新的抗神經(jīng)誘向因子-1抗體的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了神經(jīng)誘向因子?1上的線性或基本上線性表位，所述表位可能對(duì)應(yīng)于神經(jīng)誘向因子?1特異性結(jié)合受體具體是UNC5類，特別是UNC5B和UNC5A的區(qū)域，或者可選地對(duì)應(yīng)于神經(jīng)誘向因子?1特異性結(jié)合受體的區(qū)域的附近區(qū)域，當(dāng)該表位結(jié)合抗體時(shí)阻止神經(jīng)誘向因子?1/受體相互作用。線性表位的這種確定允許
【申請(qǐng)人】生產(chǎn)這樣的抗體，所述抗體結(jié)合神經(jīng)誘向因子?1并干擾神經(jīng)誘向因子?1/受體相互作用，從而誘導(dǎo)表達(dá)或過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因子?1和至少一種神經(jīng)誘向因子?1受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡，這是由于這種相互作用抑制神經(jīng)誘向因子?1結(jié)合到受體和受體的多聚化的事實(shí)。本申請(qǐng)公開了針對(duì)該表位的鼠單克隆抗體和它們的各種人源化形式。
【專利說(shuō)明】新的抗神經(jīng)誘向因子-1抗體
[0001] 本發(fā)明涉及可用于在神經(jīng)誘向因子-l(netrin-l)(特別是腫瘤表達(dá)的神經(jīng)誘向因 子-1)的存在下誘導(dǎo)具有神經(jīng)誘向因子-1受體(諸如UNC5受體)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡或細(xì) 胞凋亡的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽或抗體，及其治療癌癥的用途。
[0002] 神經(jīng)誘向因子-1是神經(jīng)誘向因子家族的成員，并且在吸引和排斥的兩者的背景下 是軸突導(dǎo)向提示，并且在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用。神經(jīng)誘向因子-1的主要受體是DCC (在結(jié)直腸癌中缺失）和UNC5 (人中的UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D，小鼠中的UNC5H1、UNC5H2、 UNC5H3、UNC5H4)，其都屬于依賴性受體家族（Keino-Masu，1996 ,Ce 11 87: 175-185; Ackermann，1997,Nature 386:838-842;Hong，1999,Ce11 97:927-941;MehIen，1998， Nature 395:801-804)。依賴性受體共有在不存在它們的各自配體的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 的能力，由此這種能力在結(jié)合各自配體后被阻斷(Mehlen，2004,Cell Mol Life Sci 61: 1854-1866；Bredesen,2005,Cell Death Differ 12:1031-1043)〇
[0003] 在各種人類癌癥中，已經(jīng)觀察到DCC表達(dá)的減少或損失，和因此DCC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋 亡的減少或損失（Kinzler ,1996 ,Proc Natl Acad Sci 100:4173-4178)。此外，已經(jīng)觀察 到，UNC5基因在大多數(shù)結(jié)直腸腫瘤中也被下調(diào)，這表明依賴性受體UNC5的損失代表對(duì)于腫 瘤細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢(shì)（Bernet ,2007 ,GastroenteroIogy 133 :180-1848; Shin ,2007， Gastroenterology 133:1849-1857)。然而，不僅依賴性受體DCC和UNC5的下調(diào)提高各種腫 瘤細(xì)胞的存活，而且還已經(jīng)觀察到它們的配體神經(jīng)誘向因子-1的自分泌表達(dá)。具體地，已經(jīng) 顯示，大多數(shù)乳腺腫瘤（即轉(zhuǎn)移性乳腺癌）表現(xiàn)出神經(jīng)誘向因子-1的表達(dá)增加(Fitamant， 2008，Proc Natl Acad Sci 105:4850-4855)。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)證實(shí)UNC5的胞外部分的這 兩個(gè)免疫球蛋白（Ig)子結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合神經(jīng)誘向因子-1，但并不清楚這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诔?分的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合是否是必需的（6641^6(31^，2003，1.8丨〇1.(：116111.278:32561-32568；Kruger,2004,J.Neur.24:10826-10834)〇
[0004] 如先前已經(jīng)證明的，神經(jīng)誘向因子-1被DCC的胞外域或此胞外域的部分的中和(充 當(dāng)神經(jīng)誘向因子-1誘餌蛋白）可以在表達(dá)依賴性受體DCC和/或UNC5的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡（EP-A1-1 989 546)。此胞外域或此胞外域的部分能夠減少乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺 (Fitamant等，2008)。此外，也已證明此胞外域或此胞外域的部分增加表達(dá)高水平的神經(jīng)誘 向因子-1的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡百分比（〇 611〇5^-Bourgeois,2009,J Natl Cancer Inst 101:237-247；Delloye-Bourgeois,2009,JEM 206: 833-847)。恥2012025618公開了具有改進(jìn)的DCC誘餌的DCC-融合蛋白。
[0005] EP 1 989 546(W02007099133)公開了作為藥物的針對(duì)神經(jīng)誘向因子-1或神經(jīng)誘 向因子-1受體的單克隆抗體或多克隆抗體，特別是針對(duì)神經(jīng)誘向因子-1受體的胞外結(jié)構(gòu)域 或針對(duì)能夠與神經(jīng)誘向因子-1受體的胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的神經(jīng)誘向因子-1的片段。
[0006] 本
【申請(qǐng)人】現(xiàn)已確定了神經(jīng)誘向因子-1上的線性或基本上線性表位，所述表位可能 對(duì)應(yīng)于神經(jīng)誘向因子-1特異性結(jié)合受體(具體是UNC5類，特別是UNC5B和UNC5A)的區(qū)域，或 者備選地對(duì)應(yīng)于神經(jīng)誘向因子-1特異性結(jié)合受體的區(qū)域的附近區(qū)域，當(dāng)該表位結(jié)合抗體時(shí) 阻止神經(jīng)誘向因子-1/受體相互作用。線性表位的這種確定允許
【申請(qǐng)人】生產(chǎn)這樣的抗體，所 述抗體結(jié)合神經(jīng)誘向因子-1并干擾神經(jīng)誘向因子-1/受體相互作用，從而誘導(dǎo)表達(dá)或過(guò)表 達(dá)神經(jīng)誘向因子-1和至少一種神經(jīng)誘向因子-1受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡，這 是由于這種相互作用抑制神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合到受體和受體的多聚化的事實(shí)。本
【申請(qǐng)人】也 生產(chǎn)針對(duì)該表位的鼠單克隆抗體和它們的各種人源化形式。
[0007] 神經(jīng)誘向因子-1的全長(zhǎng)氨基酸序列作為SEQ ID NO: 1給出并且編碼其的CDNA以 SEQ ID NO: 2給出。在神經(jīng)誘向因子-1的第二EGF樣結(jié)構(gòu)域中的線性表位已經(jīng)被表征并描繪 于SEQ ID N0:3、更特別是SEQ ID N0:35。編碼這種表位的cDNA分別描繪于SEQ ID N0:4和 36 〇
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的因此是代表神經(jīng)誘向因子-1的線性表位或所述線性表位的 片段或變體的多肽。更具體地，本發(fā)明涉及：
[0009] -序列為SEQ ID N0:3的分離的或純化的多肽，
[0010]-與SEQ ID N0:3具有至少85、90、95、96、97、98或99%同一性的變體多肽，
[0011]-至多200、150、100、90、80、70、60、50個(gè)氨基酸，并包括如上所述的SEQIDN0:3或 變體序列的變體多肽，諸如由SEQ ID NO: 3的從位置9(A)到位置30(C)(包括這些氨基酸）的 22個(gè)連續(xù)氨基酸組成的變體多肽，所述變體表示為SEQ ID NO:35，
[0012]-包含SEQ ID N0:3的至少20、25或30個(gè)連續(xù)氨基酸的變體多肽諸如序列SEQ ID NO: 35的變體多肽，或如上所述的變體序列，
[0013]-序列為SEQ ID N0:35的多肽，或如上述變體序列，
[0014]-由序列為SEQ ID N0:4或36的cDNA編碼的分離的或純化的多肽。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼所述代表神經(jīng)誘向因子-1的線性表位或所述線性表 位的片段或變體的多肽的cDNA。更具體地，本發(fā)明涉及：
[0016] -序列為SEQ ID NO:4的cDNA序列，
[0017]-借助于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，編碼序列SEQ ID N0:3或其變體的多肽的變體cDNA，
[0018]-編碼如早先所定義的變體多肽的變體cDNA，尤其是編碼變體多肽SEQ ID NO: 35 的cDNA，諸如SEQ ID NO:36的cDNA，
[0019]-與SEQ ID N0:4或36具有至少85、90、95、96、97、98或99%同一性的變體。0嫩。 [0020]根據(jù)本發(fā)明，變體多肽能夠產(chǎn)生仍然保留下列能力的抗體，所述能力是特異性結(jié) 合至神經(jīng)誘向因子-1上的線性表位，并抑制神經(jīng)誘向因子-1與其受體(具體是UNC5或DCC， 尤其是UNC5B和UNC5A)的相互作用，并誘導(dǎo)表達(dá)或過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1和神經(jīng)誘向因子-1受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。變體cDNA編碼SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:35的多 肽或變體多肽。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)目的是SEQ ID NO: 3或35的多肽或其變體產(chǎn)生單克隆抗體的用 途，并且這樣產(chǎn)生的單克隆抗體也是本發(fā)明的一個(gè)目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道允許使用漿 細(xì)胞和雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體的方法。本發(fā)明涵蓋使用這些方法來(lái)產(chǎn)生特異性針對(duì) SEQ ID N0:3或35的多肽或其變體的抗體。由于VH和VL的⑶R的確定和公開，通過(guò)基于編碼 所述特定多肽或抗體的核酸序列進(jìn)行遺傳工程產(chǎn)生多肽或單克隆抗體，也在本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。提供具有特異性針對(duì)本發(fā)明的線性表位其片段或變體的可變區(qū)的抗體片段和/或人 源化抗體或抗體片段也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合多肽"在本文將用于涵蓋保持抗體的 結(jié)合功能的抗體和抗體變體、片段和組合。
[0022]本發(fā)明因此還涉及神經(jīng)誘向因子-1多肽，其特異性結(jié)合具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3或35的多肽或其變體。所述結(jié)合多肽具有結(jié)合神經(jīng)誘向因子-1并誘導(dǎo)經(jīng)由UNC5或DCC 受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。事實(shí)是，游離或有活性的神經(jīng)誘向因子-1 不再存在或以不足的水平存在，以便神經(jīng)誘向因子-1的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被活化。
[0023]本發(fā)明還涉及神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)具有氨基酸序列SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:30或SEQ ID N0:9的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，其中所述結(jié)合多肽具有結(jié)合神 經(jīng)誘向因子-1并誘導(dǎo)經(jīng)由UNC5或DCC受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。
[0024]所述多肽可以是抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0025]使用頂GT定義，本發(fā)明因此涉及神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)具 有氨基酸序列SEQ ID N0:7(CDR3-H)、SEQ ID N0:9(CDR3-L)并優(yōu)選具有以上兩者的互補(bǔ)決 定區(qū)（⑶R)。
[0026] 更具體地，所述多肽可以進(jìn)一步通過(guò)額外存在⑶Rl、CDR2或VH和/或VL的⑶Rl和 CDR2進(jìn)行定義。因此，所述多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)具有下列氨基酸序列的CDR:SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9和序列YAS;和/或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8。
[0027] 本發(fā)明的一個(gè)目的是包含序列為SEQ ID N0:5的CDR1-H、序列為SEQ ID N0:6的 CDR2-H、序列為SEQ ID N0:7的CDR3-H的多肽。
[0028] 本發(fā)明的一個(gè)目的是包含序列為SEQ ID N0:8的CDR1-L、序列為YAS的CDR2-L和序 列為SEQ ID N0:9的CDR3-L的多肽。
[0029] 本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含序列為SEQ ID N0:5的CDR1-H、序列為SEQ ID N0:6的 CDR2-H、序列為SEQ ID N0:7的CDR3-H、序列為SEQ ID 勵(lì):8的0)1?1-1^、序列為￥45的0)1?2-1^ 和序列為SEQ ID N0:9的CDR3-L。
[0030]使用Kabat定義，本發(fā)明因此涉及神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)具 有氨基酸序列SEQ ID N0:30(CDR3-H)、SEQ ID N0:9(CDR3-L)并優(yōu)選具有以上兩者的互補(bǔ) 決定區(qū)(⑶R)。
[0031] 更具體地，所述多肽可以進(jìn)一步通過(guò)額外存在⑶Rl、CDR2或VH和/或VL的⑶Rl和 CDR2進(jìn)行定義。因此，所述多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)具有下列氨基酸序列的CDR:SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:28;SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29;SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:32;和/ 或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:31。
[0032] 本發(fā)明的一個(gè)目的是包含序列為SEQ ID N0:28的CDR1-H、序列為SEQ ID N0:29的 CDR2-H、序列為SEQ ID 從):30的〇)1?3-!1的多肽。
[0033] 本發(fā)明的一個(gè)目的是包含序列為SEQ ID N0:31的CDR1-L、序列為SEQ ID N0:32的 CDR2-L、序列為SEQ ID N0:9的CDR3-L的多肽。
[0034] 本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含序列為SEQ ID N0:28的CDR1-H、序列為SEQ ID N0:29的 CDR2-H、序列為SEQ ID N0:30的CDR3-H、序列為SEQ ID N0:31 的CDR1-L、序列為SEQ ID NO: 32的CDR2-L和序列為SEQ ID N0:9的CDR3-L。
[0035]這些多肽是神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽，其中所述結(jié)合多肽具有結(jié)合神經(jīng)誘向因 子-1并誘導(dǎo)經(jīng)由UNC5或DCC受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。這些多肽優(yōu)選 是抗體，尤其是單克隆抗體。結(jié)合多肽或抗體(包括其片段和組合）的各種形式稍后將在本 文描述。
[0036]在第一系列實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或抗體包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10、11、 12或13。典型地，其包含序列SEQ ID NO: 10和11兩者，或SEQ ID NO: 12和13兩者。
[0037]在第二系列實(shí)施方案中，所述多肽或抗體是人源化的并且包含選自SEQ ID NO: 14-19的組和/或選自SEQ ID NO: 20-27的組的氨基酸序列。典型地，所述多肽或抗體是人源 化的并且包含選自SEQ ID NO:14-19的組的氨基酸序列和選自SEQ ID NO :20-27的組的氨 基酸序列。
[0038]具體實(shí)施方案是下面的人源化的抗體。此表格中首先列舉對(duì)應(yīng)小鼠 CDR中移植入 人IgGl。其它稱為HUM的是具有可變?nèi)丝蚣軈^(qū)的單克隆抗體。該表格對(duì)于人IgGl的CH和CL也 給出了引用。也可以使用其它的同種異型。
[0041]本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽或 抗體和藥學(xué)可接受的媒介物或賦形劑的藥物組合物。在實(shí)施方案中，所述多肽或抗體是人 源化的。
[0042] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是癌癥的治療方法，其中用治療有效量的包含至少一種根據(jù) 本發(fā)明的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽或抗體和藥學(xué)可接受的媒介物或賦形劑的藥物組合物 施用給有需要的受試者。在實(shí)施方案中，所述多肽或抗體是人源化的。
[0043] 因此，所述組合物和方法可以包含如就本文公開的多肽或抗體所公開的特征中的 任一特征或特征的組合。
[0044] 根據(jù)一個(gè)特征，癌癥是其中腫瘤細(xì)胞表達(dá)或過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1受體(具體是 UNC5類，特別是UNC5B和/或UNC5A和/或DCC)的癌癥。典型地，所述腫瘤細(xì)胞逃避神經(jīng)誘向因 子-1受體相關(guān)的細(xì)胞凋亡，這是由于在神經(jīng)誘向因子-1的存在下，神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合到 所述受體，具體是UNC5類，特別是UNC5B和/或UNC5A，和/或DCC。根據(jù)一個(gè)特征，癌癥是其中 腫瘤細(xì)胞表達(dá)或過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1的癌癥。
[0045] 癌癥的一些實(shí)施方案包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、侵襲性神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰 腺癌、原發(fā)性黑素瘤、黑素瘤轉(zhuǎn)移、卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì) 胞白血病、侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤、肉瘤、腎腺癌、頭頸癌、睪丸癌(例如胚胎性癌、畸胎瘤、卵黃 囊瘤）、腎癌、胃癌、子宮癌。
[0046] 確定是否給定細(xì)胞在表面上表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1依賴性受體DCC和/或UNC5或顯 示神經(jīng)誘向因子-1基因表達(dá)的顯著上調(diào)的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括但不限于FACS (熒光激活細(xì)胞分選）的IHC(免疫組化）、定量PCR(例如，用六聚體引發(fā)的cDNA)或備選地與 基于顯色染料的蛋白檢測(cè)技術(shù)(諸如銀染或考馬斯亮藍(lán)染色)配對(duì)的蛋白質(zhì)印跡或?qū)θ芤?中或凝膠、斑點(diǎn)和微陣列上蛋白的基于熒光和基于發(fā)光的檢測(cè)方法，諸如免疫染色，以及免 疫沉淀、ELISA、微陣列和質(zhì)譜。在本發(fā)明的背景下，待治療的癌癥的實(shí)例在本文中列舉，包 括任何所提及癌癥的難治性形式。神經(jīng)誘向因子-1過(guò)表達(dá)可以因此通過(guò)RT-PCR使用合適的 如本文所公開和提供的那些引物，相對(duì)于不過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1的正常組織或類似癌癥 進(jìn)行測(cè)量。
[0047] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述組合物和方法用于治療表達(dá)或過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因 子-1的癌癥，其中此表達(dá)或過(guò)表達(dá)與癌癥本身有聯(lián)系或通過(guò)化療藥物治療誘導(dǎo)，單獨(dú)或兩 者皆有。
[0048] 本發(fā)明的目的是組合的抗癌治療方法，包括向有需要的患者施用化療藥物和如本 文公開的多肽或抗體。所述化療藥物和多肽或抗體是有效量的形式。
[0049] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含如本文所公開的多肽或抗體的組合物，其用作抗癌藥 物以與化療藥物一起在患者中組合使用。本發(fā)明還涉及包含如本文所公開的多肽或抗體的 組合物，其在用化療藥物治療的患者中用作抗癌藥物。
[0050] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含化療藥物的組合物，其用作以與本文公開的多肽或抗 體一起在患者中組合使用。本發(fā)明還涉及包含化療藥物的組合物，其在用如本文所公開的 多肽或抗體治療的患者中用作抗癌藥物。
[0051] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含如本文公開的化療藥物和多肽或抗體的組合物或成 套藥包(kit of parts)，用于同時(shí)、分開或順序施用給患者。
[0052] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含如本文公開的化療藥物和多肽或抗體的組合物或成 套藥包，用于同時(shí)、分開或順序施用給患者，用作抗癌藥物或抗癌治療。
[0053] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是在藥學(xué)可接受的載體或媒介物中包含如本文公開的化療 藥物和多肽或抗體的組合物。
[0054] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是在藥學(xué)可接受的載體或媒介物中包含如本文公開的化療 藥物和多肽或抗體的組合物，用作抗癌藥物的。
[0055] 又一個(gè)目的是如本文公開的多肽或抗體用于制備旨在用于與化療藥物組合治療 患者的抗癌藥物中的用途。
[0056] 又一個(gè)目的是化療藥物用于制備旨在用于與如本文公開的多肽或抗體組合治療 患者的抗癌藥物中的用途。
[0057] 又一個(gè)目的是如本文公開的多肽或抗體和化療藥物用于制備組合的抗癌藥物中 的用途。
[0058] 又一個(gè)目的是如本文公開的多肽或抗體和化療藥物用于制備組合的抗癌藥物組 合物或成套藥包的用途，用于同時(shí)、分開或順序施用給患者。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的特征，和下面的進(jìn)一步解釋，所述化療藥物是誘導(dǎo)神經(jīng)誘向因子-1 在癌癥細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)的藥物，并且如本文公開的多肽或抗體即使在這種過(guò)表達(dá)的情況下 也促進(jìn)神經(jīng)誘向因子-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。
[0060] 所述化療藥物具體是誘導(dǎo)神經(jīng)誘向因子-1在癌癥細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)的藥物。藥物誘 導(dǎo)神經(jīng)誘向因子-1過(guò)表達(dá)的確定可以容易地在任何癌細(xì)胞(諸如細(xì)胞系或來(lái)自活檢的細(xì) 胞)上進(jìn)行。在實(shí)施方案中，在來(lái)自待治療的癌癥(例如來(lái)自活檢）的細(xì)胞上進(jìn)行測(cè)定。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定在細(xì)胞(諸如細(xì)胞系）上進(jìn)行，所述細(xì)胞對(duì)于待治療的癌癥是代表性 的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定在A549或H460細(xì)胞系上進(jìn)行。測(cè)定可以包括比較神經(jīng)誘向因 子-1基因在用化療藥物處理的細(xì)胞和未處理的細(xì)胞間的表達(dá)。表達(dá)可以通過(guò)PCR測(cè)量，尤其 是定量RT-PCR，例如使用本文公開和提供的引物（SEQ ID N0:33和34)，如公開于PCT/ EP2013/068937中，其完整的內(nèi)容通過(guò)引用并入或技術(shù)人員可以查閱。藥物在誘導(dǎo)此過(guò)表達(dá) 的那些家族中的分類可以簡(jiǎn)單地按照描述于下文材料和方法中的方法對(duì)A549或H460細(xì)胞 系進(jìn)行，如描述于PCT/EP2013/068937中。
[0061] 化療藥物特別是細(xì)胞毒性藥物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物是多柔比星、5-氟 尿嘧啶(5FU)、紫杉醇(例如泰素 (Taxo 1))或順鉑。
[0062] 在實(shí)施方案中，藥物是細(xì)胞毒性抗生素。細(xì)胞毒性抗生素可以是放線菌素、蒽環(huán) 類、博來(lái)霉素、普卡霉素或絲裂霉素。蒽環(huán)類可以是多柔比星、柔紅霉素、戊柔比星、伊達(dá)比 星（丨(^10113；[(3；[116)或表柔比星。
[0063] 在實(shí)施方案中，藥物是烷化劑。烷化劑可以是鉑衍生物，諸如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑 或其它烷化劑諸如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、塞替派。其他類包括表鬼白毒素 (epipodophylotoxine)，例如依托泊苷、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（喜樹堿(camptotecines))，例 如伊立替康、托泊替康、DNA小溝烷化劑，例如曲貝替(Y0NDELIS )、氨甲蝶呤、培美曲塞、雷替 曲塞。
[0064]在實(shí)施方案中，藥物是紫杉烷或其它微管蛋白靶向劑。紫杉烷可以是紫杉醇或多 西紫杉醇，或艾日布林(eribuline)(最近批準(zhǔn)用于乳腺癌）。
[0065] 在實(shí)施方案中，藥物是抗腫瘤劑，諸如：
[0066] -乳房激素治療劑：例如他莫昔芬、來(lái)曲唑、阿那曲唑、依西美坦、氟維司群 (faslodex)；
[0067] -前列腺激素治療劑:例如LHRH激動(dòng)劑、比卡魯胺、阿比特龍；
[0068] -單克隆抗體:例如西妥昔單抗、帕尼單抗、貝伐單抗；
[0069] -激酶抑制劑：例如伊馬替尼、尼洛替尼、達(dá)沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、阿法替 尼、舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、克里唑替尼(crizotinib)、阿西替尼。
[0070] 定義和進(jìn)一步的實(shí)施方案，變體以及本發(fā)明的替代：
[0071] 如本文所用的，序列"與參考序列具有至少85%的同一性"是指序列在其整個(gè)長(zhǎng)度 上與參考序列的全長(zhǎng)具有85%或更多，特別是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%、99·5%、99·6%、99·7%、99·8%、99·9% 或 100% 的序列同一性。
[0072 ] "序列同一性"百分比可以通過(guò)比較兩個(gè)序列，最佳地在比較窗口進(jìn)行比對(duì)，其中 對(duì)于兩條序列的最佳比對(duì)，在比較窗口中的多肽序列部分可以相比于參考序列（其不包括 添加或缺失)包含添加或缺失（即缺口）。百分比可以通過(guò)如下計(jì)算:確定在兩條序列中出現(xiàn) 的相同氨基酸殘基所在位置的數(shù)目以獲得匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗 口中位置的總數(shù)，并將結(jié)果乘以1〇〇,以獲得序列同一性百分比。用于比較的序列的最佳比 對(duì)通過(guò)全局配對(duì)比對(duì)進(jìn)行，例如使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol .Biol .48:443的 算法。序列同一性百分比可以例如使用Needle程序用BL0SUM62矩陣和以下參數(shù):缺口-開放 = 10,缺口-延伸= 0.5容易地確定。
[0073] 在本發(fā)明的上下文中，"保守氨基酸取代"是其中一個(gè)氨基酸殘基被具有相似化學(xué) 性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)側(cè)鏈基團(tuán)的另一個(gè)氨基酸殘基取代。在一般情況下，保守氨基酸 取代基本上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。具有相似化學(xué)性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸組的實(shí)例包括1) 脂肪族側(cè)鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸;2)脂肪族-羥基側(cè)鏈:絲氨酸和蘇 氨酸;3)含酰胺側(cè)鏈:天冬酰胺和谷氨酰胺;4)芳香族側(cè)鏈:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;5) 堿性側(cè)鏈:賴氨酸、精氨酸和組氨酸;6)酸性側(cè)鏈:天冬氨酸和谷氨酸;和7)含硫側(cè)鏈:半胱 氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代組是:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨 酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0074] 在整個(gè)本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)"包含（comprising)"應(yīng)被解釋為涵蓋所有具體提及的特 征，以及任選的、另外的、未指定的特征。如本文中所使用的，使用術(shù)語(yǔ)"包含"也公開了其中 除特別提到的特征之外，不存在其它的特征（即"由......組成（consisting of )"）的實(shí)施 方案。
[0075] "抗體"可以是其中兩條重鏈通過(guò)二硫鍵互相連接，并且每條重鏈通過(guò)二硫鍵連接 到輕鏈的天然或常規(guī)抗體。存在兩種類型的輕鏈，Iambda(A)和kappa(K)。有五種主要的重 鏈類別(或同種型），其決定抗體分子的功能活性:IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每條鏈含有不同 的序列結(jié)構(gòu)域。輕鏈包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域或區(qū)域，可變結(jié)構(gòu)域(VL)和恒定結(jié)構(gòu)域(CL)。重鏈包括 四個(gè)結(jié)構(gòu)域，可變結(jié)構(gòu)域(VH)和三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3,統(tǒng)稱為CH)。輕鏈可變區(qū) (VL)和重鏈可變區(qū)(VH)二者決定對(duì)抗原的結(jié)合識(shí)別和特異性。輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CL)和重 鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CH)賦予重要的生物特性，諸如抗體鏈結(jié)合、分泌、透過(guò)胎盤的移動(dòng)性、補(bǔ) 體結(jié)合和結(jié)合Fc受體(FcR) 片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，并由一條輕鏈和 一條重鏈的可變部分組成?？贵w的特異性在于抗體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ) 性?？贵w結(jié)合位點(diǎn)是由主要來(lái)自于高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的殘基構(gòu)成。偶爾地，來(lái)自非 高變區(qū)或框架區(qū)(FR)的殘基影響整體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，并因此影響結(jié)合位點(diǎn)。
[0076] "互補(bǔ)決定區(qū)"或"^"是指這樣的氨基酸序列，它們一起限定天然免疫球蛋白結(jié) 合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)的結(jié)合親和力和特異性。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個(gè)CDR，分 別稱為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和0?1-!1、0)1?2-!1、001?-!1。因此，常規(guī)的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn) 包括6個(gè)⑶R，其包含來(lái)自每條重鏈和輕鏈V區(qū)的⑶R組。
[0077] "框架區(qū)"（FR)是指CDR之間插入的氨基酸序列，即在單一物種的不同免疫球蛋白 中相對(duì)保守的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具 有四個(gè) FR，分別稱為 FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-UPFR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
[0078] 如本文所使用的，"人框架區(qū)"是與天然存在的人抗體框架區(qū)基本上相同的（約 85%或者更多，特別是90%、95%、97%、99%或100% )的框架區(qū)。
[0079]在本發(fā)明的上下文中，在免疫球蛋白輕鏈或重鏈中的⑶R/FR定義基于頂GT定義進(jìn) 行確定（Lefranc等（2003)Dev Comp Immunol .27(1) :55_77;www. imgt.org) 〇
[0080] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指常規(guī)抗體及其片段，以及單結(jié)構(gòu)域抗體及其 片段(特別是單結(jié)構(gòu)域抗體的可變重鏈)和嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或多特異 性抗體。
[0081] 如本文所用，抗體或免疫球蛋白還包括最近已被描述的"單結(jié)構(gòu)域抗體"，并且所 述單結(jié)構(gòu)域抗體是這樣的抗體，其互補(bǔ)決定區(qū)是單結(jié)構(gòu)域多肽的一部分。單結(jié)構(gòu)域抗體的 實(shí)例包括重鏈抗體，天然缺乏輕鏈的抗體，衍生自常規(guī)四鏈抗體的單結(jié)構(gòu)域抗體，工程化單 結(jié)構(gòu)域抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體可以源自任何物種，包括但不限于小鼠、人、駱駝、美洲駝 (IIama)、山羊、兔和牛。單結(jié)構(gòu)域抗體可以是天然存在的被稱為重鏈抗體(缺乏輕鏈）的單 結(jié)構(gòu)域抗體。特別是，駱駝科物種(例如駱駝、單峰駝、美洲駝、羊駝和原駝)產(chǎn)生天然缺乏輕 鏈的重鏈抗體。駱駝重鏈抗體也缺乏CHl結(jié)構(gòu)域。
[0082]這些缺乏輕鏈的單結(jié)構(gòu)域抗體的可變重鏈在現(xiàn)有技術(shù)中稱為"VHH"或"納米抗 體"。與常規(guī)VH結(jié)構(gòu)域類似，VHH含有四個(gè)FR和三個(gè)CDR。納米抗體相對(duì)常規(guī)抗體具有以下優(yōu) 勢(shì)：它們比IgG分子約小十倍，并且因此適當(dāng)折疊的功能性納米抗體可以通過(guò)體外表達(dá)來(lái)生 產(chǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高收率。此外，納米抗體都非常穩(wěn)定，而且對(duì)蛋白酶的作用有抗性。納米抗體的 性質(zhì)和生產(chǎn)已由Harmsen和De Haard進(jìn)行了綜述（Harmsen和De Haard(2007) Appl.Microbiol.Biotechnol·77:13-22)〇
[0083] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"mAb"指的是針對(duì)特定抗原的單一氨基酸組成 的抗體分子，并且不被解釋為需要通過(guò)任何特定方法生產(chǎn)抗體。單克隆抗體可以通過(guò)B細(xì)胞 或雜交瘤的單克隆來(lái)生產(chǎn)，但也可以是重組的，即，通過(guò)蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)。
[0084] (常規(guī))抗體的"片段"包括含完整抗體的一部分，特別是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或 可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fv、Fab、F(ab'）2、Fab '、dsFv、（dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、雙功能 抗體、從抗體片段形成的雙特異性和多特異性抗體。常規(guī)抗體的片段也可以是單結(jié)構(gòu)域抗 體，諸如重鏈抗體或VHH。
[0085]術(shù)語(yǔ)" ^"表示具有約50,000Da的分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在通 過(guò)用蛋白酶(木瓜蛋白酶)處理IgG獲得的片段中，大約H鏈的N末端側(cè)的一半和整個(gè)L鏈，通 過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起。
[0086]術(shù)語(yǔ)"F(ab'）2"是指在通過(guò)用蛋白酶（胃蛋白酶）處理IgG得到的片段中，具有約 100,000Da的分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，其比經(jīng)由鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的Fab稍 大。
[0087] 單鏈Fv( "scFv" )多肽是共價(jià)連接的VH: : VL異二聚體，其通常表達(dá)自包括通過(guò)肽編 碼接頭連接的VH和VL編碼基因的基因融合體。本發(fā)明的人scFv片段包括特別是通過(guò)使用基 因重組技術(shù)保持適當(dāng)構(gòu)象的CDR。二價(jià)和多價(jià)抗體片段可通過(guò)單價(jià)scFv的結(jié)合自發(fā)形成，或 可經(jīng)由肽接頭通過(guò)偶聯(lián)單價(jià)ScFv生成，諸如二價(jià)sc(Fv)2。
[0088] "dsFv"是通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定的VH: : VL異二聚體。
[0089] "(dsFv)2"表示通過(guò)肽接頭偶聯(lián)的兩個(gè)dsFv。
[0090]術(shù)語(yǔ)"雙特異性抗體"或"BsAb"表示在單個(gè)分子內(nèi)組合兩種抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn) 的抗體。因此，BsAbs能夠同時(shí)結(jié)合兩種不同的抗原。已經(jīng)以越來(lái)越高的頻率使用遺傳工程 來(lái)設(shè)計(jì)、修飾和產(chǎn)生具有所需的一組結(jié)合性質(zhì)和效應(yīng)子功能的抗體或抗體衍生物，如例如 在EP 2 050 764 Al中所述。
[0091]術(shù)語(yǔ)"多特異性抗體"表示在單個(gè)分子內(nèi)組合兩種或更多種抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn) 的抗體。
[0092]術(shù)語(yǔ)"雙功能抗體"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段在相同的多肽 鏈中包含連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH) (VH-VL)。通過(guò)使用太短而不 能允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配 對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0093] 在具體實(shí)施方案中，表位結(jié)合片段選自Fv、Fab、F(ab'）2、Fab'、dsFv、（dsFv)2、 80?￥、80$￥)2、雙功能抗體和￥冊(cè)。
[0094]如本文所使用的"嵌合抗體"，是其中恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換的抗體， 使得可變區(qū)連接到不同物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的恒定區(qū)。"嵌合抗體"也指其中可 變區(qū)或其部分被改變、替換或交換的抗體，使得恒定區(qū)連接到不同物種或?qū)儆诹硪豢贵w類 別或亞類的可變區(qū)。
[0095]術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指這樣的抗體，其初始全部或部分是非人類來(lái)源并且其已經(jīng) 過(guò)修飾以替換某些氨基酸，特別是在重鏈和輕鏈的框架區(qū)中，以避免或最小化在人中的免 疫應(yīng)答。人源化抗體的恒定結(jié)構(gòu)域大部分時(shí)間是人CH和CL結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，人源化抗 體具有人類來(lái)源的恒定結(jié)構(gòu)域。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指包含衍生自非人免疫 球蛋白的最小序列(例如CDR)的嵌合抗體。
[0096] 使用術(shù)語(yǔ)"多肽"或"神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合多肽"涵蓋所有這些類型的抗體、片段或 其組合。
[0097] 人源化的目標(biāo)是引入到人的異種抗體(諸如鼠抗體)的免疫原性降低，同時(shí)保持抗 體完全的抗原結(jié)合親和力和特異性。人源化抗體，或適于其它哺乳動(dòng)物無(wú)排斥的抗體，可使 用幾種技術(shù)諸如表面重塑(resurfacing)和CDR移植來(lái)產(chǎn)生。如本文所用，表面重塑技術(shù)使 用分子建模、統(tǒng)計(jì)分析和誘變的組合來(lái)改變抗體可變區(qū)的非CDR表面以類似于目標(biāo)宿主的 已知抗體的表面。
[0098]可以使用各種其它技術(shù)進(jìn)行抗體人源化，所述技術(shù)包括CDR移植（EP0239400; W091/09967;美國(guó)專利號(hào) 5,530,101 和5,585,089)，鑲面（veneering)或表面重塑 (EP0592106;EPO519596;Padlan(1991)Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka等（1994)Protein Engineering 7(6):805-814;Roguska等（1994) Proc .Natl .Acad. Sci U. S·A. 91:969-973)，和鏈改組（chain shuffling)(美國(guó)專利號(hào)5， 565,332)。人抗體可通過(guò)各種本領(lǐng)域已知的各種方法包括噬菌體展示方法進(jìn)行制備。還參 見美國(guó)專利號(hào)4,444,887、4,716，111、5,545,806和5,814,318;以及國(guó)際專利申請(qǐng)恥98/ 46645、恥98/50433、恥98/24893、恥98/16654、恥96/34096、恥96/33735和恥91/10741。 [00"]在本發(fā)明的上下文中，如本文所使用術(shù)語(yǔ)"治療"（"treating"或"treatment"），指 逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制該術(shù)語(yǔ)應(yīng)用的病癥或病況或這樣的病癥或病況的一種或多種癥狀的進(jìn)展， 或預(yù)防所述病癥或病況或這樣的病癥或病況的一種或多種癥狀。
[0100]通過(guò)如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"治療癌癥"是指腫瘤的惡性細(xì)胞生長(zhǎng)和/或從所述腫瘤 的轉(zhuǎn)移進(jìn)展的抑制。這樣的治療也可導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的消退，即，可測(cè)量的腫瘤的大小減小。 在具體的實(shí)施方案中，這樣的治療導(dǎo)致腫瘤或轉(zhuǎn)移的部分消退。在另一具體實(shí)施方案中，這 樣的治療導(dǎo)致腫瘤或轉(zhuǎn)移的完全消退。
[0101]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"患者"或"有需要的患者"意在用于受惡性腫瘤侵襲或可能受惡 性腫瘤侵襲的人或非人哺乳動(dòng)物。
[0102] 在具體的實(shí)施方案中，待治療的患者可先前已經(jīng)用其它抗癌療法治療。特別是，待 治療的患者可先前已經(jīng)用基于奧沙利鉑、順鉑、卡鉑和/或紫杉醇、多西紫杉醇的方案治療。
[0103] 通過(guò)本發(fā)明的多肽或抗體的"治療有效量"是指其以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理 利益/風(fēng)險(xiǎn)比治療所述癌癥疾病的足夠量。然而，可以理解，本發(fā)明的多肽或抗體的每天的 總用量將通過(guò)主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。對(duì)于任何特定患者的具體治療有效 劑量水平將取決于多種因素，包括所治療的病癥和該病癥的嚴(yán)重程度;所采用的具體多肽 或抗體的活性;所采用的具體組合物、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食;所采 用的具體多肽或抗體的施用時(shí)間、施用途徑和排泄速率;治療的持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體 多肽或抗體組合或同時(shí)使用的藥物;和在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。在具體實(shí)施方案中， 所述施用給患者的多肽或抗體的治療有效量是體表面積的劑量范圍為5mg/m 2-500mg/m2、更 具體范圍為 150mg/m2-450mg/m2。
[0104] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或抗體，根據(jù)依賴于待治療患者(年齡、體 重、治療史等)的操作方案重復(fù)施用，其可以由熟練的醫(yī)師來(lái)確定。
[0105] "藥學(xué)上"或"藥學(xué)上可接受的"是指當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯媒o哺乳動(dòng)物(尤其是人)時(shí)，不產(chǎn) 生不利的、變應(yīng)的或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑是 指無(wú)毒的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或任何類型的制劑助劑。
[0106] 包括本發(fā)明的多肽或抗體的藥物組合物形式和施用途徑自然取決于待治療的病 況、疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡、體重以及性別等。
[0107] 本發(fā)明的多肽或抗體可以配制用于局部、口服、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下 或眼內(nèi)施用等。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或抗體靜脈內(nèi)施用。
[0108] 具體地，包括本發(fā)明的多肽或抗體的藥物組合物可以含有藥學(xué)上可接受用于能夠 注射的制劑的媒介物。這些可以具體是等滲、無(wú)菌的鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、 氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或此類鹽的混合物），或干燥，特別是凍干組合物，其取 決于情況，在加入后滅菌水或生理鹽水后，允許構(gòu)成注射液。
[0109] 為了制備藥物組合物，有效量的本發(fā)明的多肽或抗體，可以溶解或分散在藥學(xué)上 可接受的載體或含水介質(zhì)中。
[0110]適合于注射使用的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散體和用于無(wú)菌注射液或分散 體的臨時(shí)制備的無(wú)菌粉末。在所有情況下，形式必須是無(wú)菌的，并且必須是達(dá)到存在易注射 性的程度的流體。其必須在制造和貯存的條件下是穩(wěn)定的，并且必須保存免受諸如細(xì)菌和 真菌的微生物的污染。 Com]載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）、及 其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，通過(guò)使用包衣(諸如卵磷脂)通過(guò)在分散液的情 況下維持所要求的粒徑和通過(guò)使用表面活性劑、穩(wěn)定劑、防凍劑或抗氧化劑可以保持適當(dāng) 的流動(dòng)性?？赏ㄟ^(guò)抗菌劑和抗真菌劑可防止微生物作用。在許多情況下，將優(yōu)選包括等滲 劑，例如糖、或氯化鈉。
[0112] 通過(guò)將所需量的活性化合物加入具有以上列舉的幾種其它成分的適宜溶劑中，根 據(jù)需要之后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，制得無(wú)菌注射液。通常，通過(guò)將各種無(wú)菌活性成分加入含有基本 分散介質(zhì)和來(lái)自上述列舉的那些所需的其它成分的無(wú)菌媒介物來(lái)制備分散體。在用于制備 無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由先前無(wú) 菌過(guò)濾的溶液獲得活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
[0113] 配制后，將以與劑量制劑相容的方式并以治療有效的量施用溶液。制劑容易以各 種劑型施用，諸如上述類型的注射液，但也可以采用藥物釋放膠囊等。
[0114] 對(duì)于以水溶液腸胃外施用，例如，如果需要的話，將溶液應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)鼐彌_，并且液 體稀釋劑首先用足夠的鹽水或葡萄糖使其等滲。這些特定水溶液特別適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 皮下和腹膜內(nèi)施用。在這方面，可以采用的無(wú)菌含水介質(zhì)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開 內(nèi)容知曉的。例如，可以將一個(gè)劑量溶解在ImL等滲NaCl溶液中，并且加入到1000 mL皮下輸 液用流體中或在輸注的目的部位注射，（參見例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版，第1035-1038頁(yè)和第1570-1580頁(yè)）。根據(jù)所治療受試者的病況，可對(duì)劑量 進(jìn)行必要的改變。無(wú)論如何，負(fù)責(zé)施用的人應(yīng)確定用于個(gè)體受試者的適當(dāng)劑量。
[0115] 表1:序列描述：
[0123] 頂GT下的⑶R在表1中在適當(dāng)情況下以粗體突出顯示。
[0124] 本發(fā)明現(xiàn)在將使用實(shí)例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，所述實(shí)例被視為非限制性實(shí)施方案。
[0125] 附圖簡(jiǎn)述
[0126] 圖1:鼠4C11對(duì)人神經(jīng)誘向因子-1的ELISA結(jié)合測(cè)定。各種濃度的4C11孵育到包被 加 FLAG標(biāo)簽的神經(jīng)誘向因子-l(APOTECH)的96孔微量滴定板。使用綴合有辣根過(guò)氧化物酶 的山羊抗小鼠 IgG(Jackson Immunoresearch)和化學(xué)發(fā)光底物(PIERCE ECL蛋白質(zhì)印跡底 物)檢測(cè)結(jié)合的4C11。在Tecan Infinite F-500光度計(jì)上讀取發(fā)光。
[0127] 圖2:4C11對(duì)神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合UNC5B-FC上的抑制。在各種濃度的4C11存在的情 況下，加 FLAG標(biāo)簽的神經(jīng)誘向因子-l(APOTECH)孵育到包被有UNC5B-Fc(Netris)的96孔微 量滴定板上。使用綴合有辣根過(guò)氧化物酶的抗FLAG抗體（Sigma)和化學(xué)發(fā)光底物(PIERCE ECL蛋白質(zhì)印跡底物)檢測(cè)結(jié)合的神經(jīng)誘向因子-1。在Tecan Infinite F-500光度計(jì)上讀取 發(fā)光。
[0128] 圖3:使用覆蓋人神經(jīng)誘向因子-1的整個(gè)序列具有14個(gè)氨基酸的肽-肽重疊的590 個(gè)15-氨基酸線性肽的陣列進(jìn)行4C11的線性表位作圖。肽上4C11的結(jié)合用過(guò)氧化物酶(POD) 標(biāo)記的抗小鼠 IgG和化學(xué)發(fā)光底物顯現(xiàn)出來(lái)。
[0129] 圖4:顯示由鼠4C11抗體識(shí)別的神經(jīng)誘向因子-1表位的氨基酸序列（位于第二EGF 樣層粘連蛋白結(jié)構(gòu)域)的示意圖。
[0130] 圖5:在鼠4C11抗體存在的情況下，A549腺癌性人肺泡基底上皮細(xì)胞中胱天蛋白酶 3的誘導(dǎo)。
[0131] 圖6:用鼠4C11抗體治療的裸鼠中人異種移植物的生長(zhǎng)抑制。將A549人肺腺癌上皮 細(xì)胞皮下注射到無(wú)胸腺（即免疫缺陷）的裸鼠。一旦腫瘤達(dá)到約IOOmn^tdHtU=IOH/ 組）用5mg/kg 4C11或同種型對(duì)照(M0PC21)每周一次腹膜內(nèi)治療。
[0132] 圖7:用鼠4C11抗體治療的裸鼠中人異種移植物的生長(zhǎng)抑制。將GRANTA-519人套細(xì) 胞淋巴瘤細(xì)胞皮下注射到無(wú)胸腺（即免疫缺陷）的裸鼠。一旦腫瘤達(dá)到約IOOmm 3時(shí)，小鼠 （η =10只/組）用2mg/kg 4C11或媒介物(PBS)每周一次或每周兩次腹膜內(nèi)治療。
[0133] 圖8:人源化的4C11抗體(hum03)在大鼠移植骨肉瘤的生長(zhǎng)中的體內(nèi)作用。大鼠骨 肉瘤腫瘤在骨膜剝脫術(shù)后移植到脛骨旁(paratibial)位置(n = 7只）。將大鼠用4.4mg/kg的 人源化4Cllhum03或同種型對(duì)照用或不用多柔比星(2mg/kg)或用PBS腹膜內(nèi)注射每周治療 兩次。該圖顯示了在第17天腫瘤倍數(shù)增加。
[0134] 圖9:抗神經(jīng)誘向因子-1的人源化4C11單克隆抗體(NETl-H-mAb)HUM03的NETl結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的肽掃描分析。通過(guò)針對(duì)590個(gè)線性肽的重疊肽文庫(kù)篩選人源化4CllmAb獲得的原始 肽掃描數(shù)據(jù)（X軸）。相互作用的信號(hào)強(qiáng)度在y軸上可視化。峰對(duì)應(yīng)于以下的氨基酸序列： ARRCRFNMELYKLSGRKSGGVC(SEQ ID N0:35)。
[0135] 實(shí)施例1:抗體的產(chǎn)生、篩選和人源化
[0136] HTP?小鼠接受IOOyg神經(jīng)誘向因子I-Fc(Adipogen)的8次注射(每天2天;第一次注 射在完全弗氏佐劑的存在下，其它注射用不完全佐劑）。雜交瘤融合在第一次免疫(Abpro， Lexington, MA) 2周后進(jìn)行。雜交瘤上清液使用雙抗原ELISA測(cè)定法(神經(jīng)誘向因子-I-Fc和 無(wú)關(guān)的Fc嵌合蛋白）針對(duì)特異性單克隆抗神經(jīng)誘向因子-1抗體進(jìn)行篩選。使用次級(jí)ELISA型 測(cè)定法來(lái)選擇能夠阻斷神經(jīng)誘向因子-1與DCC或UNC5h2相互作用的單克隆抗體。然后選擇 鼠單克隆抗體（鼠4Cll或NETl-M-mAb)。該抗體由序列SEQIDN0 :12和13構(gòu)成。
[0137] 如下進(jìn)行人源化:編碼鼠4C11輕鏈和重鏈CDR序列的雙鏈DNA片段與人框架的庫(kù)合 并。然后將全長(zhǎng)可變結(jié)構(gòu)域克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與分泌信號(hào)和 人κ恒定結(jié)構(gòu)域一起同框（in frame)克隆。將重鏈可變結(jié)構(gòu)域與前導(dǎo)序列和人IgGl恒定結(jié) 構(gòu)域一起同框克隆。文庫(kù)的多樣性和LC和HC閱讀框的完整性通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。單個(gè)克隆 以96孔格式進(jìn)行陣列排列并且制備用于轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA。將人源化文庫(kù)轉(zhuǎn)染到 以96孔格式的CHO細(xì)胞。然后在轉(zhuǎn)染后48個(gè)小時(shí)的時(shí)候收集來(lái)自轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清液， 并用通過(guò)神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定法進(jìn)行篩選。前10個(gè)命中的輕鏈和重鏈 可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，并分析。如上所述生成人源化抗體HUM01-10。
[0138] 實(shí)施例2 :MAb生產(chǎn)和蛋白A純化
[0139] 基于編碼重鏈和輕鏈的核酸序列產(chǎn)生單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的。基于本文公開的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可產(chǎn)生針對(duì)SEQ ID N0:3或35或其任何變體的線 性表位的各種鼠、人源化和完全人源化的抗體，諸如鼠4C11和人源化HUM1-10和HUM1'-10' 抗體。
[0140] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選作為宿主用于生產(chǎn)治療性糖蛋白，由于它們以用于人類應(yīng)用的 最兼容的形式糖基化蛋白質(zhì)(Jenkins等,Nat Biotech. 1996; 14:975-81)。可使用的哺乳動(dòng) 物宿主細(xì)胞包括人Hela、283、H9和Jurkat細(xì)胞、小鼠 NIH3T3和C127細(xì)胞、Cosl、Cos7和CVl非 洲綠猴細(xì)胞、鵪鶉QC1-3細(xì)胞、小鼠 L細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。細(xì)菌極少糖基化蛋白質(zhì)，并 且與其它類型的常見宿主(諸如酵母、絲狀真菌、昆蟲和植物細(xì)胞)一樣獲得與從血流中快 速清除相關(guān)的糖基化模式。
[0141] 在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞允許遺傳穩(wěn)定的，高產(chǎn)的克隆細(xì)胞系的一致產(chǎn)生。它們 可以在簡(jiǎn)單的生物反應(yīng)器中使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)到高密度，并且允許開發(fā)安全和可重現(xiàn) 的生物過(guò)程。其它常用的動(dòng)物細(xì)胞包括幼倉(cāng)鼠腎（BHK)細(xì)胞、NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤細(xì) 胞。已經(jīng)也測(cè)試了來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)(Jenkins等,Nat Biotech. 1996; 14:975-81)。
[0142] 典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有啟動(dòng)子元件(來(lái)自SV40的早期和晚期啟動(dòng)子，來(lái)自 逆轉(zhuǎn)錄病毒例如RSV、HTLV1、HIV1的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRs)和巨細(xì)胞病毒(mCMV，hCMV)的早 期啟動(dòng)子）（啟動(dòng)子元件介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)）、蛋白質(zhì)編碼序列、以及轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物的 多聚腺苷酸化所需的信號(hào)(BGH多聚A、單純皰疹病毒的皰疹胸苷激酶基因多聚A( TKpa ))，晚 期SV40多聚A和3'UTR_Beta_Globin_多聚A)。附加元件包括增強(qiáng)子江以，11此1)、1(〇231^序列、 信號(hào)肽和側(cè)接用于RNA剪接的供體和受體位點(diǎn)的插入序列。在實(shí)施本發(fā)明的實(shí)踐中使用的 合適的表達(dá)載體包括，例如，載體諸如pcDNA3. l、pcDNA3.3、p0ptiVEC、pRSV、pEyMCMV、 pMCMVHE-UTR-BG、pHCMVHE-UTR-BG、pMCMV-UTR-BG、pHCMV-UTR-BG、pMCMVHE-SV40、pHCMVHE-SV40、pMCMV-SV40、pHCMV-SV40、pMCMVHE-TK、pHCMVHE-TK、pMCMV-TK、pHCMV-TK、pMCMVHE-BGH、pHCMVHE-BGH、pMCMV-BGH、pHCMV-UTR-BGH。
[0143] 按照通常瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染程序，用針對(duì)輕鏈和重鏈的MAb表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染空的CHO Easy C細(xì)胞。各自的人類IgH前導(dǎo)序列使H和L鏈能夠分泌。輕鏈和重鏈的編碼區(qū)被引入到 MAb表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中。分析了轉(zhuǎn)化體的正確方向和閱讀框，所述表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn) 染到CHO細(xì)胞系。
[0144] 將從CHO細(xì)胞產(chǎn)生的收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物上樣到Hi Trap rProtein A柱（GE 他已11:11〇3代，33；[111:05^311101^(1'01'，？瓜1106)，所述柱用。!17.2的磷酸鹽緩沖鹽水平衡。 非結(jié)合蛋白流穿并通過(guò)隨后用PBS緩沖液洗滌數(shù)次除去。使用在pH 3.0的0.1 M檸檬酸的洗 脫步驟將Mb洗脫出蛋白A柱。柱洗脫物通過(guò)A280監(jiān)控。合并Mb峰。
[0145] 實(shí)施例3: 4C11抗體對(duì)神經(jīng)誘向因子-1的ELISA型結(jié)合測(cè)定法（圖1)
[0146] 用IOOyL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中的IOOng加 His標(biāo)簽的神經(jīng)誘向因子-1(R&D 6419-N1)將白色96孔微量滴定板(Costar 3912 Corning)在4°C孵育過(guò)夜。用300yL PBS-0.05%吐溫-20(roS-T)洗滌三次后，通過(guò)加入IOOyL PBS-3%BSA并在室溫下孵育1小時(shí)封 閉板。用300yL PBS-T洗滌三次后，用各種量（IOng至1200ng)的抗神經(jīng)誘向因子-1抗體孵育 板。用300yL PBS-T洗滌三次后，加入IOOyL在I3BST中的3%BSA中1/10，000稀釋的綴合到辣 根過(guò)氧化物酶相關(guān)的第二抗體(例如山羊抗-人IgG(Fc)Sigma A0170或山羊抗小鼠 IgG輕鏈 特異性（1OJackson Immunoresearch 115-035-174)，并將板在室溫下孵育1小時(shí)。用300yL PBS-T洗滌三次后，加入IOOyL HRP的發(fā)光底物(ECL蛋白質(zhì)印跡底物，PIERCE)。5至10分鐘 后，在Tecan Infinite F-500光度計(jì)上讀取發(fā)光。
[0147] 圖1顯示了在ELISA型測(cè)定法中4C11鼠抗體對(duì)所吸附的神經(jīng)誘向因子-1的典型的 劑量依賴性相互作用。
[0148] 允許50%結(jié)合(EC5q)的抗體濃度從圖1中顯示的S形結(jié)合曲線計(jì)算。表1顯示了不同 的鼠（4C11整個(gè)抗體以及Fab和Fab'2片段）和人源化的4C11抗體的EC 5t^mygAiUiPWnM 計(jì))。
[0149] 表1:各種4C11變體結(jié)合神經(jīng)誘向因子_1(實(shí)施例3)或削弱神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合到 UNC5B(實(shí)施例5)的效價(jià)：
[0151] 選擇HUM03用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。HUM03下文有時(shí)可以稱為人源化4C11。
[0152] 實(shí)施例4:通過(guò)表面等離子體共振的抗體結(jié)合測(cè)定法
[0153] 抗體的結(jié)合性質(zhì)使用具有相關(guān)軟件TlOOControl Biacore TI 00 Evaluation的 Biacore T I 00(GE Healthcare)以及芯片:CM5芯片作為測(cè)定格式進(jìn)行分析。
[0154] 鼠4(：11(1861)抗體頌〇10吣：12和13)經(jīng)胺偶聯(lián)的捕獲分子捕獲。注射一系列具 有遞增濃度的神經(jīng)誘向因子-1。僅具有胺偶聯(lián)的捕獲分子的芯片表面用作參考對(duì)照表面， 用于神經(jīng)誘向因子-1的可能的緩沖作用或非特異性結(jié)合的校正。
[0155] 捕獲分子:抗小鼠 IgG抗體(來(lái)自山羊，Jackson Immuno Research)。
[0156] 捕獲分子的胺偶聯(lián)。根據(jù)制造商說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián):運(yùn)行緩沖液:HBS-N緩沖 液，通過(guò)EDC/NHS的混合物活化，目的是10000RU的配體密度；捕獲抗體稀釋于偶聯(lián)緩沖液 IOmM NaAc，pH 4.5，c = 30yg/mL中；最后剩余的活化羧基通過(guò)注射IM乙醇胺封閉。
[0157] 4C11抗體捕獲:在流通池2-4上捕獲4C11抗體;流量5yL/min，接觸時(shí)間72秒，c (抗 小鼠 IgG抗體）=5nM。捕獲緩沖液:PBS(pH7.4)，0.005%吐溫20。
[0158] 分析物樣品：經(jīng)典濃度系列通過(guò)以5或6個(gè)遞增濃度(c = 2-164nM)的50yL/min流速 的分析物連續(xù)注射進(jìn)行測(cè)量。運(yùn)行緩沖液：20mM Hepes pH7.4,600mM NaCl，0.005%吐溫 20。注射分析物3分鐘，隨后是90s的解離期。
[0159]使用如本發(fā)明所提供和描述的4C11鼠抗體對(duì)人神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合的BIAcore分 析神經(jīng)誘向因子-1對(duì)捕獲的4C11的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行半定量表面等離子體共振(SPR)分析。 經(jīng)由胺偶聯(lián)的抗-人IgG(Fc)分子將4C11抗體捕獲于芯片表面上。注射一系列具有遞增濃度 的人神經(jīng)誘向因子-1并通過(guò)SPR變化監(jiān)測(cè)動(dòng)力學(xué)結(jié)合行為。在y軸上記錄相比對(duì)照芯片的作 為相對(duì)單位(RU)隨時(shí)間（X軸）的變化。觀察到以不同濃度注射的人神經(jīng)誘向因子-1所捕獲 的分析物4C11的代表性結(jié)合和解離曲線。
[0160]然后通過(guò)使用常用的雙參考(對(duì)照參考:分析物與捕獲分子的結(jié)合;流通池：神經(jīng) 誘向因子-1濃度"〇"作為空白）和用模型"滴定動(dòng)力學(xué)1:1結(jié)合"計(jì)算來(lái)計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 [0161] 表2給出了在25°C在PBS中通過(guò)SPR(B丨ACORE?T100)測(cè)量的親和性數(shù)據(jù)：
[0163] 實(shí)施例5:4C11抑制神經(jīng)誘向因子-1與UNC5B的結(jié)合(圖2)
[0164] 用在IOOyL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中的 IOOng UNC5B-Fc (R&D1006-UN-050)或DCC-Fc(R&D 844-DC-050)將白色96孔微量滴定板(Costar 3912Corning)在4°C孵育過(guò)夜。用300 41^?83-0.05%吐溫-20(?83-1')洗滌三次后，通過(guò)加入10(^1^?83-2%834并在室溫下孵育1 小時(shí)封閉板。用300yL PBS-T洗滌三次后，用IOOyL的含有50ng/mL加 FLAG標(biāo)簽的神經(jīng)誘向因 子-I(Adipogen)和不同量(0.2ng-3000ng)4Cll抗體的PBS-I %BSA，將板在室溫下孵育1小 時(shí)。用300yLPBS-T洗滌三次后，加入IOOyL在I3BST-I % BSA中1/5000稀釋的綴合到辣根過(guò)氧 化物酶(HRP)的抗FLAG M2單克隆抗體(Sigma A8592)，并將該板在室溫下孵育1小時(shí)。用300 yL PBS-T洗滌三次后，加入IOOyL HRP的發(fā)光底物(ECL蛋白質(zhì)印跡底物，PIERCE)。5至10分 鐘后，在Tecan Infinite F-500光度計(jì)上讀取發(fā)光。
[0165] 圖2顯示通過(guò)在ELISA型測(cè)定法中增加量的鼠4C11鼠抗體的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合 UNC5B的典型劑量依賴性抑制。
[0166] 允許50%抑制（IC5q)的抗體濃度從圖5中顯示的S形結(jié)合曲線計(jì)算。表1給出了不同 的鼠（4C11整個(gè)抗體以及Fab和Fab ' 2片段）和人源化的4C11抗體的IC5Q值（以yg/mL和以nM 計(jì))。
[0167] 實(shí)施例6:小鼠4C11的神經(jīng)誘向因子-1表位作圖（圖3和4)
[0168] 使用590個(gè)15-氨基酸線性肽的陣列進(jìn)行表位作圖，所述線性肽具有14個(gè)氨基酸的 肽-肽重疊，覆蓋人神經(jīng)誘向因子-1的整個(gè)序列(無(wú)信號(hào)肽）。使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc-化學(xué)合成線 性肽，并使用三氟乙酸(trifluoric acid)去保護(hù)。含有共價(jià)連接的肽的455孔信用卡格式 的聚丙烯卡片在含有5%的SQ(SQ，Super-Q，在PBST中4%馬血清(v/v)，5%卵清蛋白（w/v)) 的PBST(PBS-1 %吐溫80)中在25°C孵育30分鐘。洗滌后，將肽與4C11 (lyg/mL)PBST-0.1 % SQ 一起孵育。洗滌后，將肽用1 / 1 〇 〇 〇稀釋的抗小鼠抗體的過(guò)氧化物酶綴合物 (SouthernBiotech)在25°C下孵育一小時(shí)。洗滌后，加入過(guò)氧化物酶底物2，2連氮基_二_ 3-乙基苯并噻唑啉磺酸（ABTS)和2微升3 %過(guò)氧化氫。一小時(shí)后，顯色用電荷耦合器件 (CCD)-攝像機(jī)和圖像處理系統(tǒng)定量。
[0169] 圖3顯示鼠4C11 與包括在SEQ ID N0:3:VACNCNLHARRCRFNMELYKLSGRKSGGVCLNCRHN TAGRHCH中的肽特異性相互作用。
[0170] 圖4是顯示由鼠4C11抗體識(shí)別的表位的位置的草圖（cartoon)。該表位由神經(jīng)誘向 因子-1的第二EGF樣結(jié)構(gòu)域攜帶。
[0171] 使用覆蓋人神經(jīng)誘向因子-1的整個(gè)序列的590個(gè)15-氨基酸線性肽的點(diǎn)陣列進(jìn)行 肽掃描表位作圖。如圖9所示，抗體HUM03結(jié)合對(duì)應(yīng)氨基酸序列"ARRCRFNMELYKLSGRKSGGVC" (SEQ ID N0:35)的8個(gè)重疊肽，其存在于NETl的V-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。該抗體的結(jié)合表位因而和涉 及與UNC5B發(fā)生相互作用的NETl結(jié)構(gòu)域重疊。為了確認(rèn)NETl的V-2結(jié)構(gòu)域確實(shí)負(fù)責(zé)與HUM03 的相互作用，我們生成了突變體的集合，并在體外進(jìn)行這些突變體與抗體以及與UNC5B的結(jié) 合測(cè)定。點(diǎn)突變K358L足以降低與HUM03的相互作用。三重突變R348A-R349A-R351A降低該相 互作用。
[0172] 實(shí)施例7:在人A549肺腺癌上皮細(xì)胞中4C11誘導(dǎo)的胱天蛋白酶_3(圖5)
[0173] 在第1天，將細(xì)胞鋪板在無(wú)血清培養(yǎng)基中（每孔1.8 X IO5個(gè)細(xì)胞，在6孔板中，每孔 Iml)。第2天，將培養(yǎng)基用含有媒介物(對(duì)照）、小鼠4C11抗體或鼠 IgGl、k無(wú)關(guān)抗體(Ab) (1 Ομ g/mL)的ImL新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基替換。處理均以一式兩份進(jìn)行。在第3天，收獲來(lái)自2個(gè)相同 處理孔的細(xì)胞并合并為一個(gè)池。離心后，細(xì)胞沉淀重新懸浮于55yL的在胱天蛋白酶3/CPP32 焚光測(cè)定試劑盒(Gentaur Biovision,Brussels,Belgium)中提供的裂解緩沖液中。然后使 用上述試劑盒，通過(guò)測(cè)量胱天蛋白酶-3活性監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。所有的值都相對(duì)于對(duì)照進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化。
[0174]圖5顯示鼠4C11抗體誘導(dǎo)人A549肺腺癌上皮細(xì)胞中胱天蛋白酶3的活性。
[0175] 實(shí)施例8:體內(nèi)4C11誘導(dǎo)的A549(人肺腺癌上皮細(xì)胞）（圖6)和GRANTA (人套細(xì)胞淋 巴瘤細(xì)胞)細(xì)胞異種移植物(圖7)的腫瘤生長(zhǎng)抑制。
[0176] 七周齡(體重20_22g)的雌性無(wú)胸腺nu/nu小鼠獲得自Charles River動(dòng)物設(shè)施。將 小鼠安置在頂部有滅菌過(guò)濾器的籠中并維持在無(wú)病原體的動(dòng)物設(shè)施中。所有腫瘤通過(guò)皮下 注射在200yLPBS中的腫瘤細(xì)胞（IO 7個(gè)A549細(xì)胞或IO6個(gè)GRANTA細(xì)胞)到小鼠的右肋進(jìn)行植 入。當(dāng)腫瘤建立時(shí)(V~IOOmm 3，約15-20天注射后)開始用4C11抗體治療。小鼠接受4C11抗體 (各種劑量和時(shí)間表）、媒介物(PBS)、或同種型對(duì)照(M0PC21)的腹膜內(nèi)注射(n= 10只小鼠）。 腫瘤大小用卡尺測(cè)量。腫瘤體積用式V=O.5*(長(zhǎng)度*寬度2)進(jìn)行計(jì)算。
[0177] 具有A549異種移植物的小鼠用5mg/kg的4C11每周治療一次，而具有GRANTA異種移 植物的小鼠接受較低劑量的4C11 (2mg/kg)每周一次或兩次。
[0178] 圖6和7證實(shí)了在免疫缺陷小鼠中異種移植人A549肺腺癌上皮細(xì)胞(A)和人GRANTA 人套細(xì)胞淋巴瘤(B)的腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制。
[0179] 4C11抗體顯示抑制A549和GRANTA腫瘤生長(zhǎng)。
[0180] 實(shí)施例9:人源化4Cll(hum03)和多柔比星之間在大鼠骨肉瘤中的協(xié)同作用（圖8)。
[0181] 輻射誘導(dǎo)的大鼠骨肉瘤已被轉(zhuǎn)化成在骨膜剝脫術(shù)后移植到脛骨旁的可移植的模 型(參見Al louche M.等，1980，Int. J. Cancer 26，777-782)。因?yàn)樵诖四[瘤中不表達(dá)神經(jīng)誘 向因子-1，我們按最近發(fā)表的（參見Paradisi等2013EMB0 Mol Med(2013)5,1821-1834)使 用化療劑(D0X，多柔比星)刺激神經(jīng)誘向因子-1及其受體表達(dá)。移植有骨肉瘤的大鼠接受每 周兩次人源化4Cllhum03(4.4mg/kg)或媒介物(ctr)的腹膜內(nèi)注射。一些動(dòng)物接受額外的多 柔比星(2mg/kg)的腹腔內(nèi)注射。腫瘤大小用卡尺測(cè)量。腫瘤體積用式V = 0.5*(長(zhǎng)度*寬度2) 進(jìn)行計(jì)算。平行地，使用MRI以跟蹤生長(zhǎng)模式。
[0182] 圖8顯示，在4C11和多柔比星同時(shí)治療的動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)骨肉瘤生長(zhǎng)的抑制。
[0183] 實(shí)施例10:在由炎癥產(chǎn)生的自發(fā)的結(jié)腸癌炎癥模型中鼠4C11的效果。（IBD(炎癥性 腸病)相關(guān)性結(jié)直腸癌的小鼠模型）
[0184] (參見Proc Natl Acad Sci U S A.20090ct 6; 106(40): 17146-51)。
[0185] 如先前所述（參考文獻(xiàn)：Neufert C等（2007)Nat Protoc 2:1998-2004)，用AOM+ DSS處理小鼠，并用PBS或4C11腹膜內(nèi)2mg/kg每周兩次治療(n = 7)。簡(jiǎn)言之，無(wú)病原體的8周 齡雌性野生型Balb/c小鼠用溶于PBS中的10mg/kg體重的AOM腹膜內(nèi)注射。一天后，在飲用水 中給予2.5%DSS超過(guò)一周，隨后是2周的正常水。每2周用DSS處理小鼠1周，直到實(shí)驗(yàn)的第十 周并且每周用4C11或用PBS注射三次。動(dòng)物在第十周的開頭處死并且移除結(jié)腸用于組織學(xué) 分析。表3清楚地表明，用4C11抗體治療小鼠阻止或減慢炎癥驅(qū)動(dòng)的結(jié)腸腺癌的發(fā)展。
[0186] 表3:抗神經(jīng)誘向因子mAb 4C11在體內(nèi)對(duì)炎癥驅(qū)動(dòng)的結(jié)腸腫瘤的影響。如早先描述 (Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Oct 6; 106(40) :17146-51)生成IBD(炎癥性腸?。┫嚓P(guān) 的結(jié)直腸癌的小鼠模型。首先用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)處理小鼠以誘導(dǎo) 結(jié)直腸癌。用PBS或4C11腹膜內(nèi)2mg/kg每周治療小鼠兩次(n = 7)。處死小鼠。移除的結(jié)腸在 甲醛中固定用于組織學(xué)分析。表3顯示展示各種癌前或癌性結(jié)腸病變的小鼠的百分比。
[0188] 實(shí)施例11:在人癌細(xì)胞中的神經(jīng)誘向因子-1蛋白定量：
[0189] 對(duì)于免疫印跡分析，將細(xì)胞在改良的RIPA緩沖液（50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、I %NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1 % SDS、ImM EDTA、蛋白酶抑制劑混合物和5mM DTT) 中通過(guò)超聲處理裂解，并在4°C孵育1小時(shí)。細(xì)胞碎片通過(guò)離心(在4 °C，10.0 OOg 15'）沉淀并 且將蛋白提取物（每泳道200yg)上樣到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上并印跡到PVDF片材 (]\1;[111卩0代00印0瓜1:;[011，13;[1161'；^&，]\^，1].3.厶.）上。濾紙（;1^]^61')用在？133/0.1%吐溫20 (PBS-T)中10 %脫脂奶粉和5 % BSA封閉過(guò)夜，并且然后與兔多克隆α-神經(jīng)誘向因子-1 (1: 500稀釋，克隆H104，Santa Cruz Biotechnology，Santa 〇112,〇4，1134)和小鼠單克隆0-肌 動(dòng)蛋白（Santa Cruz Biotechnologies)抗體孵育2小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，濾紙與適當(dāng) 的HRP綴合的第二抗體（1:10000，Jackson ImmunoResearch，Suffolk，UK)孵育1 小時(shí)。使用 West Dura化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Pierce，Rockford，IL，U· S · A·)進(jìn)行檢測(cè)。
[0190] 對(duì)于免疫焚光研究，使細(xì)胞脫壁，用離心涂片器（Shandon Cytospin 3，Thermo Scientif ic)離心到蓋玻片上，并用4% (v/v)低聚甲醛固定30分鐘。然后將細(xì)胞在0.2%的 Triton X-100/PBS中透化30分鐘，并在含有2%BSA和2%正常驢血清的PBS中封閉。內(nèi)源性 的神經(jīng)誘向因子-1使用大鼠單克隆α-神經(jīng)誘向因子-1抗體(R&D 8}^七61118)和41613-488驢 抗大鼠 IgG(Molecular probes)染色。核使用Hoescht染色(Sigma)進(jìn)行對(duì)比染色。
[0191] 實(shí)施例12:過(guò)表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1和表達(dá)DCC和/或UNC5A和/或B和/或C和/或D待 作為候選用于用UNC5-TRAP或人源化4C11抗體治療的癌癥的實(shí)例。
[0192] 對(duì)于神經(jīng)誘向因子-1及其受體的表達(dá)已被量化的每種類型癌癥，給出神經(jīng)誘向因 子-1過(guò)表達(dá)情況的百分比。
[0193] -轉(zhuǎn)移性乳腺癌60% (Fitamant等，PNAS 2008)，
[0194] -非小細(xì)胞肺癌47% (Delloye-Bourgeois等，JNCI 2009)，
[0195] -侵襲性神經(jīng)母細(xì)胞瘤38%(Delloye_Bourgeois等，J_Exp.Med.2009)，
[0196] -膜腺癌61 % (Link等，Annals of Chir · Onco · 2007 ;Dumartin et al · ,Gastro 2010)，
[0197] -原發(fā)性黑素瘤 100% (n = 7)，黑素瘤轉(zhuǎn)移（n = 6) (Kaufmann 等，Cellular Oncology 2009),
[0198] -卵巢癌76% (Panastasiou等，Oncotarget 2011)，
[0199] -膠質(zhì)母細(xì)胞瘤65%，
[0200]-急性髓細(xì)胞性白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病60%，
[0201]-侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤50%，
[0202]-肉瘤 30%，
[0203]-腎腺癌 40%，
[0204]-頭頸癌 22%，
[0205]-睪丸癌(胚胎性癌36%，畸胎瘤50%，卵黃囊瘤100%)，
[0206] -腎癌 50%，
[0207] -胃癌 26%，
[0208] -子宮癌 19 %。
[0209] 實(shí)施例13.定量RT-PCR允許根據(jù)PCT/EP2013/068937評(píng)估神經(jīng)誘向因子-1的表達(dá) 或過(guò)表達(dá)：
[0210] 根據(jù)制造商的操作步驟使川]Sucle〇Spm*RNA II試劑盒(Macherey Nagel ,DU ren，Germany)提取總RNA。用iScript?cDNA合成試劑盒(Bi orad)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。使用以 下程序反轉(zhuǎn)錄Iyg總RNA : 25 °C 5分鐘，42 °C 30分鐘和85 °C 5分鐘。對(duì)于表達(dá)研究，在 LightCycljer?2.0設(shè)備（Roche Applied Science)中使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I試劑盒(Roche Applied Science)擴(kuò)增目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物。目標(biāo)基因的表達(dá) 相對(duì)于用作持家基因的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和磷酸甘油酸激酶(PGK)基因進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化。相對(duì)于持家基因進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的量使用比較Ct法進(jìn)行計(jì)算。進(jìn)行驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)以證明目標(biāo)基因和持家基因的效率大致相等。引物序列如下：
[0211 ]正向引物：aaaagtactgcaagaaggactatgc SEQ ID N0:33〇
[0212] 反向引物：ccctgcttatacacggagatg SEQ ID N0:34。
[0213] 實(shí)施例14.根據(jù)PCT/EP2013/068937在人癌細(xì)胞中神經(jīng)誘向因子-1蛋白的定量：
[0214] 對(duì)于免疫印跡分析，將細(xì)胞在改良的RIPA緩沖液（50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、I %NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1 % SDS、ImM EDTA、蛋白酶抑制劑混合物和5mM DTT) 中通過(guò)超聲處理裂解，并在4°C孵育1小時(shí)。細(xì)胞碎片通過(guò)離心(在4 °C，10.0 OOg 15'）沉淀并 且將蛋白提取物（每泳道200yg)上樣到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上并印跡到PVDF片材 (Millipore Corporation,BilIerica，MA，U.S.A.)上。濾紙用在PBS/0.1 %吐溫20(PBS_T) 中10%脫脂奶粉和5%BSA封閉過(guò)夜，并且然后與兔多克隆α-神經(jīng)誘向因子-1(1:500稀釋， 克隆H104，Santa Cruz Biotechnology，Santa (^112,〇厶，1]3厶）和小鼠單克隆0-肌動(dòng)蛋白 (Santa Cruz Biotechnologies)抗體孵育2小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，濾紙與適當(dāng)?shù)腍RP綴 合的第二抗體（1:10000，Jackson ImmunoResearch，Suffolk，UK)孵育 1 小時(shí)。使用West Dura化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Pierce，Rockford，IL，U· S · A·)進(jìn)行檢測(cè)。
[0215] 對(duì)于免疫焚光研究，使細(xì)胞脫壁，用離心涂片器（Shandon Cytospin 3，Thermo Scientif ic)離心到蓋玻片上，并用4% (v/v)低聚甲醛固定30分鐘。然后將細(xì)胞在0.2%的 Triton X-100/PBS中透化30分鐘，并在含有2%BSA和2%正常驢血清的PBS中封閉。內(nèi)源性 的神經(jīng)誘向因子-1使用大鼠單克隆α-神經(jīng)誘向因子-1抗體(R&D 8}^七61118)和41613-488驢 抗大鼠 IgG(Molecular probes)染色。核使用Hoescht染色(Sigma)進(jìn)行對(duì)比染色。
[0216]實(shí)施例15:體內(nèi)異種移植物模型。
[0217]指數(shù)生長(zhǎng)中的不同的人細(xì)胞系（肺腺癌上皮細(xì)胞系H358和A549,和套細(xì)胞淋巴瘤 細(xì)胞系GRANTA-519和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤oci-ly3)從培養(yǎng)物中收集，用無(wú)菌I3BS洗滌兩 次，計(jì)數(shù)并且5. IO6個(gè)細(xì)胞重懸在PBS中，然后皮下植入到5周齡的雌性瑞士/裸鼠的右肋。月中 瘤體積(V)通過(guò)式V = 0.5(長(zhǎng)度X寬度2)用游標(biāo)卡尺測(cè)定。100+/-20mm3腫瘤建立后隨機(jī)化 分入多個(gè)組(每組10只小鼠）?？股窠?jīng)誘向因子1抗體或同種型對(duì)照人靜脈內(nèi)（H358、A549、 oci-ly3)或腹膜內(nèi)（GRANTA-519)以10mg/kg每周兩次注射入小鼠。確定在下表中指示的天 (d)移植的每種細(xì)胞系的腫瘤生長(zhǎng)抑制的百分比（％TGI)，并通過(guò)式TGI(%) = (1-T/C)X 100計(jì)算，其中T指示測(cè)試組（用抗神經(jīng)誘向因子1抗體治療)在d天的平均腫瘤體積，并且C指 示同種型對(duì)照治療組的平均體積。腫瘤生長(zhǎng)抑制〈50%被認(rèn)為是有意義的。
[0219]本發(fā)明的鼠和人源化抗體具有有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 分離的或純化的多肽： -其序列為SEQ ID NO: 3,或所述多肽是與SEQ ID NO: 3具有至少85%同一性的變體多 肽，或 -其由序列為SEQ ID N0:4的cDNA，或該cDNA的借助于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的變體，或與SEQ ID NO: 4具有至少85%同一性的變體cDNA編碼。2. 權(quán)利要求1的抗體，其序列如SEQ ID NO: 35所描繪，或是與SEQ ID NO: 35具有至少 85%同一性的變體多肽。3. 權(quán)利要求1的多肽，其由序列為SEQ ID N0:36的cDNA，或該cDNA的借助于遺傳密碼簡(jiǎn) 并性的變體，或與SEQ ID NO:36具有至少85%同一性的變體cDNA編碼。4. 序列為SEQ ID NO: 4或36的cDNA，或該cDNA的借助于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的變體，或與 SEQ ID NO:4或36具有至少85%同一性的變體cDNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽用于制備單克隆抗體的用途。6. 神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合抗體，其特異性結(jié)合具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或35的多肽 或與SEQ ID N0:3具有至少85%同一性的變體多肽，其中結(jié)合多肽具有結(jié)合神經(jīng)誘向因子-1并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞經(jīng)由UNC5受體或DCC受體的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。7. 神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合抗體，其包含序列為SEQ ID N0:5的CDR1-H，序列為SEQ ID NO: 6的CDR2-H，序列為SEQ ID N0:7的CDR3-H，和序列為SEQ ID N0:8的CDR1-L，序列為YAS的 ⑶R2-L，和序列為SEQ ID N0:9的⑶R3-L，其中所述抗體具有結(jié)合神經(jīng)誘向因子-1并誘導(dǎo)腫 瘤細(xì)胞經(jīng)由UNC5受體或DCC受體的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。8. 神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合抗體，其包含序列為SEQ ID N0:28的CDR1-H，序列為SEQ ID N0:29的CDR2-H，序列為SEQIDN0:30的CDR3-H，和序列為SEQIDN0:31的CDR1-L，序列為 SEQ ID N0:32的CDR2-L，和序列為SEQ ID N0:9的CDR3-L，其中所述抗體具有結(jié)合神經(jīng)誘向 因子-1并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞經(jīng)由UNC5受體或DCC受體的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。9. 權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合抗體，其是所述抗體的表位結(jié)合片段。10. 權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合抗體，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10、11、12或13,優(yōu)選地序列SEQ ID NO: 10和11兩者，或SEQ ID NO: 12和13兩者。11. 權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的神經(jīng)誘向因子-1結(jié)合抗體，其包含選自SEQ ID N0:14-19的 組和/或選自SEQ ID NO:20-27的組的氨基酸序列，優(yōu)選地，其包含選自SEQ ID NO :14-19的 組的氨基酸序列和選自SEQ ID NO:20-27的組的氨基酸序列。12. 藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)的抗體和藥學(xué)上可接受的媒介物、載 體或稀釋劑。13. 權(quán)利要求12的組合物，用于在神經(jīng)誘向因子-1的存在下治療受試者對(duì)抗癌癥，其中 所述癌癥具有表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1的腫瘤細(xì)胞。14. 權(quán)利要求12的組合物，其用于治療受試者對(duì)抗癌癥，其中所述癌癥具有表達(dá)神經(jīng)誘 向因子-1受體和神經(jīng)誘向因子-1的腫瘤細(xì)胞，或具有在表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi) 表達(dá)神經(jīng)誘向因子-1的腫瘤細(xì)胞。15. 治療癌癥的方法，其中對(duì)有需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求12的藥 物組合物。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK105979966SQ201580007753
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日
【發(fā)明人】J-G·戴爾克羅斯, Y·迪安
【申請(qǐng)人】奈特里斯藥物公司