專利名稱：化妝品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物提取物的用途，特別涉及一種以特定的生藥形式用于人體頭部的植物。
當(dāng)今社會(huì)被稱為現(xiàn)代社會(huì)或繁忙社會(huì)，人們因各種原因面臨脫發(fā)的機(jī)會(huì)越來越多。
有鑒于此，嘗試采用各種方法提供效果更好的“頭發(fā)再生劑”。
頭發(fā)再生劑對頭發(fā)的主要作用有如促進(jìn)頭發(fā)生長作用(頭發(fā)生長促進(jìn)作用，促進(jìn)再生作用)，令頭發(fā)濃密、令再生頭發(fā)變長、5a-還原酶抑制作用、促進(jìn)血液循環(huán)、殺菌作用、去頭屑作用、滋潤作用和抗氧化作用。對具有這些作用的物質(zhì)的鑒別方法中，一般將防脫發(fā)、促進(jìn)脫發(fā)再生作用，或者抑制頭屑或頭皮瘙癢的作用作為指標(biāo)。
不過雖然嘗試采用了上述各種方法，但常規(guī)的頭發(fā)再生劑的頭發(fā)再生作用(如防脫發(fā)及頭發(fā)再生作用)并非總能令人滿意。一般認(rèn)為原因可能在于造成脫發(fā)的原因很多，并且頭發(fā)再生的機(jī)理十分復(fù)雜。因此，生產(chǎn)頭發(fā)再生劑的一種更有希望的方法應(yīng)著眼于頭發(fā)本身的特殊結(jié)構(gòu)，并且亟需由此研制提供的有效成分。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種頭部用組合物，該組合物不僅具有防脫發(fā)、促進(jìn)頭發(fā)生長和抑制頭屑或頭皮瘙癢的全面作用，還能直接作用于頭發(fā)更為特殊的結(jié)構(gòu)，特別是表皮的毛乳頭細(xì)胞或毛囊上皮細(xì)胞。
本發(fā)明人首先研究制定了對能達(dá)到上述發(fā)明目的有效成分進(jìn)行鑒定的篩選體系或稱鑒定試驗(yàn)體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被測物質(zhì)在細(xì)胞增殖試驗(yàn)(采用經(jīng)培養(yǎng)的取自人體的毛乳頭細(xì)胞)或者在活化試驗(yàn)(采用經(jīng)培養(yǎng)的取自人體的毛囊上皮細(xì)胞)中取得了良好效果，具體內(nèi)容見下文，有效成分不僅能活化毛乳頭(或毛乳頭細(xì)胞)或者增加生長周期內(nèi)再生頭發(fā)的長度，還具有極好的頭發(fā)生長促進(jìn)作用、生發(fā)作用等。
在以上兩項(xiàng)試驗(yàn)中，他們還采用了各種植物提取物，發(fā)現(xiàn)分類為大戟科巴豆屬的植物提取物具有極好的效果，并且具有極好的頭發(fā)再生作用，如防脫發(fā)或促進(jìn)頭發(fā)再生，以及抑制頭屑或頭皮瘙癢的作用。
因此，本發(fā)明提供了一種頭部用組合物，該組合物中含有大戟科巴豆的植物提取物作為有效成分。在一具體實(shí)施方案提供的頭發(fā)再生組合物中含有有效量的用于人體頭發(fā)再生的大戟科巴豆屬植物提取物以及適用于化妝品或適用于皮膚的其它輔料。
另外，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中也將上述提取物加入頭發(fā)再生組合物中用作有效成分，或?qū)⒃撎崛∥飸?yīng)用于頭發(fā)再生方法中。
另外，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中也提出了一種用于活化表皮毛乳頭細(xì)胞和/或增加生長周期內(nèi)再生頭發(fā)長度的組合物，其中含有上述提取物作有效成分。


圖1A-C所示的是對得自本發(fā)明Croton birmanicus Muell.Arg.提取物的特定餾分進(jìn)行高壓液相色譜法的4α-TPA洗脫對照譜線，其中有效成分的濃度經(jīng)增濃。圖1A和圖1B是分別“得自其它制備實(shí)施例”的A餾分和B餾分，圖1C是用作對照的4α-TPA。
本發(fā)明的頭部用組合物包括適用于人體頭部特別是頭發(fā)和頭皮的任何形式。該組合物可廣泛用于頭發(fā)再生，在本說明書中“頭發(fā)再生”的概念包括促進(jìn)頭發(fā)再生、防脫發(fā)、抑制頭屑或頭皮瘙癢等作用，還包括活化表皮毛乳頭細(xì)胞或毛囊上皮細(xì)胞的作用。
雖然在理論上并無特殊限定，但相信在本發(fā)明中用作有效成分的大戟科巴豆屬植物提取物具有表皮毛乳頭活化作用，因其能使經(jīng)培養(yǎng)的人體表皮毛乳頭細(xì)胞顯著增殖，另外它還具有增加生長周期內(nèi)再生頭發(fā)長度的作用，因其能促進(jìn)經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞的增殖，詳見下文。
因此該提取物通過直接作用于頭發(fā)本身的結(jié)構(gòu)而具有促進(jìn)頭發(fā)再生和防脫發(fā)的作用，還具有抑制頭屑或頭皮瘙癢的作用，因?yàn)樵撎崛∥镌诎l(fā)揮其效能時(shí)并未對上述細(xì)胞的增殖產(chǎn)生任何不利影響。
尤其令人意外的是，注意到僅由大戟科巴豆屬的巴豆籽(也稱巴豆果實(shí))胚芽乳液經(jīng)壓制得到的巴豆油在頭發(fā)再生和生發(fā)作用方面明顯低于本發(fā)明的提取物，另一方面，其對皮膚有刺激性。
已知巴豆油中包含12-氧-四癸?；?佛波醇13-乙酸酯(下文中稱為TPA)，已知是一種腫瘤促進(jìn)劑，是建立腫瘤促進(jìn)劑兩步理論的基礎(chǔ)。已知TPA對C3H小鼠具有較強(qiáng)的毛發(fā)生長作用(《表皮正常及異常分化》，M.Seiji和I.A.Bernstein編，159-170頁，Todai-Shuppan1982年出版)，但局部施用于鼠耳時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重炎癥(P.L.Stanley等人，《皮膚藥理學(xué)》，1991；4:262-271頁)，并且在施用于Balb/c小鼠皮膚上時(shí)會(huì)令其表皮細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重變化(例如，棘皮癥、角化過度等)。
注意到該背景技術(shù)后，意外地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的提取物具有極好的頭發(fā)再生促進(jìn)作用和生發(fā)作用，另外對皮膚幾乎無刺激性，本發(fā)明人制定的篩選或鑒定試驗(yàn)方法的可用性得到了證明，并可采用經(jīng)培養(yǎng)的表皮毛乳頭細(xì)胞和經(jīng)培養(yǎng)的毛囊上皮細(xì)胞。
用于本發(fā)明的提取物的特點(diǎn)在于它不是由大戟科巴豆屬的巴豆籽胚芽乳液經(jīng)壓制得到的巴豆油，而是經(jīng)提取處理得到的。
本發(fā)明提取物所用的植物可也是巴豆屬的各種植物，以及提取物能達(dá)到本發(fā)明目的的那些植物。優(yōu)選croton birmanicus Muell.Arg。該植物主要分布在東南亞，在泰國稱為HADSAKHYYN.。
適用于本發(fā)明的植物提取物的葉、莖(包括地下莖)、根、果實(shí)、皮等或全草可經(jīng)提取溶劑浸漬，或與提取溶劑一同經(jīng)加熱回流，過濾所得混合物，濃縮濾液。提取溶劑可以是任何常用于提取操作的溶劑，特別值得一提的一種溶劑或兩種或兩種以上溶劑的混合物選自可與水混溶的有機(jī)溶劑，例如低級醇如甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇，多元醇如丙二醇和1,3-丁二醇，丙酮，乙酸乙酯等。采用低級醇時(shí)，所得的提取物可直接應(yīng)用，也可蒸餾除去提取溶劑和其中的殘留物，如必要還可經(jīng)干燥，摻混后得到本發(fā)明的頭部用組合物。
根據(jù)不同目的，本發(fā)明的提取物可以是不同等級的加工產(chǎn)品，可將經(jīng)上述提取溶劑提取過的提取物用含疏水溶劑(例如正己烷)和水的體系進(jìn)行液液分離，例如用乙酸乙酯等提取其中的含水層，然后經(jīng)適用的柱色譜法對上述提取物或未經(jīng)提取的含水層進(jìn)行分離或類似處理。
對該頭部用組合物中本發(fā)明提取物的配制含量并無特殊限制，因其取決于組合物的劑型或使用方法。但當(dāng)采用后面實(shí)施例所述方法提取得到的提取物時(shí)，其配制含量(以干物料計(jì))一般占組合物總量的0.0005-20.0％(重量)，優(yōu)選為0.001-10.0％(重量)。其用量高于20.0％(重量)時(shí)，不易進(jìn)行配制，這是不利的。另外配制用量高于10.0％(重量)，隨用量增高效果不再增高。
如必要，除上述必要成分外，本發(fā)明頭部用組合物中還可加入適用于化妝品或適用于皮膚的其它輔料、擬藥物、藥物等，例如油性成分、保濕劑、增稠劑、螫合劑、其它活性成分、抗氧劑、紫外線吸收劑、表面活性劑、醇、粉類組分、著色劑、含水成分、水、各種皮膚用營養(yǎng)成分等。
特別值得一提的是例如高級脂肪酸、固體石蠟、液體石蠟、硅油、角鯊?fù)榈扔托猿煞郑煌该髻|(zhì)酸、丙二醇、麥芽醇、粥樣膠原蛋白(atherocollagen)、乳酸鈉等保濕劑；榠櫨子粘性物質(zhì)、羧乙烯基聚合物、黃原膠等增稠劑；乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷酸鈉、焦磷酸鈉和葡糖酸等螯合劑；藥物如咖啡因、單寧酸、維垃帕米、止血環(huán)酸及其衍生物，甘草提取物、光甘草廷(glabridin)、丘角菱的熱水提取物，各種生藥、乙酸生育酚和甘草亭酸及其衍生物或其鹽、其它增白劑如維生素C、膦基抗壞血酸鎂、抗壞血酸葡糖酐、熊果苷和曲酸、糖類如葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖和海藻糖等活性成分。
另外，制備組合物時(shí)可同時(shí)加入頭發(fā)再生劑的輔料成分中除油性成分、保濕劑和增稠劑之外，還有例如油性物質(zhì)如油酸單甘酯，血管擴(kuò)張劑如煙酰胺、乙酸維生素E、當(dāng)藥提取物、氯化鎰和乙酰膽堿衍生物，氨基酸如絲氨酸和甲硫氨酸，維生素如維生素B6、維生素E及其衍生物和生物素，皮膚功能促進(jìn)劑如泛酸及其衍生物、甘草亭酸及其衍生物、煙酸、煙酸酯如煙酸甲酯、煙酸生育酚酯，以及頭孢金素，雌性激素如雌二醇等。
另外，還可加入那些常用于頭發(fā)再生劑的輔料，只要其不會(huì)破壞本發(fā)明的效果，這些輔料例如有抗菌劑如4-異丙基環(huán)庚二烯酚酮、雙三氯酚、潔爾滅、十六烷基氯化吡啶鎓、十一碳烯酸、三氯-N-碳酰苯胺和硫二氯酚，香精如薄荷醇，藥物如水楊酸、鋅及其衍生物，乳酸及其烷基酯，有機(jī)酸如檸檬酸，氨基酸如精氨酸等。
本發(fā)明組合物的劑型可以是例如生發(fā)劑、發(fā)乳、摩絲、洗發(fā)劑和護(hù)發(fā)素。
實(shí)施例將通過以下實(shí)施例具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明并非僅限于此。除非特別指出，配制用量以重量百分比計(jì)。
首先，依次描述了有關(guān)①頭發(fā)再生作用，②頭發(fā)生長作用，③經(jīng)培養(yǎng)的表皮毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞增殖④經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞的活化作用的試驗(yàn)方法和試驗(yàn)結(jié)果。①頭發(fā)再生試驗(yàn)1．提取物的制備(制備實(shí)施例1)在室溫下將Croton birmanicus(干藥材)(500克)在5.0升甲醇中浸漬5天。從提取物中蒸去溶劑，干燥所得物質(zhì)，得到15.2克經(jīng)干燥的Croton birmanicus的甲醇提取物。
2．試樣的制備將所得的經(jīng)干燥的甲醇提取物溶于75％乙醇溶液中，得到濃度為0.5％、1％和2％的試樣1-3。
3．頭發(fā)再生試驗(yàn)方法及其結(jié)果對本發(fā)明的液態(tài)試樣1-3進(jìn)行以下頭發(fā)再生試驗(yàn)，采用0.1％的巴豆油乙醇溶液作為對照試樣。
采用Ogawa等人提出的方法進(jìn)行試驗(yàn)(《表皮正常及異常分化》，M.Seiji和I.A.Bernstein編，159-170頁，Todai-Shuppan1982年出版)，在頭發(fā)生長周期的生長靜止過程中采用C3H/HeNCrJ小鼠作為試驗(yàn)用動(dòng)物。
即，將小鼠分為4組，每組10只鼠，分別用于試樣1-3和對照試樣。用推子和剃刀剃光小鼠背部毛發(fā)，并且每日涂敷0.1毫升各試樣。18天和24天后，測定毛發(fā)再生的面積。結(jié)果用再生面積的平均值表示。結(jié)果見下表1。
表1試樣頭發(fā)再生面積(％)18天后 24天后試樣1 (Croton birmanicus提取物0.5％) 7696試樣1 (Croton birmanicus提取物1％) 87100試樣1 (Croton birmanicus提取物2％) 92100對照試樣 3766如表1所示，在小鼠毛發(fā)再生試驗(yàn)中，本發(fā)明的Croton birmanicus提取物表現(xiàn)出極好的毛發(fā)再生作用。
2．其它制備實(shí)施例將按制備實(shí)施例1相同方法制得的甲醇提取物(299.2克，干重)用正己醇(6升)和水(3升)進(jìn)行液液分離，由正己醇層得到51.83克干物質(zhì)，并得到含水層。含水層經(jīng)水和乙酸乙酯(10升)液液分離，由乙酸乙酯層52.7克干物質(zhì)(下文中稱為乙酸乙酯餾分)。
將乙酸乙酯餾分經(jīng)硅膠柱分離(填充物Wakogel C-200∶1千克，洗脫液氯仿∶甲醇=50∶1→30∶1→20∶1→9∶1→2∶1)，將該用于測定C3H小鼠毛發(fā)再生作用的所得餾分進(jìn)一步經(jīng)ODS凝膠柱色譜法純化(ODS凝膠；300克，洗脫液；70％甲醇→90％甲醇→100％甲醇)，測定由該中間階段洗脫餾分得到的1.10克干物質(zhì)對C3H小鼠毛發(fā)再生的效果。分離是通過硅膠柱進(jìn)行的(填充物Wakogel C-200∶170克，洗脫液氯仿∶甲醇=20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→0∶1)。從最初階段餾分到約經(jīng)2/5洗脫的餾分約得到520毫克干物質(zhì)(下文中稱為餾分A)，由經(jīng)3/5洗脫的餾分得到530毫克干物質(zhì)(下文中稱為餾分B)。
在以下條件下對以上得到的餾分A和餾分B以及4α-TPA進(jìn)行高壓液相色譜法。各成分所得的洗脫譜線分別見圖1.A-C。高壓液相色譜法條件流動(dòng)相0-50分鐘80％乙腈50-60分鐘80-100％乙腈60—80分鐘100％乙腈柱Capcell Pak C18 UG120埃測定紫外線238nm試樣經(jīng)上述毛發(fā)再生試驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)同時(shí)觀察C3H/HeNCrJ小鼠經(jīng)剃毛并涂敷了試驗(yàn)的背部皮膚的刺激性情況。刺激情況是指脫皮和棘皮癥，如能明顯觀察到，記作++，觀察到一定程度的發(fā)生，記作+，完全未觀察到記作-。
對于毛發(fā)再生作用，當(dāng)毛發(fā)再生面積達(dá)80％或80％以上并為100％或100％以下時(shí)，記作+++，為60％或60％以上并且低于80％，記作++，為40％或40％以上并且低于60％，記作+。
試驗(yàn)結(jié)果見下表2(用75％乙醇調(diào)節(jié)試樣濃度)。
表2試樣 頭發(fā)再生刺激作用制備實(shí)施例1的提取物0.5％++ -乙酸乙酯餾分 0.5％+++ -餾分A 0.1％+++ -餾分B 0.1％+++ -TPA6ppm +++ ++TPA0.6ppm +++ ++巴豆油 0.1％ + +
由前述文獻(xiàn)，認(rèn)為TPA對皮膚具有顯著刺激作用。②毛發(fā)生長試驗(yàn)(生發(fā)試驗(yàn))1．提取物的制備按上述毛發(fā)再生試驗(yàn)實(shí)施例中制備實(shí)施例1的方法制備提取物。
2．試樣的制備將由上述方法得到的干燥甲醇提取物(0.5,1％或2％)與70％乙醇溶液(90％)、油酸鈉(0.01％)、十二烷基苯磺酸(0.49％)、硬質(zhì)蓖麻油氧化乙烯(40摩爾)加合物(0.5％)，以及去離子水(8％)攪拌混合形成溶液。再加入去離子水(剩余量)混合形成液態(tài)的試樣4、5和6。
3．頭發(fā)生長試驗(yàn)方法及試驗(yàn)結(jié)果為測定本發(fā)明頭部用組合物的頭發(fā)的再生作用如防脫發(fā)和生發(fā)作用，對人體進(jìn)行以下生發(fā)(trichogram)試驗(yàn)。
使用試樣前后均采用顯微鏡觀察拔出的毛發(fā)毛根的情況，根據(jù)毛根的結(jié)構(gòu)計(jì)算毛發(fā)在生長靜止期的毛根數(shù)，采用毛根數(shù)的增長率和降低率對毛發(fā)的再生作用進(jìn)行比較。生長靜止期間毛根的生長停止，發(fā)現(xiàn)苦于脫發(fā)的人中毛根處于生長靜止期的情況高于正常人。
在10名男性被測者的頭皮上每日2次涂敷各試樣及對照試樣，每次2毫升，持續(xù)6個(gè)月。涂敷試樣前和經(jīng)6個(gè)月涂敷后立即從每名被測者分別頭上拔除100根頭發(fā)，對毛根進(jìn)行測定，然后進(jìn)行有效試驗(yàn)。結(jié)果見下表3。
表3試樣 頭發(fā)生長靜止期發(fā)根的增減率 對頭發(fā)再生作用20％或20％以上減低±20％20％或20％以上增高的評價(jià)試樣4(0.5％) 59 3310 有效試樣5(1％) 72 321很有效試樣6(2％) 80 200很有效對照試樣 9 3159 無效如表3所示，在人體生發(fā)試驗(yàn)中，本發(fā)明的Croton birmanicus提取物具有顯著的生發(fā)作用。③經(jīng)培養(yǎng)的表皮毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞增殖試驗(yàn)1．提取物的制備按上述毛發(fā)再生試驗(yàn)實(shí)施例中制備方法1的方法制備提取物。然后用二甲基亞砜將干燥的甲醇提取物制成0.2％(重量)的溶液，然后用不含血清的培養(yǎng)基(MEM)稀釋該溶液得到Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例2-5)濃度為1.0×10-9至1.0×10-5的溶液。
2．表皮毛乳頭細(xì)胞的收集采用矯形手術(shù)剝除32歲男性頭部枕骨區(qū)域的皮膚(5毫米×1.5厘米)，分離除去皮膚的脂肪組織，剝下毛囊，從毛球部位分離出表皮毛乳頭細(xì)胞。將分離出來的表皮毛乳頭細(xì)胞在含20％FBS的MEM培養(yǎng)基(37℃,5％CO2)中培養(yǎng)2周。當(dāng)確定由表皮毛乳頭細(xì)胞中細(xì)胞快速生長時(shí)，將培養(yǎng)基換為含10％FBS的MEM(MEM+10％FBS)，培養(yǎng)條件均相同。然后每隔兩周更換一次MEM+10％FBS以保存細(xì)胞。
培養(yǎng)4周后進(jìn)行次代培養(yǎng)，此后當(dāng)細(xì)胞增殖到一定數(shù)目后，再次進(jìn)行次代培養(yǎng)，并重復(fù)該步驟。
3．試驗(yàn)方法采用第3代表皮毛乳頭細(xì)胞和MEM+10％FBS培養(yǎng)基制備細(xì)胞密度為10000個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液。將200微升該懸浮液置于96孔微量板中(即每孔2000個(gè)細(xì)胞)，在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)3天令細(xì)胞附著。培養(yǎng)72小時(shí)后，由用于對照組的肉湯培養(yǎng)基替換不含血清的MEM培養(yǎng)基，而采用肉湯培養(yǎng)基的體系則換用不含血清的MEM培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例2-5)(制備實(shí)施例7-10)。
將對照組和試樣體系再經(jīng)4天培養(yǎng)。
培養(yǎng)結(jié)束后，將20微升alamar藍(lán)(BIOSOURSE出品)加入各體系中，再培養(yǎng)8小時(shí)，用微量板讀數(shù)器(Microplate reader)(BIO RAD出品)測定其對570nm和595nm的吸收性。根據(jù)所附的操作說明，根據(jù)測出的吸收結(jié)果計(jì)算alamar藍(lán)的減少率。由于該減少率與細(xì)胞數(shù)目相應(yīng)，可將對照組和被測試樣體系中細(xì)胞的增殖率進(jìn)行比較。
4．結(jié)果測定Croton birmanicus提取物(試樣7-10)對細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的指標(biāo)見下表4。
表4試樣 增殖促進(jìn)率(％) 效果試樣7(1.0×10-9％)4.6±3.7* 有效試樣8(1.0×10-8％)18.7±6.0** 有效試樣9(1.0×10-7％)13.5±5.4** 有效試樣10(1.0×10-6％)6.3±3.2 無效參照試樣2.1±3.1 無效*顯著差別 p＜0.05**顯著差別p＜0.01如表4所示，在對經(jīng)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞活化試驗(yàn)中，本發(fā)明的Crotonbirmanicus提取物對毛乳頭細(xì)胞增殖具有顯著作用。④經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞的活化試驗(yàn)1．經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞的收集在體視顯微鏡下經(jīng)機(jī)械方法收集由外科手術(shù)副產(chǎn)品得到的頭發(fā)生長周期中生長旺盛期的男性人體毛囊。在37℃下將這些處于生長旺盛期的毛囊用經(jīng)Dulbecco改性的MEM(DMEM)培養(yǎng)基(其中含1000單位/毫升分散酶和0.2％膠原酶)處理30分鐘，用注射針頭的針尖除去毛球部分的表皮層和表皮毛乳頭以及上皮組織，將所得剩余部分在37℃下用含0.05％胰解蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸鹽緩沖劑[PBS(-)(-)是指不含鈣離子和鎂離子]處理5分鐘。
然后將毛囊加入涂有膠原蛋白(I型)的培養(yǎng)皿中，并進(jìn)行移出物培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用不含血清的培養(yǎng)基[角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM)](也可采用角質(zhì)細(xì)胞不含血清的培養(yǎng)基)。
培養(yǎng)4-5天后，當(dāng)毛囊附著在培養(yǎng)皿上并能確定細(xì)胞出現(xiàn)增殖時(shí)，更換培養(yǎng)基，此后每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。
在37℃下將所得的增殖細(xì)胞用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA處理5分鐘，用等體積的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止該反應(yīng)，經(jīng)離心(800×g,5分鐘)收集細(xì)胞。
然后將細(xì)胞浮置于上述同樣的不含血清的培養(yǎng)基中，該懸浮液在涂有膠原蛋白(Ⅰ型)的培養(yǎng)皿中的分散密度為5000個(gè)細(xì)胞/平方厘米，細(xì)胞出現(xiàn)微融合(subconfluent)時(shí)每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，在再次將細(xì)胞用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA處理5分鐘，用等體積的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止該反應(yīng)，進(jìn)行離心(800×g,5分鐘)，在所得的人體毛囊上皮細(xì)胞中加入凍細(xì)胞液(CellBanker:DIA-IATRON出品)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106個(gè)細(xì)胞/毫升，將含1.0×106個(gè)細(xì)胞的各部分分別加入冷凍管中，冷凍保存。用細(xì)胞儀計(jì)算細(xì)胞數(shù)。
測定由上述步驟得到的毛囊上皮細(xì)胞中成纖細(xì)胞的結(jié)合率(FB結(jié)合率)(放大3000倍，5倍視野)，從被測物中除去細(xì)胞結(jié)合率為3％或3％以上的細(xì)胞。
將剩余的毛囊上皮細(xì)胞分散于培養(yǎng)瓶中，用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA處理5分鐘，用等體積的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止該反應(yīng)，將該體系離心(1500轉(zhuǎn))5分鐘，除去上清液，在剩余物中加入20毫升KGM培養(yǎng)基，形成細(xì)胞懸浮液。
將該細(xì)胞懸浮液分散于96孔培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中涂有Ⅰ型膠原蛋白FALCON出品)，分散率為0.2毫升/孔(1.0×104個(gè)細(xì)胞/孔)，將該體系在室溫下保存約20分鐘，直到細(xì)胞沉降在孔底部。
隨后，在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)1天，形成所需的經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞。
在經(jīng)上述操作得到的毛囊中加入含0.25％胰蛋白酶的5毫升PBS(-)，將細(xì)胞懸浮液在37℃下培養(yǎng)5分鐘。
培養(yǎng)結(jié)束后，加入5毫升胎牛血清(FBS)和5毫升Ham’s F12培養(yǎng)基，用細(xì)胞過濾器(100微升，NALGENE出品)過濾該細(xì)胞懸浮液，然后置于50毫升離心管中，細(xì)胞懸浮液經(jīng)離心(4℃,1500轉(zhuǎn)，5分鐘)。從體系中除去上清液，剩余物為所需的毛囊上皮細(xì)胞。
2．毛囊上皮細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)為除去可能會(huì)污染體系的成纖細(xì)胞，應(yīng)對由上述步驟得到的毛囊上皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。步驟如下。
37℃下，在恒溫容器中融化上述步驟得到的冷凍細(xì)胞。然后加入10毫升FAD培養(yǎng)基[混合體積比為3∶1的Ham’s F12培養(yǎng)基(見后)和MEN培養(yǎng)基、胰島素(5.0μg/mL)、氫化可的松(0.45μg/ml)、表皮生長因子(EGF)(10.0ng/ml)、霍亂毒素(10-9M)和胎牛血清(10％)](下同)用以稀釋該細(xì)胞溶液，體系經(jīng)離心(10℃或10℃以下，1500轉(zhuǎn)，5分鐘)。離心后除去上清液，在體系中加入10毫升FAD，反復(fù)移液直至細(xì)胞群消失。
用細(xì)胞儀計(jì)算出所得的細(xì)胞數(shù)，用FAD培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升。
將細(xì)胞分散于涂有Ⅰ型膠原蛋白的75立方厘米容積的燒瓶中，在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜。
培養(yǎng)結(jié)束后，用10毫升PBS(-)將體系洗滌2次，加入2毫升含0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)4分鐘。然后在體系中加入2ml胎牛血清(FBS)，混合物經(jīng)一次輕輕振搖，除去上清液以便除去會(huì)污染體系的成纖細(xì)胞。
在體系中再加入15毫升KGK培養(yǎng)基[角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基是將牛垂體提取物(BPE)(0.4％容積)、胰島素(0.5％μm/ml)、氫化可的松(0.5μm/ml)和h-表皮生長因子(0.1ng/ml)加入KGM培養(yǎng)基得到的(CLONETICS出品的改性MCDB153培養(yǎng)基，下同)]，在37℃、5％二氧化條件下培養(yǎng)3天。
測定成纖細(xì)胞對分散有經(jīng)上述步驟得到的毛囊上皮細(xì)胞的培養(yǎng)燒瓶的污染率(FB污染率)(放大3000倍，5倍視野)，從被測物中除去成纖細(xì)胞污染率為3％或3％以上的細(xì)胞。
加入10毫升PBS(-)，用2毫升含0.25％胰蛋白酶的PBS(-)將體系洗滌2次，在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)3分鐘。采用上皮細(xì)胞和成纖細(xì)胞與胰島素的反應(yīng)性的差別從體系中除去成纖細(xì)胞，除去胰島素，再加入2毫升含0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，在37℃、20轉(zhuǎn)/分鐘條件下將混合物振搖5分鐘。
然后用顯微鏡進(jìn)一步測定細(xì)胞層，加入10毫升含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，移液至50毫升離心試管中，體系在1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下經(jīng)5分鐘離心。
除去上清液，加入20毫升KGM培養(yǎng)基，反復(fù)移液直至細(xì)胞群消失。
采用細(xì)胞過濾器(100微升，NALGENE出品)過濾該細(xì)胞懸浮液，并加入50毫升離心試管中。采用細(xì)胞儀計(jì)算出懸浮體中的活細(xì)胞數(shù)，在體系中加入KGM培養(yǎng)基，將體系中的細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5.0×104個(gè)細(xì)胞/毫升。
將該細(xì)胞懸浮液分散于96孔培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中涂有Ⅰ型膠原蛋白FALCON出品)，分散率為0.2毫升/孔(1.0×104個(gè)細(xì)胞/孔)，將該體系在室溫下保存約20分鐘，直到細(xì)胞沉降在孔底部。
隨后，在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)1天，形成所需的經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞。
3．試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備在上述制備實(shí)施例1中制得的Croton birmanicus甲醇提取物的0.2％二甲基亞砜溶液中加入1000體積的改性MCDB153培養(yǎng)基(CLONETICS出品)[提取物濃度2.0×10-4％(二甲基亞砜0.1％)]。
將這些加有被測物的培養(yǎng)基加入含0.1％二甲基亞砜的KBM培養(yǎng)基中用于將被測物的濃度從1.0×10-8稀釋到1.0×10-5％(試樣11-14)。用同樣方法制備那些不含帶有被測物的培養(yǎng)基的對照試樣。
4．用加有被測物的培養(yǎng)基進(jìn)行替換在上述A和B中，分別用如上述3中制備的含被測物的培養(yǎng)基或?qū)φ张囵B(yǎng)基(200微升/孔)替換96孔培養(yǎng)皿中用于制備經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞和經(jīng)培養(yǎng)的鼠毛囊上皮細(xì)胞的KGM培養(yǎng)基，然后在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)2天。
更換培養(yǎng)基是采用吸取器除去每孔中的KGM培養(yǎng)基，小心不使粘著在孔底部的細(xì)胞受到損傷，然后立即從孔的各向邊緣加入含被測物的培養(yǎng)基。
5．細(xì)胞增殖試驗(yàn)加入占培養(yǎng)基用量1/10(體積)的Alamar藍(lán)(ALAMAR BIOSCIENCE出品)，將混合物在37℃(5％二氧化碳)條件下培養(yǎng)6小時(shí)。
然后用微量板讀數(shù)器(BIO RAD出品)測定其對570nm和595nm的吸收性。根據(jù)所附的操作說明，根據(jù)測出的吸收結(jié)果計(jì)算alamar藍(lán)的減少率。由于該減少率與細(xì)胞數(shù)目相應(yīng)，可將對照組和被測試樣體系中細(xì)胞的增殖率進(jìn)行比較。
6．結(jié)果測定Croton birmanicus提取物(試樣11-14)對細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的指標(biāo)見下表5。
表5試樣 增殖促進(jìn)率(％) 效果試樣11(1.0×10-8％) 5.3±6.3*有效試樣12(1.0×10-7％)13.5±5.2** 有效試樣13(1.0×10-6％)15.5±3.1** 有效試樣14(1.0×10-5％)25.6±5.1 有效參照試樣 1.2±2.7 無效*顯著差別p＜0.05**顯著差別p＜0.01如表5所示，在對經(jīng)培養(yǎng)的人體毛囊上皮細(xì)胞促進(jìn)試驗(yàn)中，本發(fā)明的Crotonbirmanicus提取物對毛囊上皮細(xì)胞具有顯著促進(jìn)作用。⑤實(shí)際應(yīng)用試驗(yàn)本發(fā)明試樣實(shí)施例15生發(fā)劑(1)Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1)1.0(2)丙二醇5.0(3)透明質(zhì)酸鈉0.01(4)75％乙醇 余量測定上述配方中制備的生發(fā)劑實(shí)際應(yīng)用于如有頭屑、頭發(fā)再生和脫發(fā)等頭部癥狀時(shí)的效果。將生發(fā)劑施用于10名存在頭屑、頭發(fā)再生和脫發(fā)等頭部癥狀男性(年齡25-55歲)，每日一次或兩次，每次1-3毫升，經(jīng)4個(gè)月時(shí)間，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)測定其防頭屑效果、頭發(fā)再生促進(jìn)效果和防脫發(fā)效果。結(jié)果見表6。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(1)防頭屑的效果試驗(yàn)無效經(jīng)護(hù)理但未發(fā)現(xiàn)任何改善。有效頭屑的生成降低。很有效頭屑的生成終止。(2)頭發(fā)再生效果試驗(yàn)無效經(jīng)護(hù)理但未發(fā)現(xiàn)任何改善。有效2/3或2/3以上的脫發(fā)部位出現(xiàn)頭發(fā)再生。很有效整個(gè)脫發(fā)部位出現(xiàn)頭發(fā)再生。(3)脫發(fā)效果試驗(yàn)無效經(jīng)護(hù)理但未發(fā)現(xiàn)任何改善。有效脫發(fā)的發(fā)展減低。很有效停止脫發(fā)。
表6被測者 年齡 頭屑 頭發(fā)再生 脫發(fā)1 43 很有效 有效有效2 32 很有效 有效有效3 45 很有效 有效有效4 37 有效 有效無效5 41 無效 有效有效6 28 有效 很有效 很有效7 25 無效 有效有效8 55 有效 無效有效9 33 有效 有效有效10 27 無效 有效 很有效如表6所示，該生發(fā)劑具有極好的頭發(fā)再生促進(jìn)作用、防頭屑和防頭發(fā)作用。
本發(fā)明的頭部用組合物的各種劑型的配制實(shí)例見以下實(shí)施例。實(shí)施例1洗發(fā)劑椰油?；谆；撬徕c2.0聚氧乙烯(8mol)油酰醇2.0月桂酸二乙醇胺 4.0乙二醇脂肪酸酯 1.0甘油0.2薄荷醇 0.1Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1)1.0香精 適量丙二醇 2.0純化水 余量實(shí)施例2 頭發(fā)護(hù)理劑液體石蠟 25.0硬脂酸5.0十六醇5.0脫水山梨醇單油酸酯2.0聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯3.0Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1) 0.51,3-丁二醇5.0防腐劑 適量純化水 余量實(shí)施例3生發(fā)劑Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1)1.0硬脂基二甲基氧化胺0.5硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物 1.095％乙醇 54.0去離子水 余量(制備方法)將去離子水加入95％乙醇中，然后向其中加入硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物和硬脂基二甲基氧化胺，加入經(jīng)干燥的提取物，攪拌該混合物形成溶液。實(shí)施例4生發(fā)劑甘油2.0L-薄荷醇0.1Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1)2.095％乙醇 54.0香精0.5去離子水 余量(制備方法)將甘油、L-薄荷醇、香精和經(jīng)干燥的提取物加入95％乙醇中，攪拌該混合物形成溶液，加入去離子水。實(shí)施例5生發(fā)劑N-椰油基月桂基-β-氨基丙酸鈉0.2Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1)0.001十二烷基苯磺酸鈉0.5硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物 1.095％乙醇 54.0去離子水 余量(制備方法)將去離子水加入95％乙醇中，然后向其中加入硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物、硬脂基二甲基氧化胺和N-椰油棕櫚基月桂基-β-氨基丙酸鈉，加入經(jīng)干燥的提取物，攪拌該混合物形成溶液。實(shí)施例6生發(fā)劑甘油 2.0L-薄荷醇 0.1由Croton birmanicus提取物得到的活性餾分0.1A95％乙醇 54.0香精 0.5去離子水 余量(制備方法)將甘油、L-薄荷醇、香精和活性餾分A加入95％乙醇中，攪拌該混合物形成溶液，加入去離子水。實(shí)施例7生發(fā)劑4-異丙基環(huán)庚二烯酸酮 0.1當(dāng)藥提取物 1.0維生素B6 0.2維生素 0.01薄荷醇 0.2水楊酸 0.1由Croton birmanicus提取物得到的活性餾分A 1.0表面活性劑 0.1丙二醇 2.070％乙醇余量實(shí)施例8 生發(fā)劑4-異丙基環(huán)庚二烯酸酮0.1當(dāng)藥提取物 1.0維生素B60.2維生素 0.01薄荷醇 0.2水楊酸 0.1Croton birmanicus提取物(制備實(shí)施例1)1.0表面活性劑 0.1丙二醇 2.070％乙醇 余量
權(quán)利要求
1．一種頭發(fā)再生組合物，其中含有頭發(fā)再生有效量的分類為大戟科巴豆屬的植物提取物，該組合物中還含有適用于化妝品或適用于皮膚的其它輔料。
2．權(quán)利要求1的頭發(fā)再生組合物，其中分類為巴豆屬的植物為CrotonBirmanicus Muell.Arg。
3．權(quán)利要求1的頭發(fā)再生組合物，其中的提取物是采用一種或兩種或多種溶劑經(jīng)提取得到的，溶劑選自與水相容的有機(jī)溶劑。
4．一種用于活化人體表皮頭發(fā)毛乳頭細(xì)胞的組合物，其中含有活化表皮毛乳頭細(xì)胞有效量的分類為大戟科巴豆屬的植物提取物，該組合物中還含有適用于化妝品或適用于皮膚的其它輔料。
5．權(quán)利要求4的組合物，其中分類為巴豆屬的植物為Croton BirmanicusMuell.Arg。
6．一種用于增長人體頭發(fā)生長周期中生長旺盛期頭發(fā)的長度的組合物，其中含有增長再生發(fā)長度有效量的分類為大戟科巴豆屬的植物提取物，該組合物中還含有適用于化妝品或適用于皮膚的其它輔料。
7．權(quán)利要求6的組合物，其中分類為巴豆屬的植物為Croton BirmanicusMuell.Arg。
8．植物分類為大戟科巴豆屬的植物提取物作為有效成分的用途，它可用于制備毛發(fā)再生組合物。
9．植物分類為大戟科巴豆屬的植物提取物作為有效成分的用途，它可用于制備活化人體表皮頭發(fā)毛乳頭細(xì)胞的組合物或增長頭發(fā)生長周期中生長旺盛期頭發(fā)的長度的組合物。
10．權(quán)利要求8或9的用途，其中分類為巴豆屬的植物為Croton BirmanicusMuell.Arg。
11．植物分類為大戟科巴豆屬的植物提取物的用途，它可在頭發(fā)再生組合物中用作有效成分。
全文摘要
本說明書涉及含有Croton birmanicus提取物作為活性成分的化妝品組合物,特別涉及頭發(fā)生長組合物。該組合物不僅具有極好的頭發(fā)再生作用,如防脫發(fā)作用和頭發(fā)再生促進(jìn)作用,以及抑制頭屑和頭皮瘙癢的作用,還能通過活化表皮毛乳頭細(xì)胞或頭發(fā)毛囊上皮細(xì)胞產(chǎn)生特殊的頭發(fā)生長促進(jìn)作用。
文檔編號A61K8/96GK1215587SQ9811998
公開日1999年5月5日 申請日期1998年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月21日
發(fā)明者大田正弘, 田島正裕, 岡崎具視, 巖渕德郎, 小林孝次, 石野章博, 辻義春, 真柄綱夫 申請人:株式會(huì)社資生堂