專利名稱：土貝母苷乙用于制備防治人和動物病毒性疾病的藥物藥餌的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用土貝母苷乙及含土貝母苷乙的土貝母皂苷制備預防和治療人和動物各種病毒性疾病的藥物或藥餌。
眾所周知，病毒是一種嚴重危害人類健康、引起多種動物罹患各種疾患甚至死亡的微生物致病因子。目前在全世界廣泛流行的對人類健康威脅甚大的艾滋病、各型流感、各型病毒性肝炎、埃潑氏病毒感染、以及給人類造成巨大經(jīng)濟損失的蝦病毒病和禽流感均由病毒所引起。一些常見病毒，如單純皰疹病毒(HSV)引起的感染雖然常常是無癥狀的，但它不僅可引起局部病變，如反復發(fā)作的生殖器和口面部的損傷、角膜炎、結(jié)膜炎，還可引起嚴重的全身性疾患，如腦膜炎和新生兒全身播散性感染等。另一些常見病毒，如乳頭狀瘤病毒(HPV)和Epstein-Barr(EB)病毒則分別與子宮頸癌和鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)。值得注意的是，某些動物病毒性疾病，還可以傳染給人。對于各種病毒性疾病，目前人類尚無有效的防治手段。
在中國專利說明書(CN 1094637A)中描述了土貝母苷乙的天然衍生物土貝母苷甲注射液對人艾滋病毒I型及其變異株的復制有明顯的抑制效果，并能抑制人艾滋病毒I型所引起的細胞病變。上述專利申請在此作為參考。
土貝母苷乙是從中藥土貝母中分離提取出來的一種單體，分子量為1334，化學結(jié)構(gòu)式如

圖1所示。土貝母苷乙與土貝母苷甲的區(qū)別是土貝母苷甲苷元16位碳上是氫，而土貝母苷乙苷元16位碳上是羥基。土貝母苷乙與土貝母苷甲一樣，水溶性好，穩(wěn)定性強，唯得率較土貝母苷甲低(土貝母苷乙為0.5％，土貝母苷甲為1.8％)。本發(fā)明所涉及的土貝母皂苷系指不含土貝母苷丙的土貝母中的皂苷組分，其水溶性和穩(wěn)定性則與土貝母苷甲、土貝母苷乙相當。制備土貝母皂苷的工藝簡單易行，得率也高，約2.2％。
土貝母苷乙和土貝母皂苷的提取方法參見文獻(王永清、于立堅等陜西新醫(yī)藥，1055，1981；Kasai，R et al.，Phytochemistry，271439-1446，1988)本發(fā)明涉及土貝母苷乙或土貝母皂苷作為預防和治療人和動物各種病毒性疾病的藥物或藥餌的組合物，該藥物或藥餌組合物包括土貝母苷乙或土貝母皂苷及可藥用或食用的載體。
本發(fā)明涉及如權(quán)利要求1所定義的藥物或藥餌組合物的制備方法，該方法包括土貝母苷乙或土貝母皂苷分別與可藥用或食用的載體混合或溶解。
本發(fā)明涉及土貝母苷乙或土貝母皂苷作為預防和治療人和動物各種病毒性疾病的藥物或藥餌在需要進行這種預防或治療的人或動物中的應用。
土貝母苷乙或土貝母皂苷可與任何可藥用或食用的載體混合或溶解做成藥物組合物，這些載體包括經(jīng)皮膚、粘膜、胃腸內(nèi)和胃腸外給藥的可藥用載體或可食用的載體。該藥物組合物以常規(guī)藥用制劑的形式使用，如固體形式的片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑、扁囊劑、栓劑等，或半固體形式的油膏、軟膏等，或液體形式的針劑、懸浮劑、糖漿劑、乳劑、搽劑等。該藥物組合物中使用可藥用的賦形劑和添加劑，這些可藥用的賦形劑和添加劑包括無毒的可相容的填料、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、矯味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑、穩(wěn)定劑，例如乳糖、檸檬酸、硬脂酸、硬脂酸鎂石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、鹽酸普魯卡因、鹽酸利多卡因、抗壞血酸等。該藥物組合物可按各種制劑的常規(guī)工藝制備。該藥餌組合物以常規(guī)餌料的形式使用，餌料組合物中使用可藥用或食用的賦形劑和添加劑。
本發(fā)明所述及的土貝母苷乙或土貝母皂苷作為預防人和動物各種病毒性疾病的藥物，可作為食品添加劑、化妝品添加劑、陰道用避孕藥或避孕藥套添加劑、餌料添加劑加入到食品、化妝品、避孕藥或避孕藥套中，亦可加入到餌料或水生動物的生存環(huán)境中。
本發(fā)明所述有效成份土貝母苷乙或土貝母皂苷作為防治各種人和動物病毒性疾病的藥物，可用于各型病毒性肝炎、單純皰疹病毒引起的各類疾患、艾滋病及對蝦病毒性疾病、禽流感等。
所制成的各種口服藥物組合物中土貝母苷乙或土貝母皂苷的含量為每日每kg體重大約0.001-100mg，優(yōu)選約0.01-50mg，更優(yōu)約0.05-30mg，最佳約0.1-10mg。每日分2-4次服用，5-30天為一療程，一般用藥3-6個療程，每個療程間隔5-30天。所制成的注射用藥物組合物，可供肌肉注射或靜脈點滴，其中土貝母苷乙或土貝母皂苷的含量為每日每kg體重0.001-50mg，優(yōu)選約0.01-25mg/kg，更優(yōu)約0.05-15mg，最佳約0.1-3mg。每日分1-3次使用，5-30天為一療程，一般用藥3-6個療程，每個療程間隔5-30天。然而，精確的劑量、用藥途徑、用藥方式等應由醫(yī)生決定，主要取決于病人的年齡、體重、病情、反應等。至于動物用藥，則應根據(jù)動物對藥物的耐受和反應情況作適當調(diào)整。
下面列舉我們的實驗內(nèi)容及其結(jié)果，作為土貝母苷乙或土貝母皂苷可用于制備預防和治療各種人和動物病毒性疾病的藥物和藥餌的證據(jù)。一.藥效學試驗1.土貝母苷乙或土貝母皂苷對單純皰疹病毒I型、II型(HSV-I、HSV-II)的抑制作用1.1.細胞Vero-E6細胞株(非洲綠猴腎細胞株)。
1.2.病毒HSV-I和HSV-II，滴度分別為PFU(空斑形成單位5×106/ml、4×108/ml，實驗中使用濃度為MOI＝1。
1.3.土貝母苷乙或土貝母皂苷在體外對單純皰疹病毒I型和II型的中和作用。
1.4.病毒經(jīng)土貝母苷乙或土貝母皂苷作用后接種將不同濃度的藥液與等體積單純皰疹病毒液混合，作用1.5小時后分別加入單層細胞孔內(nèi)，每孔0.1ml，每一濃度平行作3孔。逐日觀察細胞病變情況。同時設病毒對照組、不同濃度藥液對照組及正常對照組。
1.5.細胞感染病毒后加土貝母苷乙或土貝母皂苷在長成單層細胞的孔內(nèi)，加入單純皰疹病毒，0.1ml/孔，每一濃度平行作3孔。在37℃、5％二氧化碳、飽和濕度的孵箱中孵育1.5小時后棄去病毒液。用培養(yǎng)液洗3次后分別加入不同濃度的土貝母苷乙或土貝母皂苷，逐日觀察細胞病變情況。同時設病毒對照組、不同濃度藥液對照組及正常對照組。
1.6.結(jié)果1.6.1土貝母苷乙或土貝母皂苷對HSV-I型和HSV-II型有直接滅活作用，結(jié)果見表1、2。
表1 土貝母苷乙對HSV-I的體外中和作用*觀察時間72h 96h細胞對照- - - - - -病毒對照 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++土貝母苷乙(μg/ml)0.5 - - -1.0 - - -2.0 少 部 分 空 泡4.0 部 分 空 泡8.0 死 亡病毒+土貝母苷乙(μg/ml)0.5++++ ++++ ++++++++ ++++ ++++1.0++++ ++++ ++++++++ ++++ ++++2.0 ++ ++ ++ +++++++++4.0 + + + ++ ++ ++8.0 - - -*- 細胞未出現(xiàn)病變 ±個別細胞出現(xiàn)病變、皺縮+ 25％以下細胞出現(xiàn)病變++25-50％細胞圓縮、病變+++50-75％細胞圓縮、病變 ++++75％以上細胞出現(xiàn)病變表2 土貝母苷乙對HSV-II的體外中和作用觀察時間72h 120h細胞對照 - - - - - -病毒對照++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++土貝母苷乙(μg/ml)0.5 - - -1.0 - - -2.0 少 部 分 空 泡4.0 部 分 空 泡8.0 死死死病毒+土貝母苷乙(μg/ml)0.5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++1.0+++++ ++++++ ++++ ++++2.0+ + + +++ ++ ++4.0± - - + ± ±8.0- - -*-細胞未出現(xiàn)病變 ±個別細胞出現(xiàn)病變、皺縮+25％以下細胞出現(xiàn)病變 ++25-50％細胞圓縮、病變+++50-75％細胞圓縮、病變 ++++75％以上細胞出現(xiàn)病變1.6.2土貝母苷乙或土貝母皂苷對HSV-I型和HSV-II型致細胞病變有保護作用，結(jié)果見表3、4。表3 土貝母苷乙對HSV-I致細胞病變的保護作用*72h觀察結(jié)果細胞對照 - --病毒對照 ++++ ++++ ++++土貝母苷乙對照(μg/ml)0.5 - - -1.0 - - -2.0少部分空泡4.0部分空泡8.0死 亡病毒+土貝母苷乙(μg/ml)0.25 ++++++++++++0.5 ++++++++++++1.0 ++++++++++++2.0 +++ +++ +++4.0 ++ ++ ++8.0 - - -*-細胞未出現(xiàn)病變 ±個別細胞出現(xiàn)病變、皺縮+25％以下細胞出現(xiàn)病變++25-50％細胞圓縮、病變+++50-75％細胞圓縮、病變 ++++75％以上細胞出現(xiàn)病變表4 土貝母苷乙對HSV-II致細胞病變的保護作用*觀察時間72h 120h細胞對照 - - - - - -病毒對照 ++++++++++++++++++++++++土貝母苷乙(μg/ml)0.5 - - - - - -1.0 - - - - - -2.0 少 部 分 空 泡4.0 部 分 空泡8.0 死 亡病毒+土貝母苷乙(μg/ml)0.5++++++++++++++++++++++++1.0++++++++++++++++++++++++2.0++ +++ ++ +++ +++ +++4.0+ + + ++ ++ ++8.0- - -*-細胞未出現(xiàn)病變 ±個別細胞出現(xiàn)病變、皺縮+25％以下細胞出現(xiàn)病變 ++25-50％細胞圓縮、病變+++50-75％細胞圓縮、病變 ++++75％以上細胞出現(xiàn)病變1.7結(jié)果說明與2-4μg/ml藥液作用一定時間后的皰疹病毒感染細胞，細胞病變程度明顯低于對照組。在感染后第5日，病毒對照組細胞幾乎全部脫落，而HSV-II實驗組病變表現(xiàn)為細胞由脹大變?yōu)閳@縮，折光性減弱，部分細胞破碎，卻沒有脫落或極少脫落。上述結(jié)果表明，土貝母苷乙對HSV-I型和HSV-II型有直接滅活作用。另外，土貝母皂苷對HSV-I型和HSV-II型的直接滅活作用略遜于土貝母苷乙(資料未顯示)。
先感染病毒然后用藥的實驗中，土貝母苷乙濃度在2-4μg/ml時，對皰疹病毒致細胞病變有延緩作用。實驗還顯示，在同一濃度時，先感染病毒后用藥者細胞病變出現(xiàn)時間先于中和組(藥液和病毒體外作用后感染細胞組)，而且細胞病變程度亦比中和組高，表明土貝母苷乙藥液對病毒的直接滅活作用比其抑制作用更大。土貝母皂苷抑制HSV-I型和HSV-II型的效果略遜于土貝母苷乙(資料未顯示)。
2.土貝母苷乙或土貝母皂苷對艾滋病毒(HIV-I)的抑制作用2.1.細胞T類淋巴母細胞株(MT-2細胞)，以含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2.2.病毒HIV-I的分離體HTLV-IIIB、HTLV-IIIRF和HTLV-IIIMN以H9和MT-2細胞培養(yǎng)。病毒通過離心(150×g)，8μm孔徑濾膜過濾培養(yǎng)上清獲得。病毒儲存液的滴度是1×105-10×105(每毫升MT-2細胞50％組織感染劑量，TCID50)。
2.3.病毒中和測定土貝母苷乙或土貝母皂苷對HIV-I感染的中和活性用下述兩種方法來測定抑制核心蛋白P24(HIV-I的核殼抗原)的產(chǎn)生和保護細胞免遭HIV-I病毒致細胞病變(比色法)。土貝母苷乙和土貝母皂苷以含10％胎牛血清不含酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)液進行系統(tǒng)稀釋。稀釋液加入96孔板并與等量稀釋的感染復數(shù)(MOI)為0.0015的HIV-I混合。37℃培養(yǎng)1小時后，加入25μl polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)處理的MT-2細胞(1×106/ml)。在37℃條件下孵育后，從每一孔中收集100μl培養(yǎng)上清，同時補充等量的新鮮培養(yǎng)液到各孔中。上清用于測定P24。第6天各孔加入XTT四氮唑指示劑(1mg/ml，50μl/孔)。4小時后在150nm條件下測定細胞內(nèi)的甲。HIV復制或細胞病變抑制百分率按下式計算(C-B)/C×100，B和C分別代表在加或不加土貝母苷乙或土貝母皂苷時P24的量或細胞中毒百分率。
2.4結(jié)果2.4.1土貝母苷乙抑制HTLV-IIIB的復制病毒核心蛋白P24用ELISA法測定。土貝母苷乙抑制P24的產(chǎn)生呈量效依賴關(guān)系。土貝母苷乙抑制HTLV-IIIB復制的EC50為21.6μg/ml。
2.4.2.土貝母苷乙抑制HIV介導的細胞病變土貝母苷乙明顯抑制HTLV-IIIB介導的細胞病變。土貝母苷乙抑制HTLV-IIIB介導的細胞病變的50％有效濃度(EC50)為20.4μg/ml。
2.4.3.土貝母苷乙對其他HIV-I分離株復制的抑制HTLV-IIIB是實驗中最常使用的分離株之一。土貝母苷乙也有效地抑制HTLV-IIIMN及HTLV-IIIRF的復制，其EC50分別為21.8μg/ml和18.1μg/ml。土貝母苷乙對HIV-1各種分離株復制的抑制作用略強于土貝母苷甲(參見專利CN 1094637A)，而土貝母皂苷的活性略遜于土貝母苷乙但優(yōu)于土貝母苷甲(資料未顯示)。
2.4.4.土貝母苷乙介導的細胞毒當土貝母苷乙的濃度從80μg/ml稀釋到40μg/ml時，其細胞毒性迅速減小。土貝母苷乙的50％細胞毒濃度(CC50)為62.8μg/ml。土貝母皂苷對HTLV-IIIB復制的抑制，對其他HIV-I分離株復制的抑制，對HIV介導的細胞病變的抑制效果都略遜于土貝母苷乙，而其細胞毒性則略強于土貝母苷乙(資料未顯示)。土貝母苷甲對HIV-I復制的抑制效果略遜于土貝母皂苷，而細胞毒性卻略比它強。
3.土貝母苷乙或土貝母皂苷對Epstein-Barr病毒和TPA(12-0-十四酰佛波-13-乙酸酯)協(xié)同誘發(fā)鼻咽癌的抑制效果
Epstein-Barr病毒(EBV)與鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)有密切關(guān)系。將PSG-CR2-Hyg載體轉(zhuǎn)入永生化人上皮細胞(293細胞)中獲得CR2-293細胞。間接免疫熒光法測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化的細胞表達EB病毒受體。用EB病毒感染CR2-293細胞后，1/4的細胞可表達EB病毒的抗原。用TPA作用于這些細胞后，表達病毒抗原的細胞數(shù)增加。用PCR法從EB病毒感染細胞的DNA中擴增出EB病毒DNA W片斷。在TPA持續(xù)作用下，EB病毒感染細胞的形態(tài)特征發(fā)生改變。把EB病毒感染細胞接種在裸鼠皮下，每周注射TPA，誘導細胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。經(jīng)組織病理檢查，腫瘤為低分化上皮細胞癌(李寶民等，病毒學報，14133-138，1998)。每周在EB病毒感染細胞接種部位周圍注射TPA的同時注射土貝母苷乙或土貝母皂苷，并每天觀察腫瘤形成情況。結(jié)果表明，EB病毒感染CR2-293細胞后，加5ng/mlTPA作用至第4周時，細胞形態(tài)發(fā)生改變。一些細胞成堆，多層生長，接觸抑制生長丟失，細胞觸角變少、變短。EB病毒感染CR2-293細胞后，接種于裸鼠皮下，每周在細胞接種部位注射50ng/mlTPA或在注射TPA的同時在相同部位注射土貝母苷乙或土貝母皂苷。3周后，細胞接種部位出現(xiàn)腫塊并逐漸長大。6-7周時，腫塊已相當明顯。實驗表明，除EB病毒感染CR2-293細胞接種皮下加TPA組的裸鼠約半數(shù)出現(xiàn)腫瘤外，其他各組，即接種EB病毒感染細胞但不注射TPA，或注射TPA的同時注射土貝母苷乙或土貝母皂苷，或接種未經(jīng)EB病毒感染的293細胞后注射TPA組的裸鼠都不出現(xiàn)腫瘤。由此可見，土貝母苷乙或土貝母皂苷對EB病毒和TPA協(xié)同誘發(fā)腫瘤有非常顯著的抑制效果。
4.土貝母苷乙或土貝母皂苷對家兔皰疹性角膜炎的治療效果4.1.土貝母苷乙或土貝母皂苷滴眼液用生理鹽水在無菌條件下配制，使其中土貝母苷乙或土貝母皂苷的含量為1mg/ml。
4.2. 0.1％無環(huán)鳥苷眼液(湖北潛江制藥廠生產(chǎn))。
4.3.病毒單純皰疹病毒I型SM44毒株(HSV-SM44)，滴度為106半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)/ml，引自北京生物制品研究所。
4.4.動物健康新西蘭兔24只，體重2-3kg，雌雄各半。
4.5.感染模型與實驗分組在角膜做4mm#字壓痕后，滴入病毒原液30μl，閉眼按摩30s。隨機分為4組，即土貝母苷乙治療組，土貝母皂苷治療組，無環(huán)鳥苷眼液陽性對照組和生理鹽水空白對照組，分別編號為1，2，3，4組，各組兔眼數(shù)均為12只。
4.6.滴眼治療病毒接種后24小時行雙眼給藥，每只眼每次2滴(約50μl)，每日5次，連續(xù)用藥14天。
4.7.療效觀察每日行熒光染色，裂隙燈觀察記錄角膜病變，將角膜上皮病變程度按Trousdale法分為0-4級。
4.8.結(jié)果接種HSV-1后24-28h，所有試驗兔角膜均出現(xiàn)點狀、短樹枝狀病變，各組角膜病變程度相互間比較差異無顯著性(P＞0.05)。對照組接種后第3天，角膜這些典型的樹枝狀病灶繼續(xù)不斷擴大；第6-8天形成大片密集的樹枝狀和地圖狀潰瘍，基質(zhì)水腫，浸潤，病變面積占角膜總面積的75％-100％；第9-14天病變向深層擴展，上皮潰瘍面積呈縮小趨勢。土貝母苷乙或土貝母皂苷治療組在接種后第三天，角膜可見點狀及短棒狀病變，范圍較局限。至第4-6天病情較重時，病變面積占角膜面積的20％-40％?；|(zhì)水腫、浸潤也較輕，與對照組角膜病變程度比較差異有非常顯著性(P＜0.01)。至第12天大部分兔眼角膜已痊愈。無環(huán)鳥苷眼液治療組，在接種后4-6天，病變面積占角膜面積的25％-45％。至第14天大部分兔眼角膜痊愈。治療效果由小到大的順序是無環(huán)鳥苷眼液＜土貝母皂苷＜土貝母苷乙。
5.土貝母苷乙或土貝母皂苷對皰疹病毒性皮膚病的治療效果皰疹病毒性皮膚病系由人類單純皰疹病毒(Herpes virus hominis)所致。該病毒的核酸為DNA。單純皰疹病毒可分為I、II型(簡稱HSV-I和HSV-II)。HSV-I與大多數(shù)非生殖器感染有關(guān)，HSV-II感染多發(fā)生在生殖器部位，近來發(fā)現(xiàn)HSV-II與宮頸癌的發(fā)病有關(guān)。皰疹病毒性皮膚病可分為單純皰疹、水痘、帶狀皰疹、Kaposi水痘樣疹、巨細胞包涵體病、傳染性單核細胞增多癥、B病毒病等。土貝母苷乙或土貝母皂苷對上述皰疹病毒性皮膚病均有一定的治療效果。茲以復發(fā)型口唇皰疹(顏面皰疹)(herpes labiais；herpesfacialis)30例的治療效果為例?？诖桨捳钍菑桶l(fā)性單純皰疹中最常見的一型，發(fā)作初期局部往往先有灼熱、瘙癢及潮紅，繼而出現(xiàn)密集成群或數(shù)群針頭大小水皰，較原發(fā)型的水皰要小且較蔟集，破裂后糜爛滲液，逐漸干燥結(jié)痂，全過程1-2周，愈后局部可留有暫時性色素沉著。損傷好發(fā)于皮膚粘膜交界處，如口角、唇沿及鼻孔附近，亦有發(fā)生于顏面、唇部者。本組30例，男18例，女12例，年齡分布在18-65歲之間。灼熱、瘙癢及潮紅期8例；水皰期12例；水皰破裂、糜爛期10例。用法5mg/ml的土貝母苷乙或土貝母皂苷水溶液涂抹局部，1小時1次，30例病人均在1-3日內(nèi)痊愈，愈后局部無色素沉著。90％的病人1年內(nèi)未復發(fā)。對本病的治療效果土貝母皂苷略遜于土貝母苷乙。
6.土貝母苷乙或土貝母皂苷對乳頭多瘤空泡病毒性疾病的治療效果乳頭多瘤空泡病毒(papovaviruses)，屬DNA病毒，即乳頭瘤病毒(papillomavirus)，多瘤病毒(palyoma virus)及空泡病毒(Simiare vacnolatingvirus，SV40)。人乳頭瘤病毒(HPV)感染后不僅引起疣，還有一部分會導致惡性腫瘤，如皮膚癌、舌癌和宮頸癌等。土貝母苷乙或土貝母皂苷對扁平疣(又稱青年扁平疣)和生殖器疣(又稱尖銳濕疣)的治療效果較好。用法5mg/ml的土貝母苷乙或土貝母皂苷水溶液涂抹局部，每日8-12次。對局部無刺激，愈后不留瘢痕。對本病的治療效果，土貝母皂苷略遜于土貝母苷乙。
7.土貝母苷乙或土貝母皂苷對慢性子宮頸炎的治療效果慢性子宮頸炎是婦女的一種常見病、多發(fā)病，與乳頭狀瘤病毒和HIV-II有關(guān)，臨床上表現(xiàn)為子宮頸糜爛、肥厚、息肉等，部分病例誘發(fā)子宮頸癌。土貝母苷乙或土貝母皂苷制成栓劑，置入子宮頸局部，不僅對慢性子宮頸炎有良好的治療效果，而且還能預防子宮頸癌的發(fā)生，使子宮頸局部的原位癌發(fā)生逆轉(zhuǎn)。對慢性子宮頸炎的治療效果，土貝母皂苷略遜于土貝母苷乙，但優(yōu)于土貝母苷甲(參見專利CN 1110133 A)。
8.土貝母苷乙或土貝母皂苷作為制備防治對蝦病毒性疾病藥物及藥餌的用途80年代以來，世界養(yǎng)蝦業(yè)迅速發(fā)展，產(chǎn)量從80年代初的幾萬噸增加到90年代的70多萬噸。在養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展的同時，也暴發(fā)了世界性的蝦病，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害。僅1993-1994年我國蝦病暴發(fā)流行，就使我國的養(yǎng)殖業(yè)大副度減產(chǎn)，損失達數(shù)十億元。現(xiàn)已查明，近年世界蝦病暴發(fā)性流行主要是由病毒感染引起的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對蝦病毒病有20多種，引起近年對蝦疾病的主要是桿狀病毒(一種DNA病毒)。對蝦感染病毒后有時間長短不同的潛伏期，呈隱性感染狀態(tài)。對蝦感染病毒后一旦發(fā)病，即進展迅速，1-2日內(nèi)就出現(xiàn)不攝食等癥狀，很難治療。對蝦病毒對土貝母苷乙或土貝母皂苷很敏感。土貝母苷乙或土貝母皂苷對對蝦和哺乳動物的毒性低。土貝母苷乙和土貝母皂苷都易溶于水，室溫下穩(wěn)定時間長，經(jīng)胃腸道吸收好。以土貝母苷乙或土貝母皂苷制成藥餌投喂，可預防未感染或隱性感染狀態(tài)的對蝦發(fā)病。若蝦已發(fā)病，與土霉素混合使用，對蝦病有一定的治療效果。對對蝦病毒性疾病的防治效果，土貝母皂苷略遜于土貝母苷乙(資料未顯示)。二.毒理試驗1.急性毒性試驗選用ICR小鼠用肌肉和腹腔注射給藥法進行試驗。試驗結(jié)果肌肉注射土貝母苷乙的LD50為45.66mg/Kg，土貝母皂苷的LD50為42.36mg/Kg。腹腔給藥的土貝母苷乙的LD50為20.9mg/Kg，土貝母皂苷的LD50為19.6mg/Kg。
2.對正常培養(yǎng)細胞的毒性作用采用比色法測試了土貝母苷乙對體外培養(yǎng)的T-淋巴母細胞樣細胞株(MT-2細胞)的毒性作用，試驗結(jié)果(見表5)表明，當土貝母苷乙的濃度由80μg/ml降至40μg/ml時，細胞毒性顯著下降，濃度低于40μg/ml時，毒性很低。土貝母苷乙細胞毒的CD50為68μg/ml，土貝母苷甲細胞毒的CD50為59μg/ml。土貝母皂苷細胞毒的CD50為64μg/ml。表5 土貝母苷乙對MT-2細胞的毒性作用濃度(μg/ml)細胞中毒百分率(％)土貝母苷乙 101.5202.04010.08084.6土貝母苷甲 102.2206.54013.08096.4圖1土貝母苷甲、苷乙和苷丙的化學結(jié)構(gòu)式三.實施例下面的配方舉例說明了本發(fā)明的劑型。
實施例1片劑NO 組分 用量mg/片 mg/片1 土貝母苷乙(或土貝母皂苷)501002 乳糖USP 122 1233 玉米淀粉，食品級，呈304010％的純水漿狀物4 玉米淀粉，食品級951305 硬脂酸鎂3 7合計300 400制造方法在適當?shù)幕旌蠙C中混合第1項和第2項組分15分鐘，第3組分與混合物?；?。如果需要，通過一個初篩研磨潮濕的顆粒，并使之干燥。如果需要，將干燥的顆粒過篩，并與第4項混合10-15分鐘。加入第5項混合1-3分鐘。在適當?shù)膲浩瑱C中將混合物壓成適當?shù)某叽绾椭亓俊?br> 實施例2膠囊劑NO 組分 用量mg/粒 mg/粒1 土貝母苷乙(或土貝母皂苷)50100
2 乳糖USP106 1203 玉米淀粉，食品級 40734 硬脂酸鎂NF 4 7合計 200 300制造方法將第1、2和第3項在適當?shù)幕旌蠙C中混合10-15分鐘，加入第4項混合1-3分鐘。在適當?shù)陌覚C上將該混合物裝入適當?shù)哪z囊中。
實施例3注射液土貝母苷乙(或土貝母皂苷)10g或50g葡萄糖 500g注射用水加至10000ml制造方法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)、葡萄糖溶于適量60℃的注射用水中，按配制量加0.05％針劑用活性炭攪拌，靜置15分鐘，過濾。加注射用水使終體積為10000ml，攪勻。取樣測定PH值及含量，合格后過濾，灌封115℃熱壓滅菌30分鐘，即得。
實施例4栓劑以生產(chǎn)發(fā)明產(chǎn)品10000粒為例，所用的原料及其配比為土貝母苷乙(或土貝母皂苷) 300g或600g吐溫80 800g可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油) 加至10000g制造方法混合按本實施例的配比稱取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)、吐溫80和可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)，將可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)放入不銹鋼鍋水浴加熱至大部分溶化，停止加熱。然后分別加入吐溫80和土貝母苷乙(或土貝母皂苷)，用不銹鋼攪拌機攪拌至混合均勻，便得到本發(fā)明的混合藥物。
潤滑劑的配制用軟肥皂和甘油各一份與5倍的80％醫(yī)用酒精充分混合攪拌均勻，制成潤滑劑。
成型在栓模上涂上已配制的潤滑劑。將本發(fā)明的混合藥物倒入栓模中至溢出?？?，讓其自然冷卻。待完全凝固后，用刀切去溢出部分。然后開啟模具，將栓劑從模具中取出。
無菌包裝將所制備的拴劑進行質(zhì)量檢查，每粒重量應為1g，含土貝母苷乙(或土貝母皂苷)30mg或60mg。檢查合格后包裝，鈷60滅菌。
實施例5滴眼液土貝母苷乙(或土貝母皂苷)1g羥苯乙酯0.3g氯化鈉注射液加至1000ml制造方法取羥苯乙酯溶于適量的熱氯化鈉注射液中，放冷，過濾。加氯化鈉注射液使體積為1000ml，100℃流通蒸汽滅菌30分鐘，制成無菌羥苯乙酯氯化鈉溶液備用。按無菌操作法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)，溶于適量的無菌羥苯乙酯氯化鈉溶液中，使接近950ml。取出少許測定PH(必要時以0.1mol/L氫氧化鈉液調(diào)PH至5.0-7.0)。再加羥苯乙酯氯化鈉溶液使成1000ml，混勻。必要時過濾，無菌分裝即得。本品含土貝母苷乙(或土貝母皂苷)應為0.09-0.11％(g/ml)。
實施例6眼膏劑土貝母苷乙(或土貝母皂苷) 1g眼膏基質(zhì) 加至1000g制造方法眼膏基質(zhì)配方羊毛脂100g，無菌液體石蠟100g，凡士林800g。取羊毛脂和凡士林置適當?shù)挠猩w容器中加熱熔化。加滅菌液體石蠟，混勻，必要時趁熱過濾，150℃干熱滅菌1小時，放冷備用。按無菌操作法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)，置滅菌乳缽中，加少量滅菌液體石蠟研磨，使成細膩糊狀，再分次加入眼膏基質(zhì)。邊加邊研勻，使成1000g，無菌分裝。本品含土貝母苷乙(或土貝母皂苷)應為0.09-0.11％(g/g)。
實施例7軟膏土貝母苷乙(或土貝母皂苷) 10g羊毛脂 90g凡土林 900g制造方法按無菌操作法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)，加入適量熔化的羊毛脂、凡士林研磨，再分次加入剩余的羊毛脂、凡士林，使成1000g，研勻即得。
實施例8滴鼻液土貝母苷乙(或土貝母皂苷)5g鹽酸麻黃鹼 10g甘油300ml蒸餾水 加至1000ml制造方法按無菌操作法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)溶于熱蒸餾水中，加鹽酸麻黃鹼使溶，過濾，加甘油。攪勻，加水至1000ml混勻，分裝，即得。
實施例9糖漿劑土貝母苷乙(或土貝母皂苷) 2g蒸餾水 20ml單糖漿 加至1000ml制造方法按無菌操作法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)，加入20ml蒸餾水中溶解。加單糖漿至1000ml，攪勻，分裝，即得。
實施例10溶液土貝母苷乙(或土貝母皂苷)50g無菌蒸餾水 加至10000ml制造方法按無菌操作法取土貝母苷乙(或土貝母皂苷)，加入10000ml無菌蒸餾水溶解，分裝，即得。使用時，按魚蝦的體重計算每公斤飼料的加藥量。若魚蝦已發(fā)病，則應與土霉素混合使用。
權(quán)利要求
1.預防和治療人和動物各種病毒性疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括土貝母苷乙或土貝母皂苷及可藥用的載體。
2.如權(quán)利要求1所定義的藥物組合物的制備方法，該方法包括土貝母苷乙或土貝母皂苷分別與可藥用的載體混合或溶解。
3.土貝母苷乙或土貝母皂苷在制造用于預防和治療人和動物各種病毒性疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及土貝母苷乙及含土貝母苷乙的土貝母皂苷用于制備預防和治療人和動物各種病毒性疾病的藥物或藥餌。土貝母苷乙是從土貝母中分離出來的一種化學成分,土貝母皂苷是不含土貝母苷丙的土貝母中的皂苷組分。土貝母苷乙和土貝母皂苷抑制人和動物病毒的復制,對人和動物病毒性疾病有預防和治療效果,可用于預防和治療人和動物各種病毒性疾病。
文檔編號A61P31/12GK1275378SQ99107839
公開日2000年12月6日 申請日期1999年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月1日
發(fā)明者于廷曦, 于立堅, 馬潤娣 申請人:于廷曦