專利名稱：氧化還原介體的制作方法
氧化還原介體
本發(fā)明涉及新的釕或鋨配合物以及它們在生物傳感器中的應用。具體
地，本發(fā)明涉及處于釕(in)狀態(tài)的釕配合物作為氧化還原介體的應用，所 述釕配合物在含釕種上具有少于3+的總電荷。
生物傳感器是將生化識別組分或傳感元件與物理轉換器結合的分析工 具。它們在不同的領域例如個人健康監(jiān)測、環(huán)境篩選與監(jiān)測、生物過程監(jiān) 測中，以及在食品和飲料工業(yè)中具有廣泛的應用。
生物傳感元件可以是酶、抗體、DNA序列乃至微生物。該生化組分用 于選擇性地催化反應或促進結合作用(event)。生化識別作用的選擇性允許 了生物傳感器在復雜的樣品基質即體液中的操作。轉換器將生化作用轉變 成可測量的信號，從而提供了用于檢測它的手段?？蓽y量的作用的范圍從 歸因于酶反應的產物/底物的生產和消耗的光譜變化到生化絡合時的質量 變化。
通常，轉換器具有許多形式，并且它們指示要測量的物化參數。因而， 轉換器可以是基于光學的，測量例如光學吸收、熒光或折射率的變化。它 可以是質量基的，測量伴隨生物驅動的結合反應的質量變化。另外，它可 以是熱基的(測量焓(熱)的變化)，或是伴隨分析物/生物-識別層相互作用的 電流分析或阻抗(測量電性質的變化)的。
生物傳感器提供了分布式測量的方便和便利，即，使化驗達到現場護 理(thepointof concern or care)的潛在能力。通過適當地設計和制造，可以 便利地大規(guī)模生產生物傳感器器件。然而，存在著許多對于生物傳感器的 使用的限制。這些包括轉換器對污垢(foulant)和干擾的易損性。
酶基生物傳感器廣泛地用于臨床、環(huán)境、農業(yè)和生物技術應用中的分 析物的檢測。可以在人的體液的臨床化驗中測量的分析物包括，例如，葡 萄糖、乳酸、膽固醇、膽紅素和氨基酸。生物流體例如血液中的這些分析 物的水平對于疾病的診斷和監(jiān)測是重要的。
提供可以通常用于酶基系統(tǒng)的傳感器作為現場護理的(point of care)或 無處方可銷售的(over the counter)裝置。它們可以用于試驗新鮮的未修飾的 指刺(fmger prick)全血樣品，在將該樣品加入到裝置中的1至2分鐘(注 此時間不固定，而是可以顯著變化)之內，確定總膽固醇、甘油三酯、HDL 和LDL的濃度。已經在臨床上證明以組合方式的這4個參數提供了對成 人心臟病的風險的非常良好的適應證。眾所周知，高膽固醇是無癥狀的， 因而推薦每一個成人應當進行試驗，以估計他們的風險。如果發(fā)現他們的 風險高，則可以通過單獨地飲食，或飲食與治療藥物相結合的正確處理而 顯著降低。
在這樣的酶基生物傳感器的一個實例中，采用電化學化驗來檢測所討 論的分析物。利用了介體的氧化態(tài)的變化，所述介體同與待測定的分析物 反應的酶相互作用。對介體的氧化態(tài)進行選擇，使得它在加入底物時，僅 處于將與酶相互作用的狀態(tài)。分析物通過酶與化學計量濃度的介體反應。 這引起介體被氧化或還原(取決于酶反應)，并且在介體水平上的此變化可 以通過測定在給定的電位下產生的電流來測量。
電化學化驗典型地在具有兩個或三個電極的電池中進行，其包括至少 一個測量或工作電極和一個參比電極。在3個電極的系統(tǒng)中，第3個電極 是對-電極。在2個電極的系統(tǒng)中，參比電極還起對-電極的作用。電極通 過電路例如恒電位儀連接。測量或工作電極是碳或金屬導體。在電流通過 工作電極時，氧化還原酶被電氧化或電還原。所述酶對于待測定的分析物 或對于分析物的產物是特異性的。酶的轉換率典型地與試驗溶液中的酶本 身或它的產物的濃度有關(優(yōu)選但非必要線性相關)。
酶的電氧化或電還原經常由存在于溶液中或電極上的氧化還原介體所 促進。氧化還原介體通常幫助工作電極和酶之間的電通信(electrical communication)。氧化還原介體可以被溶解在與電極電解接觸的待分析的 流體中。在酶對于需要的分析物或它的產物是催化特異性的情況下，可以 例如通過用包含氧化還原介體和所述酶的膜涂覆電極而制造有用的器件。 在水中可溶或不溶的擴散氧化還原介體，通過在例如酶和電極之間往返運 送電子而起作用。在任意情況下，當酶的底物被電氧化時，氧化還原介體 將電子從底物還原的酶運送到電極；當底物被電還原時，氧化還原介體將
電子從電極運送到底物氧化的酶。
許多先前使用的酶基電化學傳感器使用了許多不同的氧化還原介體， 例如單體二茂鐵、包括奎寧(例如，苯醌)的醌型-化合物、環(huán)己烷氨基磺酸
鎳和釕胺(mtheniumamines)。大多數情況下，這些氧化還原介體具有下列 限制的一種或多種；氧化還原介體在試驗溶液中的溶解度低，它們的化學、 光、熱或pH穩(wěn)定性差，或它們不與酶或電極或所述兩者足夠迅速地交換 電子。另外，這些報道的氧化還原介體的許多的氧化還原電位進行這樣的 氧化，使得在還原的介體在電極上電氧化的電位下，除分析物以外的溶液 組分也被電氧化；在其它的情況下，它們進行這樣的還原，使得溶液組分 例如溶解的氧也被迅速電還原。結果，利用該介體的傳感器不是充分特異 性的。
釕基配合物以前已經被利用作為包括例如膽固醇脫氫酶的反應中的氧 化還原介體。例如，平衡在適當電位的電極將存在的任意的[Ru III(NH3)6;T 種轉化為[Rum(NH3)6]3、通過的電流與由酶反應形成的Ru"(NH3)6種的量 成比例。然而，或多或少地，這樣的高度帶電荷的種例如[RiANH3)6;T通 常以離子-對的形式形成配合物，帶負電荷的基團在酶和電極表面之上，從 而阻止分析過程所必需的反應有效并有效率地發(fā)生。
因此，需要利用這樣的氧化還原介體，其與分析混合物的組分以及電 極形成不太強的配合物，或根本不形成配合物，從而導致來自所述介體的 的測量響應更加可靠、穩(wěn)定和可重現。
根據本發(fā)明的第一方面，提供了式I的配合物作為氧化還原介體的用
途，m(Xz)n 式I
其中，M是釕或鋨，并且具有0、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)； x和n是獨立選自l至6的整數；y是選自l至5的整數；m是-5至+4的 整數，并且z是-2至+l的整數； A是含有1或2個氮原子的單齒或二齒芳族配體；
B是獨立選為除雜環(huán)含氮配體以外的任意適合的配體； X是任意適合的抗衡離子；
其中，A任選由獨立選自下列基團的l至8個基團所取代取代或未取代
的垸基，鏈烯基，或芳基，-F， -Cl， -Br， -1， -N02， -CN， -C02H， -S03H， -NHNH2， -SH，垸氧基羰基，烷基氨基羰基，二烷基氨基羰基，-OH，垸 氧基，-NH2，垸基氨基，二烷基氨基，烷?；被蓟柞０被?(arylcarboxamido)，烷基肼基，羥氨基，烷氧基氨基，烷硫基； 其中，配位原子的數量為6。
配體A可以是由一個或多個(CO2R2)基團取代的單齒配體，或任選由一個或多個C02R2取代的二齒或三齒配體。
基團R2以選為H。
配體A可以選自煙酸、異煙酸、2,2，-聯吡啶、2,2-聯吡啶-5,5，-二羧酸、 2,2-聯吡啶-4,4，-二羧酸、或5-氯-8-羥基喹啉。
根據本發(fā)明的第二方面，提供了式n配合物作為氧化還原介體的用途.-m(Xz)n
式II
其中，M是釕或鋨，并且具有0、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)； x和n是獨立選自l至6的整數；y是選自0至5的整數；m是-5至+4的 整數，并且z是-2至+l的整數；
A是二齒、三齒、四齒、五齒或六齒配體，其可以是直鏈的，具有式 R1N(C2H4NR)wR1 ，或是環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)v、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q 或[(RNC2H4)(RNC3H6)L，其中w是1至5的整數，v是3至6的整數，p和q是1至3的整數，由此，p和q的總和為4、 5或6，并且s是2或3， 并且其中R和R1是氫或甲基； B是獨立選為任意適合的配體； X是任意適合的抗衡離子；
其中，B任選由獨立選自下列基團的l至8個基團所取代取代或未取代 的烷基，鏈烯基，或芳基，-F， -Cl， -Br， -1， -N02， -CN， -C02H， -S03H，-NHNH2， -SH，烷氧基羰基，垸基氨基羰基，二垸基氨基羰基，-OH，烷 氧基，-NH2，垸基氨基，二烷基氨基，垸?；被?，芳基甲酰氨基，垸基 肼基，羥氨基，烷氧基氨基，烷硫基，； 其中，配位原子的數量為6。
配體A可以是二齒、三齒或四齒配體，其可以是直鏈的，具有式 R'RN(C2H4NR)wR1 ，或是環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)v、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q、 [(RNC2H4)(RNC3H6)]S;其中w是l至3的整數，v是3或4的整數，p和 q是l至3的整數，由此，p和q的總和為4，并且s是2或3;
配體A可以選自1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷、1,1,4,7,10,10-六甲 基三亞乙基四胺、1，2-二甲基亞乙基二胺、或1，1,2,2-四甲基亞乙基二胺。
式I或式II中的配體B可以選自胺配體例如NH3，或選自CO; CN; 鹵素，以及乙酰丙酮化物(acac)， 3-溴-乙酰丙酮化物(Bracac)，草酸，吡啶， 或5-氯-8-羥基喹啉。
式I或式II中的配體A和B可以選為二齒的，并且是順式或反式配合物的幾何結構。
式I或式II的配合物中的金屬的氧化態(tài)可以選為2+、 3+或4+。 式I或式II的配合物中的金屬的氧化態(tài)可以選為3+。 式I或式II中的配體A和B可以選自下組+2、 +1、 0、 -1、 -2和-3。 式I或式II的配合物中的抗衡離子可以選自F、 Cr、 Br—、 1—、 N03—、
NH4+、 NR/、 PF6\ CF3S03-、 S042-、 CKV、 K+、 Na+、 Li+?？梢允褂每?br> 衡離子的組合。
式I或式II的配合物可以選自[Ruffl(NH3)5(吡啶-3-COOH)](PF6)2(CF3S03) 、 [Rum(2,4-戊二酮化物(pentandionate))2(吡啶 -3-<:00印(吡啶-3-0)0)]、 [Rum(3-溴-2，4-戊二酮化物)2(吡啶-3-COOH)(吡 啶-3-COO)] 、 [Rum(2，4-戊二酮化物)2(2,2，-聯吡啶-5，5 ，-(COOH)(COO)]、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2,2，-聯吡啶-4,4，-(COOH)(C00)]、 [Rum(2，4-戊二酮 化物)2(2，2，-聯吡啶)]C1 、 [Ru111(2,4-戊二酮化物)2(吡啶-4-COOH)(吡啶 -4-COO)]、 [Ru，5-氯-8-羥基喹啉)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-C00)]、 [Rum (1,1,4,7,10， 10-六甲基三亞乙基四胺)(2,4-戊二酮化物)](PF6)(CF3S03)、 [Rum(l,l,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺)(2,4-戊二酮化物)]Cl2、 [OsII(2,2，聯吡啶)2(2,4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru"(2,2，聯吡啶)2(2,4-戊二酮化物)]C1、 [Ru11 (2,2，聯吡啶)2((:204)]、 K[Rum(C204)2(吡啶-3-COOH)2]、 [Rum(l,4,7-三甲基 -1，4,7-三氮雜環(huán)壬烷)(2，4-戊二酮化物)(吡啶)]^03)2。
式I或式II的配合物可以選自[Rum(2,4-戊二酮化物)2(吡啶 -3《00 0(吡啶-3-0)0)]、 [Rum(l,4,7-三甲基-l,4，7-三氮雜環(huán)壬垸)(2，4-戊 二酮化物)(吡啶)](N03)2或[Rum(l，l，4，7，10，10-六甲基三亞乙基四胺)(2，4-戊
二酮化物)]Cl2。
該氧化還原介體可以用于電化學傳感器。電化學傳感器可以包括微帶 電極。電化學傳感器可以是電化學生物傳感器。電化學生物傳感器可以用 于檢測體液、環(huán)境樣品、食物和飲料、獸醫(yī)樣品、藥物中的分析物。
根據本發(fā)明的第三方面，提供了如在前限定的式I或式II的釕配合物 在生物傳感器中的用途。
式I或式II的配合物可以用在pH為6至10。式I或式II的配合物可 以用在pH為7至9。
該生物傳感器可以用于任意的相容的生化分析物。該分析物可以被發(fā) 現于生物流體中，并且還可以選自酶、酶底物、抗原、抗體、核酸序列、 膽固醇、膽固醇酯、脂蛋白、甘油三酯或微生物中的任何一種。
根據本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于測量分析物的檢測系統(tǒng)，包
括
(a) 使包含分析物的樣品與包含氧化還原介體的溶液接觸，所述氧化還 原介體選自根據式I或式II的含Ru或含Os的化合物的組；
(b) 在引起酶對分析物起作用的條件下培育所述接觸的樣品；
(c) 使步驟(b)的培育樣品經受產生可測量信號的變化的條件；和
(d) 測量產生的信號。
可測量信號可以是電化學、比色、熱、阻抗測量、電容或光譜信號。 可測量的信號可以是在微帶電極測量的電化學信號。
根據本發(fā)明的第五方面，提供了根據式I的配合物，m(Xz)n 式I
其中，M是釕或鋨，并且具有0、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)；
x和n是獨立選自l至6的整數；y是選自l至5的整數；m是-5至+4的
整數，并且Z是-2至+l的整數；
A是含有1或2個氮原子的單齒或二齒芳族配體；
B是獨立選為除雜環(huán)含氮配體以外的任意適合的配體的一種或多種； X是任意適合的抗衡離子-,
其中，A任選由獨立選自下列基團的1至8個基團所取代取代或未取代 的烷基，鏈烯基，或芳基，-F， -Cl， -Br，陽I， -N02， -CN， -C02H， -S03H， -NHNH2， -SH，烷氧基羰基，烷基氨基羰基，二烷基氨基羰基，-OH，烷 氧基，-NH2，烷基氨基，二烷基氮基，烷?；被蓟柞０被?，烷基 肼基，羥氨基，垸氧基氨基，烷硫基； 其中，配位原子的數量為6。
配體A可以是由一個或多個C02l^基團取代的單齒配體，或任選由一 個或多個C02^基團取代的二齒或三齒配體，其中，所述一個或多個C02R2 基團，基團R2可以選為H。
配體A可以選自煙酸、異煙酸、5-羧基-煙酸、6-吡啶基-煙酸、2，2'-聯吡啶-5,5，-雙-羧酸、2,2，-聯吡啶-4,4，-雙-羧酸、2,2，-聯吡啶、1,10-菲咯啉 -3,9-雙羧酸。
根據本發(fā)明的第六方面，提供了一種根據式n的配合物，m(X"n
式n
其中，M是釕或鋨，并且具有0、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)； x和n是獨立選自l至6的整數；y是選自0至5的整數；m是-5至+4的 整數，并且z是-2至+l的整數；
A是二齒、三齒、四齒、五齒或六齒配體，其可以是直鏈的，具有式 R'RN(C2H4NR)wR1，或是環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)v、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q 或[(RNC2H4)(RNC3H6)]s;其中w是1至5的整數，v是3至6的整數，p
和q是l至3的整數，由此，p和q的總和為4，并且s是2或3，并且其
中R和W是氫或甲基；
B是獨立選為任意適合的配體；
X是任意適合的抗衡離子；
其中，A任選由獨立選自下列基團的l至7個基團所取代取代或未取代
的垸基，鏈烯基，或芳基，-F， -Cl， -Br， -1， -N02， -CN， -C02H， -S03H， -NHNH2， -SH，烷氧基羰基，烷基氨基羰基，二烷基氨基羰基，-OH，垸 氧基，-NH2，垸基氨基，二垸基氨基，烷酰基氨基，芳基甲酰氨基，烷基 肼基，羥氨基，烷氧基氨基，垸硫基； 其中，配位原子的數量為6。
配體A可以是二齒、三齒、四齒、五齒或六齒配體，其可以是直鏈的， 具有式K^RN(C2H4NR)wR1 ，或是環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)V 、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q、 [(RNC2H4)(RNC3H6)]S;其中w是1至3的整數，v 是3或4的整數，p和q是1至3的整數，由此，p和q的總和為4，并且 s是2或3。
配體A可以選自1，4,7-三甲基-1,4,7-三氮雜環(huán)壬垸、1，1,4,7,10,10-六甲 基三亞乙基四胺、1,2-二甲基亞乙基二胺或1,1,2,2-四甲基亞乙基二胺。
配體B可以選自胺配體例如NEb或NMe3，選自CO、 CN、鹵素、乙 酰丙酮化物(acac)、 3-溴-乙酰丙酮化物(Bmcac)、草酸、1,4，7-三亞乙基冠 醚、草酸、或5-氯-8-羥基喹啉。
當將配體A或B選為二齒時，該配合物的幾何結構可以是/,^及式。
式I或式II的配合物中的金屬的氧化態(tài)可以選為2+或3+。式I或式 II的配合物中的金屬的氧化態(tài)可以選為3+。
可以對配體A和B進行選擇，使得式I或式II的配合物上的全部電荷 選自下組+2、 +1、 0、 -1、 -2和-3。
抗衡離子可以選自F-、 Cr、 Br-、 r、 N(V、 NH4+、 NR4+、 PF6—、 CF3S(V、 S042—、 C1(V、 K+、 Na+和Li+?？梢允褂每购怆x子的組合。
式I或式II的配合物可以選自[Rum(NH3)5(吡啶-3-COOH)](PF6)2(CF3S03) 、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(吡啶-3-COOH)(吡啶 -3-COO)]、 [Rum(3-溴-2,4-戊二酮化物)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-C00)]、、 [Ru，2,4-戊二酮 化物)2(2,2，-聯吡啶-4,4，-(COOH)(COO)]、 [Rum(2，4-戊二酮化物)2(2，2，-聯吡 啶)]C1、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(吡啶-4-COOH)(吡啶-4-C00)]、 [Rum(5-氯 -8-羥基喹啉)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-C00)]、 [Rum (1,1，4,7，10,10-六甲基三 亞乙基四胺)(2,4-戊二酮化物)](PF6)(CF3S03)、 [Rum(l,l，4,7，10，10-六甲基三 亞乙基四胺)(2,4-戊二酮化物)]Cl2、 [Os"(2,2，-聯吡啶)2(2,4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru"(2，2，-聯吡啶)2(2，4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru11 (2,2'-聯吡啶)2((:204)]、 K[Rum(C204)2(吡啶-3-COOH)2] 、 [Rum(l,4,7-三甲基-1,4,7-三氮雜環(huán)壬 烷)(2,4-戊二酮化物)(吡啶)](N03)2。
應當理解，在式I或式II的配合物中的每一種中，金屬可以根據需要 而選為釕或鋨。另外，可以改變上述特定配合物中的金屬，以形成相應的 釕或鋨配合物。本領域技術人員將理解，在配合物中，用Os取代Ru將使 此配合物的工作電位變化約-400 mV至-600 mV，并且必要時，通過改變 金屬中心周圍的配體，可以進一步使工作電位在相反的方向上精確調整， 直至介體達到對Ag/AgCl的工作電位為-300 mV至+300 mV。
例如的E1/2電位為-175 mV 。 [Rum(3-Bracac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]與[Rum(acac)2(py-3-COOH)(py -3-COO)]類似，但是具有溴-乙酰丙酮化物(bromo acac)代替乙酰丙酮化物 (acac)并且E1/2電位為-142 mV。與[Rum(acac)2(py-3-COOH)(py -3-COO)]類似，但是在不同的位置具有COO(py-4-COOH而不是py -3-COOH),并且具有E^電位為-165 mV。本領域技術人員將理解，工作 電位必須在E1/2以上約150 mV。
相應于這里所述的Ru配合物的配合物是[Osni(NH3)5(吡啶-3-COOH)](PF6)2(CF3S03) 、 [Osm(2，4-戊二酮化物)2(吡啶-3-COOH)(吡啶 -3-COO)] 、 [Osm(3-溴-2,4-戊二酮化物)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-COO)]、 [Osm(2，4-戊二酮化物)2(2，2，-聯吡啶-5,5，-(COOH)(C00)]、 [Osm(2,4-戊二酮 化物)2(2，2，-聯吡啶-4,4，-(COOH)(C00)]、 [Os，2,4-戊二酮化物)2(2，2，-聯吡 啶)]C1、 [Osm(2，4-戊二酮化物)2(吡啶-4-COOH)(吡啶-4-C00)]、 [Osm(5-氯-8-
羥基喹啉)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-C00)]、 [Os，l,l,4，7,10,10-六甲基三亞 乙基四胺)(2,4-戊二酮化物)](PF6)(CF3S03)、 [Osm(l,l,4，7,10,10-六甲基三亞 乙基四胺)(2，4-戊二酮化物)]Cl2、 [Os"(2,2，聯吡啶)2(2，4-戊二酮化物)]Cl、 [OsH(2,2，-聯吡啶)2(C204)]、 K[Osm(C204)2(吡啶-3-COOH)2]、 [Os，l,4,7-三 甲基-l,4，7-三氮雜環(huán)壬垸)(2,4-戊二酮化物)(吡啶)](N03)2。 當在這里使用時，下列定義限定所述的術語
術語"烷基，，包括直鏈或支鏈的飽和脂族烴。垸基的實例包括甲基、乙 基、正-丙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、叔-丁基、環(huán)戊基等。除非另外 指出，術語"烷基"包括烷基和環(huán)烷基。
術語"烷氧基"描述通過氧原子連接到結構的其余部分(remainder)的烷 基。垸氧基的實例包括甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、異丙氧基、丁氧基、 叔-丁氧基、環(huán)戊氧基等。另外，除非另外指出，術語"烷氧基"包括烷氧基 和環(huán)烷氧基。
術語"鏈烯基"描述具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和的直鏈或支鏈脂 族烴。鏈烯基的實例包括乙烯基、l-丙烯基、2-丙烯基、l-丁烯基、2-甲基 -l-丙烯基、環(huán)戊烯基等。另外，除非另外指出，術語"鏈烯基"包括鏈烯基 和環(huán)烯基。
"反應基"是這樣的分子的官能團，其能夠與另一種化合物反應，以將 該其它的化合物的至少一部分連接到該分子。反應基包括羧基、活化的酯、 磺酰鹵(sulfonyl halide)、磺酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧化物、氮 丙啶、鹵化物、醛、酮、氨基、丙烯酰胺、硫醇、酰疊氮、肼、羥胺、鹵 代烷、咪唑、吡啶、酚、垸基、磺酸酯、鹵代三嗪、亞氨酸酯、馬來酰亞 胺、酰肼、羥基和光-反應疊氮芳基。如本領域中所理解的，活化的酯通常 包括琥珀酰亞胺基、苯并三唑基，或由吸電子基團例如磺基、硝基、氰基 或鹵素基團取代的芳基的酯。
術語"acac"是指作為2,4-戊二酮的共軛堿的乙酰丙酮化物陰離子。 "取代的"官能團(例如，取代的烷基、鏈烯基或垸氧基)包括選自下列 基團的至少一種取代基鹵素、烷氧基、巰基、芳基、垸氧基羰基、烷基 氨基羰基、二烷基氨基羰基、-OH、 -NH2、垸基氨基、二烷基氨基、三烷 基銨、垸?；被⒍轷；被⒎蓟柞０被?、肼基、烷硫基、鏈烯
基和反應基。
"生物流體"是其中可以測量分析物的任意體液或體液衍生物，例如血 液、組織液、血漿、皮膚液(d薩al fluid)、汗和眼淚。
"電化學傳感器"是配置用于通過電化學氧化或還原反應檢測樣品中的 分析物的存在，或測量分析物的濃度或量的裝置。這些反應典型地可以被 轉換成可以與分析物的量或濃度相關聯的電信號。
"氧化還原介體"是一種電子轉移劑，其用于直接或通過一種或多種另 外的電子轉移劑，在分析物或分析物-還原的或分析物-氧化的酶與電極之 間運送電子。
"電解"是直接在電極上，或通過一種或多種電子轉移劑(例如，氧化還 原介體或酶)的化合物的電氧化或電還原。
術語"參比電極"，除非另外指出，包括a)參比電極，禾Q b)還可以起 對電極作用的參比電極(即，對/參比電極)。
術語"對電極"，除非另外指出，包括a)對電極，禾卩b)還可以起參比
電極作用的對電極(即，對-參比電極)。 術語"可測量的信號"是指可以被容易地測量的信號，例如電極電位、
熒光、光譜吸收、發(fā)光、光散射、NMR、 IR、質譜、熱變化，或壓電變化。 術語"生化分析物"包括可能存在于生物流體中的任何可測量的化學或
生化物質，并且還包括任何酶、抗體、DNA序列或微生物。
根據本發(fā)明的單齒、二齒和三齒在本領域中具有它們通常接受的含義。
即，將單齒配體規(guī)定為具有一個潛在配位原子的化學部分或基團。超過一
個潛在配位原子的，被稱為多齒配體，其中，潛在配位原子的數量由術語
二齒、三齒等表示。
例如，可根據本發(fā)明使用的已知的生物傳感器可以由具有四個試劑池
(reagent well)和一個普通擬參比(pseudo reference)的條帶(strip)組成；并且 每一個池具有它本身的管狀微帶工作電極。條帶的傳感組件(component) 是通過干燥不同的特別配制的試劑而提供的，所述試劑包含將與每一個池 中的試樣中的特定分析物相互作用的至少一種酶以及介體。潛在地，由于 可以向每一個池中加入并干燥不同的試劑，因此清楚的是，可以使用單個 的試樣完成多-分析物試驗。池的數量是可變的，因而獨特的試驗的數量是 可變的，例如，可以使用采用1至6個池的傳感器。
可以使用典型具有工作微電極和參比電極的常規(guī)微電極。工作電極通
常由鈀、鉑、金或碳制成。對電極典型為碳、Ag/AgCl、 Ag/Ag2S04、鈀、 金、鈾、Cu/CuS04、 Hg/HgO、 Hg/HgCl2、 Hg/HgS04或Zn/ZnS04。
在一個優(yōu)選的微電極中，工作電極處于形成所述微電極的貯器的壁中。 可以根據本發(fā)明使用的微電極的實例是WO 03/097860中公開的那些。
僅通過實施例，并且參考附圖，現在將描述本發(fā)明的實施方案，在所 述附圖中


圖1顯示緩沖液中的0.1 M KC1中的10 mM介體[Ru"(py-3COOH)(NH3)5](PF6)2溶液的伏安法，該伏安法是通過在100 mVs—1的掃描 速率下，使用WO200356319中所述的標準池電極(well electrode)記錄的；
圖 2 顯示在 0.1 M KC1 中的 10 mM 的新介體 [(Ru"(py-3COOH)(NH3)5](PF6)2的重復氧化試驗(在相對于Ag/AgCl為+0.25 V)，該重復氧化試驗是在脫氧的(紅色)和氧化的(藍色)環(huán)境中記錄的；
圖3顯示在0.1 M pH 9的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(含有0.1 M KCl)(a) 和在 0.1 M KC1 溶液(由水制成)(b)中的新介體 [Ru"(py-3COOH)(NH3)5](PF6)2的循環(huán)伏安法；
圖4a顯示在0.1 M KC1中的新介體Ru"(py-3COOH)(NH3)5](PF6)2的重 復氧化試驗(在相對于Ag/AgCl為+0.25 V)，該重復氧化試驗是在氧化環(huán)境 中記錄的。圖4b顯示相對于電流的介體濃度的Ri^+校準數據；
圖5顯示在不存在(黑色-(a))和存在(灰色-(b》葡糖氧化酶的情況下， Ru"(py丁COOH)(NH3)5](PF6)2的循環(huán)伏安圖6顯示在WO200356319中所述的總膽固醇混合物中， [Rum(NH3)5(py-3-COOH)(PF6)2(CF3S03)的循環(huán)伏安圖7A顯示在血漿作為試驗溶液的情況下，具有新介體 [Rum(NH3)5(py-3-COOH)(PF6)2(CF3S03)的總膽固醇混合物在時間為118 s 的氧化；
圖7B顯示在血漿作為試驗溶液的情況下，具有介體 [Ruffl(NH3)5(py-3-COOH-吡啶)(PF6)2(CF3S03)的總膽固醇混合物在時間 =118s的還原電流；
圖7C顯示在不同濃度的膽固醇情況下，介體[Ru，NH3)5(3-COOH-吡 啶)(PF6)2(CF3S03)的時間點實驗(time point experiment),該實驗顯示平均氧 化電流隨時間的變化；
圖8A顯示用介體[Rum(NH3)5(3-COOH-吡啶)(PF6)2(CF3S03)在時間為 118 s的氧化電流的時間點實驗；
圖8B顯示用介體[Rum(NH3)5(3-COOH-吡啶)(PF6)2(CF3S03)在時間為 202 s的氧化電流的時間點實驗；
圖8C顯示用介體[Rum(NH3)5(3-COOH-吡啶)(PF6)2(CF3S03)在時間為 202 s的還原電流的時間點實驗；
圖8D顯示在不同濃度的膽固醇情況下，Ru介體 [Ru(NH3)5(py-3-COOH)](PF6)2(CF3S03:^時間點實驗，其顯示平均氧化電 流隨時間的變化；
圖9顯示在由10 mM [Rum(acac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]、 0.1 M KC1、 16 mM Chaps和0.1 M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 9.0)組成的溶液 中，絲網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率 為100 mVi1的情況下記錄的；
圖10顯示使用[Rum(acac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]作為介體的氧化 電流相對于池中不同人血漿樣品的總膽固醇(TC)濃度的曲線圖。電流是在 將+0.15 V的氧化電位(相對于Ag/AgCl參比)施加到工作電極以后記錄的；
圖11顯示在由10mM[Rum(3-Bracac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]、0,l M KC1、 16 mM Chaps和0.1 M三羥甲基氨基甲垸緩沖液(pH 9.0)組成的溶液 中，絲網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率 為100mV's"的情況下記錄的；
圖12顯示在不存在(黑色-(a))和存在(灰色-(b))0.75 mM NADH禾Q 0.03 mg ml" PdR的情況下，由0.5 mM [Rum(3-Bracac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)] 組成的溶液的紫外-可見吸收光譜；
圖13顯示使用[Rum(3-Bracac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]作為介體，氧 化電流相對于池中不同的凍干血清樣品的總膽固醇(TC)濃度的曲線圖。電 流是在將+0.15 V的氧化電位(相對于Ag/AgCl參比)施加到工作電極以后 記錄的；
圖14顯示在由1 mM [Rum(acac)2(2，2，-bpy-5,5，-(COOH)(COO)]、 0.1 M KC1、 16 mM Chaps和0.1M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH9.0)組成的溶液中，絲網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率 為100 mVi1的情況下記錄的；
圖15顯示使用[Rum(acac)2(2,2，-bpy-5,5，-(COOH)(COO)]作為介體，氧化電流相對于池中不同的凍干血清樣品的總膽固醇(TC)濃度的校準曲線圖。電流是在將+0.15 V的氧化電位湘對于Ag/AgCl參比)施加到工作電 極以后記錄的；
圖16顯示在由10 mM [Rum(acac)2(2，2，-bpy)]Cl、 0.1 M KCl、 16 mM Chaps和0.1 M三羥甲基氨基甲垸緩沖液(pH9.0)組成的溶液中，絲網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率為100 mV-s—1 的情況下記錄的；
圖17顯示在不存在(深色-(a))和存在(淺色-(b))0.017 mg'mr1 PdR的情 況下，由1 mM [Rum(acac)2(2,2，-bpy)]Cl和1 mM NADH的溶液的紫外-可見吸收光譜；
圖18顯示使用[Rum(acac)2(2，2，-bpy)]Cl作為介體，氧化電流相對于池 中不同的凍干血清樣品的總膽固醇(TC)濃度的曲線圖。電流是在將+0.15V 的氧化電位(相對于Ag/AgCl參比)施加到工作電極以后記錄的；
圖19顯示在由10 mM[Rum(acac)2(py-4-COOH)(py-4-COO)]、 0.1 M KCl、 16 mM Chaps和0.1 M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 9.0)組成的溶液 中，絲網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率 為lOOmVi"的情況下記錄的；
圖20顯示使用[Rum(acac)2(py-4-COOH)(py-4-COO)]作為介體，氧化電 流相對于池中不同的人血漿樣品的總膽固醇(TC)濃度的曲線圖。電流是在 將+0.15 V的氧化電位(相對于Ag/AgCl參比)施加到工作電極以后記錄的；
圖21顯示在由10mM [Rum(5-Cl-Quin)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]、 0.1 MKCl、 16mM Chaps禾P 0.1 M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 9.0)組成的溶 液中，絲網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速 率為100mV's"的情況下記錄的；
圖22顯示在絲網印刷的碳微電極條帶上，在存在有10 mM NADH的
含有(a)O、 (b)O.l、 (c)0.5、 (d)l和(e)5 mg'mr1 PdR的0.1 M三羥甲基氨基 甲烷緩沖液(pH 9.0)中，[Rum(5-Cl-Quin)2(py-3-COOH)(py-3-COO)](l mM) 的循環(huán)伏安圖(在lOmVs'1);
圖23顯示在不存在(深色-(a))和存在(淺色-(b)) 0.033 mg ml—1 PdR的情 況下，含有0.25 mM [Ru'"(5-Cl-Quin)2(py-3-COOH)(py畫3-COO)]和0.25 mM NADH的溶液的紫外-可見吸收光譜；
圖24顯示在由5 mM[Ru，Me6-tet)(acac)](PF6)(CF3S03)、 0.1 MKCl、 16 mM Chaps和0.1 M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 9.0)組成的溶液中，絲 網印刷的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率為100 mVi'的情況下記錄的；
圖25顯示在不存在(深色-(a))和存在(淺色-(b)) 0.033 mg'mr1 PdR的情 況下，由5 mM[Rum(Me6-tet)(acac)](PF6)(CF3S03:^ 0.5 mM NADH組成的
溶液的紫外-可見吸收光譜；
圖26顯示使用[Rum(Me6-tet)(acac)](PF6)(CF3S03)作為介體，氧化電流 相對于池中不同的人血漿樣品的總膽固醇(TC)濃度的曲線圖。電流是在施 加+0.15 V的氧化電位(相對于Ag/AgCl參比)以后記錄的；
圖27顯示在由10 mM [Os"(2,2，-bpy)2(acac)]Cl、 0.1 M KCl、 16 mM Chaps和0.1 M三羥甲基氨基甲垸緩沖液(pH9.0)組成的溶液中，絲網印刷 的碳微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率為100 mV-s—1 的情況下記錄的；
圖28顯示在絲網印刷的碳微電極條帶上，在存在有10 mM NADH的 含有(a)O、 (b)O.l、 (c)0.5、 (d)l和(e)5 mg'mr1 PdR的0.1 M三羥甲基氨基 甲垸緩沖液(pH9.0)中，[Os"(2，2，-bpy)2(acac)]C1(1 mM)的循環(huán)伏安圖(在10 mVs-1);
圖29顯示在由1 mM [Os"(2,2，陽bpy)2(acac)]C1、0.1 MKCl、 16 mM Chaps 和0.1 M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 9.0)組成的溶液中，絲網印刷的碳微 電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率為10 mV's—'的情況 下記錄的；
圖30顯示在絲網印刷的碳微電極條帶上，在存在有0.1 M葡萄糖的含 有(a)O、 (b)0.5、 (c)1.25、禾口(d)2.5 mg-mr1葡糖氧化酶的0.1 M三羥甲基氨
基甲垸(pH 7.0)中，[Ru(2,2，-bpy)2(acac)]Cl (1 mM)的循環(huán)伏安圖(在10 mVs");
圖31顯示在絲網印刷的碳微電極條帶上，存在有0.1 M葡萄糖的含 有(a)O、 (b)0.25、 (c)1.25、和(d)5 mg m1—1葡糖氧化酶的0.1 M三羥甲基氨 基甲烷緩沖液(pH7.0)中，[Ru"(2,2'-bpy)2(acac)]C1(1 mM)的循環(huán)伏安圖(在 10mVs");
圖32顯示在絲網印刷的碳微電極條帶上，在存在有O.l M葡萄糖的 包含(a)0和(b)5mgmr1葡糖氧化酶的O.l M三羥甲基氨基甲烷(pH 7.0)中， K[Rum(C204)2(py-3-COOH)2] (5 mM)的循環(huán)伏安圖(在10 mVs—1);
圖33顯示[Ru"(Me3TACN)(acac)(py)]PF6在CH3CN中的ESI質譜(+ve 模式)；
圖34顯示[Ru，Me3-TACN)(acac)(py)](N03)2在甲醇中的ESI質譜(+ve 模式)；
圖35顯示在包含10 mM[Rum(MerTACN)(acac)(py)](NO3)2、0.1 MKC1 和0.1 M三羥甲基氨基甲垸緩沖液(pH9.0)的溶液中，絲網印刷的碳微電極 條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率為100mV's"的情況下記 錄的；
圖36顯示在不存在(深色-(a))和存在(淺色-(b))0.033 mg ml" PdR的情 況下，包含2 mM[Rum(MerTACN)(acac)(py)](N03)jtl 5 mM NADH的溶 液的紫外-可見吸收光譜；
圖 37 顯示對于含有 1 mg ml" PdR 的 10 mM[Rum(MerTACN)(acac)(py)](N03)2溶液，相對于NADH濃度的氧化電 流的曲線圖38顯示在含有3.3 mM[Rum(acac)2(2，2，-bpy-4，4，-(COOH)(C00)]、0.1 MKC1和0.1M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH9.0)的溶液中，絲網印刷的碳 微電極條帶的循環(huán)伏安圖，該循環(huán)伏安圖是在掃描速率為100mV's"的情 況下記錄的；
圖39顯示在標準的絲網印刷的碳微電極條帶上，在存在有50 mM NADH的情況下，含有(a)O禾口(b)10 mg'ml—1 PdR的含有0.1 M KCl和0.1 M 三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 9.0)的溶液中，(PF6)2(CF3S03) ; [Rum(acac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)] ; [Rum(3-Bracac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]; [Ru"(acac)2(2，2，-bpy-5，5' -(COOH)(COO)] ; [Ru"'(acac)2(2,2，-bpy-4,4，-(COOH)(C00)] ; [Rum(acac)2(2，2，-bpy)]Cl ; [Rum(acac)2(py-4-COOH)(py-4-C00)] ; [Rum (5-Cl-Quin)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]; [Rum(Me6-tet)(acac)](PF6)(CF3S03); [Rum (Me6-tet)(acac)]Cl2; [Os"(2,2，-bpy)2(acac)]Cl; [Ru(2，2，-bpy)2(acac)]Cl; [Run(2，2，-bpy)2(C204)] ; K[Rum(C204)2(py-3-COOH)2] ; 和 [Rum(MerTACN)(acac)(py)](N03)2
其中，py一比啶；3-Bracac二3-溴-2，4-戊二酮化物；acac^2，4-戊二酮化物； 2,2，-bpy二2,2，聯吡啶；2,2，-bpy-5，5，-(COOH)^2,2，-聯吡啶-5,5，-二羧酸； Me6-tet= 1 ， 1,4,7， 10,10-六甲基三亞乙基四胺；MerTACN= 1 ，4,7-三甲基-1,4,7-三氮雜環(huán)壬垸，以及5-Cl-Quii^5-氯-8-羥基喹啉。
對于配合物的每一種，具體地，可以遵循相同的合成程序，并且簡單 地將起始化合物改變成相應的釕或鋨化合物，從而制備相應的釕或鋨的配 合物。(PF6)2 禾口 [Ru"乂NH3)5(py-3-
C02H)](PF6)2(CF3S03)的合成
<formula>formula see original document page 26</formula>材料RuCl3-3H20(Heraeus;)
一水合肼(80%， RDH)
煙酸(奧德里奇(Aldrich))
對甲苯磺酸銀(奧德里奇(Aldrich》
三氟甲磺酸銀(奧德里奇(Aldrich))
六氟磷酸銨(奧德里奇(Aldrich))
氯五胺釕(III)氯化物，[Ru(NH3)5Cl]Cl2，是根據文獻方法(A. D. Allen, 無機合成(Inorg. Synth.) 1970, 12， 2)從三氯化釕制備的，并且通過在40。C從 0.1 MHC1再結晶而純化。Cl2 (1.0 g， 3.4 mmol)的懸浮液中加入2 當量的對甲苯磺酸銀(1.9g， 6.8mmol)。在室溫攪拌該混合物1 h以后，將 溶液過濾，以移除AgCl。向已經用氬氣脫氣的所得的淺黃色溶液中，加 入4倍過量的煙酸(py-3-C02H， 1.67 g， 13.6 mmol)和12-15片海綿狀鋅隸
合金(約10g)。在Ar下，在室溫攪拌該混合物2hr以后，將溶液過濾。向 得到的紅橙色溶液中加入六氟磷酸銨(NH4PF6， 3g)，并且將該混合物保持 在4。C過夜。在從丙酮-乙醚過濾并再結晶此粗產物以后，得到0.6 g的 [Ru"(NH3)5(py-3-C02H)](PF6)2。(收率29.5%)(PF6)2(CF3S03)
向30 mL丙酮中的[Ru"(NH3)5(py-3-C02H)](PF6)2 (160 mg， 0.27 mmol) 的溶液中加入1.3當量的三氟甲磺酸銀(AgCF3S03， 89mg)，并且在室溫， 將該混合物在黑暗中攪拌1 h。通過離心移除銀，以得到淺黃色溶液。在 攪拌的情況下，將得到的溶液逐滴加入到250ml乙醚中，并且將該混合物 在4。C保持3小時，以得到淺黃色沉淀。將產物用乙醚清洗，并且從丙酮 和乙醚再結晶。(收率卯mg， 44%)。
蕭式-[Ru"(acac)2(py-3-COOH)2]的合成
在氬氣下，將乙醇中的Ru(acac)3 (200 mg， 0.5 mmol)和煙酸(494 mg，
4 mmol)的混合物與幾片海綿狀鋅汞合金回流5 h。將得到的棕紅色混合物 冷卻，并且通過過濾移除Zn/Hg。將棕紅色沉積通過過濾收集，并且用O.l MHC1、水以及乙醚清洗。(粗產物收率250 mg， 91%，含有Zn/Hg碎片)。
順式-[Ru<III>(acac)2(py-3-COOH) (py-3-C00)]的合成 將/,式-[RiAacac)2(py-3-COOH)2](200 mg)溶解在0.1 M NH3中，然后
過濾。將該紅棕色濾液在空氣中攪拌過夜(約18小時)，以得到暗紫色溶液。 過濾并蒸干該溶液。收集暗紫色殘余物，并且用丙酮和乙醚清洗，然后空 氣干燥。(收率150 mg)
降順式-[Ru<ii>(3-Bracac)2(py-3-COO)(py-3-COOH)]的合成
在2 ml H20中溶解J^C-[Ru"乂acac)2(py-3-C00) (py-3-COOH)](93 mg， 0.17 mmol)。然后加入4.3 ml的0.041 M的溴水(0.17 mmol Br2)。將得到的
紫藍色懸浮液在空氣中攪拌過夜。將藍色沉淀收集并用水清洗。收率:25%;
相對于在pl^8(磷酸鹽緩沖液)的NHE， EQ=0.15 V。 [Ru，acac)2(5,5，-(COO)(COOH)-2，2，-bpy)]的合成
在氬氣下，將30 ml的乙醇中的Ru(acac)3 (200 mg， 0.5 mmol)和 5，5，-(COOH)2-2，2，-bpy (122 mg， 0.5 mmol)的紅色混合物與幾片海綿狀 Zn/Hg汞齊一起回流過夜。冷卻得到的棕色混合物，并且用鑷子移除鋅汞 合金。收集該棕色沉淀，并且用乙醇和乙醚清洗。然后，將該棕色固體溶 解在50ml的0.1MNH3中，并且過濾。將綠色的濾液在空氣中攪拌過夜， 以得到紅色溶液。將該溶液過濾，然后蒸干。收集紫-紅色沉淀，并且用丙 酮和乙醚清洗，然后空氣干燥。收率22%;相對于在pt^8(磷酸鹽緩沖 液)的NHE， EQ=0.18V。(PF6)<formula>formula see original document page 30</formula>
將[Ru"(acac)2(2,2，-bpy)] (75 mg， 0.165 mmol)溶解在二氯甲烷(15 ml) 中。在劇烈攪拌的情況下，在室溫，以相對于[Ru"(acac)2(2,2'-bpy)]溶液的 小部分加入在二氯甲烷(IO ml)中的二茂鐵六氟磷酸鹽(ferrocenium hexafluorophosphate)(54.6 mg， 0.165 mmol)溶液。幾分鐘后，溶液的顏色 從深綠色變?yōu)槲⒓t色。在進一步攪拌10分鐘以后，將溶液過濾，并且加 入乙醚(60ml)，通過離心收集沉淀，并且用乙醚清洗。(收率50%)。Cl的合成
在攪拌的情況下，在室溫，將丙酮(15ml)中的[Bii4N]CI(463 mg， 1.667 mmol)溶液逐滴加入到20 ml丙酮中的[Ru"(acac)2(2,2，-bpy)](PF6) (200 mg， 0.333 mmol)溶液中。將紫色沉淀通過過濾收集，用丙酮和乙醚清洗，然后 空氣干燥。將沉淀再溶解到乙腈中，并且通過結晶來純化，所述結晶是通 過使用乙醚的蒸汽擴散進行的。(收率=50%)的合成
<formula>formula see original document page 31</formula>在氬氣下，將40 ml乙醇中的Ru(acac)3 (200 mg， 0.5 mmol)和 py-4-COOH (124 mg， 1 mmol)的紅色混合物與幾片海綿狀Zn/Hg汞齊回流 4小時。將得到的深紫色混合物冷卻，并且用鑷子移除鋅汞合金。將暗棕 色的沉淀通過過濾收集，并且用0.1MHC1、水以及隨后的乙醚清洗。(粗 產物的收率二250mg， 91%，含有Zn汞齊)的合成
將Ru"(acac)2(py-4-COOH)2(250 mg)溶解在0.1 M NH3中，然后過濾。 將紅棕色濾液在空氣中攪拌過夜，以得到紫色溶液。將該溶液過濾，然后 蒸干。收集紫色沉淀，用丙酮和乙醚清洗，然后空氣干燥。收率=50%; 相對于在pH-8(磷酸鹽緩沖液)的NHE， EQ=0.12 V。的合成
<formula>formula see original document page 32</formula>化學式C3QH18CI2K2N406Ru2 精確質量779.89
在氬氣下，將乙醇(25 ml)中的煙酸(92.3 mg ， 0.75 mmol)和 Ru(5-Cl-Quin)3 (200 mg， 0.37 mmol)的溶液與幾片鋅汞合金回流24小時。 通過過濾離析得到的淺棕色固體，用乙醇清洗，并且空氣干燥。將該棕色 固體懸浮在水(15ml)中，并且加入KOH(0.2g， 3.57mmol)。在攪拌0.5 h 以后，將得到的暗棕色溶液過濾，并且旋轉蒸干。用乙醇清洗殘余物，并 且通過溶解到1:1的甲醇/乙醇中然后將其緩慢蒸發(fā)至約為它的最初體積的 約50°/。而再結晶。將固體在60。C真空干燥。收率57。/。(150mg，0.21 mmol)。 MS:m/z634 (M+l)。相對于在pH:8(磷酸鹽緩沖液)的NHE， EG=0.097V。(PF6)的合成
<formula>formula see original document page 32</formula>
化學式C18H37F9N405PRuS 分子量724.60
元素分析:C, 29.84; HI 5.15; F, 23.60; N, 7.73; O， 11.04; P, 4.27; Ru， 13.95; S, 4.43
將10 ml乙醇中的順式-[Rum(Tet-Me6)Cl2] (PF6) (100 mg， 0.18 mmol) 和Li(acac) (40 mg， 0.36 mmol)回流過夜。將得到的棕色溶液冷卻，然后 過濾。將濾液濃縮至約lml，加入乙醚，并且將棕色沉淀過濾，用乙醚清 洗，然后空氣干燥。收率85。/。。對于RuCnH37N402PF6所計算的C， 35.48%; H， 6.48%; N， 9.73%:實測C， 35.39%; H， 6.37%; N， 9.60%(PF6)(CF3S03)的合成
將AgCF3S03(67 mg ， 0.26 mmol)加入到10 ml丙酮中的 [RuH(Tet-Me6)(acac)](PF6) (125 mg， 0.22 mmol)的溶液中。棕色溶液立即變 為藍色，并且將該混合物在黑暗中攪拌30分鐘。通過離心移除溶液中的 銀金屬，然后將該藍色溶液緩慢加入到約80ml乙醚中。將藍色沉淀通過 過濾收集，用乙醚清洗，然后在真空中干燥過夜。收率=70%;相對于在 pm(磷酸鹽緩沖液)的NHE， EQ=0.18V。 Cl2的合成
向MeOH中的[Ru(Me6-tet)(acac)](PF6)(CF3S03)的溶液中加入 [n-Bu4N]Cl，產生[Ru(Me6-tet)(acac)]Cl2的沉淀，將所述沉淀過濾，并且在 真空中干燥過夜。Cl的合成
將乙酰丙酮化物(l ml)加入到水(20 ml)和醇(10 ml)中的[Os"(bipy)2Cl2] (0.25 g， 0.44mmol)中，并且在過量CaCO3(0.5 g)的存在下，將混合物回流 6h。將揮發(fā)物蒸發(fā)掉，并且用氯仿(30ml)萃取殘余物。將深紅棕色的氯仿 萃取液過濾，并且用無水Na2S04干燥，蒸發(fā)至小的體積，并且在加入乙 醚時，[Os"(bpy)2(acac)Cl]作為暗橙棕色片狀體結晶。然后將這些過濾并空 氣干燥。收率63% (0.176 g， 0.28mmol)。 MS: m/z 603 (M)。相對于在 pH二8(磷酸鹽緩沖液)的NHE， ED=0.31V。Cl的合成<formula>formula see original document page 34</formula>
化學式C25H23ClN402Ru 精確質量548.06
將乙酰丙酮化物(l ml， 9.70 mmol)加入到懸浮在水(20 ml)和醇(20 ml) 中的[Ru(bipy)2Cy(300 mg， 0.62mmol)中，并且在過量CaC03的存在下，
將混合物回流6小時。過濾混合物，并且將濾液旋轉蒸發(fā)干燥。將殘余物
用氯仿(30ml)萃取，并且過濾。將濾液在MgS04上干燥，然后蒸發(fā)至約5 ml。在加入乙醚時，[RuII(bipy)2(acac)]Cl作為暗棕色結晶固體緩慢結晶。 在真空中，在60。C干燥固體。收率70%(236mg， 0.43 mmol)。 MS: m/z 513 (M)。相對于在pl^8(磷酸鹽緩沖液)的NHE， EG=0.71 V。
Ru11(bipy)20x的合成<formula>formula see original document page 35</formula>
將Ru(bipy)2Cl2(0.2g， 0.41 mmol)懸浮在水(20 ml)和乙醇(IO ml)中，并 且將混合物煮沸2分鐘。加入二水合草酸鉀(52.1mg， 0.41mmo1)，并且將 混合物在回流下加熱2h，產生淺紅色溶液。在冷卻時，得到綠色結晶固 體，將所述綠色結晶固體過濾，用水和乙醚清洗，并且空氣干燥。收率 94%， 0.19 g。 MS: m/z 503.1 (M)。相對于在乙腈中的0.1 M TBHP中的 Fc/Fc+， E0=32.5mV。
K[RuIII(ox)2(py-3-COOH)2]的合成
<formula>formula see original document page 36</formula>將在50 ml H20中的K3[Ru(Ox)3] (500 mg， 1.0 mmol)和 py-3-COOH (255 mg， 2.1 mmol)的溶液在空氣中回流過夜。將產生的棕色溶液冷卻， 然后過濾。將濾液濃縮至約lml，加入丙酮，將淺棕色沉淀過濾，并且用 丙酮和乙醚清洗。使粗產物從H20/丙酮再結晶3次。收率70%。 ESI-MS: m/z = 602 (M+K)+。相對于在磷酸鹽緩沖液(pH 8.05)中的NHE， Rura/I1的 E1/2=0.16V。的制備
在二甲亞砜(5 mL)中回流三水合三氯化釕(l.O g) 5分鐘。在真空中將體 積減少至一半，加入丙酮(20mL)，產生黃色沉淀。過濾掉分離的黃色配合 物，用丙酮和醚清洗，并且真空干燥。的制備
在攪拌的情況下，向無水乙醇(25mL)中的Ru"(DMSO)4Cl2(1.0g， 2.1 mmol)的混合物中加入L(0.80 g， 4.7 mmol)(L = 1,4，7-三甲基-1,4，7-三氮雜 環(huán)壬烷)。將該懸浮液加熱到6(TC達1 h，直到得到澄清的深紅棕色溶液， 然后將其回流2h。通過旋轉蒸發(fā)，在減壓下移除溶劑。用濃HC1處理橙 紅色的殘余物，并且在空氣的存在下，將其在回流下加熱30分鐘。通過
過濾收集橙色的微晶固體，并且用水、乙醇和乙醚清洗，以及空氣干燥。PF6'H20的制備
在環(huán)境溫度，在攪拌的情況下，將固體RiAL)Cl3(2.0g; 5.0mmo1)以 少量加入到水(60 mL)中的乙酰丙酮鈉(sodium 2,4-pentanedionate) (acac) (3.0 g; 24mmol)的溶液中。將混合物攪拌3.5 h，直至得到澄清的紅色溶 液。添加H2O(5mL)中的NaPF6(2.0g)溶液，并且冷卻至(TC，引發(fā)橙色微 晶的沉淀，將其通過過濾收集，用乙醚清洗，并且空氣干燥。PF6的制備
在10片Zn汞齊的存在下，將在無水乙醇/吡啶(5mL)(4:l， v/v)中含有 [Ru"'(L)(acac)(OH)]PF6 (105 mg， 0.20 mmol)的溶液在氬氣氣氛下加熱回流 4h。冷卻至環(huán)境溫度以后，通過過濾收集紅色的微晶沉淀，用乙醚清洗， 并且空氣干燥。將該產物從丙酮/乙醚再結晶。收率(94mg， 79%)ESI/MS (正模式)m/z = 451， [M]+。相對于在CH3CN中的0.1MTBAH中的Fc佛， Ru薩'的E1/2=-0.18 V。(N03)2的制備
<formula>formula see original document page 37</formula> 將丙酮(l mL)中的AgCF3S03 (42 mg， 0.16 mmol)的溶液緩慢加入到包 含[Ru"(Me3-TACN)(acac)(py)]PF6 (90 mg， 0.15 mmol)的橙色丙酮溶液(3 mL) 中。攪拌5分鐘以后，加入固體[n-Bu4N]NO3 (304 mg， 1 mmol)，并且將
紫色沉淀過濾，用丙酮然后用乙醚清洗。將產物從甲醇/乙醚再結晶。收率
(64mg， 87%) ESI/MS (正模式)m/z = 451.0， [M]+; 225.4， [M產。相對于 在pH 8.05磷酸鹽緩沖溶液中的NHE， Rum/I1的EQ=0.2 V。
在氬氣下，將30 ml乙醇中的Ru(acac)3(200 mg， 0.5 mmol)禾口 4,4，-(COOH)2-2,2，-bpy(122 mg， 0.5 mmol)的紅色混合物與幾片海綿狀 Zn/Hg汞齊一起回流過夜。冷卻產生的棕色混合物，并且用鑷子移除鋅汞 合金。收集棕色沉淀，并且用乙醇和乙醚清洗。然后將棕色固體溶解在50 ml的0.1MNH3中，過濾并且扎起空氣中攪拌過夜，以產生紫紅色溶液。 將溶液過濾并且蒸干。收集紫色沉淀，并且用丙酮和乙醚清洗，然后空氣 干燥。收率45%。相對于在pH二8(磷酸鹽緩沖液)的NHE， EQ=0.21 V。
電化學試驗
使用循環(huán)伏安法(PdR)測試介導
為了測試以還原形式合成的介體，即， [Rum(5-Cl-Quin)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]和[Os"(2,2，-bpy)2(acac)]Cl，進行 了 一組實驗，其中，在 NADH 的存在下，將 Ru2+[Ru"(5-Cl-Quin)2(py-3-COOH)(py-3-C00)] 或 Os,Os"(2,2，-bpy)2(acac)]Cl電化學氧化。假單胞氧還蛋白還原酶(PdR)(介 導酶)的加入導致電催化，這由氧化電流的大大增加以及反向掃描中的還原 峰的缺乏所識別。
使用循環(huán)伏安法的用于測試介導的溶液制備(PdR)
通過以下方法制備一系列假單胞氧還蛋白還原酶(Biocatalysts Ltd.(生 物催化劑公司)，威爾士)溶液將PdR溶解到制成0.1 M的pH 9的Trizma 預調(Pre-set)晶體(西格瑪-奧德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd》 中，以得到10 mg/mL的儲液，并且隨后稀釋所述儲液，以得到具有不同
PdR濃度的溶液。然后將這些溶液與含有介體的NADH (西格瑪-奧德里奇 有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd))或TNADH (Oriental Yeast公司，日 本)溶液l:l(v:v)混合。測試的全部最終溶液具有1 mM介體、5 mM TNADH(或10 mMNADH)，以及不同濃度的PdR(5mg ml-1至0.1 mg mr1)。
使用循環(huán)伏安法的用于測試介體性的溶液制備(GOx) 通過以下方法制備一系列葡糖氧化酶(GOx)(西格瑪-奧德里奇有限公 司(Sigma-Aldrich Company Ltd))溶液將GOx溶解到制成0.1 M的pH 7 的Trizma 預調晶體(西格瑪-奧德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd))中，以得到10 mg/mL的儲液，并且隨后稀釋所述儲液，以得到具有 不同GOx濃度的溶液。然后將這些溶液與含有介體的NADH (西格瑪-奧德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd))或TNADH (Oriental Yeast 公司，日本)溶液l:l(v:v)混合。測試的全部最終溶液具有1 mM介體、5 mM TNADH(或10 mM NADH)，以及不同濃度的GOx(2.5mg ml—1至0.5 mg
mr')。
實驗1
為了測定新介體[Ru(II)(py-3-COOH)(NH3)5](PF6)2的電化學響應，將10 mM的介體溶液(使用非-脫氧水制備)放置到標準電極上，并且使用循環(huán)伏 安法測試。
結果顯示于圖l中，所述圖1是在-0.35 V和0.5V之間循環(huán)的情況下， 以100 mVi1的掃描速率在標準電極上測試的10mM介體溶液(氧化的)的 循環(huán)伏安圖。伏安圖清楚地顯示了介體的氧化以及隨后的還原的特定峰， 所述特定峰具有相對小的峰距。
實驗2
為了測試新介體[Ru"(py-3-COOH)(NH3)5](PF6)2的還原形式對于被溶 解氧的直接氧化的穩(wěn)定性，通過在無氧和需氧這兩種條件中重復氧化(使用 相同的溶液)來測試傳感器。
圖2顯示在手套箱(方形)和開放的空氣(圓圈)中測試傳感器時得到的
重復氧化(相對于Ag/AgCl，在+0.25V)的結果。
結果顯示，新介體的氧化電流隨重復測試而減小-在重復氧化11次的
情況下，減小約12%，但是與Ru(NH3)6Cl2比較時，溶解的氧的效果顯著降低。
實驗3
在0.1MpH9的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，在實驗l中所述的條件 下，研究介體[Ru"(py-3-COOH)(NH3)5](PF6)2)的伏安法，以測定它是否保 持相同。循環(huán)伏安法是通過以下方法進行的使用100 mV秒"的掃描速 率(sweep rate),從0 V開始，以相對于Ag/AgCl為+0.5 V和-0.35 V的掃描 限度(sweep limit)最初在正方向上掃描。圖3顯示介體在水(含有0.1 M KC1) 和0.1 MpH9的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中的伏安圖。在類似的峰電位和 絕對電流的情況下，伏安圖非常類似。與R^+種的氧化相比，Ri^+種的 更小的還原峰表明，溶液中的種主要是Ri^+。用Ru(NH3)6a所進行的類 似的實驗產生了 Ri^/R^+氧化還原電對的峰電流為50:50比率。
實驗4
在標準電極上研究介體[Ru"(py-3-COOH)(NH3)5](PF6)2對被氧氧化的 穩(wěn)定性。在P/。?；悄懰徕c(NaTC)、 50mMMgSO4、 0.1MKC1的三羥甲 基氨基甲烷緩沖液，pH9中，制備10、 5和1 mM的新介體的溶液，然后， 以相對于Ag/AgCl為+0.25 V的電位，使用重復次數方案(repeat time pmtocol)在標準電極上測試所述溶液。結果顯示于圖4中。數據顯示，在 測試的全部的介體濃度，新介體對于被氧的氧化是穩(wěn)定的。與標準釕六胺 合物(mthenium hexamine)介體的199 nA/mM的梯度相比，新介體的校準曲 線產生了 156 nA/mM的梯度(記錄相同的電極片)。來自曲線的。/。CV(方差 系數)(2.84Q/。)與對于標準釕六胺合物所觀察到的n/。CV(方差系數)(2.81。/。)幾 乎相同。相比于釕六胺合物所觀察到的截距(72nA)，該圖的截距是95nA。
實驗5
為了測試新介體[RiApy-3-COOH)(NH3)5](PF6)2是否能夠介導對于和
來自葡糖氧化酶(GOX)的電子轉移，將等分部分的GOX加入到新介體的(部
分地由氧氧化的)溶液中。全部的其它條件如實驗3中所述。圖5顯示了在 不存在和存在GOx的情況下記錄的產生的伏安圖。數據顯示，新介體可 以介導GOx和電極之間的電子轉移。
實驗6
在裸露的傳感器(bare sensor)上通過循環(huán)伏安法研究介體 [Rum(NH3)5(py-3-COOH)](PF6)2(CF3S03)。在0.1 M三羥甲基氨基甲垸(pH 9.0)、 0.1 M KC1和1% w/v的表面活性劑(NaTC或CHAPS)中，制備50 mM 的介體溶液。該介體容易溶解產生顏色是深黃色的溶液。循環(huán)伏安法是通 過以下方法進行的使用100mV秒"的掃描速率，從0mV開始，以相對 于Ag/AgCl為+0.7 V和-0.7 V的掃描限度最初在正方向上掃描。對每一個 池進行兩次掃描，并且保存第二次掃描(圖6)。對于每一表面活性劑類型， 循環(huán)伏安圖相同。伏安圖顯示了兩個還原峰和一個氧化峰，以及在氧化波 上的另外的肩，這暗示該材料可能含有一些雜質。該峰的氧化電位比Ru 的六胺合物更正，并且將相對于Ag/AgCl為+250mV的電位選擇用于氧化 計時電流實驗。還原實驗的電位在-300mV保持不變。
使用處于0.1 M三羥甲基氨基甲垸(pH 9.0)、 5%CHAPS、 5%脫氧大 CHAP(deoxy bigCHAP)和66 mg/mL膽固醇脫氫酶(ChDH)中的此介體制 備總膽固醇傳感器。加入介體，從而產生48.3 mM的最終濃度。使用Petex 擴展膜和10 pl的解凍血漿測定傳感器響應。
在第一實驗中進行五次重復次數的測量。電流-濃度響應的斜度合理地 高，盡管截距也高。這可以表明，介體包含一些雜質(例如， 一些Ru"種)。 相對于時間的平均電流的曲線(參見圖7A-C)顯示， 一旦達到最大電流值， 響應就非常穩(wěn)定。此改善的響應穩(wěn)定性最可能地歸因于新的Ru介體的增 加的穩(wěn)定性。數據顯示，[RiANH3)5(py-3-COOH)](PF6)2(CF3S03)在總膽固 醇傳感器中起介體的作用，并且顯示，新介體容易與PdR發(fā)生電子交換。
實驗7
為了進一步研究新介體[Rum(NH3)5(py-3-COOH)](PF6)2(CF3S03)與六
胺配合物相比的明顯增加的穩(wěn)定性，使用重復次數測量進行第二實驗達更 長的時期。
以下顯示了在通常的測量時間(118秒)以及最終測量時間(202秒)的傳 感器響應的結果。響應幾乎相同，這表明，響應以及因此介體是非常穩(wěn)定
的，這與也在圖8A至8D中示出的相對于時間的平均電流的曲線相一致。 實驗8
圖9顯示了在低的氧氣氣氛(還原形式)和空氣(氧化形式)中的介體的 外觀。低-氧溶液是通過首先在容器中煮沸水，隨后將其密封，然后用N2 吹掃20分鐘來制備的。然后將容器用帕拉玢膜(parafilm)密封，并且轉移 到惰性氣氛的手套箱(<9 ppm 02)中。 一旦進入內部，就用脫氧水制成0.1 M 的KC1，隨后將其加入到新介體中，以將其制成10mM的溶液。溶液呈現 紅色(下面的左圖)，而使用充氧水制成的溶液(并且靜置4小時)呈現黃色 (右圖)。
介體的不同氧化還原狀態(tài)具有不同的顏色，這可以用于光譜測量。 本發(fā)明的配合物具有低的正或負電荷(在pH7-10下，+2至-1)，并且與
分析混合物和電極形成不太強的配合物，或根本不形成配合物，從而導致 了更加可靠、穩(wěn)定和可重現的電化學過程。另外，還應當注意的是，保證 沒有釕(II)種被分子氧迅速氧化。
新介體保證了酶反應不被與蛋白質、酶以及其它的帶負電荷的物質與 電極的締合相聯系的問題所復雜化。換言之，釕種能夠有效地進行意欲賦 予的工作起有效率和有效的電子轉移介體的作用。這些化合物在保持對
于[RU(NH3)6]C13所報道的介導的品質的同時，允許了對配合物上的電荷進
行選擇，以最佳地適于所使用的酶反應。
在不背離這里所述的本發(fā)明的范圍的情況下，可以進行其它的更改和 改進。
權利要求
1.式I的配合物作為氧化還原介體的用途，[M(A)x(B)y]m(Xz)n式I其中，M是釕或鋨，并且具有0、1、2、3或4的氧化態(tài)；x和n是獨立選自1至6的整數；y是選自1至5的整數；m是-5至+4的整數，并且z是-2至+1的整數；A是含有1或2個氮原子的單齒或二齒芳族配體；B是獨立選為除雜環(huán)含氮配體以外的任意適合的配體；X是任意適合的抗衡離子；其中，A任選由獨立選自下列基團的1至8個基團所取代取代或未取代的烷基，鏈烯基，或芳基-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-CN，-CO2H，-SO3H，-NHNH2，-SH，芳基，烷氧基羰基，烷基氨基羰基，二烷基氨基羰基，-OH，烷氧基，-NH2，烷基氨基，二烷基氨基，烷?；被?，芳基甲酰氨基，肼基，烷基肼基，羥氨基，烷氧基氨基，烷硫基；其中，配位原子的數量為6。
2. 根據權利要求1中所述用途，其中A是由一個或多個(:02112基團 取代的單齒配體，或任選由一個或多個C02R2基團取代的二齒或三齒配 體。
3. 根據權利要求2中所述的用途，其中將W選為H。
4. 根據權利要求1至3的任一項中所述的用途，其中A選自煙酸、異 煙酸、2，2，-聯吡啶、2,2-聯吡啶-5,5，-二羧酸、2,2-聯吡啶-4，4，-二羧酸、5-氯-8-羥基喹啉。
5. 式II的配合物作為氧化還原介體的用途，[M (A)x(B)y]m(Xz)n 式II其中，M是釕或鋨，并且具有0、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)；x和n是獨立選自1-6的整數；y是選自0-5的整數；m是-5至+4的整數，并且z是-2至+1的整數；A是二齒、三齒、四齒、五齒或六齒配體，所述配體可以是直鏈的，具有式R'RN(C2H4NR)wR1，或是環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)v、(RNC2H4)p(RNC3H6)q或[(RNC2H4)(RNC3H6)L的，其中w是1-5的整數，v是3-6的整數，p和q是l-3的整數，由此，p和q的總和為4、 5或6，并且s是2或3，并且其中R和R1是氫或甲基；B是獨立選為任意適合的配體；X是任意適合的抗衡離子；其中，B任選由獨立選自下列基團的l-8個基團所取代取代或未取代的垸基，鏈烯基，或芳基-F， -Cl， -Br， -1， -N02， -CN， -C02H， -S03H， -NHNH2， -SH，芳基，烷氧基羰基，烷基氨基羰基，二垸基氨基羰基，-OH， 烷氧基，-NH2，垸基氨基，二烷基氨基，烷?；被?，芳基甲酰氨基，肼 基，垸基肼基，羥氨基，烷氧基氨基，垸硫基； 其中，配位原子的數量為6。
6. 根據權利要求中所述的用途，A是二齒、三齒、四齒配體，其可以 是直鏈的，具有式R'RN(C2H4NR)WR'，或環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)v、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q、 [(RNC2H4)(RNC3H6)]S;其中w是l-3的整數，v是 3或4的整數，p和q是l-3的整數，由此，p和q的總和為4，并且s是 2或3;
7. 根據權利要求5中所述的用途，其中A選自1，4，7-三甲基陽l,4,7畫三 氮雜環(huán)壬垸、或1,1,4,7，10，10-六甲基三亞乙基四胺、1，2-二甲基亞乙基二 胺、或1,1,2,2-四甲基亞乙基二胺。
8. 根據權利要求1至7的任一項中所述的用途，其中B選自胺配體例 如NH3或NMe3、 CO、 CN、鹵素、以及乙酰丙酮化物(acac)、 3-溴-乙酰 丙酮化物(Bracac)、草酸、吡啶、或5-氯-8-羥基喹啉。
9. 根據前述權利要求的任一項中所述的用途，其中在將A或B選為 二齒時，所述配合物的幾何結構是/,i^及式。
10. 根據權利要求1至9的任一項中所述的用途，其中所述金屬的氧化狀態(tài)選為2+、 3+或4+。
11. 根據權利要求9中所述的用途，其中所述金屬的氧化狀態(tài)選為3+。
12. 根據權利要求1至11的任一項中所述的用途，其中對所述配體A 和B進行選擇，使得所述配合物上的總電荷選自下組+3、 +2、 +1、 0、 -1、 -2和-3。
13. 根據權利要求1至13的任一項中所述的用途，其中所述抗衡離子選自f、 Cr、 Bf、 r、 ncv、 nh4+、 nr/、 pf6-、 cf3so3-、 so42-、 cicv、OH-、 K+、 Na+、 Li+。
14. 根據權利要求13中所述的用途，其中使用抗衡離子的組合。
15. 根據權利要求1至14的任一項中所述的用途，其中所述配合物是 [Rum(NH3)5(吡啶-3-COOH)](PF6)2(CF3S03) 、 [Rum(2,4-戊二酮化物 (pentandionate))2(妣啶-3-COOH)(吡啶-3-COO)〗、[Ru"乂3-溴陽2,4-戊二酮化 物)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-C00)]、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2,2'-聯吡啶 -5,5，-(COOH)(C00)] 、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2,2，-聯吡啶 -4,4，-(COOH)(COO)]、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2,2，-聯吡啶)]Cl、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(吡啶-4-COOH)(吡啶-4-C00)]、 [Rum(5-氯-8-羥基喹啉)2(吡啶 -3-COOH)(批啶-3-C00)]、 [Ru111 (1,1，4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺)(2，4-戊二酮化物)](PF6)(CF3S03)、 [1111111(1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺)(2,4-戊二酮化物)]Cl2、 [Os"(2，2，聯吡啶)2(2，4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru(2，2，聯吡 啶)2(2,4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru"(2,2，聯吡啶)2(C204)]、 K[Ru，C204)2(吡啶 -3-COOH)2]、 [Rum(l,4,7-三甲基-l,4,7-三氮雜環(huán)壬烷)(2,4-戊二酮化物)(口比啶)](N03)2中的任何一種。
16. 根據權利要求15中所述的用途，其中所述配合物是[Rum(2,4-戊二 酮化物)2(吡啶-3-COOH)(吡啶-3-C00)]、 [Rum(l,4,7-三甲基-l,4，7-三氮雜 環(huán)壬烷)(2,4-戊二酮化物)(吡啶)](N03)2或[Rum(l,l,4,7,10,10-六甲基三亞乙 基四胺)(2，4-戊二酮化物)]Cb。
17. 根據前述權利要求的任一項中所述的用途，其中將所述氧化還原 介體用于電化學傳感器。
18. 根據權利要求中所述的用途，其中所述電化學傳感器包括微帶電極。
19. 根據權利要求18中所述的用途，其中所述電化學傳感器是電化學生物傳感器。
20. 根據權利要求19中所述的用途，其中所述電化學生物傳感器用于 檢測體液、環(huán)境樣品、食物和飲料、獸醫(yī)樣品、藥物中的分析物。
21. 根據權利要求1至16的任一項中所限定的式I或式II的釕或鋨配 合物在生物傳感器中的用途。
22. 根據權利要求21中所述的用途，其中所述配合物用在pH為6至10。
23. 根據權利要求22中所述的用途，其中所述配合物用在pH為7至9。
24. 根據權利要求21至23的任一項中所述的用途，其中所述生物傳 感器供任意相容的分析物使用。
25. 根據權利要求24中所述的用途，其中所述分析物發(fā)現于生物流體 中，并且還可以選自酶、酶底物、抗原、抗體、核酸序列、膽固醇、膽固 醇酯、脂蛋白、甘油三酯或微生物中的任何一種。
26. —種用于測量分析物的檢測系統(tǒng)，包括(a) 使包含所述分析物的樣品與包含酶和氧化還原介體的溶液接觸，所 述氧化還原介體選自根據式I或式II的含Ru或含Os的化合物的組；(b) 在引起所述酶對分析物起作用的條件下培育所述接觸的樣品； (C)使所述步驟(b)的培育樣品經受產生可測量信號變化的條件；和 (e)測量產生的信號。
27. 根據權利要求26中所述的系統(tǒng)，其中所述可測量信號是電化學、 比色、熱、阻抗測量(impedometric)、電容或光譜信號。
28. 根據權利要求27中所述的系統(tǒng)，其中所述可測量信號是使用微帶 電極測量的電化學信號。
29. 根據權利要求28中所述的系統(tǒng)，其中所述電化學信號是使用電流 檢測方法中的微帶電極檢測的。
30. —種根據式I的配合物， [M (A)x(B)y]m(Xz)n式I其中，M是釕或鋨，并且具有0、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)；x和n是獨立選自l至6的整數；y是選自l至5的整數；m是-5至+4的整數，并且z是-2至+l的整數；A是含有1或2個氮原子的單齒或二齒芳族配體；B是獨立選為除雜環(huán)含氮配體以外的任意適合的配體的一種或多種；X是任意適合的抗衡離子；其中，A任選由獨立選自下列基團的1至8個基團所取代取代或未取代的烷基，鏈烯基，或芳基-F， -Cl， -Br， -1， -N02， -CN， -C02H， -S03H， -NHNH2， -SH，芳基，烷氧基羰基，垸基氨基羰基，二烷基氨基羰基，-OH， 烷氧基，-NH2，烷基氨基，二烷基氨基，垸酰基氨基，芳基甲酰氨基，肼 基，垸基肼基，羥氨基，烷氧基氨基，垸硫基； 其中，配位原子的數量為6。
31. 根據權利要求30中所述的配合物，其中A是由一個或多個C02R2基團取代的單齒配體，或任選由一個或多個C02^基團取代的二齒或三齒配體，其中，相對于所述配位的一個或多個雜原子，所述一個或多個C02R2 基團各自處于間位。
32. 根據權利要求31中所述的配合物，其中R 選為H。
33. 根據權利要求30至32的任一項中所述的配合物，其中A選自煙 酸、異煙酸、5-羧基-煙酸、6-吡啶基-煙酸、2,2，-聯吡啶-5,5，-雙-羧酸、2,2，-聯吡啶-4，4，-雙-羧酸、2，2，-聯吡啶、1，10-菲咯啉-3，9-雙-羧酸，
34. —種根據式II的配合物，[M (A)x(B)y]m(Xz)n 式II其中，M是釕或鋨，并且具有O、 1、 2、 3或4的氧化態(tài)； x和n是獨立選自l至6的整數；y是選自0至5的整數；m是-5至+4的整數，并且Z是-2至+l的整數；A是二齒、三齒、四齒、五齒或六齒配體，其可以是直鏈的，具有式R、N(C2H4NR)wR1，或是環(huán)狀的，具有式(RNC2H4)v、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q或[(RNC2H4)(RNC3H6)]s，其中w是1至5的整數，v是3至6的整數，p和q是l至3的整數，由此，p和q的總和為4，并且s是2或3，并且其中R和R1是氫或甲基；B是獨立選為任意適合的配體；X是任意適合的抗衡離子；其中，A任選由獨立選自下列基團的l至7個基團所取代取代或未取代 的烷基，鏈烯基，或芳基-F， -Cl， -Br， -1， -N02， -CN， -C02H， -S03H， -NHNH2， -SH，芳基，垸氧基羰基，烷基氨基羰基，二垸基氨基羰基，-OH， 烷氧基，-NH2，垸基氨基，二垸基氨基，垸?；被?，芳基甲酰氨基，烷 基肼基，羥氨基，烷氧基氨基或烷硫基； 其中，配位原子的數量為6。
35. 根據權利要求34中所述的用途，其中A是二齒、三齒、四齒配體， 所述配體可以是直鏈的，具有式R'RN(C2H4NRXvR1，或是環(huán)狀的，具有式 (RNC2H4)V、 (RNC2H4)p(RNC3H6)q、 [(RNC2H4)(RNC3H6)]S;其中w是1至3 的整數，v是3或4的整數，p禾Q q是1至3的整數，由此，p和q的總和 為4，并且s是2或3;
36. 根據權利要求35中所述的配合物，其中A選自1，4,7-三甲基-1，4,7-三氮雜環(huán)壬烷，或U,4，7，10,10-六甲基三亞乙基四胺，1,2-二甲基亞乙基 二胺，或l,l，2,2-四甲基亞乙基二胺。
37. 根據權利要求30至36的任一項中所述的配合物，其中B選自胺 配體例如NH3; CO; CN;鹵素，和乙酰丙酮化物(acac)， 3-溴-乙酰丙酮 化物(Bracac)，草酸，草酸，或5-氯-8-羥基喹啉。
38. 根據權利要求30至37的任一項中所述的配合物，其中當將A或 B選為二齒時，所述配合物的幾何結構是/,^及式。
39. 根據權利要求30至38的任一項中所述的配合物，其中所述金屬 的氧化態(tài)選為2+或3+。
40. 根據權利要求30至39的任一項中所述的配合物，其中所述金屬 的氧化態(tài)選為3+。
41. 根據權利要求40中所述的配合物，其中對所述配體A和B進行 選擇，使得所述配合物上的總電荷選自下組+2、 +1、 0、 -1、 -2和-3。
42. 根據權利要求30至41的任一項中所述的配合物，其中所述抗衡 離子選自F、 Cr、 Br—、 1—、 NO" NH4+、 NR4+、 PF6\ CF3S03-、 S042—、 C1(V、 OH-、 K+、 Na+、 Li+。
43. 根據權利要求42中所述的配合物，其中使用抗衡離子的組合。
44. 根據權利要求30至43的任一項中所述的配合物，其中所述配合 物是[Rum(NH3)5(吡啶-3-COOH)](PF6)2(CF3S03)、 [Ru，2，4-戊二酮化物)2(吡 啶-3-COOHX吡啶-3-COO)] 、 [Rum(3-溴-2，4-戊二酮化物)2(吡啶 -3-COOH)(吡啶-3-COO)] 、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2,2，-聯吡啶 -5,5，-(COOH)(COO)] 、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2，2，-聯吡啶 -4,4，-(COOH)(COO)]、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(2,2，-聯吡啶)]Cl、 [Rum(2,4-戊二酮化物)2(吡啶-4-COOH)(吡啶-4-C00)]、 [Rum(5-氯-8-羥基喹啉)2(吡啶 -3-COOH)(吡啶-3-C00)]、 [Rum(l,l,4，7,10,10-六甲基三亞乙基四胺)(2,4-戊 二酮化物)](PF6)(CF3S03)、 [Rum(U,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺)(2,4-戊 二酮化物)]Cb、 [Os"(2，2，聯吡啶)2(2，4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru(2,2，聯吡 啶)2(2,4-戊二酮化物)]Cl、 [Ru11 (2,2，聯吡啶)2((3204)]、 K[Rum(C204)2(吡啶 -3-COOH)2]、 [Rum(l,4,7-三甲基-l,4,7-三氮雜環(huán)壬垸)(2,4-戊二酮化物)(吡啶)](N03)2。
全文摘要
本申請涉及根據如這里所述的式(I)或(II)的配合物，以及它們在電化學生物傳感器中作為氧化還原介體的用途。
文檔編號C07F15/02GK101360755SQ200680048541
公開日2009年2月4日 申請日期2006年12月21日 優(yōu)先權日2005年12月21日
發(fā)明者休·奧利弗·艾倫·希爾, 克里斯托弗·保羅·紐曼, 勞太褚, 洛特·洛克·翁 申請人:牛津生物傳感器有限公司