEAhMN-14抗體(hMN_14) 對(duì)于結(jié)腸癌生長(zhǎng)的體外和體內(nèi)效果。方法和材料抗體生產(chǎn)通過(guò)蛋白A和離子交換層析(Q-Sepharose ；Pharmacia, Piscataway, NJ)來(lái)純化CDR移植的(人源化的)MN-14(hMN-14)抗癌胚抗原(CEA) (Sharkey, R. M.等， Cancer Res，55 :5935_5945，1995)連同鼠 MN-14 和其它靶向不同 CEA 表位(NP1，NP3，MN3， MN15 ； (Sharkey, R. M.，等，Cancer Res, 50 =2823-2831,1990))的抗體。通過(guò)免疫電泳、利用 還原和非還原條件的聚丙烯酰胺凝膠電泳以及大小排阻高壓液相色譜來(lái)檢測(cè)純度。體內(nèi)療法研究利用一種CEA陽(yáng)性的GW-39肺內(nèi)微轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行存活療法研究 (Sharkey, R. M.，等，JNatl Cancerlnst. ,83 :627_632，1991 ；Blumenthal, R. D.，等，Cancer Res, 52 :6036-6044，1992)。使用商業(yè)購(gòu)買的皮下GW-39人結(jié)腸直腸腫瘤制備10%或5% 的細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞(30 yl)靜脈內(nèi)注射至尾靜脈中。在細(xì)胞移植的0或3天之后開 始給藥HuMN-14 IgG，并且每天給藥，持續(xù)14天，隨后在研究期間以100 u g/劑每周給藥兩 次。在細(xì)胞移植的0或3天之后開始以160iig的劑量每天腹膜內(nèi)注射給藥CPT-11，持續(xù)5 天(MTD的20% )。對(duì)于一些研究來(lái)說(shuō)，商業(yè)購(gòu)買的GW-39腫瘤來(lái)自每天兩次接受100，000U 的IFNy，持續(xù)4天以上調(diào)CEA的表達(dá)的小鼠(Greiner，J. ff.等，16 :2129_2133，1996)，它 通過(guò)以往所述的免疫組織學(xué)進(jìn)行確認(rèn)(Blumenthal, R. D.等，Int. J Cancer, 51 =935-941, 1992)。每周監(jiān)測(cè)體重并記錄動(dòng)物的存活。以Kaplan-Meir檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并且測(cè)定 中位存活時(shí)間?？贵w誘導(dǎo)的癌細(xì)胞的化學(xué)致敏作用的體內(nèi)效應(yīng)hMN14_誘導(dǎo)的化學(xué)致敏作用的效應(yīng)在體內(nèi)和體外是顯而易見的。如上所述的患有 GW-39肺內(nèi)微轉(zhuǎn)移的，以及未處理的或單獨(dú)以hMN-14(100 y g/天X 14天，并且在研究期間 每周兩次)、單獨(dú)以CPT-11的10% MTD(80ug/天X5天)或二種形式一起進(jìn)行處理的小 鼠的存活曲線。治療開始于細(xì)胞移植的當(dāng)天(30iU的10%GW-39細(xì)胞懸浮液)。每個(gè)處 理組以10只小鼠開始并且重復(fù)研究?jī)纱?。結(jié)果顯示向患有GW-39肺微轉(zhuǎn)移的裸鼠共給藥 hMN-14和CPT-11提高了存活，超出兩種單獨(dú)形式的效果。給藥CPT-11的10%MTD導(dǎo)致了 中位存活由56天到63天的1周的增長(zhǎng)(p < 0. 05)。在0天給藥hMN-14和CPT-11的動(dòng)物 的存活期另外增長(zhǎng)了 2周，到了 77天(與未處理小鼠相比p< 0.005)。由于最大抗體增長(zhǎng) 出現(xiàn)于注射后3天，在CPT-11之前三天開始hMN-14治療，以測(cè)定這種給藥方式是否會(huì)通過(guò) 高抗體攝取以及體內(nèi)化學(xué)致敏而進(jìn)一步提高組合形式方法的療效。與具有70天中位存活 的在第3天以CPT-11單獨(dú)進(jìn)行處理相比，結(jié)果顯示以hMN-14進(jìn)行的3天預(yù)處理將中位存 活增至105天(p < 0. 001)，在所述預(yù)處理之后進(jìn)行CPT-11處理。在本研究中，hMN-14和 CPT-11的共處理是有優(yōu)勢(shì)的，正如70天的中位存活對(duì)具有63天中位存活的在0天單獨(dú)以 CPT-11進(jìn)行處理，或具有35天中位存活的未處理小鼠所證明的。這些結(jié)果對(duì)于一種進(jìn)一步 的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)是相似的，所述實(shí)驗(yàn)使用5%的GW-39細(xì)胞懸浮液而非10%的GW-39細(xì)胞懸浮 液。實(shí)施例10 在以hMN-14和CPT-11處理之前用一種免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行預(yù)處理對(duì)于腫 瘤細(xì)胞化學(xué)靈敏度的體內(nèi)作用一個(gè)另外的實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 hMN-14和CPT-11的組合治療作為用Y干擾素(IFN y )預(yù)處理GW-39商業(yè)購(gòu)買的腫瘤(10%GW-39細(xì)胞懸浮液)的結(jié)果，所述組合治療是在具有表達(dá) 較高CEA水平的GW-39腫瘤的小鼠中一起開始的。如下進(jìn)行涉及、干擾素提高裸CEA抗 體(hMN-14)的抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)。 首先，將GW-39人結(jié)腸癌皮下生長(zhǎng)于小鼠中，所述小鼠每天兩次接受100，000單位 的IFNy持續(xù)4天。具有GW-39腫瘤的對(duì)照鼠不給予IFN。對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠靜脈內(nèi)注射來(lái)自兩種 鼠(即，有或無(wú)IFN處理的)任一種的5%的GW-39懸浮液(w/v)，注射入每組8只的兩組 中。每組的4只接受來(lái)自IFN處理的小鼠的腫瘤，4只接受來(lái)自未處理小鼠的腫瘤。一組 8只小鼠隨后接受hMN-14 (100 y g/天X 14天，并且之后每周兩次直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束)，另一組 160iig/天X5天接受CPT-11( = 20%的MTD)，第三組接受相同劑量的抗體+藥物組合， 而第四組完全不進(jìn)行處理。每周測(cè)量動(dòng)物重量以及存活率。對(duì)后來(lái)進(jìn)行移植的在小鼠中以 IFN處理的商業(yè)腫瘤樣品也進(jìn)行免疫組織學(xué)處理以測(cè)試腫瘤中CEA表達(dá)的增長(zhǎng)，所述腫瘤 來(lái)自用IFN- y處理的小鼠，并且這還通過(guò)以不相關(guān)的IgG，如不顯示CEA染色的Ag8進(jìn)行的 免疫組織學(xué)處理懸浮液來(lái)進(jìn)行控制。實(shí)施例11對(duì)在動(dòng)物模型中裸hMN_14CEA Mab對(duì)于低或高(如前所述，IFN- y誘導(dǎo)的)的表 達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行比較。結(jié)果顯示在腫瘤細(xì)胞上增強(qiáng)的CEA抗原表達(dá)與抗CEA 抗體的提高的效力相關(guān)聯(lián)。比較研究的結(jié)果顯示于圖21中。因而，IFN-y預(yù)處理對(duì)于提 高抗CEA抗體療法在癌癥治療中的效力是有用的。實(shí)施例12-用CEA抗體和GM-CSF進(jìn)行的西格瑪狀結(jié)腸癌療法JR是一位62歲的男子，他接受用5-氟尿嘧啶和左亞葉酸進(jìn)行的化療以減少向肝 的轉(zhuǎn)移，所述轉(zhuǎn)移被發(fā)現(xiàn)于他的西格瑪狀結(jié)腸癌發(fā)覺與摘除之時(shí)。當(dāng)時(shí)他的癌胚抗原(CEA) 血漿效價(jià)為34ng/mL，而計(jì)算的肝的斷層攝影顯示在右葉有幾處小的病變，測(cè)量直徑介于2 和4cm之間；其它的放射研究好像是正常的。每周一次持續(xù)4周開始了用人源化抗CEAIgG、 hMN-14單克隆抗體進(jìn)行的免疫治療，以300mg/m2的靜脈內(nèi)劑量輸液超過(guò)2小時(shí)。在hMN-14 治療之前一周，該病人接受了 2次，200mcg/m2GM-CSF(sargamostim，Leukine :)的皮下注 射，在3天以后，在4周hMN-14的治療期間每周兩次持續(xù)給藥。在這四周之后，每隔兩星期 以相同劑量給藥hMN-14和GM-CSF 二者持續(xù)另外3個(gè)月，但是將GC-CSF的劑量增至250mcg/ m2。在每次給藥人源化的CEA抗體之前，給予病人口服50mg苯海拉明(Benadryl )，口服 500mg撲熱息痛(Tylenol )。在此時(shí)，用肝轉(zhuǎn)移以及多種身體其余部分的放射性掃描構(gòu) 成的CT測(cè)量為病人進(jìn)行復(fù)查。還取血進(jìn)行化驗(yàn)并且測(cè)定他的血液CEA效價(jià)。沒(méi)有記錄肝 以外的疾病區(qū)，但是在肝中可測(cè)量的腫瘤直徑之和降低了 40%，并且病人的血液CEA效價(jià) 降至18ng/mL，因而顯示了治療的反應(yīng)。用hMN-14和GM-CSF進(jìn)行的免疫治療，對(duì)于hMN-14 來(lái)說(shuō)以200mg/m2而對(duì)于GM-CSF來(lái)說(shuō)以250mg/m2每?jī)芍芤淮芜M(jìn)行給藥，再給藥2個(gè)月，復(fù)查 顯示肝腫瘤直徑之和的進(jìn)一步降低和CEA效價(jià)降至lOng/mL。由于腫瘤降低測(cè)量為大于在 治療前基線上的65%，認(rèn)為治療已經(jīng)提供了部分反應(yīng)。此后，以較小的頻率給藥，在隨后的 六個(gè)月每月一次，所有的研究都顯示疾病沒(méi)有發(fā)生變化。病人隨后被跟蹤10個(gè)月，保持部 分緩解，沒(méi)有對(duì)治療的副反應(yīng)，并且一般沒(méi)有任何疾病的癥狀。實(shí)施例13-對(duì)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的組合免疫療法和化療ST是一位52歲的婦女，她在切除了原發(fā)腫瘤之后呈現(xiàn)結(jié)腸癌的肝和肺的轉(zhuǎn)移。對(duì)她實(shí)施在 Gramont 方案(A. de Gramont 等，J ClinOncol. 2000 ；18 :2938_1947)基礎(chǔ)上的組 合化療和免疫治療方案，但是增加了人源化的抗CEA單克隆抗體IgGl。在抗體輸注之前， 她口服接受了 50mg的苯海拉明(Benadryl)和500mg的撲熱息痛(Tylenol )。她接受 了 2小時(shí)的左亞葉酸輸注(200mg/m2/天)，隨后是5-氟尿嘧啶丸劑以及22小時(shí)的5-氟 尿嘧啶(600mg/m2/天)持續(xù)輸注，每2周連續(xù)2天，上述輸注是與以85mg/m22小時(shí)輸注與 250mL 5%葡萄糖中的奧沙利鉬一起進(jìn)行的，同時(shí)在第1天(F0LF0X4方案)輸注左亞葉酸。 病人還接受了用5-羥基色胺-3-受體拮抗劑進(jìn)行的抗催吐劑預(yù)防。在這種2周的化療周 期之前一周，以200mg/m2的劑量輸注hMN_14單克隆抗CEA抗體2小時(shí)以上，重復(fù)2周化療 周期的每一周，下個(gè)月其后的每周進(jìn)行另一個(gè)化療周期。從第二個(gè)化療周期開始，每周一次 皮下給藥5mcg/kg/天的G-CSF (非格司亭，Neupogen&commat )，在用hMN-14抗體進(jìn)行 免疫治療期間，于接下來(lái)的3個(gè)月繼續(xù)此劑量。用持續(xù)給藥hMN-14和非格司亭進(jìn)行總共5 個(gè)周期的化療。其后，以相同劑量給予hMN-14和非格司亭治療，接下來(lái)的3個(gè)月每?jī)芍芤?次，沒(méi)有化療。2個(gè)月后，對(duì)病人進(jìn)行檢查，與治療之前所作的測(cè)量相比，她的肝和肺轉(zhuǎn)移顯 示> 80%的縮小，這是通過(guò)計(jì)算的斷層攝影在肝和肺中測(cè)量而得出的結(jié)論。她的血液CEA 效價(jià)也從治療前的63ng/mL降至9ng/mL。在隨后的6個(gè)月對(duì)其進(jìn)行跟蹤，她的病情看來(lái)穩(wěn) 定了，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的病灶而且殘留于肝和肺中的疾病也沒(méi)有增強(qiáng)。病人的主要毒性是周圍 感覺神經(jīng)障礙，它由咽喉感覺遲鈍組成。病人在化療周期中還經(jīng)歷了腹瀉、粘膜炎、惡心和 嘔吐，但是這些并不過(guò)度。當(dāng)僅僅施用免疫治療時(shí)她沒(méi)有經(jīng)歷任何副作用，并且能夠恢復(fù)全 日活動(dòng)而沒(méi)有任何顯著的限制。實(shí)施例14圖16顯示踝hMN-14CEA Mab和CPT-11治療在早期人結(jié)腸癌模型中的效果。從 腫瘤移植后0天開始，在14天中以100 y g/天的劑量給予小鼠hMN-14并且隨后2次/周。 在5天中以60iig/天給予CPT-11。在這些條件下hMN-14自身的作用不是顯而易見的，只 觀察到CPT-11的適度作用(p < 0. 05)。但是，如通過(guò)比較CPT-1163天的中位存活與組合 治療77天的中位存活所見到的，hMN-14增強(qiáng)了 CPT-11的作用(p < 0. 005)。用hMN_14CEA Mab和CPT-11進(jìn)行的組合治療顯著地延長(zhǎng)了具有早期人結(jié)腸腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物的存活。實(shí)施例15圖17顯示f凍hMN-14CEA Mab和CPT-11治療在低腫瘤壓力的人結(jié)腸癌模型中 的效果。在一種利用5%腫瘤細(xì)胞懸浮液的減弱的腫瘤負(fù)擔(dān)模型中，比較單獨(dú)的CPT-11、 hMN-14和hMN-14+CPT-ll的組合治療。劑量如實(shí)施例14所示。在這些條件下單獨(dú)的hMN-14 沒(méi)有明顯的效果。單獨(dú)的CPT-11導(dǎo)致70天的中位存活。與之相比，組合治療產(chǎn)生了 91天 的中位存活(P < 0. 025)。hMN-14和CPT-11的組合顯著地延長(zhǎng)了在人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型中 具有低腫瘤負(fù)擔(dān)動(dòng)物的存活。實(shí)施例16圖18顯示在人結(jié)腸癌模型中在CPT-11治療之前三天給予的用裸hMN_14CEA Mab 預(yù)治療的效果。在一種利用5%腫瘤細(xì)胞懸浮液的減弱的腫瘤負(fù)擔(dān)模型中，比較單獨(dú)的 CPT-11、hMN-14和hMN-14+CPT-ll的組合治療，在所述的組合治療中hMN-14在CPT-11之 前3天進(jìn)行給藥。劑量如實(shí)施例14所示。在這些條件下單獨(dú)的hMN-14將中位存活時(shí)間增 長(zhǎng)21% (p<0.05)。單獨(dú)的CPT-11將存活率增長(zhǎng)76% (p< 0.001)。與之相比，組合治療在單獨(dú)的CTP-11之上產(chǎn)生了另外58%的中位存活時(shí)間增長(zhǎng)(與單獨(dú)的CPT-11相比，p < 0. 001)，在所述的組合治療中hMN-14在CPT-11之前3天進(jìn)行給藥。用hMN_14預(yù)處理 顯著延長(zhǎng)了在人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型中具有低腫瘤負(fù)擔(dān)動(dòng)物的存活。實(shí)施例17圖19顯示在人結(jié)腸癌模型中裸hMN_14CEA Mab和CPT-11的各種給藥方案的比較。 在CPT-11之前3天給藥hMN-14CEA Mab是最有效的。劑量如實(shí)施例14所示。當(dāng)順序相反 時(shí)(在hMN-14之前3天給藥CPT-11)或當(dāng)二者同時(shí)給藥時(shí)，70天的中位存活時(shí)間相對(duì)于未 處理組(35天)是一個(gè)增長(zhǎng)，但是仍然明顯小于在CPT-11之前3天用hMN-14進(jìn)行預(yù)處理 的105天的中位存活時(shí)間。實(shí)施例18圖20顯示在人結(jié)腸癌模型中GM-CSF預(yù)處理對(duì)于裸hMN_14CEAMa b治療的效果。 在_4、-3、-2和-1天以1 ii g/小鼠/天的劑量給藥GM-CSF。在0天與hMN-14處理一起移 植腫瘤細(xì)胞。其它的劑量如實(shí)施例14所示。GM-CSF預(yù)處理導(dǎo)致了中位存活時(shí)間相對(duì)于單 獨(dú)的GM-CSF或單獨(dú)的hMN-14統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增長(zhǎng)(p < 0. 002)。盡管前述提到了特定的實(shí)施方案，但是人們會(huì)理解本發(fā)明并非如此進(jìn)行限定。對(duì) 于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，將可以對(duì)公開的實(shí)施方案作各種改進(jìn)并且這種改進(jìn)在本發(fā)明 的范圍之內(nèi)。在此將本說(shuō)明書中引用的所有的出版物和專利申請(qǐng)以及專利的全部?jī)?nèi)容并入作 為參考。
權(quán)利要求
一種組合物，包含至少一種裸的、人源化或嵌合的I類或I I類抗CEA單克隆抗體(MAb)或其抗原結(jié)合片段和至少一種治療劑，其中所述抗CEA MAb與粒細(xì)胞反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的抗CEAMAb或其片段是MAb的單價(jià)形式。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的抗CEAMAb或其片段是人源化的，其中所述的人源 化的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的抗CEAMAb或其片段是一種嵌合的MAb，其中所述 嵌合的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述片段選自Fab'、Fab、Fv和ScFv0
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的治療劑選自裸抗體、細(xì)胞毒性劑、藥物、放射性核 素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療劑、免疫偶聯(lián)物、激素或其組合，任選地在一種可藥用的載體中進(jìn) 行配制。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述的組合包含長(zhǎng)春新堿、阿霉素、DTIC和環(huán)磷酰胺。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述的治療劑是裸抗體或免疫偶聯(lián)物。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述的裸抗體或所述的免疫偶聯(lián)物的抗體部分包含一 種人源化的、嵌合的、人的或鼠的單克隆抗體或其片段，所述的單克隆抗體或其片段與選自 EGP-1、EGP-2、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5、KC4、TAG-72、EGFR、HER2/neu、BrE3、Le-Y、 A3、A33、Ep-CAM、AFP、Tn、Thoms on-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、細(xì)胞粘合素、 纖維結(jié)合素和Ga 733的抗原結(jié)合。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的治療劑不是DTIC。
11.一種抗體融合蛋白，所述融合蛋白包含的至少一條臂是條裸的、人源化或嵌合的I 類或II類抗CEA單克隆抗體(MAb)或其抗原結(jié)合片段并能與粒細(xì)胞反應(yīng)。
12.權(quán)利要求11的抗體融合蛋白，所述融合蛋白進(jìn)一步包含的至少一條另外的臂是結(jié) 合到CEA或結(jié)合到不同的抗原但不結(jié)合到粒細(xì)胞的MAb或其片段。
13.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，其中所述抗體片段是scFv或Fab抗體片段。
14.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，它是包含一條與NCA50/90反應(yīng)的臂和兩條僅與 CEA反應(yīng)的臂的雙特異性的、三價(jià)蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，它是一種包含結(jié)合NCA50/90的一條臂和結(jié)合III類 CEA表位的第二條臂的雙抗體。
16.權(quán)利要求15的抗體融合蛋白，其中NCA-50/90臂是hMN_3抗體或其片段而第二條 結(jié)合III類CEA表位的臂是hMN-14抗體或其片段。
17.權(quán)利要求16的抗體融合蛋白，其中融合蛋白缺乏阻止細(xì)胞因子的激活而從粒細(xì)胞 釋放的Fc結(jié)構(gòu)域，或者它具有一個(gè)已經(jīng)進(jìn)行過(guò)修飾以阻止補(bǔ)體固定和ADCC的Fc結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，它是一種包含一條hMN-3臂和兩條hMN-14臂的三抗體。
19.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，它是一種包含一條hMN-15臂和兩條hMN-14臂的三 抗體。
20.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，它包含至少一條hMN-14臂和至少一條MN-6臂。
21.權(quán)利要求11的抗體融合蛋白，進(jìn)一步包含一種與所述融合蛋白綴合的治療劑。
22.權(quán)利要求21的抗體融合蛋白，其中所述的治療劑選自細(xì)胞因子、干擾素、集落刺激因子、白介素、GM-CSF或G-CSF。
23.一種裸的、人源化或嵌合的I類或II類抗CEA MAb或其抗原結(jié)合片段和至少一種 治療劑以及任選的藥學(xué)可接受載體在制備治療癌癥的藥物中的用途，其中所述抗CEA MAb 能與粒細(xì)胞反應(yīng)。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述癌癥是甲狀腺髓樣癌。
25.權(quán)利要求23的用途，其中所述的抗CEAMAb或其片段是人源化的，其中所述人源化 的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。
26.權(quán)利要求23的用途，其中所述的抗CEAMAb或其片段是嵌合的MAb，其中所述嵌合 的MAb基本上保留了鼠抗CEA MAb的抗CEA結(jié)合特異性。
27.權(quán)利要求23的用途，其中所述的片段選自F(ab')2、Fab'、Fab、Fv和scFv。
28.權(quán)利要求23的用途，其中所述的治療劑選自裸的抗體、細(xì)胞毒性劑、藥物、毒素、放 射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏治療劑、免疫偶聯(lián)物和激素。
29.權(quán)利要求23的用途，其中所述的治療劑選自與EGP-l、EGP-2、IL-6、MUC-l、MUC-2、 MUC-3、MUC-4、MUC-5、KC4、TAG-72、EGFR、HER2/neu、BrE3、Le-Y, A3、Α33、Ep-CAM、AFP、Τη、 Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、細(xì)胞粘合素、纖維結(jié)合素和Ga 733反應(yīng) 的人源化的、嵌合的、人的或鼠的單克隆抗體或其片段。
30.權(quán)利要求29的用途，其中所述的抗體或其片段是裸的或被偶聯(lián)到另一種治療劑上。
31.權(quán)利要求23的用途，其中所述的治療劑不是DTIC。
32.權(quán)利要求28的用途，其中所述的藥物具有選自抗有絲分裂的、烷化的、抗代謝物 的、抗血管緊張素的、凋亡劑、生物堿的、C0X-2抑制劑和抗生素的藥學(xué)特性。
33.權(quán)利要求28的用途，其中所述的藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亞硝 基脲、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代 謝物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬配位復(fù)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代的脲、甲胼衍生物、腎上 腺皮質(zhì)抑制劑、拮抗劑、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、喜樹堿和阿霉素。
34.權(quán)利要求28的用途，其中所述毒素選自微生物毒素、植物毒素、動(dòng)物毒素、蓖麻毒 蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶RNA酶、DNA酶、葡萄球菌腸毒素A、 商陸抗病毒蛋白、白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
35.權(quán)利要求28的用途，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴 毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血小 板生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)、G-CSF、GM-CSF、干擾素α、干擾素β、干擾素 Y、Sl 因子、IL-U IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 和 TNF-α。
36.權(quán)利要求28的用途，其中所述的放射性核素選自125I、mI、9°Y、88Y、225Ac、mLU、188Re 和 186Re。
37.權(quán)利要求28的用途，其中所述藥物選自達(dá)卡巴嗪、CPT-11、奧沙利鉬和5-氟尿嘧啶/左亞葉酸。
38.權(quán)利要求37的用途，其中在給予藥物之前給予抗CEA抗體或其片段。
39.權(quán)利要求38的用途，其中所述抗CEA抗體或其片段使癌癥對(duì)所述藥物敏化。
40.權(quán)利要求23的用途，其中所述治療劑是干擾素且所述干擾素提高腫瘤細(xì)胞中CEA3表達(dá)。
41.權(quán)利要求40的用途，其中所述干擾素在抗CEA抗體或其片段之前給予。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含裸的人源化的、嵌合的和人的抗CEA抗體以及一種治療劑的組合物，它對(duì)于治療表達(dá)CEA的癌癥和其它疾病是有用的，以及提供了利用該組合物進(jìn)行治療的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101972478SQ20101050068
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2003年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月8日
發(fā)明者D·M·高登伯, H·J·漢森 申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司