專利名稱：放射性同位素標(biāo)記的化合物文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測各化合物的一種放射性同位素標(biāo)記的化合物文庫，制備該文庫的方法，從該文庫選擇具有所需特征的候選化合物和在同時(shí)或后續(xù)研究中檢測它們的方法，及該文庫在化合物選擇和檢測中的用途；更具體說，本發(fā)明涉及用于檢測個(gè)別化合物的一種用AMS(加速器質(zhì)譜)活性的放射性同位素標(biāo)記的化合物文庫，制備該文庫的方法，從該文庫選擇具有所需特征的候選化合物和用AMS檢測它們的方法，和該文庫在化合物選擇、特別是藥物篩選中的用途；以及提供化合物體內(nèi)代謝特征的AMS檢測。
背景技術(shù)：
制藥和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程，涉及許多候選藥物的初步選擇后大量的不同工作，I期研究需要擴(kuò)大藥物產(chǎn)量、臨床前毒理學(xué)研究、GMP制備、動(dòng)物吸收、擴(kuò)散、代謝、排泄(ADME)研究等。進(jìn)入2期試驗(yàn)前，因?yàn)樗幬飫?dòng)力學(xué)(PK)、藥效學(xué)或毒性問題多至每三種藥物中的一種將被淘汰。此過程涉及到巨大的費(fèi)用，反映在藥物進(jìn)入市場時(shí)的高成本。另外，候選藥物失敗的比率高進(jìn)一步提高了成功的候選藥物進(jìn)入市場時(shí)的成本。
最近已采取了新的技術(shù)來加速藥物進(jìn)入市場，促進(jìn)候選藥物的初步選擇，希望能提高藥物試驗(yàn)的成功率。例如，現(xiàn)在可采用高通量篩檢微量候選藥物的技術(shù)進(jìn)行大量候選藥物的選擇。甚至可對用組合性化學(xué)方法獲得的含有數(shù)百或數(shù)千種同類化學(xué)物的化學(xué)文庫進(jìn)行候選藥物的篩選。組合性化學(xué)方法的另一優(yōu)點(diǎn)是可大量篩選不需要知道其結(jié)構(gòu)的化合物，文庫可提供化合物標(biāo)記形式或化合物編號的結(jié)構(gòu)信息。篩檢該文庫的大量候選藥物，然后鑒定它們和擴(kuò)大藥物產(chǎn)量準(zhǔn)備下一期試驗(yàn)。
此外，在用于顯示體內(nèi)代謝特征的體外技術(shù)中，加速器質(zhì)譜(Accelerator MassSpectrometry，AMS)逐漸代替了前者體外技術(shù)，因其顯著提高了對化合物體內(nèi)代謝的精確評估，這導(dǎo)致產(chǎn)生了人的微量給藥(microdosing)(人0期)，這是一種革命性的新概念，依賴于AMS技術(shù)的超靈敏度。
在微量給藥中，給人一種或多種痕劑量候選藥物以獲得早期ADME和PK信息。利用這種信息作為選擇合適候選藥物，選擇具有適當(dāng)PK參數(shù)的微量給藥的藥物以便進(jìn)一步給藥的過程的一部分。這種低劑量篩選的ADME研究可保證藥物不會因?yàn)榇x功能不適當(dāng)，如第一個(gè)通過、半衰期太短、生物利用度低等而在以后的開發(fā)過程中被淘汰。人的微量給藥顯著減少了1期臨床試驗(yàn)中候選藥物選擇中的費(fèi)用。
然而采用AMS方法，用常規(guī)方法初步選擇后，必須提供放射標(biāo)記的候選化合物，這需要按訂單合成放射標(biāo)記的候選藥物。雖然微量給藥意味著只需要合成微量藥物，但需要按訂單合成和放大規(guī)模是該選擇方法的瓶頸，大大增加了成本和延長了時(shí)間。因此需要促進(jìn)此階段以加速藥物發(fā)現(xiàn)過程和降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
我們最近驚奇地發(fā)現(xiàn)可提供一種包含用放射性同位素標(biāo)記的化合物的改進(jìn)文庫，用于候選化合物的選擇，并隨后通過檢驗(yàn)它們，例如檢驗(yàn)其(體內(nèi))結(jié)合部位或檢測與各文庫成員相關(guān)的體內(nèi)代謝特征，來確定各化合物的結(jié)局。這取消了在選擇階段需要按訂單進(jìn)行放射標(biāo)記所選候選藥物的要求，有效地使整個(gè)選擇程序不會因費(fèi)時(shí)的合成而停頓。而且可在非常早期刪除那些缺乏所需代謝特征的候選藥物，這顯著減少了該選擇方法的費(fèi)用消耗。
在本發(fā)明的最大范圍內(nèi)容中，提供一種化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的文庫，各化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的信息相關(guān)聯(lián)，文庫中至少有二種化合物標(biāo)記了放射性同位素，該放射性同位素的特征是AMS活性的放射性同位素。
AMS可用于有效檢測長壽同位素，靈敏度可達(dá)到ppq(即每次10-15)，可分析10-18至10-21摩爾水平的14C。AMS可對接受放射活性劑量的人體液樣品進(jìn)行放射活性的液閃計(jì)數(shù)。AMS的最重要優(yōu)點(diǎn)之一是它可在相對短的分析時(shí)間中檢測和定量極低的放射活性，需要給予人體的這個(gè)劑量低于常規(guī)要求所規(guī)定的放射活性水平。
AMS活性的放射性同位素包括可被AMS分析接受的任何同位素。AMS活性的同位素宜具有低的天然背景，如背景范圍在1×10-5％或更低至1×10-15％。AMS的靈敏度依賴于這樣的事實(shí)，即AMS活性的放射性同位素具有非常低的天然背景，如14C的背景為0.00000000001％；相比較，13C的背景是1.1％，太高。這意味著13C的摻入率必須比14C高得多。AMS也能產(chǎn)生和分析陰離子，因此優(yōu)選能形成陰離子的AMS活性的放射性同位素。優(yōu)選AMS活性放射性的同位素具有長的半衰期，超過數(shù)周至高達(dá)1000年而易于操作。優(yōu)選AMS活性的放射性同位素在AMS活性水平時(shí)無毒性，因而適合用于人體代謝研究，并優(yōu)選具有生物醫(yī)學(xué)興趣的。
設(shè)想本發(fā)明的文庫，用于在如上所述的篩選中檢測的目的，并包含直接摻入到上述化合物中的AMS活性的放射性同位素，或與作為標(biāo)記等的化合物相關(guān)聯(lián)。宜將AMS活性放射性同位素直接摻入文庫化合物中而不會分解，除非該化合物本身被降解，例如被代謝降解。因此該放射性同位素可通過不易被水解的連接鍵，或在酸性條件下等不易于切斷的連接鍵連接。
宜將放射性同位素共價(jià)連接加入化合物。AMS活性放射性同位素宜作為組成文庫化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的原子存在，作為所需的放射活性同位素被引入或取代，而不摻入小珠中或與化合物相連接的標(biāo)記中。AMS活性放射性同位素最優(yōu)選以組成環(huán)的原子或雜原子存在，宜為芳環(huán)原子或雜原子，或脂族碳鏈原子或雜原子如飽和或不飽和原子或雜原子，可以是單鍵、雙鍵或三鍵連接等。
因此放射性同位素構(gòu)成了該化合物整體的一部分。應(yīng)理解這與施加于標(biāo)記物，如承載化合物的載體如小珠，或施加于身份標(biāo)簽以提供有關(guān)身份信息，或在合成某給定化合物的一個(gè)步驟中的放射性同位素標(biāo)記不同?？稍O(shè)想在本發(fā)明文庫的放射性同位素標(biāo)記的化合物中，放射性同位素存在于標(biāo)記物或其它成分上，能從代謝切斷后復(fù)原，因而是AMS活性的同位素。
該文庫優(yōu)選包括多個(gè)式I化合物或它們的藥學(xué)上可接受的鹽 其中，每個(gè)○是不同的，是包含一種AMS活性的放射性同位素的化合物；m是放射性同位素?fù)饺氲陌俜直戎?，是在大?至1％范圍內(nèi)的分?jǐn)?shù)；和t是與化合物化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)的標(biāo)記物，其中n是0，或一個(gè)整數(shù)。
優(yōu)選m是分?jǐn)?shù)，范圍從大于0至0.1％，因而式I的各個(gè)化合物是輕度標(biāo)記(lightly labeled)的，其一部分沒有放射性同位素。不同的式I化合物可含有相同或不同的放射性同位素。任何一種式I化合物可包含存在于相同或不同的分子中相同或不同的放射性同位素。因此該文庫宜存在多種輕度標(biāo)記的化合物；或可存在多種標(biāo)記的化合物和較少量的相應(yīng)的多種完全標(biāo)記的化合物，從而可混合得到具有所需適當(dāng)％摻入率的輕度標(biāo)記的化合物。
在采取化合物樣品時(shí)，任何一種式I化合物中放射性同位素標(biāo)記化合物的比例，宜提供在AMS檢測限度范圍內(nèi)的樣品。因此放射性同位素存在的量宜在AMS檢測極限內(nèi)。本發(fā)明文庫的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)依賴于AMS技術(shù)的超靈敏度，因此放射性同位素標(biāo)記化合物文庫可用于超低量或輕度標(biāo)記的，只適合分析文庫化合物中那些可用AMS法分析它們反應(yīng)的化合物。
本文所指輕度標(biāo)記的化合物是含有AMS活性設(shè)計(jì)量的，優(yōu)選相應(yīng)于上述范圍摻入百分比量的放射性同位素。摻入百分比值是最大比活度的一種量度，其中100％摻入定義為每一個(gè)分子摻入了一個(gè)放射性同位素，就給定量的物質(zhì)而言，每個(gè)分子都有一個(gè)特定原子被其放射活性原子所替代。
摻入百分比值宜在1×10-12至0.1％范圍內(nèi)，更優(yōu)選1×10-10至0.1％。因此本發(fā)明文庫利用了AMS的分析能力和只有AMS能用于追蹤放射性同位素標(biāo)記的文庫的事實(shí)。
不可能直接產(chǎn)生摻入百分比值，但可從化合物的比活度計(jì)算。最大比活度以dpm/mmole表示，它是放射活性--每分鐘衰變--的基礎(chǔ)單位，是每分鐘發(fā)生的核衰變平均數(shù)。然而摻入百分比是一種歸一化的函數(shù)，可比較所有放射性同位素的摻入百分比，比依賴于放射性同位素(種類)的比活度術(shù)語更有說明意義。例如作為一種AMS活性放射性同位素14C在本發(fā)明文庫某化合物中存在的量在5-12、優(yōu)選7-10dpm/mmole范圍內(nèi)，例如在7.3438-9.8562(ANU蔗糖)范圍內(nèi)。另一種同位素此值則不同。
優(yōu)選用公式I確定某給定化合物的％摻入率 公式1對于任何放射性同位素(基于每個(gè)分子一個(gè)放射性同位素，相應(yīng)于摻入率100％)，公式2給出了最大比活度ln2t1/2×N]]>公式2其中l(wèi)n2是2的自然對數(shù)(＝0.6932)，t1/2是以分鐘計(jì)的放射性同位素的半衰期，N是在1mmole中放射性同位素的原子數(shù)(化合物摩爾數(shù)乘6.0225×1020)。
(Lappin，G and Garner，RC；2003，采用加速器質(zhì)譜法超靈敏檢測放射性標(biāo)記的藥物和它們的代謝產(chǎn)物；Wilson，ID編Bioanalytical Separations Handbookof Separations，第4卷，.Elsevier Science BV Amsterdam)。
公式2沒考慮放射性同位素因的半衰期隨時(shí)間(即以0時(shí)間的最大比活度計(jì)算)而降低的放射活性(dpm值)。
以下實(shí)例計(jì)算14C的最大比活度(根據(jù)一個(gè)分子一個(gè)放射性同位素)。14C的半衰期是5730年，因此在短期內(nèi)任何放射活性的衰減可以忽略不計(jì)。說明如下Bq＝Becquerel＝60dpmkBq60×103dpmkBq/mmole理論上的最大比活度(根據(jù)一個(gè)分子一個(gè)放射性同位素)mmole＝10-3moleamole＝10-18mole從公式2得到0.6932(5730×365.3×24×60)×6.0225×1020=1.385×1011dpm=2.3083×106kBQ/mmole]]>因此，14C的理論上最大比活度是2.3083GBq/mmole(根據(jù)一個(gè)分子一個(gè)放射性同位素)，這等于100％摻入。因此本發(fā)明的輕度標(biāo)記的化合物摻入百分比適宜用上述公式1測定。取比活度81.6dpm/mmole的文庫化合物(x22)為例子它是0.00136kBq/mmole。如果100％摻入＝2.3083×106kBq/mmol，那么用以上公式1，化合物x22的％摻入率是5.8×10-8％，此種非常低的摻入率正好處在AMS的靈敏度范圍內(nèi)。AMS可測定同位素的比例(此例為12C14C)。分析文庫化合物時(shí)，背景水平是1.46amole14C/mgC?；衔飜22的同位素比例是766.49amole14C/mgC(即約524倍于背景)。此靈敏度水平充分高于許多應(yīng)用如配體結(jié)合的要求。
也可以將文庫的化合物給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人。如果檢測方法采用AMS，一般人(可耐受)的放射活性劑量是7.4kBq。例如，如果文庫化合物的量為100mg，分子量為350，那么其比活度應(yīng)為7.4kBq/0.2857mM，或25.9kBq/mM。如果100％摻入＝2.3083×106kBq/mM，那么25.9kBq/mM＝0.001％摻入。
AMS活性放射性同位素可選自能用AMS檢測技術(shù)檢測的任何放射性同位素。各放射同位素在半衰期上，因而在放射活性上有所不同，某些同位素憑借其化學(xué)性質(zhì)或其放射特征能以較小量或較大量檢測而特別適合某些預(yù)想的應(yīng)用。許多原子能形成幾種不同的放射性同位素，其中一些可能適合某些放射檢測技術(shù)。另一些適合其它技術(shù)。因此該文庫宜說明其所有的放射性原子和具體同位素的性質(zhì)，以表明文庫對預(yù)計(jì)用途的適合程度。例如，129I標(biāo)記的文庫可用于AMS檢測，而131I標(biāo)記的文庫雖然活性高但其應(yīng)用可能受到限制。類似地，14C標(biāo)記的文庫可用于AMS檢測，而13C標(biāo)記的文庫可廣泛用于許多其它放射活性技術(shù)，如NMR檢測，例如WO 97/01098中所描述的那樣，但不能用于AMS分析。特別不適合的放射性同位素不能形成負(fù)離子，值得注意的是氮原子的放射性同位素。
因此本發(fā)明文庫中的化合物適合包括的AMS活性放射性同位素，宜選自氫、鈹、碳、鋁、磷、氯、鈣、鎂、鐵、硒、碘、鋇和鑭系元素、錒系元素如鈾或钚的AMS活性放射線性同位素。本發(fā)明文庫包括的化合物宜用選自適合于AMS分析的同位素作放射性同位素標(biāo)記，宜選自2H、3H、Ba的同位素、10Be、14C、17O、18O、26Mg、26Al、32Si、36Cl、41Ca、55Fe、57Fe、60Fe、53Mn、55Mn、79Se和129I、236U、239Pu的任何一種或多種，最優(yōu)選3H、14C和36CI的任何一種或多種。
在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的上述特征性化合物文庫中，AMS活性放射性同位素是14C放射性同位素；或者或其它是36Cl或3H放射性同位素。
本發(fā)明的化合物文庫宜包括以固態(tài)或液態(tài)存在的多種化合物，通常為液態(tài)或它們的混合物；如本領(lǐng)域所知那樣各化合物裝載在固相支持物上或密封小瓶等中。該化合物文庫中的化合物載體或運(yùn)載體如小珠，已加入了標(biāo)記，有利于篩選與小珠結(jié)合的化合物。或者文庫可包括從小珠脫落的無支持物的化合物，被分成單一化合物或10個(gè)到100個(gè)到1000個(gè)或更多化合物的組供篩選。固相文庫可包括裝載在小的可界定的固相支持物上的化合物，這些支持物為可從商品市場購買到的顆?；蛐≈椤⒚?xì)管、中空纖維、針頭，固體纖維等。固相支持物可以無孔或有孔、可變形或硬的、可具有方便的結(jié)構(gòu)和形狀。某些例子中，可采用磁珠或熒光珠。這些小珠直徑通常為至少10-2000微米，常為至少20-500微米，更常為至少50-250微米。
優(yōu)選所用的固相載體包括纖維素珠、可控孔徑玻璃珠、硅膠、聚苯乙烯珠，特別是用二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯珠、接枝的共聚物珠如聚乙二醇/聚苯乙烯、聚丙烯酰胺珠，膠乳珠，二甲基丙烯酰胺珠、特別是用N，N′-雙-丙烯酰-乙二胺交聯(lián)的和含有N-叔-丁氧基羰基-β-丙氨酰-N′-丙烯酰-己烷二胺的復(fù)合物，如包衣有疏水性聚合物，如交聯(lián)的聚苯乙烯或接枝有線性聚苯乙烯的氟化乙烯聚合物的玻璃顆粒，等等。
本發(fā)明的文庫中，各化合物與以上所述文庫如組合文庫領(lǐng)域共同所知的化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)連。這些化合物也可以與存在的放射性同位素的性質(zhì)和量相關(guān)連，例如，其摻入％或比活度。相關(guān)連可以是物理性相關(guān)連，例如通過含有合成信息的標(biāo)記物，或支持該化合物(可釋放的)的或與該化合物相連接的小珠或固相載體相關(guān)的合成記憶，或通過給容器或小孔編號或編索引，以定位各化合物和提供各編號或編索引化合物的化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的參考信息。使用多孔板可使化合物身份圖的繪制變得簡單。
已知有許多方法可提供化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的信息，包括標(biāo)記支持物，如用放射性同位素標(biāo)記文庫中結(jié)合了某化合物的小珠。然而設(shè)計(jì)的這類標(biāo)記物為了進(jìn)行無支持物的試驗(yàn)或讀取合成信息時(shí)應(yīng)易被切斷。應(yīng)理解本發(fā)明的獨(dú)特處在于，本發(fā)明文庫的放射性同位素是作為各文庫化合物整體的一部分而存在，不會從化合物上分解下來，例如，如果某文庫化合物不是與作為整體結(jié)構(gòu)的一部分的藥學(xué)上相容性標(biāo)記物相連，該標(biāo)記物即與該化合物呈不可逆性相關(guān)，其程度只當(dāng)該化合物本身降解時(shí)才發(fā)生降解，例如代謝性降解。因此可通過易水解的連接鍵或在酸性條件下或相似條件下易斷裂的連接鍵以外的方法，結(jié)合放射性同位素。
所提供的化合物文庫宜是適合用作高通量篩選等的化合物陣列。該陣列可包括組合化學(xué)領(lǐng)域所知的平板如微量滴定板，細(xì)胞陣列，小瓶或瓶子陣列，支持基質(zhì)或板，光纖陣列等，或可包括多個(gè)支持物或容器，如小瓶或瓶等，其中支持物或容器或化合物可用鑒定標(biāo)簽或標(biāo)記物標(biāo)記，它們鑒定化合物為化合物文庫的組成，或它們可鑒定該化合物的化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)。含有位于固相載體(如珠)上化合物的文庫，在某些情況下其制備簡易檢測精確的優(yōu)點(diǎn)在于，合成時(shí)留在反應(yīng)混合物中的未摻入的放射性同位素可簡單地通過洗滌去除，避免了使用該文庫時(shí)的任何污染，或超過上述％摻入水平。
化合物標(biāo)記物目的是譯碼該化合物的反應(yīng)史。然后可大量生產(chǎn)該產(chǎn)品。當(dāng)反應(yīng)史明確確定了其結(jié)構(gòu)時(shí)，可采用相同或類似反應(yīng)來大批量生產(chǎn)該產(chǎn)品。當(dāng)反應(yīng)史不能明確確定其結(jié)構(gòu)時(shí)，可以大批量重復(fù)該反應(yīng)史并利用所得產(chǎn)物作結(jié)構(gòu)分析。某些例子中，可能發(fā)現(xiàn)組合化學(xué)方法的系列反應(yīng)可能不是大量生產(chǎn)該產(chǎn)品的優(yōu)選方法。
本發(fā)明的文庫和方法中，標(biāo)記物可與AMS研究的化合物保持在一起或分開；可在AMS檢測之前譯碼，但優(yōu)選直到AMS結(jié)果表明已選擇其為進(jìn)一步試驗(yàn)的候選物時(shí)才譯碼。
該文庫的化合物可以任何所需量存在，特別優(yōu)選本發(fā)明文庫包括納摩爾或毫摩爾，一般是微克級(依靠AMS檢測技術(shù)的靈敏度)至摩爾或克級的小量化合物?；衔镆艘韵嗤虿煌牧看嬖?，范圍是0.1μg-10g，優(yōu)選1μg-100mg，例如10μg-10mg。這具有二種成本優(yōu)勢，因?yàn)槌Ｒ?guī)未標(biāo)記的文庫一般不便宜，同位素也不便宜，而只需要小量放射性同位素標(biāo)記化合物有助于減少該文庫的成本。在本發(fā)明的上述一優(yōu)選實(shí)施方式中，AMS活性文庫提供了一種通過采取AMS檢測技術(shù)，減少化合物文庫中各化合物用量的方法，從而降低了成本。
本發(fā)明的文庫可包括任何所需量的化合物。通常該文庫可提供20種至幾百萬種化合物。本發(fā)明的文庫宜包括5-5×106種化合物，例如20-1,000,000種，例如超過25,000種或超過50,000種化合物，例如超過200,000種化合物。特別優(yōu)選超過25,000種化合物的更大文庫，因?yàn)橛梅派錂z測技術(shù)直接從該文庫選擇化合物優(yōu)點(diǎn)是可提高待檢測化合物的數(shù)量。另一方面文庫的成本隨著該文庫化合物數(shù)量的增加而增加，因此20-25,000種化合物的較小文庫具有優(yōu)點(diǎn)。
在一實(shí)施方案中，該文庫所有的或基本上所有的化合物含有上述量的放射性同位素。這些化合物可含有相同或不同的放射性同位素，因此優(yōu)選該文庫包含的上述化合物與放射性同位素的身份，或每個(gè)文庫成員的身份的有關(guān)信息相關(guān)連，例如就AMS中需要各種類型放射性同位素的不同樣品制備技術(shù)而言，能正確進(jìn)行AMS樣品的制備。
另一實(shí)施例是一定比例的該文庫化合物含有放射性同位素。就篩檢文庫的方法而言，優(yōu)點(diǎn)可能是先選擇具有所需活性、反應(yīng)性、功能性等的候選化合物，其中，該方法包括對活性、反應(yīng)性、功能性等鑒定為陽性的那些化合物進(jìn)行第二次選擇，以本文上述和下述的微量給藥技術(shù)進(jìn)行第二次放射檢測作選擇。本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，該第二次選擇簡單地說，是選擇那些顯示最佳活性并含有放射性同位素的化合物。
宜使至少40％的化合物輕度標(biāo)記，優(yōu)選至少50％化合物輕度標(biāo)記，較優(yōu)選至少75％化合物輕度標(biāo)記，更優(yōu)選至少90％化合物輕度標(biāo)記，最優(yōu)選所有的或基本上所有的化合物輕度標(biāo)記。
本發(fā)明文庫的化合物可含有一種以上相同或不同的，優(yōu)選不同的放射性同位素。在上述微量給藥和AMS檢測方法中，化合物被體內(nèi)代謝是共同的，這確是該方法所尋求的這種代謝數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明的文庫宜包含具有隨機(jī)加入的，或在化合物的不同部分特地加入的多種放射性同位素的多種化合物，因而能夠監(jiān)測潛在活性和潛在惰性分子的代謝途徑，得到活性和惰性部份的目標(biāo)遞送部位的更全面代謝信息。
該文庫可為結(jié)構(gòu)上不同的或相似的，宜為化學(xué)或生物化學(xué)文庫。在一個(gè)實(shí)施方式中，該文庫宜包含不能生化合成的有機(jī)化合物，即化學(xué)合成法獲得的非生化化合物。在另一實(shí)施方式中，該文庫包含由單個(gè)單元，如氨基酸、肽、核酸、脂肪酸、碳水化合物等組成的生化化合物。然而，肽和寡核苷酸以外的文庫可能具有特別的優(yōu)點(diǎn)。
該文庫可以是組合文庫，包含用組合的合成或生物合成技術(shù)獲得的共同結(jié)構(gòu)的類似物；或具有適合于靶向特定反應(yīng)或機(jī)制的、共同的反應(yīng)性官能團(tuán)不相似化合物，或可以是結(jié)構(gòu)多樣性的化合物，從而提供多種結(jié)構(gòu)類型或反應(yīng)性官能團(tuán)，適合于靶向或探查未知的反應(yīng)或機(jī)理類型。
本發(fā)明的文庫宜包含多種天然產(chǎn)生的或合成的化學(xué)或生物化學(xué)生物活性分子及其同類物，分子量達(dá)1000MW的小分子?；蛘咴撐膸彀喾N較大的分子，通常是天然產(chǎn)生的或合成的生物分子及其類似物，如放射性同位素標(biāo)記的生物聚合物，包括放射性同位素標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)，如胰島素類似物、生長激素類似物、抗體等、肽、植物或基因治療產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一方面，提供一類其上結(jié)合有化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的固相載體，所述化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)連，并含有放射性同位素，該放射性同位素的特征是上述AMS活性放射性同位素。
化學(xué)文庫領(lǐng)域所知的任何適當(dāng)?shù)墓滔噍d體如上所述，優(yōu)選與其上述化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)連接。優(yōu)選的固相載體應(yīng)具有上述和下述關(guān)于本發(fā)明文庫的特征。
本發(fā)明另一方面，提供制備上述化合物文庫的方法，包括用放射性同位標(biāo)記多種化合物，每種化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)相關(guān)連接，特征是用AMS活性放射性同位素作標(biāo)記。
制備方法可以是采用該領(lǐng)域已知技術(shù)制備液相或固相、無支持或有支持的化合物文庫的方法。進(jìn)行標(biāo)記的方式宜提供上述的文庫特征。
作為任何已知的一步或多步合成方法或生物合成的一部分進(jìn)行標(biāo)記，或可作為專用的化學(xué)合成或生物合成標(biāo)記步驟對市場購買的或先前合成的化合物或其混合物進(jìn)行標(biāo)記。放射性同位素的標(biāo)記宜用該領(lǐng)域已知的標(biāo)記化合物的技術(shù)進(jìn)行。宜通過在富含放射性同位素的環(huán)境中培養(yǎng)能產(chǎn)生生物化學(xué)產(chǎn)物的微生物進(jìn)行生物合成，收獲標(biāo)記的產(chǎn)物。富含放射性同位素的環(huán)境宜含上述AMS活性放射性同位素，AMS活性放射性同位素的量宜如上所述。由于如該領(lǐng)域所知，微生物在富含同位素的環(huán)境中生長，因而生物化學(xué)組分或代謝產(chǎn)物或微生物都被標(biāo)記。
該方法宜包括輕度標(biāo)記合成的前體或中間產(chǎn)物或生物化學(xué)培養(yǎng)底物并與其它前體或中間產(chǎn)物反應(yīng)，或培養(yǎng)其中的微生物，從而在合成或生物合成產(chǎn)物中摻入放射性同位素。不可能總是控制摻入某化合物中的放射性同位素百分比，對前體、中間產(chǎn)物或培養(yǎng)底物也是如此。因此該方法宜包括標(biāo)記合成的前體或中間產(chǎn)物或生物化學(xué)培養(yǎng)底物，測定其比活度，測得所需的比活度即得到所需的摻入百分比，并與足夠量的相應(yīng)未標(biāo)記的合成前體或中間產(chǎn)物或生物化學(xué)培養(yǎng)底物相混合，再分離得到具有所需摻入百分比的勻質(zhì)產(chǎn)物。分離勻質(zhì)產(chǎn)物可通過重結(jié)晶標(biāo)記和未標(biāo)記的混合產(chǎn)物而得到。
因此可采用輕度標(biāo)記的前體或中間產(chǎn)物或生物化學(xué)培養(yǎng)底物的合成或生物合成方法，以所需的摻入百分比摻入放射性同位素。
目前可獲得進(jìn)行克級或毫克級規(guī)模訂單合成放射性同位素標(biāo)記化合物的方法和技術(shù)。將這此訂單合成方法和技術(shù)與組合技術(shù)聯(lián)合，提供組合放射性同位素合成，是技術(shù)人員技能范圍中的事。
制備組合文庫的方法是該領(lǐng)域已知的，包括平行或系列合成、裂分合并(Splitpool)或裂(Split)分和混合合成，從而將中間產(chǎn)物分別用于多種反應(yīng)，和混合用于共同反應(yīng)等等。合成可在專用的組合反應(yīng)器，如多重反應(yīng)器合成儀中進(jìn)行，或以常規(guī)方式進(jìn)行。
因此考慮放射性同位素標(biāo)記的組合方法中，核心分子可用放射性同位素標(biāo)記，宜如上所述輕度標(biāo)記，并裂分或多個(gè)樣品，使每個(gè)樣品通過已知的或隨機(jī)的、結(jié)構(gòu)化的或多樣的反應(yīng)發(fā)生組合變化，收集該反應(yīng)一個(gè)或多個(gè)階段中的衍生試劑，提供放射性同位素標(biāo)記的衍生物文庫?；蛘撸瑢⒑诵姆肿臃殖啥鄠€(gè)樣品，使每個(gè)樣品通過已知的或隨機(jī)的反應(yīng)發(fā)生組合變化，收集該反應(yīng)一個(gè)或多個(gè)階段中的優(yōu)選放射性同位素輕度標(biāo)記的衍生試劑，提供優(yōu)選的放射性同位素輕度標(biāo)記的衍生物文庫。
本發(fā)明文庫的化合物可獲自涉及本領(lǐng)域已知的中央核心分子結(jié)構(gòu)中不同的隨機(jī)位點(diǎn)的修飾，或特定位點(diǎn)修飾的反應(yīng)。例如，可溴化多環(huán)化合物，其中溴化可發(fā)生在多個(gè)位點(diǎn)，或利用能特異性溴化特定位點(diǎn)的溴化試劑，如N-溴丁二酰亞胺。大多數(shù)反應(yīng)涉及單一位點(diǎn)或同等位點(diǎn)，如二醇的兩個(gè)羥基之一。
本發(fā)明文庫的大多數(shù)化合物可獲自合成方法，這種合成至少分二個(gè)階段，其中除官能化合物用相同的連接官能團(tuán)連接外，如氨基酸和酰胺鍵，核苷酸和磷酸酯鍵，或它們的模擬化合物如氨基異硫氰酸酯和脲鍵。優(yōu)選該方法包括一系列合成，包括添加或去除化學(xué)單元，涉及修飾或?qū)胍粋€(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)的反應(yīng)，開環(huán)，閉環(huán)反應(yīng)等等?；瘜W(xué)單元可采取許多形式，天然產(chǎn)生的或合成的，如親核劑、親子劑，雙烯，烷化或?；噭?，二胺，核苷酸，氨基酸，糖，脂質(zhì)或其衍生物，有機(jī)單體，合成子和它們的組合?；蛘?，反應(yīng)可涉及導(dǎo)致烷化、?；⑾趸?、鹵化、氧化、還原、水解、取代、消除、加成等等。化合物可以是極少量是非寡聚體、寡聚體或它們的組合，其反應(yīng)史和用于適當(dāng)情況的組成可如該領(lǐng)域所知通過標(biāo)記而確定。所述非寡聚體包括各種各樣的有機(jī)分子，如雜環(huán)族化合物、芳香族化合物、脂環(huán)族化合物、脂肪族化合物和它們的組合，包括類固醇、抗生素、酶抑制劑、配體、激素、藥物、生物堿、阿片樣物質(zhì)、萜類化合物、卟啉、毒素、催化劑及它們的組合。寡聚體包括寡肽、寡核苷酸、寡糖、聚脂、聚酯、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚醚、聚(磷衍生物)如磷酸鹽，膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、亞磷酸鹽、亞磷酰胺等；聚(硫衍生物)如砜、磺酸鹽、亞硫酸鹽、磺酰胺、亞磺酰胺等；對于磷和硫衍生物，所示雜原子大多數(shù)與C、H、N、O、或S連接，及它們的組合。
已知的組合合成方法允許每個(gè)階段的反應(yīng)可有變化，取決于涉及的試劑和條件的選擇。因此，對于氨基酸，涉及多達(dá)20種氨基酸，采用天然編碼的氨基酸外。如希望采用其它氨基酸，有非常廣泛的選擇。如D-氨基酸、具有α位氨基以外氨基的氨基酸、側(cè)鏈具有不同取代基或氨基具有不同取代基的氨基酸等。對于不同的核酸，DNA或RNA可用4種天然的核苷酸，如果不選用這4種特定核苷酸，可得到多得多數(shù)目的核酸。對于糖和脂，有非常多的不同化合物，各種取代可進(jìn)一步增加此類化合物，合成時(shí)可利用所有這些化合物。對于各種有機(jī)化合物，選擇如天文數(shù)字一樣大。此外，可用模擬的類似物，尿素、氨基甲酸乙酯、羰基亞甲基基團(tuán)等替代肽鍵，各種有機(jī)和無機(jī)基團(tuán)可替代磷酸酯鍵，氮和硫可替代醚鍵中的氧，反之亦然。
本發(fā)明的文庫可通過采用所希望生產(chǎn)的產(chǎn)物具有性質(zhì)不同的基團(tuán)的合成策略來獲得。因此該策略要考慮通過反應(yīng)階段來改變產(chǎn)物的性質(zhì)的能力，同時(shí)保留前階段的結(jié)果并預(yù)計(jì)到下階段的需要。對于同一家族的各種單元，如核苷酸、氨基酸和糖類，該合成策略相對而言已完善建立，常用的常規(guī)化學(xué)物質(zhì)也可購買到。因此，對于合成核苷酸，可采用亞磷酰胺酸酯或亞磷酸酯化學(xué)；對于寡肽，可采用Fmoc或Boc化學(xué)采用常規(guī)的保護(hù)基團(tuán)。對于糖類，該策略不是很常規(guī)，但合成多糖所需的大量保護(hù)基團(tuán)，反應(yīng)性官能基團(tuán)和反應(yīng)條件業(yè)已建立。對于其它類型的化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)注意各單元的性質(zhì)，合成機(jī)會或?qū)⒅?，或?qū)⑦m當(dāng)設(shè)計(jì)。
某些例子中，本發(fā)明文庫可包括在合成的相同或不同階段導(dǎo)入而含有相同或不同嵌段的化合物。例如，在合成時(shí)希望導(dǎo)入含有共同的肽功能單元，如纖連蛋白結(jié)合單元(RGDS)、多糖如Lex，有機(jī)基團(tuán)如內(nèi)酰胺、內(nèi)酯、苯環(huán)、鏈烯基團(tuán)、二醇、硫醚基團(tuán)等。以這種方式可獲得其中引入了變化的分子。這種情況可能只涉及具有多種選擇的很少幾個(gè)階段，這種階段相對于特定的官能團(tuán)實(shí)體可生產(chǎn)大量產(chǎn)品。當(dāng)對已知具有所需特征的核心分子或單元相關(guān)的大量衍生物感興趣時(shí)，這種方法可能有特殊的應(yīng)用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的文庫可通過批量合成一些化合物來獲得，這些化合物可在組合合成中制備。舉個(gè)極端例子，例如合成可能涉及空間障礙、電荷和/或偶極相互反應(yīng)，或者涉及反應(yīng)通路等，可優(yōu)化反應(yīng)條件提高用別的方法不可能形成的或只能低產(chǎn)量形成的化合物的產(chǎn)量。以這種方式，可以改變組合合成時(shí)的反應(yīng)條件，包括溶劑、溫度、時(shí)間、濃度等的不同。此外，可采用分批合成，提供特定產(chǎn)物比組合合成高得多的濃度，以發(fā)展能特征鑒定化合物活性的試驗(yàn)方法。
該方法宜包括合成摻入有痕量水平14C度放射性同位素輕度標(biāo)記前體的一種或混合的液相/固相輕度標(biāo)記文庫。所述前體宜是核心物質(zhì)標(biāo)記而非取代基標(biāo)記的，例如輕度環(huán)標(biāo)記的苯甲酸。
該方法優(yōu)選包括2-6組分縮合，取代或上述反應(yīng)，例如4組分的縮合，如Ugi反立((a)Cao，X；Moran，EJ；Siev，D；Lio，A；Ohashi，C；Mjalli，AMM；Bioorg &Med Chem Lett.，1995，5；2953-2958和(b)Nakamura，M；Inoue，J；Yamada，T；Bioorg & Med Chem Lett.，2000，10；2807-2810)。這使羧酸、胺、醛和異氰化物縮合形成取代的α(酰氨基)酰胺。方案1和2中，可用相同或不同的AMS活性放射性同位素同位素輕度標(biāo)記4種組分的一種或多種。
方案1對于固相文庫，宜采用固相載體支持的前體，如胺(方案2)
方案2可在代表性文庫成員上采用未標(biāo)記的(‘冷的’)前體，如苯甲酸進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明不能合成含有苯甲醛的作為砌塊的文庫成員，這些可從該文庫去。
如上所述可在富含AMS活性放射性同位素的環(huán)境中培養(yǎng)微生物來方便地制備生物化學(xué)文庫。已知的技術(shù)包括存在標(biāo)記的糖和鹽時(shí)，或標(biāo)記的甲醇，或標(biāo)記的海藻裂解物時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌或酵母菌，在標(biāo)記的CO2下向光性培養(yǎng)海藻，在標(biāo)記的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞等。收集微生物組分作為輕度標(biāo)記的前體或文庫化合物，如氨基酸、脂肪酸、糖、核酸等。
宜將微生物培養(yǎng)在放射性同位素輕度標(biāo)記的培養(yǎng)液中，如14C葡萄糖中，并鼓勵(lì)突變形成突變細(xì)菌，接種和培養(yǎng)形成菌落，產(chǎn)生同位素標(biāo)記的次級代謝產(chǎn)物，收集該代謝產(chǎn)物提供本發(fā)明的文庫。所謂收集是中斷培養(yǎng)并裂解細(xì)菌，或提取分泌的代謝產(chǎn)物。
可在上述該領(lǐng)域已知的文庫通常采用的支持物載體上提供本發(fā)明的文庫，它們易于混合、分離并作為后續(xù)合成的固體底物。取決于合成的性質(zhì)，可用各種方法使小珠官能化，使起始反應(yīng)物能與之結(jié)合。這種結(jié)合可通過穩(wěn)定的連接鍵，如酯鍵、酰胺鍵、胺鍵、醚鍵，或通過硫、硅或碳原子連接，取決于是否希望能夠從小珠上取下產(chǎn)物。方便地，連接小珠的鍵可以是永久性的，但小珠與產(chǎn)物之間的連接接頭可以是表1所舉例的可切斷的?？刹捎枚N或多種不同的連接鍵而使標(biāo)記物和/或產(chǎn)物區(qū)別性釋放。
取決于與顆粒相結(jié)合的連接基團(tuán)的性質(zhì)，小珠上的反應(yīng)官能基團(tuán)可能是插入單鍵或雙鍵連接方式所不需要的，如用卡賓和氮賓或其它高反應(yīng)物質(zhì)可取得的那樣。此時(shí)在連接基團(tuán)中可采用可切割連接鍵，將產(chǎn)物或標(biāo)記連接于小珠上。
理想地，當(dāng)產(chǎn)物是永久性連接時(shí)，可延長與小珠的連接臂使小珠不會空間干擾篩選時(shí)產(chǎn)物的結(jié)合?？刹捎酶鞣N連接鍵，特別是親水性連接，如聚乙烯氧鍵、糖鍵、聚醇、酯、酰胺鍵，它們的組合等。
小珠上存在的官能基團(tuán)可包括，羥基、羧基、鹵代亞胺基、氨基、巰基、活性鹵素(CI或Br)或擬鹵素(如-CF3、CN等)、羰基、甲硅烷基、甲苯磺?；⒓谆酋；?、對溴苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。選擇官能基時(shí)，應(yīng)作某種考慮，即鑒定劑常可結(jié)合在小珠上?？紤]相同或不同的官能基是否應(yīng)與產(chǎn)物和鑒定劑相連接，以及二種功能基是否適當(dāng)與產(chǎn)物或鑒定劑結(jié)合階段和標(biāo)記脫落階段相容。對產(chǎn)物可采用不同的連接基團(tuán)，從而可選擇性釋放特定量的產(chǎn)物。某些例子中，所述顆?？删哂惺鼙Ｗo(hù)的官能團(tuán)，在每一階段前可部分或全部去保護(hù)，并在以后可重新保護(hù)。例如，多肽合成中氨基可用芐酯基保護(hù)，羥基用芐醚保護(hù)。
可從文庫化合物中釋放出標(biāo)記物，然后檢測，例如與能檢測到的分子反應(yīng)。這種標(biāo)記物可以非常簡單，具有與文庫化合物連接的相同官能團(tuán)以便檢測。例如，通過連接于羥基羧基，可以釋放羥基然后可用能夠檢測到的分子酯化或醚化。例如在二元模式中采用氟烷或氯烷基的組合，氟烷和/或氯烷基的數(shù)目可確定選擇，而碳原子數(shù)目表明階段。本發(fā)明的文庫宜包括具有可脫離標(biāo)記物的化合物，對此該領(lǐng)域知道有許多官能團(tuán)和反應(yīng)物質(zhì)。方便地話，可采用醚類，其中取代的芐基醚或其衍生物，如二苯甲基醚、2′3-二氫化茚基醚等可用酸性或溫和的還原條件切斷?；蛘撸衫忙?消除法，此時(shí)溫和的堿性條件即可釋放產(chǎn)物。可采用乙縮醛，包括其硫代同類物，溫和的酸性條件，特別是存在捕獲的羰基化合物時(shí)即可起作用。通過組合甲醛、HCl和醇，形成α-氯醚。然后可與小珠上的羥基偶聯(lián)形成乙縮醛?？刹捎酶鞣N光不穩(wěn)定的連接鍵，如鄰-硝基芐基、7-硝基二氫化茚基、2-硝基二苯甲基醚或酯等。酯和酰胺可作為接頭，與環(huán)化酐形成半酸酯或酰胺鍵，然后利用偶聯(lián)試劑如碳二亞胺與小珠上的羥基或氨基反應(yīng)?？刹捎秒淖鳛榻宇^，使該肽序列經(jīng)受能識別特定序列的酶水解?？衫锰妓嵫苌锶绻鈿?、碳酰二咪唑等和溫和的堿制備碳酸酯和氨基甲酸酯。對于碳酸酯，可用酸、堿或強(qiáng)還原劑，如LiAIH4切斷此連接鍵。
本發(fā)明另一方面提供一種試劑盒，用本發(fā)明的方法來制備上述本發(fā)明的文庫，該試劑盒裝有一套或多套多種分開的反應(yīng)試劑，和任選的一定量的一種或多種待與各套試劑反應(yīng)的共同反應(yīng)劑，各反應(yīng)劑的特征是均含有與結(jié)構(gòu)或身份信息相關(guān)的可鑒別性組份，并具有至少一種共同的官能基團(tuán)，其中至少一套或一種共同的反應(yīng)劑用上述AMS活性放射性同位素標(biāo)記。
該試劑盒在進(jìn)行文庫合成時(shí)可提供用作標(biāo)記物的各種試劑。用作標(biāo)記物的試劑可包括至少4種，常為5種不同的化合物，裝在分開的容器中，較常至少10種不超過100種，更常不超過36種不同分裝的有機(jī)化合物。對于二元檢測，其檢測方式對有關(guān)分析的化合物是共同的，因此可以是檢測共同的生色基團(tuán)、共同的原子等。在預(yù)先制備每種鑒定劑的情況下，每種鑒定劑的特征是含有一種可鑒別性組份和基團(tuán)，其表明的選擇和階段可通過物理測量方法確定，或所有的化合物都含有至少一種共同的官能團(tuán)。
或者，該試劑盒可提供組合后能產(chǎn)生各種鑒定劑或標(biāo)記物的反應(yīng)試劑。此反應(yīng)試劑可包括多種不同的第一官能性化合物，常為雙官能有機(jī)化合物，常為4種或更多種，通常合成的每一階段一種，該官能性有機(jī)化合物含有相同的官能團(tuán)并可鑒別至少一種可測定的特征。此外，該試劑盒可裝有至少一種，通過至少二種第二有機(jī)化合物，其能與上述官能性有機(jī)化合物的官能團(tuán)反應(yīng)，并能形成可鑒別各種第二有機(jī)化合物量的混合物。例如，這種試劑可包括二醇、氨基酸、或乙醇酸，此時(shí)存在的氟或氯原子數(shù)目可鑒別各種雙官能化合物以確定反應(yīng)階段，所述試劑包括碘甲烷，此時(shí)一種碘甲烷無放射性同位素，另一種有14C，另一種有一個(gè)或多個(gè)3H。利用二種或多種碘甲烷可提供各種混合物，可通過它們發(fā)射的射線測定這些混合物?；蛘撸诙艽a中可采用多種第二有機(jī)化合物。
本發(fā)明另一方面，提供一種選擇用于醫(yī)學(xué)的一種或多種候選化合物的方法，該方法包括篩選上述本發(fā)明含有AMS活性放射性同位素標(biāo)記化合物的文庫，并獲得篩選的樣品，或提交鑒定的化合物作代謝研究，獲得研究后的樣品進(jìn)行該樣品的AMS檢測。篩選所需的活性、反應(yīng)性、抑制、官能團(tuán)等，如該領(lǐng)域所知那樣，鑒定一種或多種候選的放射性同位素標(biāo)記的文庫化合物。AMS檢測宜在篩選樣品時(shí)進(jìn)行，或給藥，例如微量給藥于人、動(dòng)物或植物對象中該候選的放射性同位素標(biāo)記的化合物，并進(jìn)行這些對象代謝樣品的AMS檢測。用于AMS的樣品宜從篩選所產(chǎn)生的樣品制備，如細(xì)胞或細(xì)胞膜樣品，或人、動(dòng)物或植物產(chǎn)生的給藥樣品，如組織或細(xì)胞，體液如血液或尿、糞便、植物組織、土壤或土壤生物如蠕蟲等。
因此本發(fā)明的方法可用于在體外檢測化合物的活性、反應(yīng)性、抑制或官能團(tuán)篩選和選擇，和提供所選化合物的結(jié)合或體內(nèi)代謝資料，特別是提供ADME和PK數(shù)據(jù)。
以已知方式提取文庫各化合物的樣品作所需試驗(yàn)進(jìn)行篩選。
可用任何已知的或新的醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境等的篩選進(jìn)行篩選，通常是人或動(dòng)物的生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)等，例如蛋白質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)，如受體結(jié)合試驗(yàn)。
許多測試方法和技術(shù)是可以購得的，用來測定感興趣的篩選化合物的特性。
可對直接結(jié)合有其鑒定劑，如上述小珠的化合物進(jìn)行篩選，可對單個(gè)小珠或諸組化合物進(jìn)行篩選，以確定該化合物或化合物組是否顯示活性。各組可包含10、100、1000或更多種化合物。用此方式，可快速篩檢大的化合物組并將其分成較小的化合物組。
通常的篩選是檢測與特定生物分子如受體的結(jié)合。受體可以是單個(gè)分子、與微粒體或細(xì)胞結(jié)合的分子等。當(dāng)對激動(dòng)劑活性感興趣時(shí)，可能希望采用完整的生物或細(xì)胞，此時(shí)可檢定對目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)合反應(yīng)。某些例子中，可能需要將化合物從小珠上解離下來，特別是當(dāng)對轉(zhuǎn)導(dǎo)某信號的生理活性感興趣時(shí)。當(dāng)對結(jié)合感興趣時(shí)，可采用標(biāo)記的受體，所述標(biāo)記是熒光素、酶、放射性同位素等，這些可檢測受體與小珠上的化合物結(jié)合情況。或者，可提供能與該受體結(jié)合的抗體，此時(shí)標(biāo)記該抗體，可放大信號避免感興趣受體發(fā)生改變從而影響其與感興趣產(chǎn)物的結(jié)合。也可以通過置換與該受體結(jié)合的配體來檢測結(jié)合，此時(shí)用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記該配體。
篩選過程可包括二階段篩選，包括初步篩選時(shí)的結(jié)合，然后在第二步篩選中用活細(xì)胞篩選生物活性。采用重組技術(shù)制備文庫得以在細(xì)胞的遺傳能力上產(chǎn)生極大的差異。然后可產(chǎn)生外源基因或外源轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，使基因或序列與膜表面蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生可觀察的信號，如細(xì)胞內(nèi)信號。例如，第二輪篩選可包括將無色染料導(dǎo)入細(xì)胞中，此時(shí)某些酶可將該無色染料轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物，具體如熒光產(chǎn)物，在與膜表面結(jié)合的相應(yīng)部位，如β-半乳糖苷酶和雙半乳糖苷熒光素時(shí)表現(xiàn)出來。以此方式，通過使特定的細(xì)胞與特定的候選化合物相結(jié)合，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光性質(zhì)可用FACS檢測，從而可鑒定出活性候選化合物?？刹捎酶鞣N技術(shù)以保證候選化合物保持與細(xì)胞的結(jié)合，即使候選化合物釋放了產(chǎn)物。例如，該化合物可包括針對膜表面蛋白質(zhì)的抗體，如可將親和素連接于細(xì)胞表面，而將生物素直接或通過其運(yùn)載體或小珠連接于該候選化合物等。
可采用單種化合物或化合物組或它們的組合，分步進(jìn)行試驗(yàn)。例如，組合合成后將50-10000種化合物的各組分裝在不同的容器中，在每只容器中如果各化合物結(jié)合于一運(yùn)載體，將其一部分釋放出來。分步釋放可以是由于產(chǎn)物與顆粒連接上有差異而致，或可利用有限量的試劑和反應(yīng)條件等，使得每個(gè)載體釋放的化合物分子平均數(shù)目低于每個(gè)載體的化合物總數(shù)。篩選介質(zhì)在小體積中含有化合物的混合物。該混合物然后可用于結(jié)合試驗(yàn)，此種結(jié)合可能是已知的結(jié)合配體與受體的結(jié)合的抑制，細(xì)胞代謝過程的激活或抑制等。如該領(lǐng)域所知，可利用各種試驗(yàn)條件來檢測結(jié)合活性。一旦某組顯示有活性即可采用相同或不同的試驗(yàn)篩檢各化合物，總共為3或4個(gè)階段，將大組分成較小的組等等，最后篩檢單一化合物。每階段載體上化合物的一部分釋放下來，將得到的混合物用于相應(yīng)的試驗(yàn)作檢測。這些試驗(yàn)可以相同或不同，后階段或最后階段采用更精細(xì)和費(fèi)時(shí)的試驗(yàn)。
或者可在立體空間陣列上進(jìn)行篩選，為此可將各化合物分配到蜂窩狀平板中，蜂窩平板的每一孔含0或1種化合物。
可通過篩選來鑒定具有催化作用，如水解活性、酯酶活性的化合物。在催化性篩選中，可將化合物包埋在半固體基質(zhì)中，周圍是可擴(kuò)散的測試底物。如果該方法可檢測到局部的催化活性而不干擾基質(zhì)，例如因切斷底物所引起的光吸收變化，或可檢測到熒光，可分離得到催化活性區(qū)帶中的化合物和譯出它們的鑒定劑標(biāo)記物。
可利用篩選來鑒定具有抑制或激活活性的化合物。可搜尋能抑制或激活酶或阻斷結(jié)合反應(yīng)的化合物。為了檢測能抑制某種酶的化合物，宜使化合物從載體上釋放下來擴(kuò)散到半固體基質(zhì)中或?yàn)V膜上，從而可觀察這種抑制、激活或封阻作用。然后可挑出形成可見或可檢測抑制、激活或封阻區(qū)帶的化合物并譯出其標(biāo)記物。
此種情況下，標(biāo)記物宜通過可切斷的連接鍵，優(yōu)選光不穩(wěn)定連接鍵與化合物結(jié)合，而標(biāo)記物的一部分仍保持與小珠結(jié)合，挑出后采用前述不同方法使其釋放。
可利用透析膜，其中有一層支持的化合物，其與一層放射性同位素標(biāo)記的配體/受體對相隔開。用紫外線照射化合物層釋放出的化合物擴(kuò)散到配對層中，在該層中放射性同位素標(biāo)記的配體以該化合物對受體的親和力成比例地釋放出來。放射性同位素標(biāo)記的配體將擴(kuò)散返回化合物層。因?yàn)榉派湫酝凰仉x該化合物最近，可分析與發(fā)射放射線相關(guān)的化合物。
可利用篩選試驗(yàn)來鑒定具有生物活性的化合物。某些應(yīng)用中，需要尋找對活細(xì)胞有作用，如能抑制微生物生長、抑制病毒生長、抑制基因表達(dá)、激活基因表達(dá)的化合物。可實(shí)現(xiàn)對支持的化合物的篩選，例如將支持物包埋在半固體介質(zhì)中，從包埋的支持物釋放化合物文庫使化合物擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中，可觀察到這種作用，如菌落中的空斑。然后可觀察到生長抑制或生長活躍的區(qū)帶或?qū)虮磉_(dá)的抑制，挑取該區(qū)帶中心的化合物進(jìn)行分析。
篩選介質(zhì)可包含其中分布有待起作用的分子或細(xì)胞系統(tǒng)的凝膠，可將這些分子或細(xì)胞基本上均勻地包埋在該凝膠中?？刹捎酶鞣N膠凝劑，如聚丙烯酰胺、瓊脂糖、明膠等?？蓪⒒衔锷⒉荚谀z中使化合物之間有充分的間隔便于各自的檢測。如果所需的化合物具有水解活性，可在凝膠中加入能提供熒光產(chǎn)物的底物，而能篩檢凝膠中的熒光，用機(jī)械方法選出與該熒光信號相關(guān)的化合物。
可將細(xì)胞包埋在凝膠中從而產(chǎn)生細(xì)胞集落。如上所述分布化合物。用該領(lǐng)域已知的技術(shù)在凝膠上安置一網(wǎng)格以確定有一個(gè)化合物或沒有化合物的區(qū)域。通過培育釋放的文庫化合物足夠時(shí)間，然后在凝膠上散布活性染料來檢測細(xì)胞毒性。然后區(qū)分吸收染料或不吸收染料的那些細(xì)胞。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，可用基因工程技術(shù)改造細(xì)胞，當(dāng)某信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)可顯示該細(xì)胞。有許多其基因表達(dá)已知可被激活的受體。將外源性基因插入受到啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的位點(diǎn)中而對這類受體起反應(yīng)時(shí)，可產(chǎn)生能提供可檢測信號，如產(chǎn)生熒光信號的酶。然后分析與該熒光細(xì)胞相關(guān)的化合物的反應(yīng)史。
本發(fā)明方法包括在一成功的篩選中選擇一種或多種化合物，如5-100種化合物，提供從本發(fā)明文庫中選出化合物的代謝性同位素標(biāo)記的樣品，和在后續(xù)研究中進(jìn)行放射檢測，如在代謝、藥物動(dòng)力學(xué)等研究中作AMS檢測。
宜通過給予人或動(dòng)物對象一定量的候選化合物本身，或加上合適的載體進(jìn)行AMS微量給藥。給藥通常經(jīng)口服、皮膚、口頰、陰道、肛門、皮下、鼻內(nèi)途徑或吸入途徑。微量給藥宜包括足夠的化合物以產(chǎn)生低劑量毫微居里級，如納克或毫克級的放射活性標(biāo)記物。微量給藥宜包括1-5毫微居里，更優(yōu)選不到1 microSievert，這是規(guī)則所批準(zhǔn)的。因此微量給藥可包括1微克至1毫克，優(yōu)選1-500微克放射性同位素標(biāo)記的本發(fā)明文庫化合物。
在數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月時(shí)間后，提取組織或細(xì)胞樣品、血樣品、尿液或糞便。宜間隔一段時(shí)間取樣以檢測化合物的代謝速率，顯示代謝快和慢的化合物。WO01/59476中描述的方法納入本文作為參考。
AMS結(jié)果分析表明了同位素計(jì)數(shù)值，如14C的計(jì)數(shù)值，現(xiàn)代(modern)同位素(即天然產(chǎn)生的)的比率，現(xiàn)代同位素的百分率；這種計(jì)數(shù)值和現(xiàn)代同位素比率的組合。pMC(現(xiàn)代碳的百分率)是放射活性的AMS術(shù)語，代表樣品中碳含量的量度。PMC＝倍數(shù)現(xiàn)代(Times modern)×100。一個(gè)倍數(shù)現(xiàn)代＝1952時(shí)大氣中14C/12C比率。12C/13C比率保持相對恒定。
在本發(fā)明的方法中，制備的AMS分析用樣品是微克級或更低量的組織或細(xì)胞，至數(shù)微升血液或尿液。如該領(lǐng)域所知，樣品可包括植物組織，土壤或土壤生物如蠕蟲。
如該領(lǐng)域所知，制備的樣品形式應(yīng)能在儀器的離子源中產(chǎn)生負(fù)離子?？刹捎弥苽鋵?dǎo)熱和導(dǎo)電固體的傳統(tǒng)方法制備樣品，不分級，有效保護(hù)防止被內(nèi)量異位素(isobar)污染，或在實(shí)驗(yàn)儀器中或儀器上不能預(yù)計(jì)濃度的罕見同位素的污染。通過將所有樣品還原到均勻狀態(tài)，從此狀態(tài)制備最終的目標(biāo)物質(zhì)，以確保樣品和標(biāo)準(zhǔn)品完全均一和具有可比性。然后將還原的樣品壓制成藥片形狀裝在園柱形鋁制陰極中，以AMS進(jìn)行元素同位素的分析。
例如，可將獲自微量給藥的同位素碳標(biāo)記的文庫化合物轉(zhuǎn)化成石墨，將獲自微量給藥的同位素鹵素原子標(biāo)記的文庫化合物轉(zhuǎn)化成銀鹵鹽，將獲自微量給藥的同位素鋁標(biāo)記的文庫化合物轉(zhuǎn)化成氧化鋁，將獲自微量給藥的同位素鈣標(biāo)記的文庫化合物轉(zhuǎn)化成二鹵化鈣或二酐。碳樣品(如含14C)的轉(zhuǎn)化，例如，可將其氧化成CO2然后還原成石墨，通常用氫或鋅在鐵或鈷催化劑或粘合劑上的鋅還原CO2(Vogel，.JS；1992，為生物醫(yī)學(xué)AMS快速生產(chǎn)無污染的石墨，Radiocarbon，34344-350)。在溫度高達(dá)900℃的熔爐中，采用氧化劑如氧化銅，加熱密封管約8小時(shí)，進(jìn)行氧化。在第二步低溫轉(zhuǎn)移后，用氫化鋅或氫化鈦等還原劑和鈷作為催化劑，在高達(dá)約500℃約18小時(shí)，將產(chǎn)生的CO2還原成石墨。然后將鈷/石墨壓制成藥片形狀裝在園柱形鋁制陰極中，以AMS進(jìn)行基本同位素的分析。
或者，用WO 01/59476的改良技術(shù)(其內(nèi)容納入本文作參考)制備樣品。宜將WO 01/59476方法制備的樣品與優(yōu)選的導(dǎo)電粘合劑均勻混合，該粘合劑可以是能使樣品與粘合劑混合物壓制成藥片形狀的任何物質(zhì)。如待檢測的同位素是14C時(shí)，所述粘合劑更優(yōu)選石墨、鈷和鋁粉之一或它們的混合物；如待測同位素是钚時(shí)，優(yōu)選氧化鋁和鐵或氧化鐵之一或它們的混合物。
本發(fā)明方法宜包括下一步分析AMS檢測結(jié)果，和鑒定在所需對象中具有所需代謝模式特征的一種或多種候選化合物，并對所鑒定的候選化合物進(jìn)一步研究其醫(yī)學(xué)可接受性和效應(yīng)。
本發(fā)明另一方面提供檢測人、動(dòng)物或植物之一種或多種的液體樣品中存在的放射性同位素標(biāo)記化合物的同位素AMS檢測方法，定量上述文庫被鑒定到的一種或多種候選化合物。
本發(fā)明另一方面提供該文庫、含放射性同位素標(biāo)記化合物的固相支持物的用途，或如上所述在生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)用化學(xué)、環(huán)境學(xué)等中用AMS檢測篩選作進(jìn)一步研究的方法。
生物醫(yī)學(xué)篩選宜篩選化合物的活性、反應(yīng)性如結(jié)合、抑制作用或其它功能，以評估代謝特征；農(nóng)用化學(xué)篩選是篩選化合物的活性、反應(yīng)性如結(jié)合、抑制作用或其它功能，以評估植物、昆蟲等的代謝特征；環(huán)境學(xué)篩選是篩選化合物的活性、反應(yīng)性如結(jié)合、抑制作用或其它功能，評估土壤、水份或沉積物的吸收、擴(kuò)散、瀝濾、代謝、降解、耗散或光分解作用研究。
本發(fā)明文庫可用于目前所用化合物文庫的任何用途，采用AMS放射檢測技術(shù)對放射性同位素的分析有利于檢測樣品中化合物的存在，化合物所在的部位，如樣品的來源，或任何部位或樣品中化合物的量。這可用于文庫中能成功結(jié)合所需底物的化合物的初步篩選。或者，本發(fā)明的文庫可用于在篩選后，選擇具有所需活性，如具有所需結(jié)合特征的的化合物，提供所選文庫化合物的放射性同位素標(biāo)記的樣品，顯示文庫初步篩選中具有活性的化合物，直接進(jìn)行下一步研究需要的謝性同位素，如代謝樣品的放射性檢測。
篩選方法中宜采用本發(fā)明的文庫，以選擇候選化合物和提供這些化合物的放射性同位素標(biāo)記的樣品，測定其與細(xì)胞受體的結(jié)合，以已知方式在動(dòng)物研究中研究代謝作用的機(jī)制，并進(jìn)行代謝研究等。例如，可篩檢受體結(jié)合時(shí)的許多放射性同位素代謝和收集形成的受-配體復(fù)合物，以確定是否存在放射性同位素，從而表明所述文庫代謝產(chǎn)物與受體的結(jié)合；或可進(jìn)行篩選以選擇有醫(yī)學(xué)用途的候選化合物并給藥，宜采用微量給藥，用AMS檢測取自人或動(dòng)物的液體樣品中的可用于人或動(dòng)物的候選化合物確定其代謝特征。因此，本發(fā)明文庫的用途是以改進(jìn)的方式提供有關(guān)候選化合物代謝特征的體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)，不需要在反應(yīng)中間檢測候選物及合成它們和合成放射性同位素標(biāo)記的同類物。


現(xiàn)在參見以下實(shí)施例和附圖以非限制性方式闡述本發(fā)明圖1-5顯示文庫化合物的反應(yīng)方案和結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-環(huán)中摻入痕量14C標(biāo)記的苯甲酸液相/固相文庫的合成化學(xué)文庫產(chǎn)品的典型例子描述見Ugi反應(yīng)(Cao，X.，Moran，EJ.，Siev，D.，Lio，A.，Ohashi，C and Mjalli，AMM；1995.，Boorgand Med Chem Lett.，52953-2958；和Nakamura，M.，Inoue，J and Yamada，T.，2000.，Bioorg and Med Chem Lett.，102807-2810)該反應(yīng)可在液體中或固定化的樹脂上進(jìn)行，包括4種反應(yīng)物，此例中是羧酸、胺、醛和異氰化物的縮合。終末產(chǎn)物(即文庫化合物)視所選的不同反應(yīng)物而異。
以下是一些探索性實(shí)驗(yàn)，所用反應(yīng)物的混合物如表1所述。反應(yīng)x1-x9在液體中進(jìn)行。反應(yīng)x21-x29用TentaGel S-RAM樹脂進(jìn)行。此固相支持物能貢獻(xiàn)出氨基用在反應(yīng)中。
表1Ugi反應(yīng)所用的化合物基于溶液的反應(yīng)


基于固定的反應(yīng)

*--編號在數(shù)字順序中不是必須的。在初步臨床實(shí)驗(yàn)后選出所示終末產(chǎn)物，不是所有的反應(yīng)混合物都能形成所需的產(chǎn)物。采用Ugi反應(yīng)這是常見的。
此反應(yīng)和終末產(chǎn)物見圖1-5。
1A-放射標(biāo)記前體的制備對所有反應(yīng)都恒定的羧酸用14C標(biāo)記。將無放射標(biāo)記的苯甲酸(ca 1.5g)與ca 4,200dpm的苯環(huán)有14C標(biāo)記的苯甲酸(Sigma)溶于熱水中，然后冷卻重結(jié)晶(產(chǎn)量ca 97％輕度標(biāo)記的苯環(huán)14C標(biāo)記的苯甲酸)。
1B-液相合成的通用程序在無水甲醇(0.5ml)中加入胺(0.4mmol)和醛(0.4mmol)。28℃攪拌所得溶液10分鐘。在此溶液中加入無水甲醇(1ml)配的苯環(huán)14C輕度標(biāo)記的苯甲酸(得自1A)(0.4mmol)，然后加入異氰化物(0.4mmol)。28℃攪拌反應(yīng)60小時(shí)。除X4混合物外，真空蒸發(fā)所有反應(yīng)物，殘余物重溶于乙酸乙酯(10ml)和飽和NaCI(10ml)中，用MgSO4干燥并過濾。真空蒸發(fā)掉有機(jī)層得到粗縮合產(chǎn)物。
完成反應(yīng)后，用質(zhì)譜特征鑒定產(chǎn)物(結(jié)果見圖1-5)，用核磁共振譜(NMR)特征鑒定二種化合物(分別是X4和X22，N-芐基-N-(環(huán)己基環(huán)己基氨基甲?；谆?苯甲酰胺和N-(1-環(huán)己基氨基甲?；旎?苯甲酰胺)。
實(shí)施例1Bx4---x4的合成采用以上1B的通用程序，在無水甲醇(0.5ml)中加入芐胺(44ml，0.4mmol)和環(huán)戊烷甲醛(48μl，0.4mmol)。28℃攪拌所得溶液10分鐘。在該溶液中加入用無水甲醇(1ml)配的14C輕度標(biāo)記的苯甲酸(得自1A)(48mg，0.4mmol)然后加入環(huán)己基異氰化物(0.4mmol)。28℃攪拌反應(yīng)物60小時(shí)，過濾所得到的粗沉淀物，用冰冷的甲基醇洗滌，真空干燥得到粗制N-芐基-N-(環(huán)己基環(huán)己基氨基甲?；谆?苯甲酰胺(122mg，71％)1H NMR □□(400MHz，CDCl3)7.55-6.85(m，10H)，4.67(d，J 16.2Hz，1H)，4.45(d，J 16.2Hz，1H)，4.17(d，J 9.5Hz，1H)3.66(m，1H)，2.41(m，1H)，1.95-1.45(m，10H)，1.40-0.85(m，10H).
13C NMR □c(400MHz，CDCl3)24.6，25.5，25.7，25.7，26.3，29.7，30.2，32.6，32.9，36.1，47.7，52.9，66.7，126.6，127.2，127.4，128.2，128.4，129.6，136.7，137.0，169.2，174.0.
m/z(CI)433(M+H+)；(實(shí)測值433.2853，C28H37N2O2為M+H+所要求，433.2855)1C-固相合成的通用程序用二氯甲烷(DCM)(3×1ml)配的20％哌啶脫保護(hù)Rink樹脂(1.1mmol，0.055g)。使該樹脂在50％DCMMeOH(1ml)中溶脹30分鐘。在該預(yù)溶脹的樹脂中加入醛(10當(dāng)量，根據(jù)最初樹脂加載量)，28℃攪拌反應(yīng)混合物10分鐘。加入14C輕度標(biāo)記的苯甲酸(得自1A)(10當(dāng)量)和異氰化物(10當(dāng)量)，28℃攪拌樹脂36小時(shí)。用DCM(10×5ml)洗滌樹脂，真空干燥。用30％TFADCM(1ml)切割樹脂3小時(shí)。過濾除去樹脂，減壓濃縮濾液得到粗制縮合產(chǎn)物。
實(shí)施例1Cx22---x22的合成采用以上1C的通用程序，用二氯甲烷(DCM)(3×1ml)配的20％哌啶脫保護(hù)Rink樹脂((1.1mmol，0.055g)。使該樹脂在50％DCMMeOH(1ml)中溶脹30分鐘。在該預(yù)溶脹的樹脂中加入戊醛(64μl，10當(dāng)量，根據(jù)最初樹脂加載量)，28℃攪拌反應(yīng)混合物10分鐘。加入14C輕度標(biāo)記的苯甲酸(得自1A)(73mg，10當(dāng)量)和環(huán)己基異氰化物(76μl，10當(dāng)量)，28℃攪拌樹脂36小時(shí)。用DCM(10×5ml)洗滌樹脂，真空干燥。用30％TFADCM(1ml)切割樹脂3小時(shí)。過濾除去樹脂，減壓濃縮濾液得到粗制N-(1-環(huán)己基氨基甲?；旎?苯甲酰胺(17.9mg，94％)。
1H NMR □□(400MHz，CDCI3)7.82(d，J 7Hz，2H)，7.54-7.42(m，3H)，6.61(d，J8Hz，1H)，4.63(ddd，J 7，7，8Hz)，3.77(m，1H)，2.0-1.5(m，6H)，1.4-1.1(m，9H).，0.92-0.89(m，3H)13C NMR □c(400MHz，CDCl3)13.9，22.4，24.7，25.4，27.7，32.3，32.6，32.8，48.8，53.9，127.2，128.6，132.0，133.4，167.6，171.3.
m/z(CI)317(M+H+)；(實(shí)測值317.2227，C19H29N2O2為M+H+所要求，317.2229)實(shí)施例2---文庫樣品的AMS分析采用Vorel(Vogel，JS.，1992，Radiocarbon.34344-350)的方法將實(shí)施例1所用14C-苯甲酸前體樣品和實(shí)施例1所獲得的x4、x12、x19和x22的樣品石墨化，用NEC 15SDH-2 Pelletron AMS系統(tǒng)進(jìn)行分析。終末電壓為4.5MV，粒子能約22.5MeV。在中央末端，從碳原子上剝下電子產(chǎn)生帶陽電荷的碳離子(12，13，14C+1至+6)選出C4+作測定，因?yàn)檫@些離子含此種能量最為豐富。
苯甲酸起始物質(zhì)的比活度是1.56dpm/mg。所分析的文庫化合物的比活度見表2。

因此所有的文庫化合物都是用14C輕度標(biāo)記的。以“Percent Modern Carbon”(現(xiàn)代碳百分?jǐn)?shù))(pMC)單位輸出AMS。平均背景值為2.37pMC。化合物X4-X22的pMC值分別為約2500、3200、2200和800。因此雖然表2所示比活度低，但它們均良好位于AMS的測定限度之內(nèi)。
這表明文庫存化合物適合以已知方式對對象作微量給藥以測定各化合物的ADME和PK。
實(shí)施例2可從市場上購買到具有潛在活性如抗菌或嗜菌體活性的化合物文庫。取10mg各化合物用14C置換作輕度放射標(biāo)記，產(chǎn)生本發(fā)明放射性同位素標(biāo)記的文庫。此例中所述文庫小，各化合物裝在獨(dú)立的小瓶中，小瓶標(biāo)記有文庫的系列號和參考文字，通過交互觀看文庫的系列號和帶有文庫分類的參考文字可知道各例的身份。
選擇化合物，用沙門氏菌微粒體試驗(yàn)(Salemonella microsome assay，Ames試驗(yàn))，檢測與沙門氏菌微粒體相關(guān)受體分子的結(jié)合。從試驗(yàn)結(jié)果選出候選的陽性化合物。
候選的文庫化合物已經(jīng)過放射性同位素標(biāo)記，因此可直接進(jìn)行微量給藥和AMS。先制備微量給藥形式的候選化合物，各化合物對應(yīng)于不同的人，每人5微克量。幾個(gè)月之后取各人的血液和尿液樣品，標(biāo)記上候選文庫化合物的系列號。如該領(lǐng)域所知制備AMS樣品。進(jìn)行AMS，分析結(jié)果顯示各文庫化合物的代謝特征。根據(jù)可接受的PK特征，制備選出的化合物進(jìn)行臨床I期試驗(yàn)。
實(shí)施例3本例中，重組的人抗體文庫是14C標(biāo)記的生物合成的文庫，采用了合并的必需14C-氨基酸。其摻入了足夠的入放射活性提高了AMS的檢測限度(比1 l.o.d的ELISA提高幾千倍)。在適當(dāng)?shù)氖荏w結(jié)合試驗(yàn)中通過測定受體的結(jié)合，篩選文庫中各放射性同位素標(biāo)記的文庫抗體的活性，并選出作PK分析。用實(shí)施例1的方法，用選出的候選文庫抗體制備的AMS樣品進(jìn)行微量給藥，用該抗體加強(qiáng)的人血清進(jìn)行研究，并用給予該抗體的大鼠作研究。本發(fā)明的方法要花6周時(shí)間來制備放射性同位素標(biāo)記的文庫(此例幾乎獨(dú)立于文庫的大小，可以是用上述生物合成法平行標(biāo)記放射性同位素的化合物)和篩選、鑒定候選化合物和進(jìn)行AMS。
特別的優(yōu)點(diǎn)是，可對本發(fā)明的候選放射性同位素標(biāo)記的文庫化合物進(jìn)行臨床前毒理學(xué)試驗(yàn)和臨床期限試驗(yàn)，于用本發(fā)明方法鑒定?？稍?2-16周內(nèi)完成整個(gè)臨床期限試驗(yàn)過程。
本發(fā)明的放射標(biāo)記文庫的優(yōu)點(diǎn)及其在本發(fā)明改進(jìn)的篩檢方法中的用途，是例如，只須一次合成微量的候選化合物，篩選和微量給藥之間不會延誤時(shí)間，縮短了放大規(guī)模鑒定具有最佳PK特征的活性候選藥物的時(shí)間，因此，這對于商業(yè)計(jì)劃是從事候選化合物研究作為未來藥物的新興多國藥物開發(fā)組織和投資公司，無疑有更大的優(yōu)越性。
權(quán)利要求
1.化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的文庫，其特征在于，該文庫各化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的信息相關(guān)連，文庫中至少有二種化合物標(biāo)記了放射性同位素，該放射性同位素的特征是AMS活性的同位素。
2.如權(quán)利要求1所述的文庫，其中所述AMS活性的放射性同位素的天然背景范圍低至1×10-5％或更低。
3.如權(quán)利要求1或2所述的文庫，其中所述AMS活性的放射性同位素的半衰期長至幾周以上。
4.如權(quán)利要求1-3所述的文庫，其中所述AMS活性的放射性同位素直接摻入到文庫化合物中不能從該化合物中分離，除非該化合物本身發(fā)生降解。
5.如權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的文庫，其中所述AMS活性的放射性同位素被共價(jià)摻入到文庫化合物中。
6.如權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的文庫，該文庫包括下式I的多種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中各個(gè)○是不同的，并且是一種化合物，含有AMS活性同位素*的化合物；m是放射性同位素?fù)饺氲陌俜直戎?，其分?jǐn)?shù)范圍從大于0至1％；和t是與化合物的化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)的標(biāo)記物，其中n是0或整數(shù)。
7.如權(quán)利要求6所述的文庫，其中m的范圍從大于0至0.1％，因而式I各化合物是輕度標(biāo)記的，即其一部分沒有放射線性同位素。
8.如權(quán)利要求6-7任何一項(xiàng)所述的文庫，其中所述摻入百分比(m)是最大比活度的一種量度，其中100％摻入被定義為每個(gè)分子摻入一個(gè)同位素，對于給定量的物質(zhì)中的每個(gè)分子都有一個(gè)特定原子被其放射活性等價(jià)物所取代。
9.如權(quán)利要求6-8任何一項(xiàng)所述的化合物文庫，其中所述摻入百分比(m)的范圍是1×10-12至0.1％。
10.如權(quán)利要求6-9任何一項(xiàng)所述的化合物文庫，其中某給定化合物的摻入百分比用公式Equ 2確定
11.如權(quán)利要求8-10任何一項(xiàng)所述的化合物文庫，其中所述所述最大比活度，根據(jù)每個(gè)分子一個(gè)放射性同位素(相當(dāng)于100％摻入)，用公式Equ1計(jì)算 其中1n2是2的自然對數(shù)(＝0.6932)t1/2是以分鐘計(jì)的放射性同位素半衰期N是1毫摩爾(mmole)中的放射性同位素原子數(shù)(摩爾化合物×6.0225×1020)。
12.如權(quán)利要求1-11任何一項(xiàng)所述的化合物文庫，其中所述AMS活性的放射性同位素選自氫、鈹、碳、鋁、磷、氯、鈣、鎂、鐵、硒、碘、鋇和鑭系及錒系如鈾或钚的AMS活性放射性同位素。
13.如權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)所述的文庫，其中所述AMS活性放射性同位素選自2H、3H、Ba的同位素、10Be、14C、17O、18O、26Mg、26AI、32Si、36CI、41Ca、55Fe、57Fe、60Fe、53Mn、55Mn、79Se和129I、236U、239Pu的任何一種或多種。
14.如權(quán)利要求1-13任何一項(xiàng)所述的文庫，該文庫包含多種以固相或液相存在的化合物，或它們的混合物，各化合物負(fù)載在固相載體上或裝在密封小瓶中。
15.如權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)所述的文庫，該文庫提供了適合用于高通量篩選的一種化合物陣列。
16.如權(quán)利要求1-15任何一項(xiàng)所述的文庫，依靠AMS檢測技術(shù)的靈敏度，該文庫包含納摩爾或毫摩爾級，一般為毫克級的少量化合物，可高達(dá)數(shù)摩爾或數(shù)克級。
17.如權(quán)利要求1-16任何一項(xiàng)所述的文庫，該文庫包含的5-5×106種化合物。
18.如權(quán)利要求1-17任何一項(xiàng)所述的文庫，其中至少40％的化合物到基本上100％的化合物是輕度標(biāo)記的。
19.如權(quán)利要求1-17任何一項(xiàng)所述的文庫，該文庫是化學(xué)或生物化學(xué)文庫。
20.其上結(jié)合負(fù)載有如權(quán)利要求1-19任何一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的固相載體，所述化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)連并含有放射性同位素，其特征是所述放射性同位素是權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)所述的AMS活性放射性同位素。
21.制備如權(quán)利要求1-19任何一項(xiàng)所述化合物文庫的方法，該方法包括用放射性同位素標(biāo)記多種化合物，每種化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)信息相關(guān)連，特征是用AMS活性放射性同位素進(jìn)行所述標(biāo)記。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，通過任何一步或多步驟合成途徑的部份或生物合成進(jìn)行所述標(biāo)記，或在商品購得的或事先合成的化合物或其混合物上進(jìn)行所述化學(xué)或生物合成標(biāo)記步驟。
23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中通過在富含AMS活性放射性同位素的環(huán)境中，培養(yǎng)能產(chǎn)生生化產(chǎn)物的微生物進(jìn)行生物合成，并收獲標(biāo)記的產(chǎn)物。
24.如權(quán)利要求21-23任何一項(xiàng)所述的方法，該方法包括輕度標(biāo)記合成的前體或中間產(chǎn)物或生物化學(xué)培養(yǎng)底物，并使它們與其它前體或中間產(chǎn)物反應(yīng)，或在其中培養(yǎng)的微生物，從而將放射性同位素?fù)饺氲胶铣傻幕蛏锖铣傻漠a(chǎn)物中。
25.如權(quán)利要求21-24任何一項(xiàng)所述的方法，該方法包括標(biāo)記合成的前體或中間產(chǎn)物或生化培養(yǎng)底物，測定其比活度，測定所需的比活度產(chǎn)生所需的摻入百分比，和與足夠量的相應(yīng)的未標(biāo)記合成前體或中間產(chǎn)物或生化培養(yǎng)底物相混合，并分離成具有所需摻入百分比的均質(zhì)產(chǎn)品。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中用輕度標(biāo)記的前體或中間產(chǎn)物或生化培養(yǎng)底物進(jìn)行合成或生物合成，以所需摻入百分比摻入放射性同位素。
27.一種采用如權(quán)利要求21-26任何一項(xiàng)所述的本發(fā)明方法，制備如權(quán)利要求1-19任何一項(xiàng)所述本發(fā)明文庫的試劑盒，該試劑盒包括一組或多組多種分開的反應(yīng)物，和任選地一定量的一種或多種與上述各組起反應(yīng)的反應(yīng)物，各反應(yīng)物的特征是具有與其結(jié)構(gòu)或身份信息相關(guān)連的可鑒別組成，并具有至少一種共同的官能團(tuán)，至少一組或一種共同的反應(yīng)物標(biāo)記有如上所述的AMS活性放射性同位素。
28.選擇一種或多種候選化合物的方法，其特征在于，該方法包括篩檢權(quán)利要求1-19任何一項(xiàng)所述的本發(fā)明含有AMS活性放射性同位素標(biāo)記化合物的文庫，和從此種篩檢獲得某樣品或提交所鑒定的某化合物作代謝研究，從中獲得其樣品并進(jìn)行該樣品的AMS檢測。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中AMS檢測在篩檢樣品上進(jìn)行，或通過給藥于人、動(dòng)物或植物對象以候選放射性同位素標(biāo)記的化合物，并對取自這種對象的代謝樣品進(jìn)行AMS檢測。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中所述AMS檢測樣品，產(chǎn)生自篩檢如細(xì)胞或細(xì)胞膜樣品，或從人、動(dòng)物或植物的微量給藥產(chǎn)生的樣品如組織或細(xì)胞、體液如血液或尿液、糞便、植物組織、土壤或土壤生物如蠕蟲等。
31.如權(quán)利要求27或29所述的方法，其中所述篩檢方法是人或動(dòng)物的生化試驗(yàn)等，例如，蛋白質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)如受體結(jié)合試驗(yàn)。
32.從存在于篩選樣品中的一種或多種放射性同位素標(biāo)記化合物，或取自權(quán)利要求1-19所述的文庫中鑒定的候選化合物給藥的樣品所具有的AMS活性放射性同位素的AMS檢測方法，或采用如權(quán)利要求27-30任何一項(xiàng)所述的方法。
33.如權(quán)利要求1-32任何一項(xiàng)所述的包含放射性同位素標(biāo)記化合物的文庫、固相載體，或方法在(生物)醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)化學(xué)、環(huán)境學(xué)等篩檢中的用途，用于AMS檢測作進(jìn)一步研究。
34.如權(quán)利要求33所述的用途，其中(生物)醫(yī)學(xué)篩檢是篩檢化合物的活性、反應(yīng)性如結(jié)合、抑制作用或其它功能，以評估代謝特性；農(nóng)業(yè)化學(xué)篩檢是篩檢化合物的活性、反應(yīng)性如結(jié)合、抑制作用或其它功能，和評估植物、昆蟲等的代謝活動(dòng)；環(huán)境學(xué)篩檢是篩檢化合物的活性、反應(yīng)性如結(jié)合、抑制作用或其它功能，和評估土壤、水或沉積物的吸收或吸附、擴(kuò)散、瀝濾、代謝、降解、消散或光分解研究。
35.如權(quán)利要求33或34任何一項(xiàng)所述的用途，是采用AMS放射檢測技術(shù)，檢測樣品中某化合物的存在，檢測某化合物所處的部位例如樣品的來源部位，或任何部位或樣品中某化合物的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的文庫，每個(gè)化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的信息相關(guān)連，這些化合物中至少有二種化合物用放射性同位素標(biāo)記的，其中，所述同位素是AMS活性的放射性同位素；具有在此定義的化合物或其藥學(xué)上可接受鹽連接于其上的固相支持物，該化合物與其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的信息相關(guān)連并含有放射性同位素，所述同位素的特征是上述定義的AMS活性放射性同位素；如權(quán)利要求1－19任何一項(xiàng)所述化合物的文庫的制備方法，包含放射性同位素標(biāo)記的多種化合物，每個(gè)化合物與有關(guān)其化學(xué)身份和結(jié)構(gòu)的信息相關(guān)連，特征是這些化合物是用AMS活性放射性同位素或其試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。選擇一種或多種候選化合物的方法，包括篩檢含有如上定義的AMS活性放射性同位素標(biāo)記化合物的本發(fā)明文庫，從該篩檢獲得樣品，或?qū)⒁谚b定的某化合物作代謝研究，從中獲得該研究的樣品進(jìn)行AMS檢測；以及上述文庫，包含放射性同位素標(biāo)記化合物的固相支持物的用途，或上述定義的方法在生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境科學(xué)等中的篩選或篩檢，以便用AMS檢測的進(jìn)一步研究方法的用途。
文檔編號C07B61/00GK1754099SQ200480005421
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者R·C·加納, G·J·拉平 申請人:伊克賽拉倫有限公司