專(zhuān)利名稱：纖維素分解酶、木聚糖分解酶和β－葡聚糖分解酶的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維素分解酶、木聚糖分解酶和/或β-葡聚糖分解酶(有時(shí)也稱為纖維素酶、戊聚糖酶和/或半纖維素酶)的抑制劑，尤其是戊聚糖降解酶如木聚糖內(nèi)切酶(如EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(如EC3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(如EC3.2.1.55)的抑制劑，涉及纖維素酶(如EC3.2.1.4)、β-葡聚糖酶(如EC3.2.3.73或EC3.2.1.6)的抑制劑，并且涉及其它木聚糖、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖降解酶的抑制劑，它們存在于微生物、植物、植物材料或其部份中(如谷物、谷粒、谷粉或其部份)。
本發(fā)明也涉及獲得所述抑制劑的方法，以及該抑制劑在食品、飼料和/或飲料技術(shù)不同領(lǐng)域中的應(yīng)用，如麥芽制造和釀造；如為了提高其轉(zhuǎn)化的動(dòng)物飼料的生產(chǎn)；烘制和/或壓制的谷類(lèi)制品如死面團(tuán)、發(fā)面團(tuán)和Chorleywood面包、早餐谷類(lèi)食品、不同類(lèi)型的餅干、意大利面食(pasta)和面條的生產(chǎn)；淀粉衍生的糖漿、山梨糖醇、木糖和/或木糖醇的生產(chǎn)；面筋-淀粉分離工業(yè)；玉米加工；植物病害抵抗力的提高；該抑制劑在營(yíng)養(yǎng)藥或藥物應(yīng)用如保持食用纖維材料的結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用，以及在造紙及紙漿技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
除大麥芽之外，未發(fā)芽的谷物如小麥通常用于啤酒生產(chǎn)(Pierce，J.S.，歐洲釀造廠例會(huì)論文集(Proceedings of the European BreweryConvention Congress)，馬德里(Madrid)，1987，445)。未發(fā)芽的小麥(40-50％)例如可用于比利時(shí)白(小麥)啤酒的生產(chǎn)。
盡管大麥和小麥的胚乳細(xì)胞壁中分別含有20％和70％(w/w)的阿拉伯木聚糖(Ballance，G.M.和Manners，D.J.，碳水化合物研究(Carbohydrate Research)，1978，61，107；Fincher，G.B.和Stone，B.A.，于《谷類(lèi)科學(xué)與技術(shù)進(jìn)展》(Advances in Cereal Science andTechnology)，卷VIII，Y.Pomeranz(編)，美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)學(xué)會(huì)(Am.Assoc.Cereal Chem.)，St.Paul(MN)，1986，207)，但其總阿拉伯木聚糖含量是相當(dāng)?shù)?，即?duì)于大麥為2.8-7.1％(w/w)，對(duì)于小麥為3.6-7.1％(w/w)(Henry，J.，食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志(Journal of the Science of Food andAgriculture)，1985，36，1243；Hashimoto，S.，Shogren，M.D.和Pomeranz，Y.，谷類(lèi)化學(xué)(Cereal Chemistry)，1987，64，30)。
谷粒中也含有類(lèi)似水平的水可提取的阿拉伯木聚糖，即對(duì)于大麥為0.24-0.80％(w/w)，對(duì)于小麥為0.25-1.18％(Henry，J.，食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志，1985，36，1243；Hashimoto，S.，Shogren，M.D.和Pomeranz，Y.，谷物化學(xué)，1987，64，30；Aman，P.和Hesselman，K.，瑞典農(nóng)業(yè)研究雜志(Swedish Journal of Agricultural Research)，1984，14，135；Girhammer，U.和Nair B.M.，食品水解膠體(Food Hydrocolloids)，1992，6，285)。此外，大麥和小麥的胚乳細(xì)胞壁中分別含有70％和20％的β-葡聚糖(Ballance，G.M.和Manners，D.J.，碳水化合物研究，1978，61，107；Fincher G.B.和Stone，B.A.，于《谷類(lèi)科學(xué)與技術(shù)進(jìn)展》，卷VIII，Y.Pomeranz(編)，美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)學(xué)會(huì)，St.Paul(MN)，1986，207)。
大麥谷粒中含有1.7-4.1％(w/w)的水可提取的β-葡聚糖和3.6-6.4％(w/w)的總β-葡聚糖(Anderson，M.A.，Cook，J.A.和Stone，B.A.，釀造研究所雜志(Journal of the Institute of Brewing)，1978，84，233-239；Henry，J.，食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志，1985，36，1243)。小麥谷粒中含有0.1-0.8％(w/w)的水可提取的β-葡聚糖和0.6-1.4％(w/w)的總β-葡聚糖(Anderson，M.A.，Cook，J.A.和Stone，B.A.，釀造研究所雜志，1978，84，233-239；Henry，J.，食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志，1985，36，1243)。由于在小麥中僅能檢測(cè)到低水平的阿拉伯木聚糖降解酶(Cleemput，G.，Bleukx，W.，van Oort，M.，Hessing，M.和Delcour，J.A.，谷類(lèi)科學(xué)雜志(Journal of Cereal Science)，1995，22，139)和β-葡聚糖降解酶活性，因此大麥芽肯定主要擔(dān)負(fù)釀造過(guò)程中小麥和麥芽阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的水解。
阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的有效水解是重要的，因?yàn)檫@些化合物能涉及生產(chǎn)問(wèn)題，如麥芽汁粘性(Ducroo，P.和Frelon，P.G.，歐洲釀造廠例會(huì)論文集，蘇黎世(Zurich)，1989，445；Vietor，R.J.和Voragen，A.G.J.，釀造研究所雜志，1993，99，243)和過(guò)濾性和糊涂(haze)的形成(Coote，N.和Kirsop，B.H.1976，釀造研究所雜志，1976，82，34；Izawa，M.，Kano，Y.和Kanimura，M.1991.Aviemore麥芽制造、釀造和蒸餾會(huì)議論文集(Proceedings Aviemore Conference on Malting，Brewing andDistilling)，1990，427)。
在其它領(lǐng)域中木聚糖和/或阿拉伯木聚糖的有效水解也是非常希望的。實(shí)例包括黑麥和小麥面包制造方法、造紙及紙漿技術(shù)。隨后由于上述應(yīng)用對(duì)木聚糖和/或阿拉伯木聚糖水解酶的(潛在)應(yīng)用進(jìn)行了大量研究工作。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及纖維素分解酶、木聚糖分解酶和/或β-葡聚糖分解酶的抑制劑，優(yōu)選地木聚糖內(nèi)切酶、β-葡聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其它木聚糖、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖降解酶的抑制劑，它們優(yōu)選地從微生物、植物、植物材料或其部份(如谷物、谷粒、谷胚或其部份、谷粉或其部份)中獲得。
“酶的抑制劑”意思是能部分或完全抑制所述酶的活性的分子。在不可逆抑制中，抑制劑與酶共價(jià)連接，或者緊密結(jié)合使得它與酶的解離非常緩慢。在此情況下，抑制劑通常在交聯(lián)反應(yīng)中模擬該酶的正常底物。相反，可逆抑制的特征在于酶與抑制劑之間的快速平衡。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑阻止底物與活性部位結(jié)合，并可通過(guò)減少與底物結(jié)合的酶分子的比例降低反應(yīng)速率。在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑可降低轉(zhuǎn)換數(shù)。通過(guò)測(cè)定提高底物濃度能否克服抑制，可區(qū)分競(jìng)爭(zhēng)性抑制與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。從特定生物種分離的并且有蛋白質(zhì)或糖蛋白性質(zhì)的抑制劑能對(duì)相同種的酶(即內(nèi)源酶)和/或不同種的酶(即外源酶)有活性。
便利地，本發(fā)明的抑制劑可由微生物產(chǎn)生，或者可存在于微生物或植物材料的多種提取介質(zhì)中，如谷物或其部份、如谷?；蚱洳糠荨⑷绻扰呋蚱洳糠?、如谷粉或其部份，如來(lái)源于小麥、硬粒小麥、黑麥、黑小麥、大麥、高粱、燕麥、玉米和/或水稻，可通過(guò)本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的方法從中獲得抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案，抑制劑是一種木聚糖酶抑制劑，它一般是水溶性的堿性蛋白質(zhì)種，pI(即等電點(diǎn)的-log)大于約7.0。經(jīng)SDS-page測(cè)定，木聚糖酶抑制劑的分子量一般為40-43kDa。用β-巰基乙醇還原后，發(fā)現(xiàn)SDS-page分子量約40-43 kDa、約30 kDa和約10 kDa的三條SDS-page蛋白質(zhì)帶。40-43 kDa蛋白質(zhì)或糖蛋白的N端序列至今才描述，一般如下SEQ ID No.1Lys-Gly-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-Pro-Val-Thr-Lys-Xaa-Thr-Ala，其中Xaa優(yōu)選地是Asp。30 kDa帶具有上述典型的N端氨基酸SEQ ID No.1，而10 kDa帶的N端氨基酸序列一般如下SEQ ID No.2Xaa-Ala-Pro-Val-Ala-Lys-Met-Val-Leu-Pro-Val-Ala-Met-Lys-Glu-Xaa-Val，其中第一個(gè)Xaa優(yōu)選地是Ser、Phe或Gly，第二個(gè)Xaa未鑒定。該序列以前未描述過(guò)。
因此，本發(fā)明也涉及一種SDS-page分子量一般為40-43 kDa的抑制劑，它是一種蛋白質(zhì)或糖蛋白，具有一種標(biāo)志，該標(biāo)志的氨基酸序列與SEQID No.1具有超過(guò)70％的同源性，優(yōu)選地超過(guò)85％的同源性，更優(yōu)選地與之相同。
本發(fā)明另外也涉及一種SDS-page分子量一般為30 kDa的抑制劑，它是一種蛋白質(zhì)或糖蛋白，具有一種標(biāo)志，該標(biāo)志的氨基酸序列與SEQ IDNo.1具有超過(guò)70％的同源性，優(yōu)選地超過(guò)85％的同源性，更優(yōu)選地與之相同。
本發(fā)明另外也涉及一種SDS-page分子量一般為10 kDa的抑制劑，它是一種蛋白質(zhì)或糖蛋白，具有一種標(biāo)志，該標(biāo)志的氨基酸序列與SEQ IDNo.2具有超過(guò)70％的同源性，優(yōu)選地超過(guò)85％的同源性，更優(yōu)選地與之相同。
有利地，該標(biāo)志是蛋白質(zhì)或糖蛋白的末端氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)或糖蛋白的標(biāo)志意思是一種特異的氨基酸序列(或其相應(yīng)的核苷酸序列)，它能將一種蛋白質(zhì)家族與另一種蛋白質(zhì)家族區(qū)分開(kāi)來(lái)。
對(duì)木聚糖和/或阿拉伯木聚糖水解酶的抑制作用能由例如應(yīng)用AZCL阿拉伯木聚糖的木聚糖內(nèi)切酶法證明(參見(jiàn)下文)。同樣，對(duì)β-葡聚糖水解酶的抑制作用能由例如應(yīng)用AZCL β-葡聚糖的β-葡聚糖酶法證明(參見(jiàn)下文)。
本發(fā)明也涉及一種方法，用于從微生物，如表達(dá)所述抑制劑的遺傳修飾微生物中、從植物中、或從植物材料如谷物、谷粒、谷粉或其部份中獲得該抑制劑，方法是對(duì)該植物、該植物材料和/或該微生物進(jìn)行一次或多次提取和域分級(jí)分離步驟。
本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，用于基因轉(zhuǎn)化微生物、植物或植物材料，以獲得根據(jù)本發(fā)明的抑制劑的表達(dá)，其中通過(guò)將編碼該抑制劑的遺傳物質(zhì)引入該微生物、植物或植物材料中遺傳修飾該微生物、植物或植物材料，并通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的遺傳工程方法獲得其翻譯和表達(dá)。
本發(fā)明另外涉及這樣的方法，其目的在于改變、優(yōu)選地降低或提高微生物、植物或植物材料中所述抑制劑的水平，方法是通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的方法，和/或使用能阻斷該抑制劑活性或激活該抑制劑的分子，降低或提高該抑制劑的表達(dá)。
本發(fā)明另外還涉及獲得的抑制劑、微生物、植物、植物材料和/或其部份，并涉及它們?cè)谑称贰暳虾?或飲料技術(shù)不同領(lǐng)域中的應(yīng)用，如改進(jìn)麥芽制造和釀造、提高動(dòng)物飼料的效能、烘制和/或壓制的谷類(lèi)制品(如死面團(tuán)、發(fā)面團(tuán)和Chorleywood面包、早餐谷類(lèi)食品、不同類(lèi)型的餅干、意大利面食和面條)、改進(jìn)淀粉衍生的糖漿、山梨糖醇、木糖和/或木糖醇的生產(chǎn)、改進(jìn)面筋-淀粉分離和生產(chǎn)、玉米加工、提高植物病害抵抗力，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)藥或藥物應(yīng)用(如保持食用纖維材料的結(jié)構(gòu))以及改進(jìn)造紙及紙漿技術(shù)。
在以下一種優(yōu)選實(shí)施方案的描述中將詳細(xì)描述本發(fā)明，它并不限制本發(fā)明的范圍。發(fā)明詳述在研究比利時(shí)白啤酒和生產(chǎn)過(guò)程之中間產(chǎn)物中的阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)的工作過(guò)程中，發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)小麥的水可提取物對(duì)大麥芽木聚糖分解系統(tǒng)的抑制跡象。這在以前未報(bào)道過(guò)，盡管清楚地確定在谷粒中存在內(nèi)源和外源α-淀粉酶抑制劑(Deponte，R.，Parlamenti，T.，Petrucci，V.，Silano，V.和Tomasi，M.，谷類(lèi)化學(xué)，1976，53，805；Buonocore，V.，Petrucci，T.和Silano，V.，植物化學(xué)(Phytochemistry)，1977，16，811；Mundy，J.，Hejgaard，J.和Svendsen，I.，學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(Federation of Societies)，1984，167，210；Silano，V.，α-淀粉酶抑制劑，于《酶及其在谷類(lèi)技術(shù)中的作用》，J.E.Kruger，D.Lineback和C.E.Stauffer(編)，美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)學(xué)會(huì)，St.Paul(MN)，1987，141)和蛋白酶(Birk，Y.，酶學(xué)方法(MethodsEnzymology)，1976，45，723；Lawszkowski，M.和Kato，I.，生物化學(xué)年述(Annual Review of Biochemistry)，1980，49，593)。
實(shí)際上，當(dāng)目的為(1)將原材料的酶活性與相應(yīng)麥芽汁的阿拉伯木聚糖含量相聯(lián)系，以及(2)研究釀造中小麥以何種方式干擾阿拉伯木聚糖的溶解，測(cè)定在應(yīng)用大麥芽和未發(fā)芽之小麥的釀造中阿拉伯木聚糖的溶解時(shí)，有證據(jù)表明小麥中木聚糖酶抑制劑的存在。將用60％麥芽和40％小麥制備的麥芽汁中阿拉伯木聚糖的溶解和游離木糖(Xyl)的釋放與100％麥芽汁中的情況相比較時(shí)，確實(shí)地觀察到這一點(diǎn)。
在一定實(shí)驗(yàn)條件下，在麥芽汁制備過(guò)程中向麥芽汁中加入微生物來(lái)源的木聚糖酶明顯地提高了阿拉伯木聚糖的溶解。
實(shí)施例材料β-D-阿洛糖、β-巰基乙醇、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷和Trizma堿(試劑級(jí)，三[羥甲基]氨基甲烷)從美國(guó)MO St-Louis的Sigma獲得。天青染料交聯(lián)的(AZCL)小麥阿拉伯木聚糖(Xylazyme阿拉伯木聚糖片)、AZCL和來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)的木聚糖酶M4從愛(ài)爾蘭Bray的Megazyme獲得。來(lái)源于微生物枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)、綠色木霉(Trichoderma viride)和黑曲霉的微生物木聚糖酶從比利時(shí)Groot-Bijgaarden的NV Puratos獲得。緩沖液A是0.025M乙酸鈉，pH4.7；緩沖液B是0.025M馬來(lái)酸鈉，pH6.0；緩沖液C是0.025M磷酸鈉，pH6.0；緩沖液D是0.250mM乙酸鈉，pH5.0；緩沖液E是；0.025M乙酸鈉，pH5.0。
大麥芽樣品由Herent(比利時(shí))的Cargill Malt Division提供。發(fā)明者使用兩行的(two-rowed)冬大麥品種(Clarine)，其具有低活性的木聚糖內(nèi)切酶和低含量的水可提取的Xyl，并使用六行的冬大麥品種Plaisant的兩種麥芽，該品種具有水可提取的高含量的Xyl。Plaisant麥芽樣品1和樣品2分別具有高的和低的木聚糖內(nèi)切酶活性。小麥樣品來(lái)自于Amylum，Aalst(比利時(shí))和SAPSA SES SA，Jodoigne(比利時(shí))。發(fā)明者使用Skirlou和Soissons，它們分別具有高的和低的水可提取的Xyl含量。小麥胚芽由Vilvoorde(比利時(shí))的Ceres提供。黑麥粉來(lái)自于由荷蘭鹿特丹(Rotterdam)的Meneba提供的荷蘭黑麥品種的混合物。大麥來(lái)自于由Herent(比利時(shí))的Cargill Malt Division提供的品種Clarine。Clarine大麥、Plaisant 1和Plaisant 2大麥芽、Skirlou和Soissons小麥粗粉用Tecator樣品磨粉機(jī)(Hoganas，瑞典)制備，或者對(duì)于釀造實(shí)驗(yàn)用EBC認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室型磨粉機(jī)(Analytica-EBC，第四版，Brauerei-undGetranke-Rundschau，蘇黎世，1987)制備。Soissons小麥粉用BuhlerMLU-202實(shí)驗(yàn)型磨粉機(jī)(Buhler，Uzwil，瑞士，提取率70％)產(chǎn)生。提取液BMWM1、WWM和WG將磨碎的大麥芽和小麥樣品(3.00g)或小麥胚芽(1.00g)懸浮于緩沖液A(10.0mL)中。于室溫劇烈搖動(dòng)15分鐘后，離心該懸液(3000g，15分鐘，20℃)。產(chǎn)生的提取液稱為BMWM1(大麥芽粗粉提取液1)、WWM(小麥粗粉提取液)和WG(小麥胚芽提取液)。WF、RF和BWM
將適量的面粉或粗粉樣品(2.50g)懸浮于緩沖液B(10.0mL)中。于室溫劇烈搖動(dòng)15分鐘后，離心該懸液(10000g，15分鐘，20℃)并過(guò)濾(0.45μ)上清液。產(chǎn)生的粗粉提取液稱為WF(小麥粉提取液)、RF(黑麥粉提取液)和BWM(大麥粗粉提取液)。BMWM2將磨碎的大麥芽樣品(5.00g)懸浮于緩沖液B(10.0mL)中。于室溫劇烈搖動(dòng)15分鐘后，離心該懸液(10000g，15分鐘，20℃)并過(guò)濾(0.45μ)上清液。產(chǎn)生的粗粉提取液稱為BMWM2(大麥芽粗粉提取液2)。方法Xyl含量的測(cè)定提取和水解方法如Cleemput等人(Cleemput，G.，Roels，S.P.，vanOort，M.，Grobet，P.J.和Delcour，J.A.，谷類(lèi)化學(xué)，1993，70，324)所述，在提取之前加熱(130℃)粗粉樣品(小麥和大麥芽)5小時(shí)以去除酶活性。用與粗粉的水提取物相同的方法分析麥芽汁。通過(guò)在乙酸糖醇制備之前省略水解步驟測(cè)定游離的Xyl。在Supelco SP-2380柱(30m，0.32mmID，0.2μm膜厚度)上于225℃分離乙酸糖醇樣品(1μL)(Englyst，H.N.和Cummings，J.H.，分析者(Analyst)，1984，109，937)，并用Chrompack9011層析儀(Middelburg，荷蘭)中的火焰電離檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。注入和檢測(cè)溫度為275℃。β-D-阿洛糖用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)到的阿拉伯糖(Ara)來(lái)源于阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖兩者，使之不可能以0.88×(Ara+Xyl)計(jì)算阿拉伯木聚糖的水平(Cleemput，G.，van Oort，M.，Hessing，M.，Bergmans，M.E.F.，Gruppen，H.，Grobet，P.J.，Delcour，J.A.，谷類(lèi)科學(xué)雜志，1995，22，73-84)。此外，由于在小麥粗粉的水提取物中相當(dāng)部分的半乳糖(Gal)不是來(lái)源于阿拉伯半乳聚糖，所以通過(guò)假定阿拉伯半乳聚糖中的Gal/Ara比例與小麥一樣為1.5(Izydorczyk，M.，Biliaderis，C.G.和Bushuk，W.，谷類(lèi)化學(xué)，1991，68，139-144)，對(duì)阿拉伯半乳聚糖的Ara數(shù)值的校正同樣是不可能的。因此以后將Xyl數(shù)值用作阿拉伯木聚糖水平的相對(duì)量度。類(lèi)似地，釀造中Xyl水平的升高表明釀造中阿拉伯木聚糖的溶解。木聚糖內(nèi)切酶(EC3.2.1.8)活性及其抑制的測(cè)定將提取液(1.0mL)BMWM1和WWM(參見(jiàn)上文)于50℃溫育5分鐘，之后加入AZCL-木聚糖片(Megazyme)。然后于50℃繼續(xù)溫育60分鐘。通過(guò)加入1％(w/v)Trizma堿(10.0mL)并劇烈旋轉(zhuǎn)攪拌終止反應(yīng)。室溫放置5分鐘后，劇烈振搖試管，將內(nèi)容物通過(guò)Whatman N°1濾紙過(guò)濾。測(cè)定590nm處相對(duì)于對(duì)照的吸光度，對(duì)照是通過(guò)將不含底物片的提取液在50℃溫育60分鐘而制備的。向提取液中加入1％(w/v)Trizma堿后加入底物片。活性表示為樣品與對(duì)照間590nm處吸光度的差異，以每克干麥芽表示(ΔA590/g)。
將0.6mL BMWM1(參見(jiàn)上文)和0.4mL緩沖液A中的木聚糖內(nèi)切酶活性與加入了0.4mL WWM的0.6mL BMWM1中的活性相比較。有時(shí)，在加入之前將WWM煮沸30分鐘并離心(3000g，15分鐘，20℃)。
在不同谷物的提取液對(duì)微生物酶的抑制的評(píng)估中，使用下列方法。將提取液(WF、WG、RF和BWM)或煮沸(30分鐘，100℃)并離心(10000g，15分鐘，20℃)的提取液(25μL)與250μL適當(dāng)稀釋的微生物木聚糖酶溶液在室溫下預(yù)溫育30分鐘，加入xylazyme片，混合物于50℃溫育60分鐘。除了用5.0mL 2％(w/v)Trizma堿代替10.0mL 1％(w/v)Trizma堿終止反應(yīng)外，剩余步驟如上所述。β-葡聚糖酶(EC 3.2.3.73)活性及其抑制的測(cè)定將提取液(WF、RF和BWM)或煮沸(30分鐘，100℃)并離心(10000g，15分鐘，20℃)的提取液(450μL)與50μL BMWM2在室溫下預(yù)溫育30分鐘，加入β-Glucazyme片，混合液于40℃溫育60分鐘。除了用5.0mL 2％(w/v)Trizma堿代替10.0mL 1％(w/v)Trizma堿終止反應(yīng)外，剩余步驟如上所述。釀造根據(jù)EBC法(Analytica-EBC，第四版，Brauerei-und Getranke-Rundschau，蘇黎世，1987)以雙份制備麥芽汁。對(duì)于100％大麥麥芽汁，使用50.0g大麥芽，對(duì)于含40％小麥的麥芽汁，使用30.0g大麥芽和20.0g小麥。將麥芽汁以2000×g(室溫)離心15分鐘。洗滌用過(guò)的谷粒(150mL)，將洗滌物加入麥芽汁中。
在與60％Clarine麥芽和40％Soissons或Skirlou小麥混合之前，將枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶加入水(46℃)中。加入麥芽汁中的木聚糖內(nèi)切酶的水平(0.867ΔA599/g)等于將Clarine麥芽的木聚糖內(nèi)切酶活性(0.750 ΔA590/g)提高到Plaisant1麥芽中的水平(1.617 ΔA590/g)所需的水平。
上述所有分析都至少以雙份進(jìn)行，并表示為平均值。由個(gè)體與平均值之間的差異(％)計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差(E.E.)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦根據(jù)Laemmli，U.K.的方法(自然(Nature)，1970，227，680-685)，用PhastSystem單位(Pharmacia，Uppsala，瑞典)在還原(β-巰基乙醇，1％)或非還原條件下，于20％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-page)，測(cè)定純化的抑制劑的分子量。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(Pharmacia，開(kāi)發(fā)技術(shù)文件N°210)將凝膠銀染色。低分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物是α-乳清蛋白(14400 Da)；胰蛋白酶抑制劑(20100 Da)；碳酸酐酶(30000 Da)；卵清蛋白(43000 Da)；清蛋白(67000 Da)；磷酸化酶b(94000 Da)。用使用含有兩性電解質(zhì)(pH 3-9)的聚丙烯酰胺凝膠的PhastSystem單位并應(yīng)用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)(Pharmacia校準(zhǔn)試劑盒，pI3.5-9.3)測(cè)定抑制劑的等電點(diǎn)。銀染色蛋白質(zhì)(參見(jiàn)上文)。蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列測(cè)定應(yīng)用與120A PTH分析儀(Perkin Elmer，比利時(shí))聯(lián)機(jī)的AppliedBiosystems 477A型氣相序列測(cè)定儀測(cè)定N端氨基酸序列。小麥中存在木聚糖內(nèi)切酶抑制劑的證明大麥芽和小麥Xyl水平及阿拉伯木聚糖水解活性列于表I中。100％麥芽汁中的Xyl水平(表II)為0.41-0.62％(所有分析數(shù)據(jù)表示為干物質(zhì)的百分?jǐn)?shù))。含40％小麥的麥芽汁中的Xyl水平為0.35-0.61％(表III)。
在含40％小麥的麥芽汁中，發(fā)明者使用60％的大麥芽。將使用60％麥芽的釀造中Xyl的增加與使用100％大麥芽的Xyl增加的60％相比較，顯示12-58％的的降低(表II和表IH)。這提示，在小麥的存在下大麥芽的木聚糖內(nèi)切酶被抑制，或者小麥阿拉伯木聚糖是麥芽木聚糖內(nèi)切酶的較不適宜的底物。發(fā)芽破壞大麥細(xì)胞壁，使其更易被酶接近(Selvig，A.和Aarnes，H.，釀造研究所雜志，1986，92，185)。麥芽汁中的游離Xyl水平100％麥芽汁中的游離Xyl水平為0.046-0.076％，在含40％小麥的麥芽汁中為0.025-0.040％(表IV)。釋放的游離Xyl水平之間的差異，對(duì)于100％麥芽汁為0.032-0.044％，對(duì)于含40％小麥的麥芽汁為0.015-0.020％。與應(yīng)用100％大麥麥芽汁的游離Xyl釋放的60％相比，游離Xyl釋放的降低為1-32％(表II和表IV)?？莶菅挎邨U菌木聚糖內(nèi)切酶的應(yīng)用不引起游離Xyl的增加。游離Ara水平也不升高。因此，木聚糖內(nèi)切酶沒(méi)有β-D-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的額外活性。
由一起使用小麥和大麥芽引起的、木聚糖內(nèi)切酶誘導(dǎo)的Xyl增加或阿拉伯木聚糖溶解的降低，比游離Xyl的釋放的降低更明顯。由于這個(gè)原因，大家關(guān)注于小麥成分對(duì)大麥芽木聚糖內(nèi)切酶的抑制。小麥提取液對(duì)麥芽木聚糖分解系統(tǒng)的抑制

圖1顯示加入WWM代替緩沖液A時(shí)BMWM1中木聚糖內(nèi)切酶活性的降低。木聚糖內(nèi)切酶活性的降低為26-58％。通過(guò)加入小麥粗粉提取液(WWM)代替緩沖液，獲得大麥芽粗粉提取液(BMWM1)中木聚糖內(nèi)切酶活性的降低。圖1表示使用未煮沸(□)和煮沸的提取液(■)所獲得的結(jié)果。(a)Clarine麥芽+Soissons小麥，(b)Clarine麥芽+Skirlou小麥，(c)Plaisant1麥芽+Soissons小麥，(d)Plaisant1麥芽+Skirlou小麥，(e)Plaisant2麥芽+Soissons小麥，(f)Plaisant2麥芽+Skirlou小麥。
在栽培品種Skirlou中比栽培品種Soissons中觀察到更強(qiáng)的降低。這與應(yīng)用栽培品種Skirlou的釀造中比應(yīng)用栽培品種Soissons的釀造中Xyl更強(qiáng)的降低相一致(見(jiàn)表III)。栽培品種Skirlou的水可提取的Xyl含量高于栽培品種Soissons意味著，釀造中小麥底物的較低敏感性可引起溶解性降低。當(dāng)煮沸WWM時(shí)，幾乎所有抑制都消失。該抑制劑似乎是不耐熱的，因此發(fā)明者推斷它可能有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。然而，認(rèn)為專(zhuān)注于一種蛋白酶是不可能的，因?yàn)辂溠恐械牡鞍酌富钚詳?shù)倍高于小麥的蛋白酶活性?；钚越档偷闹饕糠诛@然不是由小麥阿拉伯木聚糖所引起的，因?yàn)闊崽幚聿桓淖冃←溙崛∫旱陌⒗揪厶菨舛?。小麥抑制劑?duì)內(nèi)源大麥芽木聚糖內(nèi)切酶或外源木聚糖內(nèi)切酶是否有活性尚不清楚。應(yīng)用枯草芽孢桿菌木聚糖酶的釀造用于大麥芽-小麥粗粉釀造中阿拉伯木聚糖溶解較差的一種溶液枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶是在圖2的實(shí)驗(yàn)條件下相對(duì)較少被抑制的一種微生物酶，其提高麥芽汁中存在的Xyl水平。與不加入木聚糖內(nèi)切酶而制備的相同麥芽汁相比，使用栽培品種Soissons作為小麥添加物獲得多出94％的Xyl溶解，使用栽培品種Skirlou作為小麥添加物獲得多出179％的Xyl溶解。枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶顯然溶解來(lái)源于小麥品種Skirlou的阿拉伯木聚糖多于來(lái)源于小麥品種Soissons的阿拉伯木聚糖(表IV)。木聚糖酶抑制劑從小麥粉中的純化將Soissons小麥粉(2.0kg)懸浮于10.0L 0.1％(w/v)抗壞血酸中。懸液于7℃混合過(guò)夜并離心(7℃，10000g，30分鐘)。向上清液中加入2.0g/LCaCl2，加入2.0M NaOH使pH升高至9.0。將提取液置于7℃過(guò)夜并離心(7℃，10000g，30分鐘)。用2.0M HCl調(diào)節(jié)提取液的pH至5.0，并將該提取液泵送至陽(yáng)離子交換柱(SP Sepharose Fast Flow，50×50mm，Pharmacia)。該柱用緩沖液C(200mL)平衡，用200mL 0.5M NaCl洗脫蛋白質(zhì)級(jí)分。洗脫物稀釋5倍，如上將pH調(diào)節(jié)至5.0，交換陽(yáng)離子(SPSepharose Fast Flow，26×100mm，Pharmacia)。用緩沖液C(200mL)平衡該柱，0-0.5M NaCl(800mL)的線性鹽梯度后，用所述Xylazyme法測(cè)定脫鹽(PD 10柱，Pharmacia)后的10mL級(jí)分的木聚糖內(nèi)切酶抑制，該方法中以洗脫物代替谷物提取液和適當(dāng)稀釋的黑曲霉木聚糖酶M4。收集具有抑制活性的級(jí)分，對(duì)去離子水透析(7℃，過(guò)夜)并凍干。用緩沖液D(6.0mL)溶解凍干物質(zhì)，在Sephacryl S100柱(26×670mm，Pharmacia)上分離，用相同緩沖液洗脫。收集2.5mL級(jí)分，測(cè)定其抑制活性。收集活性級(jí)分，如上透析并凍干。用緩沖液E(6mL)溶解凍干物質(zhì)，用相同緩沖液交換陽(yáng)離子(Mono S HR 5/5，Pharmacia)。收集以鹽梯度(0-0.5M NaCl)洗脫的級(jí)分，如上測(cè)定其木聚糖酶抑制。這樣，我們獲得該抑制劑的一種級(jí)分(1mL)，它在SDS-PAGE上以單一蛋白質(zhì)條帶遷移。它具有約40-43kDa的表現(xiàn)分子量。用β-巰基乙醇還原后，檢測(cè)到另外兩條分子量一般為30 kDa和10 kDa的SDS-PAGE帶。木聚糖內(nèi)切酶抑制劑的N端氨基酸序列測(cè)定對(duì)β-巰基乙醇還原的抑制劑蛋白質(zhì)和/或糖蛋白級(jí)分進(jìn)行SDS-page、印跡和N端氨基酸序列測(cè)定。
約40-43 kDa帶的N端氨基酸序列(SEQ ID No.01)是Lys-Gly-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-Pro-Val-Thr-Lys-Xaa-Thr-Ala，其中Xaa優(yōu)選地是Asp。該序列以前未報(bào)道過(guò)。上述約30 kDa帶也具有上述典型的N端氨基酸SEQ ID No.1，而約10 kDa帶的N端氨基酸序列一般如下SEQ IDNo.2Xaa-Ala-Pro-Val-Ala-Lys-Met-Val-Leu-Pro-Val-Ala-Met-Lys-Glu-Xaa-Val，其中第一個(gè)Xaa優(yōu)選地是Ser、Phe或Gly，第二個(gè)Xaa未鑒定。該序列以前未描述過(guò)。來(lái)源于小麥和其它谷類(lèi)的木聚糖內(nèi)切酶抑制劑對(duì)不同微生物木聚糖內(nèi)切酶的抑制圖2顯示在WF、RF和BWM存在下不同微生物木聚糖酶的抑制。列出了當(dāng)加入谷物提取液代替煮沸30分鐘的相同提取液時(shí)木聚糖酶活性的降低(％)。在此實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)于源自Trichoderma reesei的三種木聚糖酶的混合物發(fā)現(xiàn)了最大降低(82-94％)，對(duì)于源自枯草芽孢桿菌的木聚糖酶發(fā)現(xiàn)最小降低(24-39％)。
通過(guò)加入谷物提取液(WF、RF和BWM)代替煮沸的谷物提取液獲得微生物木聚糖內(nèi)切酶活性的降低。圖2表示應(yīng)用小麥粉(
)、黑麥粉(□)和大麥粗粉(■)獲得的結(jié)果。微生物木聚糖酶(a)來(lái)源于Trichoderma reesei的三種木聚糖酶的混合物，(b)來(lái)源于黑曲霉的木聚糖酶M4，(c)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的木聚糖酶，(d)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的三種木聚糖酶的混合物，(e)來(lái)源于黑曲霉的木聚糖酶，(f)來(lái)源于黑曲霉的五種木聚糖酶的混合物，(g)來(lái)源于黑曲霉的五種木聚糖酶的混合物。在此實(shí)驗(yàn)條件下，WG使黑曲霉木聚糖酶M4的活性降低約80％。夾源于小麥和其它谷類(lèi)的抑制劑對(duì)大麥芽β-葡聚糖酶的抑制圖3顯示在WF、RF和BWM存在下麥芽β-葡聚糖酶的抑制。列出了當(dāng)加入谷物提取液代替煮沸30分鐘的相同提取液時(shí)β-葡聚糖酶活性的降低(％)。降低為7-12％。
通過(guò)加入谷物提取液(WF、RF和BWM)代替煮沸的谷物提取液獲得大麥芽提取液(BMWM2)中β-葡聚糖酶活性的降低。圖3表示應(yīng)用小麥粉(a)、黑麥粉(b)和大麥粗粉(c)獲得的結(jié)果。
表I.3種大麥芽和2種小麥的水可提取的和游離的木糖含量(％干物質(zhì))以及阿拉伯木聚糖降解酶活性*水可提取的Xyl 游離Xyl 木聚糖內(nèi)切酶 β-D-木糖苷酶(ΔA590/g)(U/g)大麥芽Clarine 0.29 0.0140.750 0.286Plaisant1 0.41 0.0311.617 0.331Plaisant2 0.40 0.0130.607 0.299小麥Soissons0.27 0.0050.115 0.054Skirlou 0.52 0.0030.205 0.053E.E.＜7％E.E.＜4％E.E.＜9％ E.E.＜6％*Xyl＝木糖；水可提取的Xyl=總數(shù)-游離的木糖水提取物；E.E.＝實(shí)驗(yàn)誤差。
表II.麥芽汁中的木糖和游離木糖水平(％干物質(zhì))以及應(yīng)用100％大麥芽的釀造中木糖和游離木糖增加的水平(％干物質(zhì))*大麥芽 Xyl麥芽汁 Xyl增加 游離Xyl麥芽汁 游離Xyl增加Clarine 0.41 0.15 0.046 0.032Plaisant1 0.62 0.26 0.075 0.044Plaisant2 0.51 0.09 0.049 0.035E.E.＜6％ E.E.＜7％*Xyl＝木糖；Xyl麥芽汁＝總數(shù)-游離木糖麥芽汁；Xyl增加＝總木糖麥芽汁-總木糖水提取物大麥芽；Ara＝阿拉伯糖；E.E.＝實(shí)驗(yàn)誤差。
表III谷粒及用60％大麥芽和40％小麥制備的相應(yīng)麥芽汁中的木糖水平(％干物質(zhì))。釀造中木糖水平的提高(％干物質(zhì))以及加入枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶的影響。與100％麥芽汁情況中木糖水平提高的60％的差異(％)*大麥芽(60％)+Xyl谷粒Xyl麥芽汁Xyl提高 100％麥芽小麥(40％) 汁差異Clarine+Soissons 0.290.35 0.08 -12Clarine+Skirlou 0.410.46 0.07 -27Plaisant1+Soissons0.350.44 0.10 -36Plaisant1+Skirlou 0.480.53 0.06 -58Plaisant2+Soissons0.350.39 0.06 -28Plaisant2+Skirlou 0.480.51 0.05 -40Clarine+Soissons+BSX 0.310.45 0.16 93Clarine+Skirlou+BSX 0.440.61 0.19 130E.E.＜8％ E.E.＜7％*Xyl＝木糖；Xyl谷粒＝0.6×(總數(shù)-游離木糖水提取物大麥芽)+0.4×(總數(shù)-游離木糖水提取物小麥)；Xyl麥芽汁＝總數(shù)-游離木糖麥芽汁；Xyl提高＝總木糖麥芽汁-
；100％麥芽汁差異＝[100×(60％麥芽和40％小麥的麥芽汁中的木糖增加)/(100％麥芽的麥芽汁中的木糖增加)]-100；BSX＝枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶；E.E.＝實(shí)驗(yàn)誤差。
表IV應(yīng)用60％大麥芽和40％小麥的釀造中游離木糖的釋放。加入枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶的影響。與100％麥芽汁情況中木糖釋放的60％的差異(％)*。大麥芽(60％)+游離Xyl小麥(40％) 谷粒 麥芽汁釋 100％麥芽汁差異Clarine+Soissons 0.010 0.025 0.015-20Clarine+Skirlou 0.010 0.029 0.019-1Plaisant1+Soissons 0.021 0.039 0.018-32Plaisant1+Skirlou0.020 0.040 0.020-24Plaisant2+Soissons 0.010 0.029 0.019-9Plaisant2+Skirlou0.009 0.029 0.020-5Clarine+Soissons+BSX 0.010 0.026 0.015-19Clarine+Skirlou+BSX 0.010 0.029 0.019-2E.E.＜8％ E.E.＜7％*Xyl＝木糖；100％麥芽汁差異＝[100×(60％麥芽和40％小麥的麥芽汁的木糖釋放)/(100％麥芽的麥芽汁的木糖釋放)]-100；BSX＝枯草芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶；E.E.＝實(shí)驗(yàn)誤差。
權(quán)利要求
1.一種纖維素分解酶、木聚糖分解酶和/或β-葡聚糖分解酶的蛋白質(zhì)或糖蛋白抑制劑。
2.權(quán)利要求1的抑制劑，其特征在于該抑制劑抑制纖維素酶、木聚糖內(nèi)切酶、β-葡聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或其它纖維素、木聚糖、阿拉伯木聚糖或β-葡聚糖降解酶。
3.權(quán)利要求1或2的抑制劑，其特征在于該抑制劑可從植物材料或其部份中獲得。
4.權(quán)利要求3的抑制劑，其特征在于所述植物材料選自谷物、小麥的谷粒或谷粉、硬粒小麥、黑麥、黑小麥、大麥、高粱、燕麥、玉米或水稻。
5.權(quán)利要求1或2的抑制劑，其特征在于該抑制劑可從微生物或其部份中獲得。
6.權(quán)利要求1-5中任一個(gè)的抑制劑，其特征在于它是一種木聚糖酶抑制劑。
7.權(quán)利要求6的抑制劑，其特征在于它是一種水溶性的種類(lèi)。
8.權(quán)利要求7的抑制劑，它具有一種標(biāo)志，該標(biāo)志的氨基酸序列與SEQ IDNo.1和/或SEQ ID No.2具有超過(guò)70％的同源性。
9.權(quán)利要求8的抑制劑，其特征在于該標(biāo)志是蛋白質(zhì)或糖蛋白的N端氨基酸序列。
10.權(quán)利要求8或9的抑制劑，它具有一種標(biāo)志，該標(biāo)志的氨基酸序列與SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2具有超過(guò)85％的同源性。
11.權(quán)利要求10的抑制劑，其特征在于該標(biāo)志是蛋白質(zhì)或糖蛋白的N端氨基酸序列。
12.權(quán)利要求7的抑制劑，它具有一種標(biāo)志，該標(biāo)志的氨基酸序列與SEQID No.1和/或SEQ ID No.2相同。
13.權(quán)利要求12的抑制劑，其特征在于該標(biāo)志是蛋白質(zhì)或糖蛋白的N端氨基酸序列。
14.權(quán)利要求7-13中任一個(gè)的抑制劑，其特征在于所述蛋白質(zhì)或糖蛋白選自分子量一般為40kDa-43kDa的蛋白質(zhì)或糖蛋白、分子量一般為30kDa的蛋白質(zhì)或糖蛋白以及分子量一般為10kDa的蛋白質(zhì)或糖蛋白。
15.權(quán)利要求7-14中任一個(gè)的抑制劑，其特征在于所述蛋白質(zhì)或糖蛋白分子量一般為40kDa-43kDa，并且pI大于約7。
16.從可能遺傳修飾的微生物、植物或植物材料中獲得權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑的方法，其中對(duì)該微生物、植物或植物材料進(jìn)行一次或多次提取和/或分級(jí)分離步驟。
17.獲得根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑的方法，其中通過(guò)將編碼該抑制劑的遺傳物質(zhì)引入微生物、植物或植物材料中遺傳修飾該微生物、植物或植物材料。
18.轉(zhuǎn)化微生物、植物或植物材料的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑的活性降低。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的抑制劑表達(dá)的降低獲得其活性降低。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其特征在于通過(guò)阻斷抑制劑的功能降低該抑制劑的活性。
21.轉(zhuǎn)化微生物、植物或植物材料的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑的活性提高。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的抑制劑表達(dá)的提高獲得其活性的提高。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于通過(guò)激活抑制劑的功能提高該抑制劑的活性。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求17-23中任一個(gè)的方法所獲得的微生物、植物或植物材料。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物和/或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于改進(jìn)谷類(lèi)如大麥、高粱和小麥的麥芽制造和/或啤酒的生產(chǎn)。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于改進(jìn)烘制或壓制的谷類(lèi)制品的生產(chǎn)和/或質(zhì)量，該谷類(lèi)制品選自死面團(tuán)、發(fā)面團(tuán)、Chorleywood面包、早餐谷類(lèi)食品、餅干、意大利面食和面條。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于提高動(dòng)物飼料的效能。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于改進(jìn)淀粉衍生的糖漿、山梨糖醇、木糖和/或木糖醇的生產(chǎn)。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于小麥面筋-淀粉的分離和生產(chǎn)。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于改進(jìn)玉米的加工。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于提高植物病害的抵抗力。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)藥和/或藥物的應(yīng)用。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一個(gè)的抑制劑或由權(quán)利要求16的方法、根據(jù)權(quán)利要求24的微生物、植物或植物材料所獲得的抑制劑的應(yīng)用，用于改進(jìn)造紙及紙漿技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及木聚糖分解酶和/或β－葡聚糖分解酶的抑制劑、獲得該抑制劑的方法、用于獲得微生物、植物或植物材料的所述抑制劑和方法,其中根據(jù)本發(fā)明的抑制劑的活性升高或降低,并且涉及該抑制劑、所述微生物、植物或植物材料在多種方法和應(yīng)用中的用途。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1254374SQ98804680
公開(kāi)日2000年5月24日 申請(qǐng)日期1998年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月30日
發(fā)明者W·德比瑟, J·德勒庫(kù)爾 申請(qǐng)人:K·U·洛文研究和發(fā)展公司