專利名稱：含有枯草溶菌素變種的織物清洗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含蛋白酶的織物清洗組合物，其中的蛋白酶是枯草溶菌素的變種。
背景技術(shù)：
酶是最大的一類天然存在的蛋白質(zhì)。每類酶一般催化(促進反應(yīng)但本身不會被消耗掉)不同種類的化學(xué)反應(yīng)。已知的一類酶是蛋白酶，它們水解(將化合物分解成兩個或多個簡單化合物，這些化合物保留了在斷開的化學(xué)鍵任一側(cè)的水分子的H和OH部分)其它蛋白質(zhì)的能力是已知的。通過將天然存在的蛋白酶和人工產(chǎn)生蛋白質(zhì)的蛋白酶作為添加劑加入洗衣洗滌劑制品中，它們水解蛋白質(zhì)的能力得到了利用。在衣物上的許多污漬是蛋白類的污垢，特性寬的蛋白酶可基本上改善了對這些污漬的去除。
遺憾的是處于天然的、細菌環(huán)境的這些有效力的蛋白質(zhì)常常不能轉(zhuǎn)換成適于相對的非天然的洗滌環(huán)境。具體說，在蛋白酶的天然環(huán)境之外應(yīng)用，蛋白酶的特性如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性和基質(zhì)的特性都不是所需最佳的。
蛋白酶的氨基酸序列決定了蛋白酶的特性。蛋白酶氨基酸序列的變化可以改變酶的性質(zhì)，變化酶的等級或甚至可使酶失活，這取決于在氨基酸序列中所變化的位置、性質(zhì)和/或數(shù)量。已采用了幾種方案變化溫和型蛋白酶的氨基酸序列以試圖改善它們的性質(zhì)，目的是增強蛋白酶在洗滌環(huán)境中的效力。這些方案包括改變氨基酸序列以增強在多種條件下的熱穩(wěn)定性和改善在多種條件下的氧化穩(wěn)定性。
盡管在現(xiàn)有技術(shù)中描述了多種方案，但仍不斷需求用于清洗織物表面的包含蛋白酶有效變種的組合物。
本發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供包含枯草溶菌素酶變種的織物清洗組合物。
概述本發(fā)明涉及包含枯草溶菌素BPN′變種的用于清洗織物表面的組合物。用于這些組合物中的BPN′變種比溫和型枯草溶菌素BPN′在至少一個、兩個或三個明確確定的氨基酸位置處有不同氨基酸(即替代物)，由此該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比降低了對于不溶性基質(zhì)的吸附和增強了對不溶性基質(zhì)的水解。
詳述1.用于織物清洗組合物中的枯草溶菌素變種本發(fā)明涉及包含枯草溶菌素酶，尤其是BPN′的織物清洗組合物，所述的酶是通過突變編碼酶的各種核苷酸序列由此改變了酶的氨基酸序列而被改性的。用于本發(fā)明組合物中的改性的枯草溶菌素酶(下文稱“BPN′變種”)與溫和型的枯草溶菌素相比降低了對不溶性基質(zhì)的吸附和增強了對不溶性基質(zhì)的水解。這些BPN′變種中的某些被描述在Brode等人于1993年9月15日申請的共同未決的申請U.S.S.N.08/121，437中。
用于本發(fā)明組合物中的枯草溶菌素酶屬于已知為蛋白酶的一類酶。蛋白酶是分裂肽鍵的催化劑。一種類型的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶的特點在于在活性部位存在主要為絲氨酸的殘基。
有許多資料證明觀測到酶水解可溶性基質(zhì)的速率隨酶濃度而增加。對于例如在許多清洗應(yīng)用中所遇到的結(jié)合在表面的基質(zhì)物而言，水解速率隨著表面濃度增加而增加，這似乎是合理的。對于這種情況已有所說明。(Brode，P.F.III和D.S.Rauch，LANGMUIR，“枯草溶菌素酶BPN′在不動基質(zhì)上的活性(Subtilisin BPN′Activity on anImmobilized Substrate)”，8卷，pp.1325-1329(1992)。事實上當酶的表面濃度變化時，發(fā)現(xiàn)不溶性基質(zhì)物的水解速率與表面濃度之間有線性關(guān)系。(Rubingh，D.N.和M.D.Bauer的“在蛋白質(zhì)-溶液界面處蛋白酶對水解的催化(Catalysis of Hydrolysis by Proteasesat the Protein-Solution Interface.)”in POLYMER SOLUTIONS，BLENDS AND INTERFACES，由I.Noda和D.N.Rubingh出版，Elsevier，p，464(1992))。意外的是當試圖應(yīng)用這種原則來尋找給出較好清洗織物性能的蛋白酶變種時，我們沒有發(fā)現(xiàn)吸附較多基質(zhì)物的酶會給出較好的性能。事實上我們意外地測定到了相反的情況降低酶對基質(zhì)物吸附卻導(dǎo)致了基質(zhì)物的水解的增強(即，產(chǎn)生較好的清洗性能)。
不希望受理論的約制，但確信當將一種變種與另外的進行比較時，這種改進的性能是以下事實的結(jié)果，即吸附少的酶也被結(jié)合的不太牢固，因此它在將被除去的不溶性蛋白質(zhì)基質(zhì)物的表面上有較高流動性。在可比的酶溶液的濃度下，這種增加的流動性與向表面釋放較高濃度酶相比足以勝過任何優(yōu)點。
本文描述的突變性指的是酶對粘合在表面上污垢的吸附的變化(即降低)。在BPN′中，從199位置至220位置的氨基酸在酶分子上形成一個較大內(nèi)環(huán)。已發(fā)現(xiàn)該環(huán)在酶分子對于結(jié)合在表面上的肽的吸附方面起顯著作用，和在該環(huán)中的特定變化對于這種吸附有顯著影響。不希望受理論約制，相信該環(huán)對于BPN′分子吸附作用的重要性有至少兩個原因。第一這種內(nèi)環(huán)中的氨基酸可與分子所暴露的任何表面有密切接觸。第二該環(huán)與活性位置的接近和BPN′分子的結(jié)合位置在催化產(chǎn)生的酶對于結(jié)合在表面上的基質(zhì)物(肽/蛋白污垢)的吸附方面賦予酶一定的作用。
本文所用的“變種”意思是具有不同于溫和型的氨基酸序列的酶。
本文所用的“突變體BPN′基因”意思是編碼BPN′變種的基因。
本文所用的“溫和型枯草溶菌素BPN”指的是由SEQ ID NO1表示的枯草溶菌素酶。枯草溶菌素BPN′的氨基酸序列另外由Wells，J.A.，E.Ferrari，D.J.Henner，D.A.Estell和E.Y.Chen，描述在核酸研究(NUCLEIC ACIDS RESEARCH)，第II卷，7911-7925中(1993)，其在本文被引用作參考。
本文所用的術(shù)語“溫和型氨基酸序列”包括SEQ ID NO1以及在氨基酸序列中在199-220位置以外處有變化的SEQ ID NO1。
本文所用的“易親水的氨基酸”指的是比具有參照下表中的親水力的試樣氨基酸具有更大親水力的任意其它氨基酸。以下表(表1)中是按增加的親水力的遞減次序列置的氨基酸(參見Hopp，T.P.，and Woods，K.R.，“Prediction of Protein Antigenic Determinants from AminoAcid Sequences”，PROCEEDINGS OF THE NATIONALACADEMY OF SCIENCE USA，78卷，pp.3824-3828，1981，該文獻在本文引用作參考)。
表1

表1還說明了氨基酸可帶有電荷(該性質(zhì)是基于pH為約8-9)。帶正電荷的氨基酸是Arg和Lys，帶負電荷的氨基酸是Glu和Asp，其余氨基酸是中性的。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，取代氨基酸是中性或帶負電荷的，較優(yōu)選是帶負電荷的(即Glu和Asp)。
因此，例如這種陳述“用中性或具有負電荷的等價或更易親水的氨基酸取代Gln”意思是Gln將被Asn(其與Gln有相等的親水力)或Ser、Glu或Asp(它們比Gln更易親水力)取代；它們均為中性的或具有負電荷，并較之Gln有較大的親水力值。類似的這種陳述“用中性或具有負電荷的更易親水的氨基酸取代Pro”意思是Pro將被Gln、Asn、Ser、Glu或Asp取代。A.包含至少一處氨基酸取代的變種在本發(fā)明一種實施方案中，BPN′變種包含溫和型氨基酸序列，其中該溫和型氨基酸序列在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、218、219或220位置中的一處或多處被取代；該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比，降低了對不溶性基質(zhì)物的吸附，和增強了對不溶性基質(zhì)物的水解。優(yōu)選被取代的氨基酸位置是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或215；較優(yōu)選200、201、202、205或207。
優(yōu)選取代199位置的氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代200位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代201位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代202位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代203位置的氨基酸是Met、Cys、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代204位置的氨基酸是Glu。
優(yōu)選取代205位置的氨基酸是Leu、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代206位置的氨基酸是Pro、Asn或Ser。
優(yōu)選取代207位置的氨基酸是Asp或Glu。
優(yōu)選取代208位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代209位置的氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代210位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代211位置的氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代212位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代213位置的氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代214位置的氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu。
優(yōu)選取代215位置的氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代216位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代218位置的氨基酸是Glu。
優(yōu)選取代219位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代220位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu。
更優(yōu)選取代任意位置199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219和220的氨基酸是參照表1為中性或帶負電荷的，比溫和型枯草溶菌素BPN′的相應(yīng)位置上的氨基酸有相當?shù)幕蚋子H水力，優(yōu)選是更易親水的。
更優(yōu)選的還有取代任意位置199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219和220的氨基酸是Asp或Glu；取代204或218位置的氨基酸是G1u。B.包含至少兩處氨基酸取代的變種在本發(fā)明另一實施方案中，BPN′變種包含溫和型氨基酸序列，其中該溫和型氨基酸序列在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220位置中的兩處或多處被取代；該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比，降低了對不溶性基質(zhì)物的吸附，和增強了對不溶性基質(zhì)物的水解。優(yōu)選具有取代氨基酸的位置是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212、或215；更優(yōu)選的位置是200、201、202、205或207。
優(yōu)選取代199位置的氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代200位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代201位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代202位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代203位置的氨基酸是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代204位置的氨基酸是Asp或Glu。
優(yōu)選取代205位置的氨基酸是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代206位置的氨基酸是Pro、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代207位置的氨基酸是Asp或Glu。
優(yōu)選取代208位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代209位置的氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代210位置的氨基酸是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代211位置的氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代212位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代213位置的氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser或Asp。
優(yōu)選取代214位置的氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代215位置的氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代216位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代217位置的氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代218位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代219位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代220位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
更優(yōu)選取代任意位置199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220的氨基酸是參照表1為中性或帶負電荷的，比溫和型枯草溶菌素BPN′的相應(yīng)位置上的氨基酸有相當?shù)幕蚋子H水力，優(yōu)選是更易親水的。
更優(yōu)選的還有取代任意位置199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、218、219或220的氨基酸是Asp或Glu；取代217位置的是Leu、Asp或Glu；取代213位置的是Asp。C.包含至少三處氨基酸取代的變種在本發(fā)明另一實施方案中，BPN′變種包含溫和型氨基酸序列，其中該溫和型氨基酸序列在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位置中的三處或多處被取代；該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比，降低了對不溶性基質(zhì)物的吸附，和增強了對不溶性基質(zhì)物的水解。優(yōu)選具有取代氨基酸的位置是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212、或215；更優(yōu)選的位置是200、201、202、205或207。
優(yōu)選取代199位置的氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代200位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代201位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代202位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代203位置的氨基酸是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代204位置的氨基酸選自Asp或Glu。
優(yōu)選取代205位置的氨基酸是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代206位置的氨基酸是Pro、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代207位置的氨基酸是Asp或Glu。
優(yōu)選取代208位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代209位置的氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代210位置的氨基酸是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代211位置的氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代212位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代213位置的氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代214位置的氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代215位置的氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代216位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代217位置的氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代218位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代219位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
優(yōu)選取代220位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
更優(yōu)選取代任意位置199、200、201、202、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220的氨基酸是參照表1為中性或帶負電荷的，比溫和型枯草溶菌素BPN′的相應(yīng)位置上的氨基酸有相當?shù)幕蚋子H水力，優(yōu)選是更易親水的。
更優(yōu)選的還有取代任意位置199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、218、219或220的氨基酸是Asp或Glu；取代217位置的是Leu、Asp或Glu；取代213位置的是Asp。D.酶變種的制備實施例1突變體BPN′基因?qū)⒑袦睾托涂莶萑芫谺PN′基因的中等噬菌體(phagemid)(pSS-5)(Mitchinson，C.和J.A.Wells(1989)，“ProteinEngineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN′，BIOCHEMISTRY，28卷，4807-4815頁)轉(zhuǎn)化成大腸埃希氏桿菌ung-菌株CJ236，并使用VCSM13輔助噬菌體制備含有單鏈尿嘧啶的DNA模板(Kunkel，T.A.，J.D.Roberts和R.A.Zakour，“Rapid 和efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection”，METHODS IN ENZYMOLOGY，154卷，pp.367-382(1987)；由Yuckenberg，P.D.，F(xiàn).Witney，J.Geisselsoder和J.McClary修正的，“Site-directed in vitro mutagenesis using uracil-containingDNA和phagemid vectors”， DIRECTED MUTAGENESIS-APRACTICAL APPROACH由M.J.McPherson出版，pp.27-48(1991)；這兩篇文獻在本文引用作參考)。使用直接的單一引物點引起突變的Zoller和Smith的修正方法(Zoller，M.J.，和M.Smith，“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derivedvectorsan efficient和general procedure for the productionof point mutations in any fragment of DNA”NUCLEICACIDS RESEARCH，10卷，pp.6487-6500(1982)，該文獻在本文引用作參考)制備所有突變體(基本上由以上Yuckenberg等人表示的，1991)。使用Applied Biosystem Inc.380B DNA合成器制備低聚核苷酸。誘變反應(yīng)產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化成大腸埃希氏桿菌菌株MM 294(American Type Culture Collection E.Coli.33625)。所有突變體由DNA順序確定，分離的DNA被轉(zhuǎn)化為枯草芽孢桿菌表達菌株BG 2036(Yang，M.Y.，E.Ferrari和D.J.Henner(1984)，“Cloning of theNeutral Protease Gene of Bacillus Subtillis and the Use ofthe Cloned Gene to Create an in Vitro-derived DeletionMutation”，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，160卷，pp.15-21)。在氨基酸217處具有終止移碼的密碼子突變的一些改性的pSS-5突變體被用于制備尿嘧啶模板。使低聚核苷酸恢復(fù)在217位置處的正常讀碼，并在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位置處也被無規(guī)取代物編碼(對在這些密碼子下的所有三種基質(zhì)而言，是所有四種核苷酸的等摩爾和/或變化的混合物)校正終止移碼和產(chǎn)生官能酶的突變是由它們消化酪蛋白的能力鑒定的。無規(guī)取代物是由DNA順序決定的。
實施例2發(fā)酵含有枯草芽孢桿菌細胞(BE 2036)的有益枯草溶菌素突變體在1升的LB-葡萄糖肉湯培養(yǎng)物中生長為中等-Log相，并被接種到總體積為10升的Biostat ED發(fā)酵罐(B.Braun Biotech，Inc.Allentown，Pennsylvania)中。發(fā)酵介質(zhì)含有酵母抽提物、淀粉、抗泡劑、緩沖劑和痕量礦物質(zhì)(參見FERMENTATIONA PRACTICAL APPROACH，由B.McNeil和L.M.Harvey出版，1990)。在發(fā)酵過程中肉湯被保持在pH恒定為7.0。加入氯霉素用于對誘變處理的質(zhì)粒的抗生素選擇。細胞在37℃下生長過夜至A600為約60，并被收集。
實施例3精制將發(fā)酵的肉湯經(jīng)過以下步驟得到純酶。該肉湯經(jīng)離心清出枯草芽孢桿菌細胞，并用100K截止膜除去細顆粒使其澄清。接著在10K截止膜上濃縮，和經(jīng)過流動滲析降低離子強度，用0.025M MES緩沖劑(2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸)調(diào)整pH至5.5。將該酶裝入陽離子交換色譜柱或親合吸附色譜柱中并用NaCl或丙二醇梯度從柱中洗脫該酶使酶進一步得到精制(參見Scopes，R.K.PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPLES AND PRACTICE，Springer-Verlag，New York(1984)，該文獻在本文引用作參考)。
使用pNA試驗(DelMar，E.G.，C.Largman，J.W.Brodrick和M.C.Geokas，ANAL.BIOCHEM.，Vol.99，pp.316-320(1979)，該文獻在本文引用作參考)測定在梯度洗脫過程中收集的餾分中的活性酶濃度。該試驗測定了酶水解合成的可溶性基質(zhì)物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基丙氨酸-對硝基酰苯胺(sAAPF-pNA)所釋放的對硝基苯胺的速率。在分光光度計上，在410nm處測定由水解反應(yīng)產(chǎn)生的黃色的速率，其與活性酶濃度是呈正比的。此外，在280nm處測定吸收以確定總蛋白質(zhì)濃度。由活性酶/總蛋白質(zhì)比例得到酶純度，并用該比例鑒定所收集的原液餾分。
為了避免酶在儲存過程中自溶，可將等重量的丙二醇加入由色譜柱收集得到的餾分中。在該精制步驟完成時，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)驗正原酶溶液的純度，和使用11-T型胰蛋白酶抑制劑由Sigma Chemical Company(st.Louis，Missouri)購買的turkey eqq white通過活性位點滴定法測定酶絕對濃度。所測定的轉(zhuǎn)變因數(shù)將表明在酶分子中不同位置處產(chǎn)生的變化得到了具有比溫和型的酶對于可溶性基質(zhì)物pNA增強活性的酶變種。
在準備使用時，將酶原液經(jīng)過Sephadex-G25(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)尺寸排阻柱洗脫除去丙二醇和交換緩沖劑。在酶原液中的MES緩沖劑被換成0.1M Tris緩沖劑(三(羥甲基-氨基甲烷)，該緩沖劑含有0.01M CaCl2，用HCl將pH調(diào)整至8.6。所有試驗是在pH為8.6，在Tris緩沖劑下，恒溫在25℃下進行的。E.酶變種的特性實施例4表面制備模型用由CPG Inc.(Fairfield，New Jersey)購買的氨丙基可控帶孔玻璃(CPG)作為與由Bachem，Inc(Torrence，California)購買的sAAPF-pNA基質(zhì)物共價連接的載體。該反應(yīng)在二甲基亞砜中進行，使用(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳化二亞胺鹽酸化物)(EDC)作為螯合劑。反應(yīng)完成時(由pNA試驗鑒測)，除去過量溶劑，用二甲基亞砜(DMSO)和二次蒸餾水漂洗CPGsAAPF-pNA，然后在約70℃下用N2氣吹掃烘干。該反應(yīng)路線和固定化基質(zhì)的制備是按以下文獻描述進行的Brode，P.F.III，和D.S.Rauch的“Subtilisin BPN′Activity on an Immobilized Substrate，” LANGMUIR，Vol.8，p.1325-1329(1992)，該文獻在本文引用作參考。
CPG表面具有62,000±7,000 pNA分子/μm2。對于收到的CPG而言，表面積將保持由CPG Inc.報導(dǎo)的50.0m2/g值不變。這提示了使用向CPG上加sAAPF-pNA的步驟不破壞孔結(jié)構(gòu)(平均直徑為486A)。
實施例5表面水解試驗使用CPGSAAPF-pNA在一個試驗中可測定酶變種的吸附和結(jié)合CPG肽的水解。將少量的酶變種原溶液加入已被除氣的含有Tris緩沖劑和CPGSAAPF-pNA的燒瓶中。將燒瓶放在擺環(huán)式傳動搖動器上搖動90分鐘，其間該搖動器在不同時間間隔處停頓(例如在最初的吸附水解階段中，例如開始的20分鐘，每2分鐘停頓一次，后至反應(yīng)結(jié)束每10分鐘停頓一次)。使CPGs AAPF-pNA固定，該溶液作為試樣。該試驗步驟和對吸附和水解的計算是按以上Brode等人，1992描述進行的。
監(jiān)測所有酶抗自溶的穩(wěn)定性，表明在該試驗過程中沒有明顯的自溶損失。因此，通過測定溶液損失可測定酶的吸附。酶變種起始濃度與在每個不同時間點測定的濃度之間的差值為被吸附的酶變種的量。取等分試樣在410nm處的吸光度讀數(shù)計算由表面水解的pNA量。將試樣量和燒瓶中剩余的量相加計算水解的pNA總量。通過減去當沒有酶存在時，在pH為8.6，Tris緩沖劑下被水解掉的pNA量來校正以上數(shù)值。這種堿性水解為總水解的7-29％，這取決于酶的效力。
實施例6可溶性基質(zhì)動力學(xué)分析通過在DU-70分光光度計上于410nm處測定隨時間增加的吸收值來監(jiān)測可溶性基質(zhì)sAAPF-pNA的水解速率。恒定并制備在6-10納摩爾范圍的酶濃度，同時對于每個動力學(xué)測定，從90-700μM sAAPF-pNA變化基質(zhì)物濃度。每秒鐘取一個吸收數(shù)據(jù)，經(jīng)過900秒，這些數(shù)據(jù)被表示在LOTUSTM棋盤式對照表(Lotus Development Corporation，Cambridge，Massachusetts)上。用標準Lineweaver Burk分析法對動力學(xué)參數(shù)進行分析，其中在運行初始部分(一般是第一分鐘)的數(shù)據(jù)適合于線性回歸曲線，由此得到V0。用標準轉(zhuǎn)換方法將V0和S0繪圖得到KM和Kcat。F.BPN′變種實例在以下表2中說明了本發(fā)明的BPN′變種，其降低了對結(jié)合在表面上的基質(zhì)物的吸附和增加了對結(jié)合在表面上的基質(zhì)物的水解。在描述該特定的突變中，首先給出的是溫和類型的最始存在的氨基酸，其次是所在的位置編號，再次是取代的氨基酸。
表2BPN′變種實例-單一突變-Ala 216 GluAla 216 AspAla 216 GlyVal 203 Glu
-雙突變-Ile 205 Leu+Ala 216 GluIle 205 Leu+Ala 216 AspPro 210 Ala+Gly 215 ThrTyr 214 Phe+Tyr 217 AsnGln 206 Glu+Ala 216 GluAla 216 Glu+Try 217 LeuGln 206 Glu+Tyr 217 Leu-三處突變-Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 LeuGln 206 Pro+Gly 211 Ala+Ala 216 Glu-四處突變-Val 203 Glu+Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 LeuVal 203 Glu+Pro 210 Ala+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu-五處突變-Val 203 Glu+Gln 206 Glu+Gly 215 Thr+Ala 216 Glu+Tyr 217 LeuVal 203 Glu+Pro 210 Ala+Gly 215 Thr+Ala 216 Glu+Tyr 217 LeuII.織物清洗組合物物質(zhì)除了含有上文描述的BPN′變種以外，本發(fā)明織物清洗組合物還可包含一種或多種與蛋白酶相容的清洗組合物物質(zhì)。本文所用的術(shù)語“清洗組合物物質(zhì)”意思是被所需的特殊類型的清洗組合物和產(chǎn)物形式(例如液體、顆粒、條)所選擇的任意液體、固體或氣態(tài)物質(zhì)，這些物質(zhì)與組合物中所用的BPN′變種也是相容的?？紤]到被清洗的織物和在使用中對清洗條件所需形式的組合物(例如用洗滌劑洗滌)可容易地對清洗組合物物質(zhì)進行特定選擇。在本文中使用的術(shù)語“相容”意思是清洗組合物物質(zhì)不會使在正常使用環(huán)境中所需的BPN′變種的蛋白水解活性降至蛋白酶為無效的程度。在下文詳細說明特定的清洗組合物物質(zhì)。
本文所用的“織物清洗組合物”指的是用于清洗織物的洗滌劑組合物的所有形式，包括但不限于顆粒、液體和條塊形式。優(yōu)選的織物清洗組合物是液態(tài)形式。
本文所用的“有效量的酶變種”指的是獲得在特定的清洗組合物中需要的酶催活性的所需的酶變種量。該有效量容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，這基于許多因素，例如所使用的特殊酶變種、清洗應(yīng)用、特定的洗滌組合物的組成、是否需要液體或干燥(例如顆粒)組合物、等等。本發(fā)明清洗組合物優(yōu)選包含約0.0001％-10％一種或多種酶變種，較優(yōu)選約0.001％-1％，更優(yōu)選約0.01％-0.1％。在以下進一步詳細討論本發(fā)明不同清洗組合物的幾種實例。除非另有說明，本文中所用的所有份數(shù)、百分數(shù)和比例均按重量計。
本發(fā)明酶變種可以與各種常規(guī)的組分一起使用以得到充分配制的洗滌織物組合物。這類組合物可以是液體、顆粒等等。這類組合物可配制為含有多至30％-60％(重)表面活性劑的現(xiàn)今“濃縮”洗滌劑。
本發(fā)明織物清洗組合物可選擇性地和優(yōu)選地含有各種陰離子、非離子、兩性離子等表面活性劑。
這些表面活性劑一般含量為組合物的約5％至約35％。
在本發(fā)明中使用的非限制的表面活性劑的實例包括常規(guī)的C11-C18烷基苯磺酸鹽，和伯和無規(guī)烷基硫酸鹽，式為CH3(CH2)x(CHOSO3-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸鹽，其中x和(y+1)是至少約7的整數(shù)，優(yōu)選至少約9，M是水增溶性陽離子，特別是鈉，C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(尤其是EO 1-5乙氧基硫酸鹽)、C10-C18烷基烷氧基羧酸鹽(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸鹽)、C10-C18烷基多苷、和它們相應(yīng)的硫酸化多苷，C12-C18α-磺化的脂肪酸酯、C12-C18烷基和烷基酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)、C12-C18甜菜堿和磺基甜菜堿(“sultaines”)、C10-C18氧化胺等等。本發(fā)明優(yōu)選烷基烷氧基硫酸鹽(AES)和烷基烷氧基羧酸鹽(AEC)。(也優(yōu)選將這類表面活性劑與前述的氧化胺和/或甜菜堿或磺基甜菜堿表面活性劑結(jié)合使用，這取決于配方師的要求)，其它常規(guī)有用的表面活性劑列于標準教科書中。特別有用的表面活性劑包括公開在1993年3月16日授權(quán)的Connor等人的U.S.專利5,194,639中的C10-C18N-甲基葡糖酰胺，該文獻在本文引用作參考。
在織物清洗組合物中有用的多種其它組分可包括在本發(fā)明組合物中，包括其它的活性組分、載體、水溶助長劑、加工助劑、染料或顏料、用于液體配方的溶劑等。如果需要額外增加發(fā)泡力，可以向組合物中摻入一般約1％至約10％的增泡劑，如C10-C16烷醇酰胺。C10-C14單乙醇酰胺和二乙醇酰胺是這種增泡劑典型的一類。將這種增泡劑與高發(fā)泡力的輔加表面活性劑如上述的氧化胺、甜菜堿和磺基甜菜堿一起使用也是有益的。如果需要的話，可溶性鎂鹽如MgCl2、MgSO4等一般可以約0.1％-2％的量加入以提供額外的發(fā)泡力。
本發(fā)明液體織物清洗組合物可含有水和其它溶劑作為載體。低分子量伯或仲醇，其代表例為甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇是適宜的。一元醇是優(yōu)選的增溶表面活性劑，但多元醇例如含有約2-6個碳原子和約2-6個羥基的那些(例如1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)也可以使用。組合物中可含有約5％-90％，一般約10％-50％這類載體。
本發(fā)明的織物清洗組合物優(yōu)選被配制為在用于含水的洗滌操作過程中，洗滌水具有pH約6.8-11.0。成品一般是在該范圍內(nèi)配制的。控制pH為建議使用值的技術(shù)包括使用緩沖劑、堿、酸等，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
當配制本發(fā)明的織物清洗組合物時，配方師希望使用含量為約5％-50％(重)的各種助洗劑。典型的助洗劑包括1-10微米沸石、聚羧酸鹽如檸檬酸和氧聯(lián)二琥珀酸、層狀硅酸鹽、磷酸鹽等。其它常規(guī)助洗劑列于標準配方書中。
另外，配方師希望在這種組合物中使用一般用量為約0.001％-1％(重)的各種附加酶，如纖維素酶、脂酶、淀粉酶和蛋白酶。各種織物護理酶是洗衣洗滌劑技術(shù)中公知的。
各種漂白化合物，如過碳酸鹽、過硼酸鹽等可用于這種組合物中，一般用量為約1％-15％(重)。如果需要的話，這種組合物也可含有漂白活化劑如四乙酰乙二胺、壬酰氧基苯磺酸鹽等，它們也是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。其用量一般為約1％-10％(重)。
各種污垢解脫劑，尤其是陰離子低聚酯類型的、各種螯合劑、尤其是氨基膦酸鹽和乙二胺二琥珀酸鹽、各種粘土污垢去除劑，尤其是乙氧基化的四亞乙基五胺、各種分散劑、尤其是聚丙烯酸鹽和聚天冬氨酸鹽、各種增白劑、尤其是陰離子性的增白劑、各種抑泡劑、尤其是聚硅氧烷和仲醇，各種織物柔軟劑，尤其是綠土粘土等都可用于這種組合物中，其用量范圍為約1％-35％(重)。在標準配方書和公開的專利中對這些常規(guī)物質(zhì)有許多詳細描述。
酶穩(wěn)定劑也可用于本發(fā)明的清洗組合物中，這種酶穩(wěn)定劑包括丙二醇(優(yōu)選約1％-10％)，甲酸鈉(優(yōu)選約0.1％-1％)和甲酸鈣(優(yōu)選約0.1％-1％)。a.粒狀織物清洗組合物本發(fā)明粒狀織物清洗組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明酶變種，優(yōu)選含為組合物重量的約0.001％-10％，較優(yōu)選約0.005％-5％，最優(yōu)選約0.01％-1％活性酶。除了一種或多種酶變種以外，粒狀織物清洗組合物一般包含至少一種表面活性劑、一種或多種助洗劑，和在某些情況下含有漂白劑。
由以下實施例說明本發(fā)明實施的粒狀織物清洗組合物。
實施例7-10粒狀織物清洗組合物實施例編號組分 7 8 910Ala 216 Glu 0.10 0.20 0.03 0.05Gln 206 Glu+Tyr 217 Leu- -0.02 0.05C13直鏈烷基苯磺酸鹽 22.00 22.00 22.00 22.00磷酸鹽(為三聚磷酸鈉) 23.00 23.00 23.00 23.00碳酸鈉23.00 23.00 23.00 23.00硅酸鈉14.00 14.00 14.00 14.00沸石 8.20 8.20 8.20 8.20螯合劑(二亞乙基三胺五乙酸)0.40 0.40 0.40 0.40硫酸鈉5.50 5.50 5.50 5.50水余量加至100％在實施例7-8中，用表2中所列的除了Ala 216 Glu以外的BPN′變種代替Ala 216 Glu，得到基本相似的結(jié)果。
在實施例9-10中，用表2中所列的其它任意BPN′變種組合代替Ala 216 Glu和Gln 206 Glu+Tyr 217 Leu，得到基本相似的結(jié)果。
實施例11-14粒狀織物清洗組合物實施例編號組分11 121314Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu 0.10 0.20 0.03 0.05Pro 210 Ala+Gly 215 Thr - -0.02 0.05C12烷基苯磺酸鹽 12.00 12.00 12.00 12.00沸石A(1-10微米) 26.00 26.00 26.00 26.002-丁基辛酸 4.00 4.00 4.00 4.00C12-C14仲(2，3)烷基硫酸鈉 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 5.00 5.00 5.00 5.00熒光增白劑 0.10 0.10 0.10 0.10硫酸鈉 17.00 17.00 17.00 17.00水和微量成分 余量加至100％在實施例11-12中，用表2中所列的其它BPN′變種代替Gln 206Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu，得到基本相似的結(jié)果。
在實施例13-14中，用表2中所列的其它任意BPN′變種組合代替Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu和Pro 210 Ala+Gly 215Thr，得到基本相似的結(jié)果。
實施例15和16粒狀織物清洗組合物組分實施例編號15 16直鏈烷基苯磺酸鹽 11.410.70牛油烷基硫酸鹽 1.802.40C14-15烷基硫酸鹽 3.003.107倍乙氧基化的C14-15醇4.004.0011倍乙氧基化的牛油醇 1.801.80分散劑 0.070.1聚硅氧烷流體 0.800.80檸檬酸三鈉 14.00 15.00檸檬酸 3.002.50沸石 32.5032.10馬來酸丙烯酸共聚物 5.00 5.00二亞乙基三胺五亞甲基膦酸 1.00 0.20Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu0.30 0.30脂酶 0.36 0.40淀粉酶 0.30 0.30硅酸鈉 2.00 2.50硫酸鈉 3.50 5.20聚乙烯吡咯烷酮 0.30 0.50過硼酸鹽 0.5 1苯酚磺酸鹽 0.1 0.2過氧化酶 0.1 0.1微量成分 至100至100實施例17和18粒狀織物清洗組合物組分 實施例編號1718直鏈C12烷基苯磺酸鈉6.5 8.0硫酸鈉 15.0 18.0沸石A 26.0 22.0次氮基三乙酸鈉 5.0 5.0聚乙烯吡咯烷酮 0.5 0.7四乙酰乙二胺3.0 3.0硼酸4.0 -過硼酸 0.5 1苯酚磺酸鹽 0.1 0.2Ile 205 Leu+Ala 216 Glu 0.4 0.4填料(例如硅酸鹽；碳酸鹽；香料；水) 至100 至100
實施例19濃縮粒狀織物清洗組合物組分 重量％烷基硫酸鹽 8.0烷基乙氧基硫酸鹽 2.03倍和7倍乙氧基化的C25和C45醇的混合物 6.0多羥基脂肪酸酰胺 2.5沸石 17.0層狀硅酸鹽/檸檬酸鹽 16.0碳酸鹽 7.0馬來酸丙烯酸共聚物 5.0污垢解脫聚合物 0.4羧甲基纖維素 0.4聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物0.1乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物 0.1PEG 2000 0.2Val 203 Glu+Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu 0.5脂酶 0.2纖維素酶 0.2四乙酰乙二胺 6.0過碳酸鹽 22.0乙二胺二琥珀酸 0.3抑泡劑 3.54，4′-雙(2-嗎啉代-4-苯胺基-s- 0.25三吖嗪-6-基氨基)芪-2，2′-二磺酸二鈉4，4′-雙(2-磺基肉桂基(styril))聯(lián)苯二鈉 0.05水、香料和微量成分 至100
實施例20粒狀織物清洗組合物組分 重量％直鏈烷基苯磺酸鹽 7.6C16-C18烷基硫酸鹽 1.37倍乙氧基化的C14-15醇 4.0椰子油烷基二甲基羥乙基氯化銨 1.4分散劑0.07聚硅氧烷流體 0.8檸檬酸三鈉5.0沸4A 15.0馬來酸丙烯酸共聚物4.0二亞乙基三胺五亞甲基膦酸 0.4過硼酸鹽 15.0四乙酰乙二胺 5.0綠土粘土 10.0聚氧乙烯(MW 300,000) 0.3Tyr 214 Phe+Tyr 217 Asn 0.4脂酶 0.2淀粉酶0.3纖維素酶 0.2硅酸鈉3.0碳酸鈉10.0羧甲基纖維素 0.2增白劑0.2水、香料和微量成分 至100實施例21粒狀織物清洗組合物組分重量％直鏈烷基苯磺酸鹽 6.92牛油烷基硫酸鹽 2.057倍乙氧基化的C14-15醇4.43倍乙氧基化的C12-15烷基乙氧基硫酸鹽 0.16沸石 20.2檸檬酸 5.5碳酸鹽 15.4硅酸鹽 3.0馬來酸丙烯酸共聚物 4.0羧甲基纖維素 0.31污垢解脫聚合物 0.30Val 203 Glu+Pro 210 Ala+Gly 215 Thr+Ala 216 Glu+ 0.2Tyr 217 Leu脂酶 0.36纖維素酶 0.13過硼酸鹽四水合物 11.64過硼酸鹽一水合物 8.7四乙酰乙二胺 5.0二亞乙基三胺五甲基膦酸 0.38硫酸鎂 0.40增白劑 0.19香料、硅氧烷、抑泡劑 0.85微量成分至100b.液體織物清洗組合物本發(fā)明液體織物清洗組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明酶變種，優(yōu)選含有為組合物重量的約0.005％-5％，更優(yōu)選約0.01％-1％活性酶。這種液體織物清洗組合物一般還包含陰離子表面活性劑、脂肪酸、水溶性助洗劑和水。
由以下實施例說明本發(fā)明實施的液體織物清洗組合物。
實施例22-26液體織物清洗組合物實施例編號組分 2223242526Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu 0.05 0.03 0.30 0.03 0.10Pro 210 Ala+Gly 215 Thr- - -0.01 0.20C12-C14烷基硫酸鈉 20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸5.00 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00C10醇乙氧基化物(3) 13.00 13.00 13.00 13.00 13.00單乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 余量加至100％在實施例22-24中，用表2中所列的其它BPN′變種代替Gln 206Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu，得到基本相似的結(jié)果。
在實施例25-26中，用表2中所列的其它任意BPN′變種組合代替Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu和Pro 210 Ala+Gly 215 Thr，得到基本相似結(jié)果。
實施例27-28液體織物清洗組合物實施例編號組分 2728C12-14鏈烯基琥珀酸 3.0 8.0檸檬酸一水合物 10.0 15.0C12-15烷基硫酸鈉8.0 8.02倍乙氧基化的C12-15醇硫酸鈉 - 3.07倍乙氧基化的C12-15醇 - 8.05倍乙氧基化的C12-15醇 8.0 -二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸) 0.2 -油酸1.8 -乙醇4.0 4.0丙二醇 2.0 2.0Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu 0.2 0.2聚乙烯吡咯烷酮 1.0 2.0抑泡劑 0.15 0.15NaOH 至pH 7.5過硼酸鹽0.5 1苯酚磺酸鹽 0.1 0.2過氧化酶0.4 0.1水和微量成分 至100份在這里的實施例27和28中，用表2中所列的其它BPN′變種代替Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu，得到基本相似的結(jié)果。
實施例29-31液體織物清洗組合物實施例編號組分 29 30 31檸檬酸 7.10 3.00 3.00脂肪酸 - 2.00 2.00乙醇1.93 3.20 3.20硼酸2.22 3.50 3.50單乙醇胺0.71 1.09 1.091，2-丙二醇 7.89 8.00 8.00枯烯磺酸鈉 1.80 3.00 3.00甲酸鈉 0.08 0.08 0.08NaOH6.70 3.80 3.80聚硅氧烷抗泡劑 1.16 1.18 1.18Ala 216 Glu 0.0145 - -Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu - 0.0145 -Gln 206 Glu+Ala 216 Glu+Tyr 217 Leu - - 0.0145脂酶.200 .200 .200纖維素酶- 7.50 7.50污垢解脫聚合物 0.29 0.15 0.15抗泡劑 0.06 0.085 0.085增白劑360.095 - -增白劑3 - 0.05 0.05C12烷基苯磺酸 9.86 - -C12-15烷基聚乙氧基(2，5)硫酸鹽 13.80 18.00 18.00C12葡糖酰胺 - 5.00 5.00C12-13烷基聚乙氧基化物(9)2.00 2.00 2.00水、香料和微量成分 余量加至100％C.條塊織物清洗組合物適于手洗帶污垢織物的本發(fā)明條塊織物清洗組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明酶變種，優(yōu)選其為組合物重量的約0.001％-10％，較優(yōu)選約0.01％-1％。
由以下實施例說明本發(fā)明實施的條塊織物清洗組合物。
實施例33-36條塊織物清洗組合物實施例編號組分 33343536Val 203 Glu 0.3 -0.1 0.02Tyr 214 Phe+Tyr 217 Asn - 0.3 0.4 0.03C12-C16烷基硫酸鈉 20.0 20.0 20.0 20.00C12-C14甲基葡糖酰胺 5.0 5.0 5.0 5.00C11-C13烷基苯磺酸鈉 10.0 10.0 10.0 10.00碳酸鈉 25.0 25.0 25.0 25.00焦磷酸鈉7.0 7.0 7.0 7.00三聚磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.00沸石A(0.1-10μ) 5.0 5.0 5.0 5.00羧甲基纖維素0.2 0.2 0.2 0.20聚丙烯酸鹽(MW 1400) 0.2 0.2 0.2 0.20椰子油單乙醇酰胺5.0 5.0 5.0 5.00增白劑、香料0.2 0.2 0.2 0.20CaSO41.0 1.0 1.0 1.00MgSO41.0 1.0 1.0 1.00水 4.0 4.0 4.0 4.00填料*余量加至100％*可以選自適宜的物質(zhì)，例如CaCO3、滑石、粘土、硅酸鹽等。
在實施例33中，用表2中所列的其它BPN′變種代替Val 203 Glu，得到基本相似的結(jié)果。
在實施例34中，用表2中所列的其它BPN′變種代替Tyr 214 Phe+Tyr 217 Asn，得到基本相似的結(jié)果。
在實施例35-36中，由表2中所列的其它任意BPN′變種組合代替Val 203 Glu和Tyr 214 Phe+Tyr 217 Asn，得到基本相似的結(jié)果。
本發(fā)明具體實施方案已被公開，顯然對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下可對本發(fā)明作各種變化和修改。這意指在所附的權(quán)利要求中覆蓋了在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這類修改。
序列情報(1)一般情報(i)申請人 BRODE，PHILIP F.
BARNETT，BOBBY L.
RUBINGH，DONN N.
GHOSH，CHANCHAL K.
(ii)發(fā)明題目含有枯草溶菌素變種的織物清洗組合物(iii)序列號1(2)序列ID 1號情報(i)序列特征(A)長度275氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列ID NO1Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro GIy Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His VaI Ala G1y Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln27權(quán)利要求
1.一種織物清洗組合物，包含(a)有效量的含有溫和型氨基酸序列的BPN′變種，其中溫和型氨基酸序列199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、218、219或220中的一處或多處位置被取代，其特征在于i當取代發(fā)生在199位置時，取代199位置的氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；ii當取代發(fā)生在200位置時，取代200位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；iii當取代發(fā)生在201位置時，取代201位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；iv當取代發(fā)生在202位置時，取代202位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；v當取代發(fā)生在203位置時，取代2位置的氨基酸是Met、Cys、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；vi當取代發(fā)生在204位置時，取代204位置的氨基酸是Glu；vii當取代發(fā)生在205位置時，取代205位置的氨基酸是Leu、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；viii當取代發(fā)生在206位置時，取代206位置的氨基酸是Pro、Asn或Ser；ix當取代發(fā)生在207位置時，取代207位置的氨基酸是Asp或Glu；x當取代發(fā)生在208位置時，取代208位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xi當取代發(fā)生在209位置時，取代209位置的氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xii當取代發(fā)生在210位置時，取代210位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xiii當取代發(fā)生在211位置時，取代211位置的氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xiv當取代發(fā)生在212位置時，取代212位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu；xv當取代發(fā)生在213位置時，取代213位置的氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xvi當取代發(fā)生在214位置時，取代214位置的氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu；xvii當取代發(fā)生在215位置時，取代215位置的氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xviii當取代發(fā)生在216位置時，取代216位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xix當取代發(fā)生在218位置時，取代218位置的氨基酸是Glu。xx當取代發(fā)生在219位置時，取代219位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xxi當取代發(fā)生在220位置時，取代220位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu；特征在于該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比，降低了對不溶性基質(zhì)物的吸附和增強了對不溶性基質(zhì)物的水解；和(b)一種或多種與BPN′變種相容的清洗組合物物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的織物清洗組合物，其特征在于a.當取代發(fā)生在206位置時，取代206位置的氨基酸是Asn或Ser；b.當取代發(fā)生在211位置時，取代211位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；c.當取代發(fā)生在214位置時，取代214位置的氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu；和d.當取代發(fā)生在215位置時，取代215位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
3.權(quán)利要求2的織物清洗組合物，其特征在于當216位置被取代時，用Gly取代216位置的Ala。
4.權(quán)利要求2的織物清洗組合物，其特征在于當取代發(fā)生在199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219或220中的一處或多處位置時，取代199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219或220中任意一處位置的氨基酸是Asp或Glu；當取代發(fā)生在204或208中的一處或這兩處位置時，取代204或218位置的氨基酸是Glu；其中取代優(yōu)選發(fā)生在199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或215，中的一處或多處位置，更優(yōu)選發(fā)生在200、201、202、205或207中的一處或多處位置。
5.權(quán)利要求1的織物清洗組合物，其有一處氨基酸取代，特征在于該取代是a.Glu取代216位置的Ala；b.Asp取代216位置的Ala；c.Glu取代203位置的Val。
6.一種織物清洗組合物，包含(a)含有溫和型氨基酸序列的BPN′變種，其中溫和型氨基酸序列199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220中的兩處或多處位置被取代，特征在于i當取代發(fā)生在199位置時，取代199位置的氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；ii當取代發(fā)生在200位置時，取代200位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；iii當取代發(fā)生在201位置時，取代201位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；iv當取代發(fā)生在202位置時，取代202位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；v當取代發(fā)生在203位置時，取代203位置的氨基酸是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；vi當取代發(fā)生在204位置時，取代204位置的氨基酸是Asp或Glu；vii當取代發(fā)生在205位置時，取代205位置的氨基酸是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；viii當取代發(fā)生在206位置時，取代206位置的氨基酸是Pro、Asn、Ser、Asp或Glu；ix當取代發(fā)生在207位置時，取代207位置的氨基酸是Asp或Glu；x當取代發(fā)生在208位置時，取代208位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn或Ser；xi當取代發(fā)生在209位置時，取代209位置的氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xii當取代發(fā)生在210位置時，取代210位置的氨基酸是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xiii當取代發(fā)生在211位置時，取代211位置的氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xiv當取代發(fā)生在212位置時，取代212位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu；xv當取代發(fā)生在213位置時，取代213位置的氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xvi當取代發(fā)生在214位置時，取代214位置的氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、或Ser；xvii當取代發(fā)生在215位置時，取代215位置的氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xviii當取代發(fā)生在216位置時，取代216位置的氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xix當取代發(fā)生在217位置時，取代217位置的氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；xx當取代發(fā)生在218位置時，取代218位置的氨基酸是Gln、Ser、Asp或Glu。xxi當取代發(fā)生在219位置時，取代219位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；和xxii當取代發(fā)生在220位置時，取代220位置的氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；特征在于該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比，降低了對不溶性基質(zhì)物的吸附和增強了對不溶性基質(zhì)物的水解；和(b)一種或多種與BPN′變種相容的清洗組合物物質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的織物清洗組合物，特征在于該溫和型BPN′在兩處位置被取代。
8.權(quán)利要求7的織物清洗組合物，特征在于所說的兩處取代是a.Ala取代210位置的Pro和Thr取代215位置的Gly；b.Phe取代2l4位置的Tyr和Asn取代217位置的Tyr；c.Glu取代216位置的Ala和Leu取代217位置的Tyr；d.Leu取代205位置的Ile和Glu取代216位置的Ala；e.Leu取代205位置的Ile和Asp取代216位置的Ala；f.Glu取代206位置的Gln和Glu取代216位置的Ala；g.Asp取代216位置的Ala和Leu取代217位置的Try；或h.Glu取代206位置的Gln和Leu取代217位置的Try。
9.權(quán)利要求7的織物清洗組合物，其特征在于a.當取代發(fā)生在206位置時，取代206位置的氨基酸是Glu、Asn或Ser；b.當取代發(fā)生在210位置時，取代210位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；c.當取代發(fā)生在211位置時，取代211位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；d.當取代發(fā)生在214位置時，取代214位置的氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu；和e.當取代發(fā)生在215位置時，取代215位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
10.權(quán)利要求6的織物清洗組合物，其特征在于當取代發(fā)生在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219或220處位置時，取代199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219或220中任意位置的氨基酸是Asp或Glu；當取代發(fā)生在213位置時，取代213位置的氨基酸是Asp；和其中取代優(yōu)選發(fā)生在199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或215中的兩處或多處位置，更優(yōu)選取代發(fā)生在200、201、202、205或207中的兩處或多處位置。
11.權(quán)利要求6的織物清洗組合物，其特征在于Glu或Asp取代216位置的Ala，和Leu取代217位置的Tyr。
12.權(quán)利要求6的織物清洗組合物，其特征在于溫和型BPN′在三處位置被取代。
13.權(quán)利要求12的織物清洗組合物，其中所說的三處取代是a.Pro取代206位置的Gln，Ala取代211位置的Gly，和Glu取代216位置的Ala；b.Val取代205位置的Ile，Ala取代210位置的Pro，和Glu取代213位置的Lys；或c.Glu取代206位置的Gln，Glu取代216位置的Ala，和Leu取代217位置的Tyr。
14.權(quán)利要求12的織物清洗組合物，特征在于a.當取代發(fā)生在206位置時，取代206位置的氨基酸是Asn或Ser；b.當取代發(fā)生在210位置時，取代210位置的氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；c.當取代發(fā)生在211位置時，取代211位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu；d.當取代發(fā)生在214位置時，取代214位置的氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或Glu；和e.當取代發(fā)生在215位置時，取代215位置的氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或Glu。
15.權(quán)利要求6的織物清洗組合物，特征在于溫和型BPN′在四處或五處位置被取代。
16.權(quán)利要求15的織物清洗組合物，其中所說的取代是a.Glu取代203位置的Val，Glu取代206位置的Gln，Glu取代216位置的Ala和Leu取代217位置的Tyr；b.Glu取代203位置的Val，Ala取代210位置的Pro，Glu取代216位置的Ala和Leu取代217位置的Tyr；c.Glu取代203位置的Val，Glu取代206位置的Gln，Thr取代215位置的Gly，Glu取代216位置的Ala和Leu取代217位置的Tyr；或d.Glu取代203位置的Val，Ala取代210位置的Pro，Thr取代215位置的Gly，Glu取代216位置的Ala和Leu取代217位置的Tyr。
17.權(quán)利要求1-16的任意織物清洗組合物，特征在于所說組合物是液態(tài)形式的。
18.權(quán)利要求1-16的任意織物清洗組合物，其中該組合物包含為該組合物重量的至少約5％表面活性劑和至少約5％助洗劑。
19.一種清洗織物的方法，該方法包括將需要清洗的織物與權(quán)利1-18的任意組合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含枯草溶菌素BPN′變種的織物清洗組合物，其中BPN′變種比溫和型枯草溶菌素BPN′在一個或多個明確確定的氨基酸位置處有不同的氨基酸(即替代物)，由此該BPN′變種與溫和型枯草溶菌素BPN′相比降低了對于不溶性基質(zhì)的吸附和增強了對于不溶性基質(zhì)的水解。
文檔編號C11D7/42GK1151757SQ95193811
公開日1997年6月11日 申請日期1995年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月2日
發(fā)明者P·F·布羅迪, B·L·巴列特, D·N·盧賓, C·K·戈什 申請人:普羅格特-甘布爾公司