專利名稱：人DNA聚合酶β突變基因和對應(yīng)蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的人基因核苷酸序列，具體涉及一種人類修復(fù)基因DNA聚合酶β的cDNA序列，是DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現(xiàn)形式，稱為M-POLB，它所編碼的蛋白完全喪失DNA聚合酶β的DNA修復(fù)活性，該蛋白稱為M-POLB.AMI。即本發(fā)明涉及了該基因的cDNA編碼序列、該核苷酸序列編碼的多肽以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的M-POLB.AMI的方法。
背景技術(shù)：
1971年Weissbach等從牛胸腺中分離出了一類不同于DNA聚合酶α的新的DNA聚合酶，并命名為DNA聚合酶β(Polymeraseβ，POLB)，其全稱為依賴DNA的DNA聚合酶β。迄今為止它是真核生物中已知的五種DNA聚合酶之一。有人稱其為生物進(jìn)化過程中的“看家酶”[1]。POLB是一種分子量為39kDa的小分子多肽，廣泛存在于哺乳類動物細(xì)胞內(nèi)，其功能主要是參與DNA的損傷修復(fù)(Dresler Sl et al，J Rio Chem，19832589990-9994)。POLB分子結(jié)構(gòu)和催化活性POLB是廣泛存于哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)，是一條由單條肽鏈小分子蛋白質(zhì)，其分子量為39Kda，在溶液中以單鏈形式存在。人和嚙齒類動物POLB的一級結(jié)構(gòu)為一條由335個氨基酸組成的多肽，其2級結(jié)構(gòu)中有10％的螺旋和50％ β片層(TanabeK et al，J Bio Chem，1981，2563089-3102)。由四個亞基構(gòu)成。POLB具有催化DNA聚合的作用，但它與其它DNA聚合酶不同，不具有3’→或5’→核酸外切酶活性，亦無焦磷酸置換，焦磷酸水解，dNTP和RNA水解功能。用蛋白裂解法證明該酶有兩個不同的功能區(qū)(Beard Wa et al.Mutat Res 2000，30；460231-44)一個N-未端，約含有75個氨基酸；一個C-末端，約含有250個氨基酸，。在催化DNA聚合反應(yīng)時，前者與模板結(jié)合，后者與dNTP結(jié)合。進(jìn)一步研究表明，C-末端區(qū)分為三個亞區(qū)一個“指部”亞區(qū)(88至151氨基酸)；一個“掌部”亞區(qū)(151至262氨基酸)和一個“拇指”亞區(qū)(263至355氨基酸)。N-末端具有切除脫氧磷酸殘基的活性并與DNA模板及引物具有高度的親和性；它的催化中心位于Lys72。而C-末端區(qū)具有核苷酸轉(zhuǎn)移活性即聚合酶活性其中最重要的催化位點(diǎn)，位于掌亞區(qū)的190位和192位氨基酸的Asp以及拇指區(qū)256位氨基酸的Asp和283的Arg，它們均與核苷酸轉(zhuǎn)移活性關(guān)系密切(M.R，Sawaya，et al，Science 1994，2641930-1935)。更深入的研究表明拇指亞區(qū)的運(yùn)動對POLB的活性非常重要，在缺乏DNA和dNTP的情況下，位于鹽橋中的Asp192與Arg258結(jié)合；而DNA和dNTP存在的情況下，拇指亞區(qū)與掌亞區(qū)接近，拇指亞區(qū)殘基Glu295和Tys296以氫鍵結(jié)合到Arg258上，接著，Arg192從Arg258上解脫而連接上一個Mg2+，作為連接金屬離子的核苷酸來激活核苷酸轉(zhuǎn)移步驟。在催化反應(yīng)過程中，需要Mg2+或Mn2+作為激活劑。與引物適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合形狀、原料dNTP及POLB活性位點(diǎn)氨基酸殘基均是該酶保真性的影響因素。其反應(yīng)過程遵循BiBi機(jī)制即它先和模板引物結(jié)合，再與dNTP反應(yīng)，在雙鏈DNA缺口中插入一個核苷酸時，再次與引物的3’-OH結(jié)合，開始第二輪反應(yīng)。反應(yīng)的最適PH在8.5-9.0范圍內(nèi)，高鹽濃度(＞100mmol/L)對酶有激活作用，甘油和蔗糖對其也有激活作用。pH在4.5-10.5范圍內(nèi)該酶較穩(wěn)定，若在酶溶液中加入蛋白質(zhì)可以增加它的穩(wěn)定性。它對許多試劑有抗性，如5M脲、磷酸乙酯、20％-50％Z醇和丙酮均可影響其活動。但是該酶的穩(wěn)定性較差，在過熱(＞42℃)時此酶更容易失去活性。某些抑制劑(如d2TTP和d2CTP)能特異性地抑制POLB的活性。綜觀現(xiàn)有研究結(jié)果，POLB參于DNA的聚合反應(yīng)特點(diǎn)是催化雙鏈DNA上短小缺口中的DNA合成，當(dāng)這些缺口在10個核苷酸下時它能將它們完成填補(bǔ)，對DNA雙鏈上更大的缺口的修補(bǔ)，常常需要與其它修復(fù)酶共同參于。POLB還可能參與DNA的重組合成以及由單鏈DNA向雙鏈DNA轉(zhuǎn)化的過程。
在細(xì)胞內(nèi)POLB常與一種對雙鏈DNA具有雙向外切(5’→3’和3’→5’)作用的DNaseV以等克分子復(fù)合物一起分離出來。推測這兩種蛋白一起構(gòu)成了DNA修復(fù)復(fù)雜體系超分子結(jié)構(gòu)中的一部分。Moshangh和Linn于1983年證實，Hela細(xì)胞POLB和DnaseV能從DNA上單個核苷酸缺口處開始進(jìn)行長片段的DNA合成，Hela細(xì)胞能夠加強(qiáng)POLB聚合DNA的速度和程度，它可能與DnaseV聯(lián)合參與DNA鏈上長、短缺口的修復(fù)合成。Zmudzka等用重組大鼠POLB研究了酶濃度同催化作用的關(guān)系，表明該酶活性同反應(yīng)混合物中酶蛋白濃度是有關(guān)的。當(dāng)酶和模板缺口比例超過1∶1時，能夠進(jìn)行廣泛的鏈重組合成；當(dāng)酶濃度較低時，此酶難以利用帶小缺口的DNA模板。POLB在催化DNA合成時，可能還需要酶蛋白分子的相互協(xié)同作用。最近有報道它也可與XRCC1形成復(fù)合體[51]。Zhou J等報道p53能協(xié)助POLB進(jìn)行堿基切除修復(fù)(ZhouJ，et al.EMBO J 2001 Feb 15；20(4)914-23)參與DNA損傷的修復(fù)一系列研究結(jié)果提示，POLB參于DNA損傷修復(fù)過程。Hubscher等報道，成年大鼠神經(jīng)細(xì)胞核中幾乎無DNA聚合酶α活性，γ酶也只占0.8％，而POLB高達(dá)99.2％。這種細(xì)胞經(jīng)UV照射后，大量的DNA修復(fù)合成是由POLB參與的。國內(nèi)外的一些研究者采用γ和β酶專一性抑制劑NEM/d2TTP，在選擇性抑制α酶和γ的條件下，觀察γ射線照射后細(xì)胞核內(nèi)受損DNA的修復(fù)合成，提示POLB參與了受損DNA的修復(fù)合成。一些學(xué)者對POLB參與了化學(xué)藥物所致的DNA損傷修復(fù)過程也作了報道。另外Raaphorst在實驗中發(fā)現(xiàn)，用d2CTP抑制POLB以后，可以增加C3H10T-1/2細(xì)胞的潛在性致死損傷(PTD)和潛在性轉(zhuǎn)化損傷(PTD)，細(xì)胞的存活率和腫瘤轉(zhuǎn)化能力均降低，提示POLB還可能參與細(xì)胞PLD和PTD的修復(fù)過程，并且這種修復(fù)過程是通過旁路修復(fù)實現(xiàn)的。Ohnishi的研究結(jié)果提示，POLB對DNA損傷的修復(fù)作用，有一部分可能是通過切除修復(fù)完成的。T.Lindahl，和R.D.Wood指出，堿基修復(fù)包括五個程序化反應(yīng)①通過特異性的葡萄糖基酶移去突變的堿基而產(chǎn)生一個AP位點(diǎn)(apurinic-apyrimidinic site)；②通過AP核酸內(nèi)切酶切開5’端的AP位點(diǎn)；③切除5’端的脫氧核糖磷酸殘基而造成一個單鏈核苷酸缺口；④DNA聚合酶通過DNA合成來填補(bǔ)缺口；⑤DNA連接酶封閉缺口。在此過程中，DNA聚合酶既有切除脫氧核糖磷酸酶活性也有聚合酶活性，從而在堿基修復(fù)中發(fā)揮重要效能(Podlutsky AJ，et al，Biochemistry 2001 Jan23；40(3)809-13)。
其它生物學(xué)功能POLB除了有修復(fù)DNA損傷作用外，人們還發(fā)現(xiàn)它有其它功能。一些跡象表明，POLB對細(xì)胞生長，增殖和分化可能有調(diào)控作用；另外，POLB與腫瘤組織可能存在某些生物學(xué)聯(lián)系。腫瘤組織中POLB變化可能與腫瘤細(xì)胞對化療或放療的抗性有關(guān)，也可能與腫瘤修復(fù)發(fā)有關(guān)(Miura M，et al，Radiat Res 2000，Jun；153(6)773-80)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人基因序列M-POLB，并根據(jù)M-POLB基因特征用于食管癌的早期診斷和基因治療的人DNA聚合酶β突變體基因，該基因是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現(xiàn)形式。
本發(fā)明的目的還在于提供了一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)對應(yīng)該基因的新的蛋白M-POLB.AMI。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種分離出的DNA分子(以M-POLB表示)，是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現(xiàn)形式，與GenBank中M13140比較它包括177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。具體基因序列如下10 20 30 40 50 60CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC AAGCTGGGAG70 80 90100110120AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG GGTGCAGGCC GCCATGAGCA130140150160170180AACGGAAGGC GCCGCAGGAG ACTCTCAACG GGGGAATCAC CGACATGCTC ACAGAAAAGC190200210220230240AGCATCTGTT ATAGCAAAAT ACCCACACAA AATAAAGAGT GGAGCTGAAG CTAAGAAATT250260270280290300GCCTGGAGTA GGAACAAAAA TTGCTGAAAA GATTGATGAG TTTTTAGCAA CTGGAAAATT310320330340350360ACGTAAACTG GAAAAGATTC GGCAGGATGA TACGAGTTCA TCCATCAATT TCCTGACTCG370380390400410420AGTTAGTGGC ATTGGTCCAT CTGCTGCAAG GAAGTTTGTA GATTAAGGAA TTAAAACACT430440450460470480AGAAGATCTC AGAAAAAATG AAGATAAATT GAACCATCAT CAGCGAATTG GGCTGAAATA490500510520530540TTTTGGGGAC TTTGAAAAAA GAATTCCTCG TGAAGAGATG TTACAAATGC AAGATATTGT550560570580590600ACTAAATGAA GTTAAAAAAG TGGATTCTGA ATACATTGCT ACAGTCTGTG GCAGTTTCAG610620630640650660AAGAGGTGCA GAGTCCAGTG GTGACATGGA TGTTCTCCTG ACCCATCCCA GCTTCACTTC670680690700710720AGAATCAACC AAACAGCCAA AACTGTTACA TCAGGTTGTG GAGCAGTTAC AAAAGGTTCA730740750760770780TTTTATCACA GATACCCTGT CAAAGGGTGA GACAAAGTTC ATGGGTGTTT GCCAGCTTCC790800810820830840CAGTAAAAAT GATGAAAAAG AATATCCACA CAGAAGAATT GATATCAGGT TGATACCCAA
850860870880890900AGATCAGTAT TACTGTGGTG TTCTCTATTT CACTGGGAGT GATATTTTCA ATAAGAATAT910920930940950960GAGGGCTCAT GCCCTAGAAA AGGGTTTCAC AATCAATGAG TACACCATCC GTCCCTTGGG970980990 1000 1010 1020AGTCACTGGA GTTGCAGGAG AACCCCTGCC AGTGGATAGT GAAAAAGACA TCTTTGATTA1030 1040 1050 1060 1070 1080CATCCAGTGG AAATACCGGG AACCCAAGGA CCGGAGCGAA TGAGGCCTGT ATCCTCCCTG1090 1100 1110 1120 1130 1140GCGCAGACAC AACCCAATGG GTCTTAATTT ATTTCTTAAC CTTTGCTATG TAAGGGTCTT1150 1160 1170 1180 1190 1200TGGTGTTTTT AAATGATTGT TTCTTCTTCA TGCTTTTGCT TGCAATGTAG TCAATAAAAC1210 1220 1230 1240 1250 1260C......... .......... .......... .......... .......... ..........
DNA分子即M-POLB，其編碼的多肽序列如下(以M-POLB.AMI表示)，該序列具有M-POLB中從核苷酸114位～192位的核苷酸編碼Met Ser Lys Arg Lys Ala Pro Gln Glu Thr Leu Asn Gly Gly Ile Thr Asp MetLeu Thr Glu Lys Gln His Leu Leu。
本發(fā)明的積極效果如下本發(fā)明的M-POLB基因特征與食管癌發(fā)生的相關(guān)性極為密切，檢測本發(fā)明特征基因位點(diǎn)，可用來對食管癌，早發(fā)現(xiàn)、早治療，可以大大提高術(shù)后存活率。利用本發(fā)明提供的M-POLB基因，結(jié)合基因特征，可以人工合成針對M-POLB基因的反義RNA，用于阻斷突變型DNA聚合酶β的表達(dá)，以實現(xiàn)基因治療的目的。在中國食管癌高發(fā)區(qū)林州市食管癌病人手術(shù)標(biāo)本中檢測到本發(fā)明的M-POLB基因特征占80％以上。
1.食管癌病人與正常人DNA聚合酶β(簡稱POLB)基因比較

從本表統(tǒng)計分析結(jié)果可以清晰看出，正常人中DNA聚合酶β(簡稱POLB)基因正常，而在食管癌病人中，無論是早期、無論是高發(fā)區(qū)、還是非高發(fā)區(qū)的癌病人的DNA聚合酶β(簡稱POLB)基因絕大多數(shù)發(fā)生了本發(fā)明涉及的變異。因此，利用檢測本發(fā)明的M-POLB，作為早期檢測和診斷食管癌的方法，是可行的、也是可靠的。
2.反義RNA基因治療荷瘤動物實驗結(jié)果設(shè)計包含M-POLB基因特征點(diǎn)177-234位缺失的反義RNA，純化后，用脂質(zhì)體包裹，注入荷瘤裸鼠體內(nèi)。反義RNA基因治療組比對照組荷瘤裸鼠的平均存活時間長出22天，比干擾素治療組荷瘤裸鼠的平均存活時間長出14天。本實驗結(jié)果說明，使用本發(fā)明設(shè)計的針對M-POLB的反義RNA治療方法，對食管癌細(xì)胞有顯著的治療效果，比通常使用的抗腫瘤藥物干擾素更有效。


圖1、2、3為本發(fā)明的M-POLB基因的獲得途徑圖。圖4為本發(fā)明的M-POLB基因核苷酸序列讀碼框架分析圖。圖5為本發(fā)明的M-POLB基因原核表達(dá)載體構(gòu)件及蛋白表達(dá)純化圖。圖6為本發(fā)明的M-POLB基因真核表達(dá)載體構(gòu)件及蛋白表達(dá)純化圖。
具體實施例方式
實施例1M-POLB基因的克隆如圖1、2、3、4所示，本發(fā)明的M-POLB基因的獲得途徑和M-POLB基因核苷酸序列讀碼框架分析如下1.組織分離中國食管癌高發(fā)區(qū)河南省林州市浸潤癌的食管癌組織手術(shù)標(biāo)本，于手術(shù)現(xiàn)場取材后立即儲存于-196℃液氮中。2.mRNA的分離用QIAGEN公司總RNA提取試劑盒選取(按提取試劑盒進(jìn)行)3.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA片段5×RT緩沖液(含50mmol/LMgCl2)6μl，10mmol/L 4×dNTP 2μl，RNasin 40U，AMV 2U，下游引物(P25’TCATTCGCTCCGGTCCTTGG 3’)1μl，提取總RNA 5μl，DEPC水補(bǔ)足30μl，用2滴液體石蠟封頂，42℃水浴逆轉(zhuǎn)錄45min。4.PCR擴(kuò)增和克隆擴(kuò)增反應(yīng)體積為30μl，10×緩沖液3μl，5mmol/L 4×dNTP 2μl，上游和下游引物(P1 5’ATGAGCAAACGGAGGGCGCCG 3’，P2 5’TCATTCGCTCCGGTCCTTGG 3’由上海生工公司合成，PAGE純化)各1μl，PE公司Golden Taq酶2U，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，去離子H2O補(bǔ)足30μl體積。20μl液體石蠟封頂，用PE 480型PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為95℃ 10min預(yù)變性；94℃ 50sec，66℃ 50sec，72℃ 60sec三溫循環(huán)30次；72℃ 7min末延伸。將聚合酶β全基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，從瓊脂糖中回收該區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用Promega公司的PCR產(chǎn)物純化和克隆試劑盒，純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化入宿主菌JM103。經(jīng)α互補(bǔ)藍(lán)白篩選得到陽性克隆。5.序列分析利用熒光標(biāo)記法ABI377測序儀測序，得到M-POLB基因序列。M-POLB基因同源性比較本發(fā)明的人M-POLB的全長cDNA編碼序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ數(shù)據(jù)庫及Non-redundantGenBanktranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與人和小鼠DNA聚合酶β基因具有最高的同源性。
圖中M13140為GenBank人DNA聚合酶β基因序列，加方框處為，本發(fā)明基因特征位點(diǎn)，包括177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。
10 20 30 40 50M13140 1 CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC50M-POLB 1 CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC5060 70 80 90100M1314051 AAGCTGGGAG AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG100M-POLB51 AAGCTGGGAG AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG100 蛋白質(zhì)同源性比較結(jié)果10 20 30 40 50M13140 1 MSKRKAPQET LNGGITDMLT ELANFEKNVS QAIHKYNAYR KAASVIAKYP50M-POLB 1 MSKRKAPQET LNGGITDMLT EKQHLL---- ---------- ----------5060 70 80 90100M13140 51 HKIKSGAEAK KLPGVGTKIA EKIDEFLATG KLRKLEKIRQ DDTSSSINFL100M-POLB 51 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------100110120130140150M13140101 TRVSGIGPSA ARKFVDEGIK TLEDLRKNED KLNHHQRIGL KYFGDFEKRI150M-POLB101 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------150160170180190200M13140151 PREEMLQMQD IVLNEVKKVD SEYIATVCGS FRRGAESSGD MDVLLTHPSF200M-POLB151 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------200210220230240250M13140201 TSESTKQPKL LHQVVEQLQK VHFITDTRSK GETKFMGVCQ LPSKNDEKEY250M-POLB201 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------250260270280290300M13140251 PHRRIDIRLY PKDQYYCGVL YFTGSDIFNK NMRAHAKEKG FTINEYTIRP300M-POLB251 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------300310320330340350M13140301 LGVTGVAGEP LPVDSEKDIF DYIQWKYREP KDRSE..... ..........350M-POLB301 ---------- ---------- ---------- -----..... ..........350實施例2針對M-POLB基因特征點(diǎn)的基因檢測方法設(shè)計檢測M-POLB基因特征點(diǎn)177-234位缺失的探針。設(shè)計探針應(yīng)用于檢測本發(fā)明的M-POLB基因。設(shè)計探針可以包含部分和全部以下核苷酸序列或互補(bǔ)序列5’CTCGCAAACTTTGAGAAGAACGTGAGCCAAGCTATCCACAAGTACAATGCTTACAGAA 3’具體核酸分子雜交方法見分子克隆。以雜交反應(yīng)陽性，可早期診斷為食管癌。
PCR擴(kuò)增檢測M-POLB基因特征點(diǎn)177-234位缺失的引物，如上游引物5′GTCCTGGTACCTCCTTCAA 3′下游引物5′ACTCGTATCATCCTGCCGAA 3′，擴(kuò)增片段為365bp為正常，擴(kuò)增片段為308bp為異常，可早期診斷為食管癌。具體PCR方法見分子克隆。以PCR反應(yīng)陽性，可早期診斷為食管癌。
PCR擴(kuò)增檢測M-POLB基因特征點(diǎn)462nt G→T；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A的引物。具體PCR方法見分子克隆。以PCR反應(yīng)陽性，可早期診斷為食管癌。實施例3 反義RNA設(shè)計包含M-POLB基因特征點(diǎn)177-234位缺失的反義RNA，體外表達(dá)或合成，純化后，用脂質(zhì)體包裹，注入病變部位。設(shè)計的反義RNA如下5′CUAUAACAGAUGCUGCUUUUCUGUGAGCAUGUCGGUGAUUCCCCCGUUGAGAGUCUCCUGCGGCGCCUUCCGUUUGCUCAU 3′實施例4 人M-POLB在大腸桿菌中的表達(dá)以得到M-POLB基因克隆為模板，以含有PstI和HindIII的引物，使用PE公司高保真Taq酶擴(kuò)增出M-POLB讀碼框部分基因，用PstI和HindIII雙酶切擴(kuò)增片段和表達(dá)質(zhì)粒pQE-9，然后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入表達(dá)受體菌M15/rep4，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pERP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kan+)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用PstI和HindIII鑒定插入片段，并測序驗證M-POLB表達(dá)區(qū)cDNA片段已正確插入載體。在加入Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)上述鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子克隆，培養(yǎng)到光密度(OD600)為0.6時加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至終濃度為1mmol/L。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000g，20min)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中，待澄清后，通過對6-His標(biāo)記的親和層析柱分離，然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白進(jìn)行透析，得到純的表達(dá)蛋白。經(jīng)電泳分析和氨基酸序列測序，結(jié)果與預(yù)期一致。凍干保存。實施例5 人M-POLB在真核細(xì)胞(CHO)中的表達(dá)以得到M-POLB基因克隆為模板，以含有HindIII和BamHI的引物，使用PE公司高保真Taq酶擴(kuò)增出M-POLB讀碼框部分基因，用HindIII和BamHI雙酶切擴(kuò)增片段和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3，然后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入表達(dá)受體菌Ecoli DH5α。在含有Amp的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用HindIII和BamHI鑒定插入片段，并測序驗證M-POLB表達(dá)區(qū)cDNA片段已正確插入載體。然后在含有Amp(100μg/ml)的液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)含所構(gòu)件的克隆。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)實施。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)。對混合克隆無限稀釋，選擇具有較高蛋白酶活性的細(xì)胞亞克隆。按照常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞，以含0.05％Triton的50mmol/L Tris-HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以.含0.1mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白活性峰。然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白進(jìn)行透析。凍干保存。實施例6 抗體制備將實施5和6中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下，重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳方法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全福氏佐劑乳化，用100-500μg/ml乳化過的蛋白，0.2ml對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全福氏佐劑乳化的100-500μg/ml乳化過的蛋白，0.2ml對小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每各7天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行4次。獲得的抗血清的特異性反應(yīng)用它在體外沉淀M-POLB基因表達(dá)產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果顯示，抗體可特異性的與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
附圖為本發(fā)明的構(gòu)成圖(圖1—圖6)。采用一些常規(guī)方法，圖示質(zhì)粒和DNA片段。在實施本發(fā)明中所采取的大部分分子生物學(xué)的方法，包括RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR、SSCP、DNA重組、DNA序列分析、同源性序列比較、克隆表達(dá)等，都是該領(lǐng)域中專業(yè)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。使用的各種酶是由商業(yè)來源得到的，并按照說明書建議的方法使用。各種試劑、緩沖液和培養(yǎng)條件都是該領(lǐng)域中的專業(yè)人員公知的。這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的一般參考資料為Sambrook et al，Molecular CloningALaboratory Manual，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.″.″表示上下核苷酸一樣，″-″表示缺失，圖中M13140為GenBank人DNA聚合酶β基因序列，加方框處為，本發(fā)明基因特征位點(diǎn)，包括177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。
權(quán)利要求
1.一種人DNA聚合酶β突變體基因，其特征在于是一種分離出的DNA分子，以M-POLB表示，它是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現(xiàn)形式，與GenBank中M13140比較，它包括177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A，具體基因序列如下10 20 30 40 50 60CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC AAGCTGGGAG70 80 90100110120AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG GGTGCAGGCC GCCATGAGCA130140 150 160170180AACGGAAGGC GCCGCAGGAG ACTCTCAACG GGGGAATCAC CGACATGCTC ACAGAAAAGC190200210220230240AGCATCTGTT ATAGCAAAAT ACCCACACAA AATAAAGAGT GGAGCTGAAG CTAAGAAATT250260270280290300GCCTGGAGTA GGAACAAAAA TTGCTGAAAA GATTGATGAG TTTTTAGCAA CTGGAAAATT310320330340350360ACGTAAACTG GAAAAGATTC GGCAGGATGA TACGAGTTCA TCCATCAATT TCCTGACTCG370380390400410420AGTTAGTGGC ATTGGTCCAT CTGCTGCAAG GAAGTTTGTA GATTAAGGAA TTAAAACACT430440450460470480AGAAGATCTC AGAAAAAATG AAGATAAATT GAACCATCAT CAGCGAATTG GGCTGAAATA490500510520530540TTTTGGGGAC TTTGAAAAAA GAATTCCTCG TGAAGAGATG TTACAAATGC AAGATATTGT550560570580590600ACTAAATGAA GTTAAAAAAG TGGATTCTGA ATACATTGCT ACAGTCTGTG GCAGTTTCAG610620630640650660AAGAGGTGCA GAGTCCAGTG GTGACATGGA TGTTCTCCTG ACCCATCCCA GCTTCACTTC670680690700710720AGAATCAACC AAACAGCCAA AACTGTTACA TCAGGTTGTG GAGCAGTTAC AAAAGGTTCA730740750760770780TTTTATCACA GATACCCTGT CAAAGGGTGA GACAAAGTTC ATGGGTGTTT GCCAGCTTCC790800810820830840CAGTAAAAAT GATGAAAAAG AATATCCACA CAGAAGAATT GATATCAGGT TGATACCCAA850860870880890900AGATCAGTAT TACTGTGGTG TTCTCTATTT CACTGGGAGT GATATTTTCA ATAAGAATAT910920930940950960GAGGGCTCAT GCCCTAGAAA AGGGTTTCAC AATCAATGAG TACACCATCC GTCCCTTGGG970980990 1000 1010 1020AGTCACTGGA GTTGCAGGAG AACCCCTGCC AGTGGATAGT GAAAAAGACA TCTTTGATTA1030 1040 1050 1060 1070 1080CATCCAGTGG AAATACCGGG AACCCAAGGA CCGGAGCGAA TGAGGCCTGT ATCCTCCCTG1090 1100 1110 1120 1130 1140GCGCAGACAC AACCCAATGG GTCTTAATTT ATTTCTTAAC CTTTGCTATG TAAGGGTCTT1150 1160 1170 1180 1190 1200TGGTGTTTTT AAATGATTGT TTCTTCTTCA TGCTTTTGCT TGCAATGTAG TCAATAAAAC1210 1220 1230 1240 1250 1260C......... .......... .......... .......... .......... ..........
2.一種人DNA聚合酶β突變體基因?qū)?yīng)蛋白，其特征在于DNA分子即M-POLB其編碼的多肽，序列如下(以M-POLB.AMI表示)，該序列具有M-POLB中從核苷酸114位～192位的核苷酸編碼Met Ser Lys Arg Lys Ala Pro Gln Glu Thr Leu Asn Gly Gly Ile Thr Asp MetLeu Thr Glu Lys Gln His Leu Leu。
3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種人DNA聚合酶β突變體基因，其特征在于對應(yīng)M-POLB的特征突變點(diǎn)177-234位缺失點(diǎn)設(shè)置探針，探針核苷酸序列如下5CTCGCAAACTTTGAGAAGAACGTGAGCCAAGCTATCCACAAGTACAATGCTTACAGAA 3’
4.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種人DNA聚合酶β突變體基因，其特征在于可將上述基因插入兩種載體pQE9和pcDNA3，可得到的重組克隆pQE9-M-POLB和pcDNA3-M-POLB。
5.根據(jù)權(quán)利4要求所述的一種人DNA聚合酶β突變體基因，其特征在于所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。即將重組克隆pQE9-M-POLB轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α所得到的原核表達(dá)所述的多肽M-POLB.AMI的工程菌細(xì)胞；重組克隆pcDNA3-M-POLB轉(zhuǎn)化入真核細(xì)胞株CHO所得到的真核表達(dá)所述的多肽M-POLB.AMI的工程細(xì)胞株。
6.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種人DNA聚合酶β突變體基因，其特征在于基因治療用反義RNA分子為設(shè)計包含M-POLB基因特征點(diǎn)177-234位缺失的反義RNA，體外表達(dá)或合成，純化后，用脂質(zhì)體包裹，注入病變部位。設(shè)計的反義RNA如下5’CUAUAACAGAUGCUGCUUUUCUGUGAGCAUGUCGGUGAUUCCCCCGUUGAGAGUCUCCUGCGGCGCCUUCCGUUUGCUCAU 3’
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人基因核苷酸序列,尤其涉及人類修復(fù)基因DNA聚合酶β的cDNA序列,是DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現(xiàn)形式,它所編碼的蛋白完全喪失DNA聚合酶β的DNA修復(fù)活性,它是一種分離出的DNA分子,以M－POLB表示,是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現(xiàn)形式,與GenBank中M13140比較,它包括:177－234位缺失;462nt G→T;599位T→A;796位G→T;797位T→G;962位A→G;972位A→C;973位A→T;974位G→A;889位插入G,896位缺失A,本發(fā)明提供的基因特征對于食管癌的早期診斷和基因治療具有重要作用。
文檔編號C07K14/435GK1366047SQ0112837
公開日2002年8月28日 申請日期2001年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月24日
發(fā)明者董子明, 趙國強(qiáng), 趙勤, 譚曉輝, 楊洪艷, 薛樂勛 申請人:鄭州大學(xué)