專利名稱：：新的川楝皮提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的川楝皮提取物及其提取方法。背景介紹川楝皮系楝科楝屬植物，分布廣泛，具有驅(qū)蟲、療癬作用。現(xiàn)代藥理研究表明，川楝皮除具有驅(qū)蟲作用外，還具有抗腫瘤作用、抑菌抗病毒作用、抗肉毒作用，影響循環(huán)、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)。國內(nèi)外有關(guān)楝科植物化學(xué)成分的研究工作表明其含有三萜、香豆精、多糖類、黃酮、色素及油脂等多種化學(xué)成分，其中甘遂垸型四環(huán)三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗血小板聚集、抗結(jié)核、免疫調(diào)節(jié)等多方面作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了新的〗11楝皮提取物。本發(fā)明還提供了新的川楝皮提取物的混合物。本發(fā)明還提供了包含新的川楝皮提取物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了包含新的川楝皮提取物的混合物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了新的川楝皮提取物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了新的〗11楝皮提取物的混合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所指的新的川楝皮提取物，具有式I的結(jié)構(gòu)通式HOOC:21、其特征是化合物S1:R,為R2為OH，113為H;或者化合物S2:R,為R2為H，Rj為OH;或者化合物S3:R,為R2、R3連接同一個(gè)0。本發(fā)明的新的川楝皮化合物的分離過程如下川楝皮粉碎呈塊狀，95%乙醇浸漬過夜，加熱回流提取3次(3.0h，1.5h，1.5h)，提取液減壓回收乙醇，得乙醇提取物。該提取物加水分散后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯部分，分別減壓回收溶劑，得石油醚部分，乙酸乙酯部分。將石油醚部分進(jìn)行硅膠柱層析分離，用石油醚乙酸乙酯系統(tǒng)(1:0,50:1，30:1,10:1，5:1，1:1，0:1，V:V)梯度洗脫，按薄層含相同斑點(diǎn)合并，得粗分組分A。將乙酸乙酯部分進(jìn)行硅膠柱層析分離，用石油醚乙酸乙酯系統(tǒng)(1:0,3:1，1:l，O:1，V:V)梯度洗脫，按薄層含相同斑點(diǎn)合并，得粗分組分B。組分A、B分別反復(fù)經(jīng)過硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱、反相柱層析以及HPLC分離、純化，得到以上三個(gè)新化合物。相關(guān)的鑒定數(shù)據(jù)如表1和表2:表l化合物'3C-NMR數(shù)據(jù)(125MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1化合物1H-NMR數(shù)據(jù)(500MHz,JinHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明的新的川楝皮化合物在分離的過程中可形成多組分的混合物，包括上述提及的三個(gè)新化合物。本發(fā)明的新的川楝皮化合物或其混合物可與藥學(xué)上可接受的載體形成組合物。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的細(xì)胞毒活性化合物的常規(guī)篩選方法，通過體外多種腫瘤細(xì)胞株的篩選研究，研究人員發(fā)現(xiàn)，式I化合物具有一定的抗腫瘤活性，可作為抗腫瘤藥物的候選藥。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一歩的說明。本發(fā)明中沒有具體描述的提取、分離方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)說明書的提示采用藥典規(guī)定的方法或者其他操作規(guī)程限定的方法結(jié)合所使用儀器的說明書進(jìn)行操作，即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。實(shí)施例1粗分組分的制備川楝皮30kg，粉碎呈塊狀，95%乙醇浸漬過夜，加熱回流提取3次(3h,1.5h，1.5h)，提取液減壓回收乙醇，得乙醇提取物。該提取物加水分散后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯部分，分別減壓回收溶劑，得石油醚部分325g，乙酸乙酯部分250g。將石油醚部分進(jìn)行硅膠柱層析分離，用石油醚乙酸乙酯系統(tǒng)(l:0，50:1，30:1,10:1，5:1，1:1，0:1，V:V)梯度洗脫，按薄層含相同斑點(diǎn)合并，得粗分組分A(17.4g)。將乙酸乙酯部分進(jìn)行硅膠柱層析分離，用石油醚乙酸乙酯系統(tǒng)(1:0，3:1，1:1,0:1，V:V)梯度洗脫，按薄層含相同斑點(diǎn)合并，得粗分組分BG.5g)。實(shí)施例2化合物S1、S2、S3的分離將組分A(17.4g)，依次經(jīng)硅膠柱層析(石油醚乙酸乙酯(10:1、5:1、1:1)梯度)、SephadexLH-20凝膠柱層析(氯仿:甲醇(l:l)〕、硅膠柱層析〔石油醚乙酸乙酯(10:1))、ODS反相柱層析〔85%-100%甲醇梯度)得a和b兩部分，a、b兩部分分別經(jīng)HPLC(83%乙腈和89%乙腈)分離純化，分別得到化合物Sl(tR=14.5分鐘)、S2(tR=24分鐘)。將組分BG.5g)，依次經(jīng)硅膠柱層析〔氯仿甲醇(100:1)〕、反相柱層析〔90%甲醇洗脫)、SephadexLH-20凝膠柱層析〔氯仿:甲醇(l:l)〕、HPLC(55%乙腈)，反復(fù)分離純化，得到化合物S3。實(shí)施例3活性實(shí)驗(yàn)篩選的細(xì)胞株有人白血病細(xì)胞株(HL—60)，人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29)，人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)。測定按常規(guī)采用SRB法。材料細(xì)胞株(共3株)1.1人白血病細(xì)胞株(HL—60)1.2人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29)1.3人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)以上細(xì)胞株用相應(yīng)培養(yǎng)基，于37。C，5。/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.藥物化合物S1、S2、S33.試劑3.1RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI1640+10。/。小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霄素0.15g/l)。3.2高糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10。/。小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。3.3胰酶、DMSO4.設(shè)備4.1C02培養(yǎng)箱、無菌操作臺、酶標(biāo)儀、離心機(jī)等。4.2移液槍、移液管、離心管、96孔板等。二.方法2.1操作歩驟2丄1接種取處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入適量胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，用含10%小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞密度調(diào)整稀釋至一定濃度.取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔。2丄2培養(yǎng)將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入恒溫C02培養(yǎng)箱中，在37'C，5。/。C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。2丄3初篩加藥受試23種化合物先用DMSO配制成0.IM濃度，再作5個(gè)稀釋度，用于篩選(濃度見結(jié)果)。加入受試化合物，20ul/孔，培養(yǎng)72小時(shí)。每組設(shè)3個(gè)平行孔，并重復(fù)3次。2丄4染色將96孔板各孔接種細(xì)胞加TCA固定1h，水洗5遍干燥，加SRB染色15min，醋酸洗滌5遍干燥，Tris溶解。2丄5測定酶標(biāo)儀設(shè)定波長為490nm，測定96孔板每孔吸光值，記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。2.2注意事項(xiàng)2.2.1細(xì)胞懸液需充分混勻，以避免各孔之間細(xì)胞分布不均，加細(xì)胞的過程應(yīng)控制在4小時(shí)以內(nèi)，避免細(xì)胞活性受損。2.2.2各板需單獨(dú)設(shè)定空白對照及陰性對照。2.3數(shù)據(jù)處理2.3.1細(xì)胞抑制率的計(jì)算對照組平均OD值-給藥組平均OD值抑制率=--------------................................—..........xlOO%<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、從川楝皮中提取分離的化合物，具有式I結(jié)構(gòu)其特征是化合物S1R1為R2為OH，R3為H；或者化合物S2R1為R2為H，R3為OH；或者化合物S3R1為R2、R3連接同一個(gè)O。2、一種從川楝皮中提取的混合物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的化合物。3、一種藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。4、一種藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求2所述的混合物和藥學(xué)上可接受的載體。5、權(quán)利要求l的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求2的混合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了具有式I結(jié)構(gòu)的新的川楝皮化合物及其混合物，或與藥學(xué)上可接受的載體構(gòu)成的組合物，以及它們在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號C07J9/00GK101235066SQ200810020388公開日2008年8月6日申請日期2008年3月4日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者周春燕,桑已曙申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司