專利名稱：羥基磷灰石復(fù)性及同時(shí)純化基因重組蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羥基磷灰石復(fù)性及同時(shí)純化基因重組蛋白質(zhì)的方法，屬于基因工程下游技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
以大腸桿菌為宿主來(lái)表達(dá)的基因重組蛋白質(zhì)，往往絕大部分以不可溶且無(wú)生物活性的包涵體形式存在。常用變性劑來(lái)溶解包涵體，然后通過(guò)透析或稀釋的方法除去變性劑或降低其濃度，在無(wú)變性劑或低濃度變性劑的條件下，蛋白質(zhì)才能獲得天然構(gòu)象，獲得生物活性，這一過(guò)程稱為復(fù)性。但采用這兩種方法，大部分蛋白質(zhì)要形成沉淀，只有小部分蛋白質(zhì)，約5～20％，獲得復(fù)性。
根據(jù)劉國(guó)詮主編《生物工程下游技術(shù)》，化學(xué)工業(yè)出版社2003年第二版，采用液相色譜技術(shù)復(fù)性蛋白質(zhì)有良好的效果，活性回收率有很大的改善，且同時(shí)有純化的作用。能夠用于蛋白質(zhì)復(fù)性及同時(shí)純化的有凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜、疏水色譜、親和色譜。凝膠過(guò)濾色譜是利用蛋白質(zhì)分子與變性劑分子的大小不同，而逐漸將兩者分離，實(shí)現(xiàn)復(fù)性，其關(guān)鍵是在柱床中形成良好的變性劑濃度梯度，使蛋白逐漸脫離變性劑；后三者屬于吸附性色譜，都是利用柱床的固定相與蛋白質(zhì)的吸附作用力強(qiáng)于固定相與變性劑的作用力，而將蛋白質(zhì)與變性劑分離，這種吸附作用也可幫助蛋白復(fù)性和防止蛋白沉淀。但是，均有其不足之處。凝膠過(guò)濾色譜中，變性劑的濃度梯度不易控制，蛋白質(zhì)容易在色譜柱中沉淀而堵塞柱子，加載蛋白濃度不能太高；純化能力較差。在離子交換色譜，最常用的變性劑鹽酸胍也會(huì)在固定相中保留，不僅影響柱容量，而且往往與蛋白質(zhì)一起在洗脫過(guò)程中流出色譜柱，從而使最有效提取蛋白質(zhì)的變性劑鹽酸胍的使用受到限制。中國(guó)專利ZL92102727，在疏水色譜復(fù)性中，要在變性液中加高濃度的鹽，限制了蛋白濃度，且容易在柱頭處產(chǎn)生沉淀。親和色譜只對(duì)一種或少數(shù)幾種蛋白質(zhì)有親和作用，適用范圍窄。因此，采用良好的色譜填料、探索適宜的操作條件，在復(fù)性純化蛋白質(zhì)的同時(shí)，防止沉淀的產(chǎn)生，是液相色譜復(fù)性基因重組蛋白質(zhì)的關(guān)鍵問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種羥基磷灰石復(fù)性及同時(shí)純化基因重組蛋白質(zhì)的方法，其特點(diǎn)是采用羥基磷灰石作為液相色譜填料，在變性蛋白加載前后加入變性劑，對(duì)高濃度變性蛋白進(jìn)行復(fù)性，避免了蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中產(chǎn)生沉淀，提高了活性回收率，目的蛋白的純度達(dá)到90％。
本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所用原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外，均為摩爾數(shù)。
羥基磷灰石復(fù)性及同時(shí)純化基因重組蛋白質(zhì)的方法1.選用對(duì)變性蛋白有強(qiáng)的吸附能力而對(duì)變性劑和還原劑的吸附能力較弱的羥基磷灰石作為填料，用高濃度變性劑4～8mol/L脲，防止蛋白在管道和柱頭處的沉淀。用洗脫方法將蛋白與變性劑和還原劑分離，實(shí)現(xiàn)蛋白的折疊復(fù)性；同時(shí)將目的蛋白和雜蛋白分離，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的純化。
2.洗脫變性劑、還原劑常用變性劑為鹽酸胍和脲、還原劑為二硫蘇糖醇，與羥基磷灰石結(jié)合力較弱，可用去離子水或低濃度鹽溶液如0～0.05mol/L的含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+等陽(yáng)離子的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽溶液將其洗脫。
3.洗脫蛋白質(zhì)羥基磷灰石對(duì)蛋白的吸附作用類似于離子交換劑，可用pH＞5的濃度較高的鹽如0.1～3mol/L，含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+等陽(yáng)離子的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽溶液，線性梯度或階梯梯度分別洗脫雜蛋白和目的蛋白。
4.柱子再生目的蛋白洗脫后，用上述高濃度鹽或0.5～1mol/L的氫氧化鈉將所有雜蛋白完全洗脫，然后再用去離子水或低離子濃度鹽溶液平衡柱子，至少5個(gè)柱床體積。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)在變性蛋白上樣前后加用變性劑，避免了蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集而沉淀；(2)適用范圍廣，羥基磷灰石既能結(jié)合帶正負(fù)電荷的蛋白，也能結(jié)合不帶電荷的中性蛋白，可用于多種基因重組蛋白質(zhì)的復(fù)性及純化；而且，鹽酸胍和脲變性的蛋白都可以直接上柱；(3)羥基磷灰石十分穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好；填料經(jīng)濟(jì)，有助于工業(yè)放大。適用于基因工程下游重組蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化。
四

圖1為色譜操作裝置示意圖1.去離子水或低濃度鹽溶液槽2.高濃度脲溶液槽3.變性蛋白槽4.高濃度鹽溶液槽5.泵6.羥基磷灰石色譜柱7.檢測(cè)器8.收集器。
圖2為上樣示意圖9.高濃度脲10.變性蛋白溶液。
圖3為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的復(fù)性及同時(shí)純化操作中的色譜圖和電泳圖A、B、C為雜蛋白組分，D為目的蛋白組分，a、b、c、d為雜蛋白組分的電泳圖譜，e、f為目的蛋白組分的電泳圖譜，g為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
五具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
實(shí)施例1、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2用鹽酸胍及二硫蘇糖醇將重組菌包涵體還原變性溶解，使總蛋白濃度25～30mg/ml，鹽酸胍濃度6mol/L，二硫蘇塘醇0.2mol/L。上樣條件先用1ml 8mol/L脲平衡柱頭，柱子規(guī)格為φ1.6cm×3cm，上變性液1.5ml，而后，又灌注1ml 8mol/L脲。淋洗條件先用去離子水洗脫變性劑和還原劑，再用梯度磷酸鈉分別洗脫雜蛋白和目的蛋白。色譜和電泳測(cè)試結(jié)果詳見圖3所示，A、B、C為雜蛋白峰，a條帶為A峰的組分，b、c為C峰組分，d為B峰組分，g條帶為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，D峰為目的蛋白峰，e、f為D峰組分，目的蛋白純度為90％。將D峰組分脫鹽后直接氧化。氧化條件是pH＝8.5，還原型谷胱甘肽2mmol/L，氧化型谷胱甘肽1mmol/L。誘導(dǎo)大鼠胚胎肌母細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)生物活性，目的蛋白活性回收率約30～50％。
2、雞蛋白溶菌酶用8mol/L脲和0.2mol/L二硫蘇糖醇還原變性溶菌酶，溶菌酶濃度約35mg/ml，充分變性4小時(shí)后，加磷酸二氫鈉至終濃度0.02mol/L，而后上樣0.2ml于用0.02mol/L磷酸二氫鈉平衡好的羥基磷灰石柱子φ1.6cm×2cm，加樣前后加用0.5ml含8mol/L脲和0.02mol/L磷酸二氫鈉的溶液。依次用0.02M磷酸二氫鈉和0.2M磷酸氫二鈉淋洗，得到兩個(gè)峰。將第一峰脫鹽、氧化，氧化條件是0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸pH＝8.5、2mmol/L還原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽氧化；第二峰直接加還原型谷胱甘肽至2mmol/L、氧化型谷胱甘肽至0.2mmol/L氧化?；钚曰厥章蚀笥?5％。
3、豬胃蛋白酶變性方法及柱子規(guī)格同溶菌酶，蛋白濃度約33.33mg/ml，上樣0.3ml，前后用0.5ml8mol/L脲溶液。依次用去離子水、0.15mol/L磷酸氫二鈉淋洗，得到兩個(gè)峰。將第一峰脫鹽后，加三羥甲基氨基甲烷-鹽酸pH＝8.5至終濃度0.05mol/L、2mmol/L還原型谷胱甘肽和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽氧化；第二峰直接加2mmol/L還原型谷胱甘肽、0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽氧化?；钚曰厥章始s75％。
權(quán)利要求
1.羥基磷灰石復(fù)性及同時(shí)純化基因重組蛋白質(zhì)的方法，其特征在于(1)選用對(duì)變性蛋白有強(qiáng)的吸附能力而對(duì)變性劑和還原劑的吸附能力較弱的羥基磷灰石作為填料，用高濃度變性劑4～8mol/L脲，防止蛋白在管道和柱頭處的沉淀，用洗脫方法將蛋白與變性劑和還原劑分離，實(shí)現(xiàn)蛋白的折疊復(fù)性；同時(shí)將目的蛋白和雜蛋白分離，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的純化，(2)洗脫變性劑、還原劑常用變性劑為鹽酸胍和脲、還原劑為二硫蘇糖醇，與羥基磷灰石結(jié)合力較弱，可用去離子水或低濃度鹽溶液如0～0.05mol/L的含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+陽(yáng)離子的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽溶液將其洗脫，(3)洗脫蛋白質(zhì)羥基磷灰石對(duì)蛋白的吸附作用類似于離子交換劑，可用pH＞5的濃度較高的鹽如0.1～3mol/L，含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+陽(yáng)離子的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽溶液，線性梯度或階梯梯度分別洗脫雜蛋白和目的蛋白，(4)柱子再生目的蛋白洗脫后，用上述高濃度鹽或0.5～1mol/L的氫氧化鈉將所有雜蛋白完全洗脫，然后再用去離子水或低離子濃度鹽溶液平衡柱子，至少5個(gè)柱床體積。
全文摘要
一種羥基磷灰石復(fù)性及同時(shí)純化基因重組蛋白質(zhì)的方法。其特點(diǎn)是選用對(duì)變性蛋白有強(qiáng)的吸附能力而對(duì)變性劑和還原劑的吸附能力較弱的羥基磷灰石作為填料，用高濃度變性劑防止蛋白在管道和柱頭處的沉淀。用適當(dāng)?shù)南疵摲椒▽⒌鞍?、變性劑和還原劑分離，實(shí)現(xiàn)蛋白的折疊復(fù)性，同時(shí)將目的蛋白和雜蛋白分離，提高了活性回收率，目的蛋白純度達(dá)到90％。
文檔編號(hào)C07K1/16GK1569888SQ20041002247
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月10日
發(fā)明者姚少華, 張伶俐, 張興棟, 范紅松 申請(qǐng)人:四川大學(xué)