專(zhuān)利名稱(chēng)：淋巴管的穩(wěn)定劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供包含Tie2活化(磷酸化)劑的淋巴管的穩(wěn)定劑。
背景技術(shù)：
血液從心臟被送入經(jīng)過(guò)毛細(xì)血管和/或靜脈回到心臟。淋巴管與該血管系統(tǒng)分開(kāi)地形成組織液的排水途徑。淋巴管通過(guò)在末梢組織中使從血管滲漏出的間質(zhì)液、蛋白質(zhì)、脂肪、細(xì)胞等向血管系統(tǒng)回流來(lái)保持一定的血液量，從而維持封閉循環(huán)系統(tǒng)。在存在于皮膚的毛細(xì)血管中，內(nèi)皮細(xì)胞的外側(cè)被基底膜包圍、進(jìn)而附著有周皮細(xì)胞。另ー方面，在毛細(xì)淋巴管中，內(nèi)皮細(xì)胞的外側(cè)幾乎沒(méi)有基底膜，也沒(méi)有附著周皮細(xì)胞。該結(jié)構(gòu)對(duì)于有效地從間質(zhì)攝取體液和/或細(xì)胞是有用的(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。迄今為止，已顯示出酪氨酸酶型受體·VEGFR(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，vascular endothelial growth factor receptor)_3在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，并顯示出作為其配基的VEGF-C和VEGF-D誘導(dǎo)淋巴管新生。此外明確了，VEGF-A是介由在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的VEGFR2來(lái)誘導(dǎo)淋巴管新生(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。此外，關(guān)于淋巴管的功能，有以下報(bào)導(dǎo)。在感染了表達(dá)VEGF-A的腺病毒的小鼠耳部觀察到了顯著的淋巴管新生，但是結(jié)構(gòu)異常，并且由在耳部注入了膠態(tài)炭的實(shí)驗(yàn)明確了，淋巴管的回收功能也被顯著抑制(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。即，認(rèn)為對(duì)淋巴管的功能而言，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞適當(dāng)?shù)嘏渲貌⒈恢问潜匾?。我們將這定義為“淋巴管的穩(wěn)定化”。對(duì)皮膚的物理或化學(xué)刺激會(huì)誘導(dǎo)血管新生和/或VEGF-A等引起的血管滲透性，結(jié)果發(fā)生組織液的蓄積和浮腫。另ー方面，還已知這些刺激直接誘導(dǎo)淋巴管的新生和/或擴(kuò)張。迄今為止，可觀測(cè)到紫外線炎癥引起的淋巴管擴(kuò)張，由注入了染料的實(shí)驗(yàn)明確了淋巴管的功能發(fā)生障礙。認(rèn)為隨著血管擴(kuò)張，水分向真皮內(nèi)滲漏出，從而淋巴管擴(kuò)張而要回收間質(zhì)液。然而，認(rèn)為過(guò)量的淋巴管擴(kuò)張反而會(huì)降低其回收功能井延遲浮腫(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。SP，認(rèn)為為了迅速回收組織間液，避免誘導(dǎo)淋巴管的過(guò)量擴(kuò)張的“淋巴管的穩(wěn)定化”是必要的。迄今為止，作為與淋巴管的功能不全相關(guān)的病態(tài)，已知先天性淋巴浮腫，以及伴隨絲蟲(chóng)病、手木、惡性腫瘤、炎癥所產(chǎn)生的繼發(fā)性淋巴浮腫。作為先天性淋巴浮腫，有米耳羅伊病(Milroy病，原發(fā)性淋巴水腫)、梅杰病(Meige病)、淋巴水腫-重睫(lymphedema-distichiasis)綜合征。報(bào)告了在米耳羅伊病中淋巴管不發(fā)育和/或發(fā)育不全，另ー方面，報(bào)告了在淋巴水腫-重睫綜合征中淋巴管增生。由此也可認(rèn)為，保持回收功能不僅需要通過(guò)淋巴管的新生，還要通過(guò)淋巴管的穩(wěn)定化(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)I :実験醫(yī)學(xué) Vol. 24，No. 18 (2006)，pp. 133-138非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 : Jussi la L and Alitalo K, (2006) Vascular growth factors andlymphangiogenesis (血管生長(zhǎng)因子和淋巴管生成).Phisiol Rev82:673-700非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :Nagy et al. , (2002) Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well asangiogenesis (血管通透因子/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)淋巴管生成以及血管生成).J ExpMed 196:1497-1506非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:Kajiya K. , Hirakawa S. , and Detmar M. , (2006) VEGF-A mediatesUVB-induced impairment of lymphatic vessel function (VEGF-A 介導(dǎo) UVB-誘導(dǎo)的淋巴管功能的損傷).Am J Pathol 169:1496-1503非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :実験醫(yī)學(xué) Vol. 24，No. 18 (2006)，pp. 139-143非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :Kajiya K. , et al. , (2005) Hepatocyte growth factor promoteslymphatic vessel formation and function (肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)淋巴管形成和功能).EMBO J 24:2885-95非專(zhuān)利文獻(xiàn)7 :実験醫(yī)學(xué) Vol. 20，No. 8 (2002)，pp. 52-57

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題是提供在實(shí)現(xiàn)淋巴管的穩(wěn)定化、維持和/或增強(qiáng)淋巴管的回收功能方面有效的藥劑。以VEGF被分子克隆為開(kāi)端，作為特異性地在血管形成中發(fā)揮作用的因子，已經(jīng)相繼鑒定出VEGF家族和血管生成素(angiopoietin ;Ang)家族的分子。VEGF及其受體與從被稱(chēng)為脈管形成的血管早期發(fā)生至隨后的血管新生的非常寬范圍的血管形成相關(guān)。另一方面，Ang在脈管形成后，在伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞的芽生、分枝、嵌入、萎縮等細(xì)胞現(xiàn)象的管腔形成中發(fā)揮作用?？梢岳斫?，Ang介由在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的受體型酪氨酸激酶Tie (含Ig和 EGF 同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶,tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain) -2來(lái)控制血管內(nèi)皮細(xì)胞與周皮細(xì)胞(周細(xì)胞)和/或血管平滑肌細(xì)胞這樣的血管壁細(xì)胞的粘著，在血管的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化中發(fā)揮作用(非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)，但是Tie2與淋巴管的關(guān)系還未充分闡明。本發(fā)明者著眼于Ang-I與在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Tie2的關(guān)系而進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ang-I介由Tie2的活化來(lái)促進(jìn)淋巴管的回收功能，從而完成以下發(fā)明(I) 一種淋巴管的穩(wěn)定劑,包含Tie2活化劑。(2)根據(jù)⑴所述的淋巴管的穩(wěn)定劑，所述Tie2活化劑是選自血管生成素I (Ang-I)、樟(Cinnamomum)屬植物的提取物、刺五加(Siberian Ginseng)提取物和丁香樹(shù)脂醇中的至少I(mǎi)種。(3)根據(jù)⑵所述的淋巴管的穩(wěn)定劑，所述提取物來(lái)源于肉桂種植物(Cinnamomumcassia Blume)。(4)根據(jù)⑵所述的淋巴管的穩(wěn)定劑，所述提取物來(lái)源于桂枝或桂皮。(5)根據(jù)⑵ ⑷的任一項(xiàng)所述的淋巴管的穩(wěn)定劑，所述提取物是水提取物。(6) 一種用于改善或預(yù)防水腫的美容學(xué)方法，其中，應(yīng)用(I) (5)的任一項(xiàng)所述的淋巴管的穩(wěn)定劑。通過(guò)使用本發(fā)明涉及的淋巴管的穩(wěn)定劑，能夠改善和/或預(yù)防水腫等。


圖I是將Ang-I引起的淋巴管的回收功能的變化通過(guò)視覺(jué)判定評(píng)分來(lái)數(shù)值化而得的圖。圖2顯示桂皮提取物產(chǎn)生的Tie2磷酸化的結(jié)果。圖3顯示刺五加提取物產(chǎn)生的Tie2磷酸化的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式對(duì)Tie2的活化劑沒(méi)有特別的限制，可列舉血管生成素I等眾所周知具有活化Tie2的活性的活化劑,和/或來(lái)源于樟(Cinnamomum)屬植物的提取物、刺五加(SiberianGinseng)提取物或丁香樹(shù)脂醇等本發(fā)明者新發(fā)現(xiàn)的具有該活性的活化劑。另外，此處所謂的Tie2的活化是指可以通過(guò)將Tie2磷酸化而轉(zhuǎn)換成其活性體(磷酸化Tie2)的能力。樟屬是樟目(Lauraceae)、樟科(Lauraceae)的植物，存在300以上的種，已知例如肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、樟(C. camphora)、圓葉肉桂(C. daphnoides)、柴肉 桂(C. doederleinii)、天竺桂(C. japonicum)、圓葉藪肉桂(C. pseudo-pedunculatum)、日本肉桂(C. sieboldii)、錫蘭肉桂(C. verum)、錫蘭肉桂(C. zeyIanicum)。作為本發(fā)明中的Tie2活化劑,優(yōu)選使用肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、特別是來(lái)源于作為肉桂的嫩枝的桂枝(肉桂枝)或桂皮(肉桂皮)的提取物。已知來(lái)源于作為肉桂的樹(shù)皮的桂皮的提取物例如作為生發(fā)劑的有效成分是有用的(特開(kāi)平10-265350號(hào)公報(bào))，但是完全不知道其具有淋巴管的穩(wěn)定化活性。刺五加(Siberian Ginseng)提取物在傳統(tǒng)上被認(rèn)為對(duì)滋養(yǎng)強(qiáng)壯有效。在虛弱、極度疲勞、注意力降低等精神和/或身體能力的降低、病后的恢復(fù)方面顯示優(yōu)異的效力。在美國(guó)，作為膳食補(bǔ)充劑(diet supplement)被使用。上述提取物可以通過(guò)常規(guī)方法獲得，例如可以將作為其來(lái)源的植物與提取溶劑ー起在常溫或加熱下浸潰或加熱回流，然后過(guò)濾、濃縮而獲得。作為提取溶剤，只要是通常提取所使用的溶劑就可以任意使用，可以單獨(dú)使用或組合使用下述溶劑例如，水性溶劑，例如水、生理鹽水、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液；或者有機(jī)溶剤，例如こ醇、丙ニ醇、1，3- 丁ニ醇、甘油等醇類(lèi)，含水醇類(lèi)，氯仿，ニ氯こ烷，四氯化碳，丙酮，こ酸こ酷，己烷等。優(yōu)選使用水作為溶剤。用上述溶劑提取得到的提取物可以直接使用，或使用通過(guò)例如凍干等使其濃縮后的提取物，還可以根據(jù)需要使用采用吸附法、例如離子交換樹(shù)脂除去雜質(zhì)后的提取物，和/或用多孔聚合物(例如ァンバーラィ卜XAD-2)的柱進(jìn)行吸附、然后用所需溶劑溶出、再濃縮后的提取物。丁香樹(shù)脂醇是植物所特有的抗氧化物質(zhì)木酚素類(lèi)化合物，由于具有改善高血壓癥的效果和/或抑制幽門(mén)螺旋桿菌(H. pylori)的效果，因此可用于食品、飲料和/或藥品(例如，特開(kāi)平8-268887號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2004-352652號(hào)公報(bào)等)。丁香樹(shù)脂醇具有以下化學(xué)結(jié)
構(gòu)I OH
/-O
HO /°丁香樹(shù)脂醇是公知的化合物，在樟目(Laurales)、樟科(Lauraceae)的肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、特別是在其嫩枝(桂枝)或者樹(shù)皮(桂皮)中含有。完全不知道其具有淋巴管的穩(wěn)定化和/或Tie2活化等效果等。丁香樹(shù)脂醇可以是從桂枝或桂皮等天然來(lái)源提取的，或者也可以是合成的。丁香樹(shù)脂醇可以是無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽。作為鹽，沒(méi)有特別的限制，例如，作為無(wú)機(jī)鹽，可列舉鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣 鹽、銨鹽等。作為有機(jī)鹽，可列舉こ酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、三こ醇胺鹽、ニこ醇胺鹽、氨基酸鹽等。本發(fā)明涉及的淋巴管穩(wěn)定劑可以用作對(duì)淋巴管結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定化造成的淋巴液滲漏所導(dǎo)致的各種皮膚疾病、例如浮腫(水腫)的治療和/或預(yù)防有效的藥品或化妝品。浮腫包括例如伴隨紫外線照射、絲蟲(chóng)病、手木、惡性腫瘤、炎癥產(chǎn)生的繼發(fā)性淋巴浮腫，和/或先天性淋巴浮腫，例如米耳羅伊病、梅杰病、淋巴水腫-重睫綜合征。本發(fā)明涉及的淋巴管穩(wěn)定劑還可在用于減少和/或預(yù)防水腫和/或眼袋的美容學(xué)方法中利用。該美容學(xué)方法可以如下進(jìn)行例如將本發(fā)明涉及的淋巴管穩(wěn)定劑應(yīng)用于有水腫等的部位，直接放置或按照例如淋巴管的流動(dòng)方向?qū)嵤┌茨Φ?，以促進(jìn)淋巴管液的流動(dòng)等。該方法的應(yīng)用部位可列舉面部、頸部、手腳等全身所有部位。本發(fā)明涉及的淋巴管穩(wěn)定劑可以根據(jù)其使用目的來(lái)適當(dāng)決定用量、用法、劑型。例如，對(duì)本發(fā)明的淋巴管穩(wěn)定劑的給藥方式?jīng)]有特別的限制，可以是ロ服、非ロ服、外用等。優(yōu)選為外用劑。作為劑型，可以列舉例如，軟膏、霜、乳液、洗劑、面膜、浴用劑等外用劑，注射劑、點(diǎn)滴劑或栓劑等非ロ服給藥劑，或片劑、粉劑、膠囊劑、顆粒劑、浸膏劑、糖漿劑等ロ服給藥劑。此外，關(guān)于本發(fā)明涉及的淋巴管穩(wěn)定劑，還可以列舉作為功能性食品等用途。本發(fā)明的淋巴管穩(wěn)定劑中的Tie2活化劑的配合量可以根據(jù)用途來(lái)適當(dāng)決定，一般在試劑總量中為O. 0001 20. O摩爾％，優(yōu)選為O. 0001 10. O摩爾％。此外，本發(fā)明的淋巴管穩(wěn)定劑中除了可配合Tie2活化劑以外，還可以根據(jù)需要適當(dāng)配合例如，通常的食品和/或藥品中使用的賦形劑、防潮劑、防腐剤、增強(qiáng)劑、增稠劑、乳化劑、抗氧化劑、甜味料、酸味料、調(diào)味料、著色劑、香料等，化妝品等中通常使用的美白劑、保濕劑、油性成分、紫外線吸收劑、表面活性剤、增稠劑、醇類(lèi)、粉末成分、著色劑、水性成分、水、各種皮膚營(yíng)養(yǎng)劑等。另外，在將本發(fā)明的淋巴管穩(wěn)定劑作為皮膚外用劑使用的情況下，還可以適當(dāng)配合皮膚外用劑中常用的助劑，例如こニ胺四こ酸ニ鈉、こニ胺四こ酸三鈉、檸檬酸鈉、多聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡糖酸等金屬螯合劑，咖卩非因、單寧、維拉帕米(Verapamil)、凝血酸(Tranexamic Acid)及其衍生物、甘草提取物、光甘草定(Glabridin)、木瓜果實(shí)的熱水提取物、各種生藥、こ酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等藥劑，維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白劑，葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖類(lèi)，視黃酸、視黃醇、視黃醇こ酸酷、視黃醇棕櫚酸酯等維生素A類(lèi)等。實(shí)施例接下來(lái)，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。另外，本發(fā)明不限于此。配合量為質(zhì)量％。實(shí)驗(yàn)方法
·
淋巴引流測(cè)定法用Hamilton注射器(Hamilton, Reno, NV),使8周齡的小鼠的耳廓感染將來(lái)源于小鼠的血管生成素-1 (Ang-I)基因插入AdenoX載體中而得的腺病毒(lxl09ifu/小鼠)。作為對(duì)照，感染僅含有AdenoX載體的腺病毒。感染4周后,從耳廓末端用Hamilton注射器注入Iul膠體炭溶液(Kamei Co.，Ltd, Japan),分析淋巴流動(dòng)隨時(shí)間的變化。其結(jié)果是，在Angl高表達(dá)小鼠耳部，觀察到了淋巴管的回收功能被促進(jìn)(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，對(duì)淋巴管的回收功能的變化進(jìn)行視覺(jué)判定，以5階段進(jìn)行數(shù)值化(5 :油墨全部留在淋巴管中的狀態(tài)，I :油墨全部被回收而從淋巴管消失的狀態(tài))來(lái)比較，其結(jié)果示于圖2。由該圖觀察到，通過(guò)作為T(mén)ie2活化劑的Ang-I的表達(dá)，淋巴管的回收功能比對(duì)照顯著增強(qiáng)，可知通過(guò)Tie2的活化可實(shí)現(xiàn)淋巴管的穩(wěn)定化。此外，通過(guò)麻醉進(jìn)行安樂(lè)死后，同時(shí)回收耳部，在液氮中粉碎，用PhosphosafeExtraction Reagent (Novagen, Madison, WI)提取蛋白質(zhì)?？偟鞍琢渴褂?RC DC ProteinAssay Kit (BIO-RAD, Hercules, CA)定量，如下進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)來(lái)檢測(cè)。將等量的總蛋白量用15%丙烯酰胺凝膠(NPU-7. 5L, ATT0, Japan)進(jìn)行SDS-PAGE，Ang-I的蛋白質(zhì)表達(dá)使用 Ang-I 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)通過(guò) ECLKit使其顯色來(lái)確認(rèn)。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞從人新生兒包皮中作為⑶31陽(yáng)性⑶34陰性⑶45陰性細(xì)胞而分離出來(lái)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞用加入了添加因子的EBM-2 (Cambrex; Verviers, Belgium)進(jìn)行培養(yǎng),在各種藥劑(Ang_l、桂皮提取物、刺五加提取物和丁香樹(shù)脂醇)存在下用 Phosphosafe Extraction Reagent (Novagen, Madison, WI)提取蛋白質(zhì)。還調(diào)制了添加了 DMSO的細(xì)胞作為對(duì)照。另外，桂皮提取物和丁香樹(shù)脂醇如下調(diào)制。刺五加提取物(アスク藥品)使用將刺五加的根用30%こ醇提取而得的提取物。用HPLC確認(rèn)了該提取物中含有I. 01質(zhì)量％的丁香樹(shù)脂醇。將該提取物用DMSO溶解，作為各試驗(yàn)樣品。將總蛋白量使用RC DC Protein AssayKit (BIO-RAD, Hercules, CA)定量,如下進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)來(lái)檢測(cè)。將等量的總蛋白量用7. 5%丙烯酰胺凝膠(NPU-7. 5L, ATT0, Japan)進(jìn)行SDS-PAGE，Tie2和磷酸化 Tie2 的蛋白質(zhì)表達(dá)使用 Ang-I 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)通過(guò)ECL Kit來(lái)顯色。圖2顯示桂皮提取物與Ang-I同樣地將Tie2磷酸化，即活化。圖3顯示刺五加提取物與Ang-I同樣地將Tie2磷酸化，即活化。另外，對(duì)于丁香樹(shù)脂醇，雖然未顯示數(shù)據(jù)，但是確認(rèn)了與Ang-I同樣地活化Tie2。桂枝熱水提取干燥殘余成分的調(diào)制在400. 7g桂枝(Cinnamomum cassia Blume)中加入2L水,進(jìn)行3小時(shí)加熱提取，然后過(guò)濾。在所得的殘?jiān)屑尤?L水，重復(fù)同樣的操作，再進(jìn)行2次加熱提取。將所得的濾液凍干，從而獲得了 39. 7g熱水提取干燥殘余成分。熱水提取干燥殘余成分的分級(jí)和分離將31. Og 熱水提取干燥殘余成分使用 Sephadex LH-20 (Amersham PharmaciaBiotech AB)進(jìn)行粗分級(jí)。獲得了水溶出流分(2.7g)、50%甲醇溶出流分(8.5g)、甲醇溶出流分(4. 9g)、丙酮溶出流分(0.5g)和未溶出流分(7.4g)。對(duì)于甲醇溶出流分，通過(guò)ァンバーライ卜XAD2(オルガノ(株))柱來(lái)分級(jí)，然后通過(guò)HPLC分離(柱Capcell Pak C18AQ(株)資生堂制，檢測(cè)UV210nm，流動(dòng)相CH3CN/H20混合體系)，從而分離出丁香樹(shù)脂醇(2. 08mg) ο
權(quán)利要求
1.刺五加(SiberianGinseng)提取物在制備通過(guò)Tie2活化的淋巴管的穩(wěn)定劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，所述提取物是水提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供包含Tie2活化劑的淋巴管的穩(wěn)定劑。Tie2活化劑優(yōu)選為選自血管生成素1(Ang-1)、樟(Cinnamomum)屬植物的提取物、刺五加(Siberian Ginseng)提取物和丁香樹(shù)脂醇中的至少1種。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK102813689SQ20121028900
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者加治屋健太朗, 大田正弘 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂