專利名稱：應(yīng)用類胰高血糖素肽－1(glp－1)或類似物消除外科手術(shù)后的分解代謝改變的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及。本發(fā)明涉及一種促進(jìn)外科手術(shù)后恢復(fù)的方法，是通過防止由外科手術(shù)創(chuàng)傷引起的分解代謝反應(yīng)和胰島素抗性。
2．背景情況。在西方世界每百萬居民中，每年要進(jìn)行大約2-2.5萬例外科手術(shù)。同任何創(chuàng)傷一樣，外科手術(shù)也會引發(fā)明顯的代謝改變[Shaw,J.H.F.,et al.,Ann.Surg.,209(1):63-72(1989)；Little,R.A.,et al.,Prog.Clin.Biol.Res.263A:463-475(1987)；Frayn,K.N.Clin.Endocrinol.24:577-599(1986)；Brandi,L.,et al.,Clin.Sci.85:525-35(1993)]。葡萄糖是組織修復(fù)的主要燃料，加速葡萄糖合成是外科手術(shù)后的重要代謝改變，并且是在消耗身體蛋白質(zhì)和能量貯存的情況下進(jìn)行[Gump,F.E.,et al.,J.Trauma,14:378-88(1974)；Black,R.B.,et al.,Ann.Surg.196:420-35(1982)]。
以前把這些改變歸因于葡糖調(diào)節(jié)應(yīng)激激素和其它一些分解代謝因子如細(xì)胞因子，它們是作為對創(chuàng)傷的反應(yīng)而被釋放。分解代謝改變越顯著，致病率越高，并且病人的恢復(fù)越緩慢[Thorell,A.,et al.,Eur.J.Surg.,159:593-99(1993)；Chernow,B.,et al.,Arch,Intern.Med.,147:1273-8(1987)]。
手術(shù)后的分解代謝狀態(tài)可以用促蛋白質(zhì)合成的激素，特別是生長激素和IGF-1來治療[Hammarkvist,F.,et al.,Ann,Surg.,216(2):184-190(1991)；Ziegler,T.,et al.,Annu.Rev.Med.,45:459-80(1994)；Ziegler,T.R.,et al.J.Parent.Ent.Nutr.14(6):574-81(1990)]。某些研究表明，胰島素治療對創(chuàng)傷性分解代謝病人有明顯的好處[Hinton,P.,et al.,Lancet,17(4月)767-69(1971),Shizgal,H.,et al.,Am.J.Clin.Nutr.50:1355-63(1989)；Woolfson,A.M.J.,et al,N.Clin.Nntr.,50:1355-63(1989)；Woolfson,A.M.J.,et al.,N.Clin.Nutr.,50:1355-63(1989)；Woolfson,A.M.J.,et al.,N.Engl.J.Med.300:14-17(1979)；Brooks,D.,et al.,J.Surg.Res,40:395-405(1986)；Sakurai,Y.,et al.,Ann.Surg.222:283-97(1995)]。
但是，還有另一些研究表明，手術(shù)后胰島素的有益作用常常被胰島素抗性抵消。由于胰島素抗性，正常濃度的胰島素只能引發(fā)比正常反應(yīng)更小的反應(yīng)。胰島素抗性可能是由于胰島素對細(xì)胞表面受體的結(jié)合減少了，或者是由于細(xì)胞內(nèi)代謝發(fā)生了改變。認(rèn)為第一種類型是對胰島素敏感性降低了，一般可通過增加胰島素的濃度來克服。認(rèn)為第二種類型是對胰島素反應(yīng)性降低了，不能通過加大胰島素的量來克服。
創(chuàng)傷后的胰島素抗性，可以通過給予與胰島素抗性程度成比例的胰島素劑量來克服，因此，顯然是對胰島素敏感性降低了[Brandi,L.S.et al.,Clin.Science 79:443-450(1990)；Henderson,A.A.,et al.,Clin.Sci.80:25-32(1990)]。在選擇性腹部外科手術(shù)之后，對胰島素敏感性降低至少將持續(xù)5天，但是不會超過3周，并且在手術(shù)后第1天降低最深，可能持續(xù)3周才能恢復(fù)正常[Thorell,A.,et al.,(1993)]。
對于創(chuàng)傷后所觀察到的暫時性胰島素抗性的原因尚未完全了解。皮質(zhì)醇和胰高血糖素都可能有助于對創(chuàng)傷的分解代謝反應(yīng)[Alberti,K.G.M.M.,et al.,J.Parent.Ent.Nutr.4(2):141-46(1980)；Gelfand,R.A.,et al.,J.Clin.Invest.74(12月)2238-2248(1984)；Marliss,E.B.,et al.,J.Clin.Invest,49:2256-70(1970)]。但是，對手術(shù)后胰島素抗性的研究，未能發(fā)現(xiàn)外科手術(shù)后這些分解代謝激素的改變和胰島素敏感性改變之間有任何相互關(guān)系[Thorell.A.,et al,(1993)；Thorell.A.,Karolinska Hospital andInstitute,10401 Stockholm,Sweden(1993)；Thorell.A.et al.,Br.J.Surg.81:59-63(1994)]。
創(chuàng)傷后對脂類的可利用性增加，可能通過葡萄糖-脂肪酸循環(huán)誘發(fā)胰島素抗性[Randle,P.J.,et al.,Diab.Metab.Rev.4(7):623-38(1998)]。游離脂肪酸(FFA)的可利用性增加，可誘發(fā)胰島素抗性，并可改變從葡萄糖到脂肪的底物氧化作用，即使在同時輸注胰島素的情況下[Ferrannini,E.,et al.,J.Clin.Invest,72:1737-47(1983)；Bevilacqua,S.,et al.,Metabolism 36:502-6(1987)；Bevilacqua,S.,et al.,Diabetes 39:383-89(1990),Bonadonna,R.C.,et al.,Am.J.physiol.259:E736-50(1990)；Bonadonna,R.C.,et al.,Am.J.physiol.257:E49-56(1989)]。
為了減少麻醉的危險性，非急需的外科手術(shù)按常規(guī)是在禁食過夜之后進(jìn)行。這種被牢固確立的，在外科手術(shù)之前使病人禁食過夜(10-16小時)的慣例，促進(jìn)了分解代謝狀態(tài)的發(fā)展，并使胰島素抗性更加嚴(yán)重。對遭受應(yīng)激狀態(tài)如出血和內(nèi)毒素血癥的大鼠進(jìn)行的研究表明，少于24小時的禁食可明顯地影響對創(chuàng)傷的分解代謝反應(yīng)[Alibegovic,A.,et al.,Circ.Shock,39:1-6(1993)；Eshali,A.H.,et al.Eur.J.Surg.,157:85-89(1991)；Ljungqvist,O.,et al.,Am.J.Physiol.,22:E692-98(1990)]。即使在對大鼠創(chuàng)傷性攻擊之前短時間的禁食，也可顯著地減少碳水化合物的貯存，深刻地改變激素狀況，增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)，而最重要的是增加死亡率[Alibegovic,A.,et al.,Circ.Shock,39:1-6(1993)]。
同禁食的病人相比較，外科手術(shù)之前給予葡萄糖，口服[Nygren,J.,et al.,Ann.Surg.222:728-34(1995)]或輸注都可減少外科手術(shù)后的胰島素抗性。在非急需的腹部外科手術(shù)之前，給予葡萄糖輸注(5mg/kg/min)過夜的病人，手術(shù)后平均喪失了32％的胰島素敏感性，而按常規(guī)禁食過夜之后進(jìn)行外科手術(shù)的病人，他們平均喪失了55％的胰島素敏感性[Ljungqvist,O.,et al.,J.Am.Coll.Surg.178:329-36(1994)]。
除了禁食對外科手術(shù)的恢復(fù)有不利的作用之外，在外科手術(shù)期間和之后，限制病人活動和低熱量的營養(yǎng)也會增加外科手術(shù)后的胰島素抗性。對于健康的志愿受試者，24小時限制活動和低熱量營養(yǎng)已表明可誘發(fā)外周胰島素抗性增加20-30％。因此，以前報導(dǎo)的在手術(shù)前給予葡萄糖輸注后出現(xiàn)的手術(shù)后胰島素抗性[Ljungqvist,O.,(1994)]，可能部分地是由于手術(shù)后的臥床休息和低熱量營養(yǎng)的附加作用。
為了促進(jìn)愈合和減少死亡率，在給予良好外科手術(shù)的前提下，重要的是使反面副作用如分解代謝反應(yīng)和胰島素抗性減到最小。手術(shù)后的胰島素抗性，使以胰島素治療分解代謝狀態(tài)無效。已牢固確立的手術(shù)前禁食的醫(yī)療慣例也加重了手術(shù)后的分解代謝狀態(tài)和胰島素抗性。因此，需要一種克服分解代謝狀態(tài)和胰島素抗性的治療方法。
如在此所公開的，克服分解代謝狀態(tài)和胰島素抗性的這種治療方法之一是，在手術(shù)之前，手術(shù)過程中，和手術(shù)之后同時給予葡萄糖和胰島素。但是，胰島素輸注有引起低血糖的可能性，低血糖的定義是血中葡萄糖低于0.3mM。低血糖會增加心室節(jié)律異常的危險性，這是胰島素輸注的危險后果。對于糖尿病患者，已建立了一套防止低血糖的胰島素輸注規(guī)則系統(tǒng)[Hendra,T.J.,et al.,Diabetes Res.Clin.Pract.,16:213-220(1992)]。但是，在這種規(guī)則系統(tǒng)之下，仍有21％的病人形成了低血糖。在另一項(xiàng)心肌梗死后的葡萄糖控制研究中，當(dāng)以胰島素和葡萄糖輸注，18％的病人形成了低血糖[Malmberg,K.A.,et al.,Diabetes Care,17:1007-1014(1994)]。
胰島素輸注還要求頻繁地監(jiān)測血糖水平，以便能發(fā)覺低血糖的出現(xiàn)并盡可能早地糾正。在所引證的病人接受胰島素輸注的研究中[Malmberg,1994]，至少每2小時檢測血糖一次，并據(jù)此調(diào)節(jié)輸注速度。因此，對于心肌梗死病人胰島素-葡萄糖輸注治療的安全和有效性，取決于能否方便迅速地得到血糖數(shù)據(jù)。這樣一種對監(jiān)測血糖的強(qiáng)制性需要，對醫(yī)護(hù)專業(yè)人員是一個沉重的負(fù)擔(dān)，并且會增加麻煩和治療費(fèi)用。因而，手術(shù)前的臨床護(hù)理單位，在手術(shù)之前常常不采取措施監(jiān)測調(diào)節(jié)血糖水平，例如可以通過靜脈內(nèi)給予胰島素來調(diào)節(jié)。鑒于胰島素輸注的固有危險性和負(fù)擔(dān)，需要另一種方法用于在手術(shù)前/后控制對創(chuàng)傷的分解代謝反應(yīng)。
腸降血糖素激素，即類胰高血糖素肽-1，縮寫為GLP-1，是在內(nèi)臟中從胰高血糖素原產(chǎn)生的?？纱龠M(jìn)營養(yǎng)物誘發(fā)的胰島素釋放[Krcymann B.,et al.,Lancet2:1300-1303(1987)]。已知GLP-1的不同剪截形式可刺激胰島素分泌(促胰島素作用)和cAMP生成[參見如Mojsov,S.,Int.J.Peptide Protein Research,40:333-343(1992)]。已經(jīng)確立了各種體外實(shí)驗(yàn)和哺乳動物，特別是人對外源性給予GLP-1,GLP-1(7-36)酰胺，和GLP-1(7-37)酸的促胰島素反應(yīng)之間的相互關(guān)系[參見如Nauck,M.A.,et al.,Diabetologia,36:741-744(1993)；Gutniak,M.,et al.,New England J.of Medicine,326(20):1316-1322(1992)；Nauck,M.A.,et al.,J.Clin.Invest.,91:301-307(1993)；和Thorens,B.,et al.,Diabetes,42:1219-1225(1993)]。對于胰島素依賴性糖尿病患者，GLP-1(7-36)酰胺通過刺激胰島素敏感性和通過在生理濃度下促進(jìn)葡萄糖誘發(fā)的胰島素釋放，而發(fā)揮顯著的抗糖尿病發(fā)生的作用[Gutniak M.,et al.,New England J.Med.326:1316-1322(1992)]。如果對非胰島素依賴性糖尿病患者給藥，GLP-1(7-36)酰胺則可刺激胰島素釋放，減少胰高血糖素分泌，抑制胃排空，并提高對葡萄糖的利用[Nauck,1993；Gutniak,1992；Nauck,1993]。
將GLP-1類型的分子用于長效治療是不可能的，因?yàn)檫@種肽的血清半衰期非常短。例如，GLP-1(7-37)只有3-5分鐘的血清半衰期。GLP-1(7-36)酰胺皮下注射給藥時具有約50分鐘的半衰期。因此，為了達(dá)到長時間的作用，這些GLP分子必須以連續(xù)輸注給藥[Gutniak M.,et al.,Diabetes Care 17:1039-1044(1994)]。對于本發(fā)明，GLP-1的短半衰期以及因此而必須連續(xù)給藥并不是不利條件，因?yàn)樵谕饪剖中g(shù)之前病人通常都住院了，并且在手術(shù)之前，手術(shù)過程中和手術(shù)之后都要連續(xù)地輸注給予液體。
發(fā)明概述因此本發(fā)明首次提出了一種減弱外科手術(shù)后分解代謝改變和胰島素抗性的方法，包括在需要時對病人給予選自如下的化合物GLP-1,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，以及其藥劑學(xué)允許的鹽。
附圖簡述

圖1顯示6名對照組病人(○)和7名在非急需的外科手術(shù)之前和手術(shù)過程中接受高血胰島素，正常血糖量輸注的病人(■)，在相對于手術(shù)前(術(shù)前)箝制期(clamp period)的手術(shù)后(術(shù)后)箝制期中的葡萄糖輸注速度(GIR)改變的百分?jǐn)?shù)。
圖2顯示5名非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)病人，在夜間連續(xù)輸注GLP-1(7-36)酰胺對平均血糖濃度(mM)(-■-)的作用。此圖還顯示出，相同的這5名NIDDM病人，但在不同的一天夜間，連續(xù)輸注胰島素對平均血糖濃度(--○--)的作用。
圖3顯示5名NIDDM病人，在一天內(nèi)的3次用餐開始時，開始的3小時GLP-1(7-36)酰胺輸注對平均血糖濃度(mM)(-■-)的作用。此圖還顯示相同的這5名NIDDM病人，但在不同的一天，在每次用餐之前短時間皮下注射胰島素對平均血糖濃度(--○--)的作用。
發(fā)明詳述GLP-1意指GLP-1(7-37)。按專業(yè)習(xí)慣，GLP-1(7-37)的氨基末端已被指定為序號7，而羧基末端被指定為序號37。本專業(yè)人員都熟知GLP-1(7-37)的氨基酸序列，但為了方便讀者，仍提供于下NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly15-Arg-Gly37-COOH(SEQ ID NO:1)“GLP-1類似物”被定義為，與GLP-1相比較，具有一個或幾個氨基酸取代，刪除，轉(zhuǎn)換或增加的分子。本領(lǐng)域已知的GLP-1類似物包括例如，GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35),GLP-1(7-36),Gln9-GLP-1(7-37),D-Gln9-GLP-1(7-37),Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)，以及Lys18-GLP-1(7-37)。優(yōu)選的GLP-1類似物是GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，它們被公布在U.S.Patent No:5,118,666中，在此引入此專利作為參考，還有GLP-1(7-36)，是GLP-1的生物學(xué)加工形式，具有促胰島素特性。另一些GLP-1類似物被公布在U.S.Patent No.5,545,618中，此專利在此也被引入作為參考。
“GLP-1衍生物”被定義為如下一種分子，它具有GLP-1或GLP-1類似物氨基酸序列，但是另外還具有化學(xué)修飾的一個或幾個氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，α-碳原子，末端氨基，或者未端羧酸基?；瘜W(xué)修飾包括，但不局限于，增加部分化學(xué)結(jié)構(gòu)，生成新鍵，和除去部分化學(xué)結(jié)構(gòu)。對氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾包括，但不局限于，賴氨酸ε-氨基的?；?，精氨酸，組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰氨基。末端氨基的修飾包括，但不局限于脫氨基，N-低級烷基修飾，N-二低級烷基修飾和N-?；揎?。對末端羧基的修飾包括但不局限于酰胺修飾，低級烷基酰胺修飾，二烷基酰胺修飾和低級烷基酯修飾。低級烷基是C1-C4烷基。并且，還可以用蛋白質(zhì)化學(xué)的普通技術(shù)人員熟知的保護(hù)基，保護(hù)一個或幾個側(cè)鏈基團(tuán)或末端基團(tuán)。還可以使氨基酸的α-碳原子單甲基化或二甲基化。
用于本發(fā)明的一組優(yōu)選的GLP-1類似物和衍生物，由如下結(jié)構(gòu)式的分子及其藥劑學(xué)允許的鹽組成R1-X-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-A1a-Ala25-Lys-Z-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2(SEQ ID NO:2)其中R1選自L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基組氨酸，2-氨基組氨酸，β-羥基組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基組氨酸和α-甲基組氨酸；X選自丙氨酸，甘氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸和α-甲基丙氨酸；Y選自谷氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，蘇氨酸，絲氨酸和甘氨酸；Z選自谷氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，蘇氨酸，絲氨酸和甘氨酸；R2選自NH2，和甘氨酸-OH；還必須此化合物的等電點(diǎn)在大約6.0-9.0的范圍內(nèi)，并且進(jìn)一步要求當(dāng)R1是組氨酸，X是丙氨酸，Y是谷氨酸，以及Z是谷氨酸時，R2必須是NH2。
已公開了許多具有此范圍等電點(diǎn)的GLP-1類似物和衍生物，包括例如GLP-1(7-36)NH2Gly8-GLP-1(7-36)NH2Gln9-GLP-1(7-37)
D-Gly9-GLP-1(7-37)酰胺基-Lys9-GLP-1(7-37)Thr9-GLP-1(7-37)D-Thr9-GLP-1(7-37)Asn9-GLP-1(7-37)D-Asn9-GLP-1(7-37)Ser22-Arg23-Arg24-Gln26-GLP-1(7-37)Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)Lys18-GLP-1(7-37)Arg23-GLP-1(7-37)Arg24-GLP-1(7-37)等，[參見WO91/11457]。
在WO91/11457中還公開了另一組可用于本發(fā)明的優(yōu)選活性化合物，基本上由GLP-1(7-34),GLP-1(7-35),GLP-1(7-36)，或GLP-1(7-37)，或者其酰胺形式，以及其藥劑學(xué)允許的鹽組成，此化合物具有至少一種選自如下的修飾(a)以如下氨基酸之一取代位置26和/或位置34的賴氨酸甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，或D-賴氨酸；或者以如下氨基酸之一取代位置36的精氨酸甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，或D-精氨酸；(b)以氧化作用抗性氨基酸取代位置31的色氨酸；(c)至少如下之一的取代以酪氨酸取代位置16的纈氨酸；以賴氨酸取代位置18的絲氨酸；以天冬氨酸取代位置21的谷氨酸；以絲氨酸取代位置22的甘氨酸；以精氨酸取代位置23的谷氨酰胺；以精氨酸取代位置24的丙氨酸，以及以谷氨酰胺取代位置26的賴氨酸；知(d)至少如下之一的取代以甘氨酸，絲氨酸，或半胱氨酸取代位置8的丙氨酸；以天冬氨酸，甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸取代位置9的谷氨酸；以絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸取代位置10的甘氨酸；以及以谷氨酸取代位置15的天冬氨酸；和(e)以甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸，或者組氨酸的D-或N-?；问交蛲榛问饺〈恢?的組氨酸；其中取代作用是(a),(b),(d)和(e)時，被取代的氨基酸可任選地是D-構(gòu)型，并且，在位置7被取代的氨基酸可以任選地是N-?；騈-烷基化形式。
因?yàn)槎幕?肽酶Ⅳ(DPP Ⅳ)可能與所觀察到的在體內(nèi)給予的GLP-1迅速失活有關(guān)[參見例如Mentlein,R.,et al.,Eur.J.Biochem.,214:829-835(1993)]，所以優(yōu)選的是給予能抵抗DPP Ⅳ活性的GLP-1類似物和衍生物，更優(yōu)選的是給予Gly8-GLP-1(7-36)NH2,Val8-GLP-1(7-37)OH,α-甲基-Ala8-GLP-1(7-36)NH2，和Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH，或者其藥劑學(xué)允許的鹽。
把在U.S.Patent No.5,188,666中要求專利保護(hù)的分子用于本發(fā)明是優(yōu)選的，特別將此專利引入作為參考。這種分子是選自具有如下氨基酸序列的肽以及該肽的衍生物NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-X(SEQ ID NO:3)在此氨基酸序列中，X是選自Lys和Lys-Gly，對于衍生物，其中的肽選自該肽的藥劑學(xué)允許的酸加成鹽；該肽的藥劑學(xué)允許的羧酸鹽；該肽的藥劑學(xué)允許的低級烷基酯；以及該肽的藥劑學(xué)允許的酰胺，選自酰胺，低級烷基酰胺，和低級二烷基酰胺。
另一組用于本發(fā)明的優(yōu)選分子，由在U.S.Patent No.5,512,549中要求專利保護(hù)的化合物及其藥劑學(xué)允許的鹽組成，在此特將此專利引入作為參考，這些化合物具有如下通式R1-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R3|R2(SEQ ID NO:4)其中R1是選自4-咪唑丙?；?，4-咪唑乙?；?-咪唑-α,α二甲基-乙?；?；R2是選自無分支鏈C6-C10酰基，或者不存在；R3是選自Gly-OH或NH2；Xaa是Lys或Arg，這些化合物可用于本發(fā)明。
用于本發(fā)明更優(yōu)選的SEQ ID NO:4化合物，是那些其中Xaa是Arg,R2是無分支鏈C6-C10?；幕衔?。
用于本發(fā)明高度優(yōu)選的SEQ ID NO:4化合物，是那些其中Xaa是Arg,R2是無分支鏈C6-C10酰基，R3是Gly-OH的化合物。
用于本發(fā)明更高度優(yōu)選的SEQ ID NO:4化合物，是那些其中Xaa是Arg,R2是無分支鏈C6-C10?；?，R3是Gly-OH，并且R1是4-咪唑丙?；幕衔铩?br> 用于本發(fā)明最優(yōu)選的SEQ ID NO:4化合物，是其中Xaa為Arg，R2是無分支鏈C8?；?，R3是Gly-OH,R1是4-咪唑丙?；幕衔?。
把在U.S.Patent No.5,120,712中要求專利保護(hù)的分子用于本發(fā)明是高度優(yōu)選的，特將此專利引入作為參考。這種分子是選自具有如下氨基酸序列的肽，以及該肽的衍生物
NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-COOH(SEQ ID NO:1)其中的肽是選自該肽的藥劑學(xué)允許的酸加成鹽，該肽的藥劑學(xué)允許的羧酸鹽；該肽的藥劑學(xué)允許的低級烷基酯；以及該肽的藥劑學(xué)允許的酰胺，選自酰胺，低級烷基酰胺，和低級二烷基酰胺。
將GLP-1(7-36)酰胺，或其藥劑學(xué)允許的鹽用于本發(fā)明是最高度優(yōu)選的。GLP-1(7-36)的氨基酸序列是NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2(SEQ ID NO:5)制備用于本發(fā)明的活性化合物的方法，即制備用于本發(fā)明的GLP-1,GLP-1類似物，或GLP-1衍生物的方法是熟知的，并在U.S.Patent Nos.5,118,666,5,120,712，和5,523,549中描述了，這些專利被引入作為參考。
用于本發(fā)明的活性化合物的氨基酸部分，或者其前體部分，可通過如下幾種方法制備1>固相化學(xué)合成法，2>從天然來源的GLP分子純化，或者3>采用重組DNA技術(shù)。
多肽的固相化學(xué)合成法是本領(lǐng)域熟知的，可以在一般教科書的范圍內(nèi)找到，例如Dugas,H.and Penney,C.,Bioorganic Chemistry,Springer,Verlag,New York(1981),pp.54-92,Merrifield,J.M.,Chem.Soc.,85:2149(1962)，以及Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,Freeman,San Francisco(1969)pp.24-66.
例如，氨基酸部分可使用430A肽合成儀(PE-AppliedBiosystems,Inc.,850 Lincoln Center Drive,Foster City,CA94404)，通過固相法合成，合成循環(huán)由PE-Applied Biosystems提供。BOC-氨基酸的其它試劑可從PE-Applied Biosystems和其它化學(xué)試劑商店購得。為了生成C-末端的氨甲酰，采用雙偶聯(lián)方案的順序Boc化學(xué)法用于起始的對-甲基二苯甲基胺樹脂。為了生成C-末端的酸，可使用相應(yīng)的PAM樹脂。使用預(yù)先形成的羥基苯并三唑酯，可偶聯(lián)天冬酰胺，谷氨酰胺和精氨酸?？墒褂萌缦碌膫?cè)鏈保護(hù)基精氨酸，甲苯磺?；於彼?，環(huán)己基谷氨酸，環(huán)己基絲氨酸，芐基蘇氨酸，芐基酪氨酸，4-溴芐氧羰基Boc去保護(hù)可在二氯甲烷中用三氟乙酸來實(shí)現(xiàn)。合成完成之后，可用含有10％間-甲酚的無水氫氟酸(HF)，使肽去保護(hù)，并從樹脂上斷裂下來。側(cè)鏈保護(hù)基的斷開，以及肽與樹脂斷開是在-5℃-5℃下進(jìn)行，優(yōu)選地是在冰浴上持續(xù)60分鐘。除去HF之后，用乙醚洗肽和樹脂，然后用冰醋酸抽提出肽，并冷凍干燥。
還可采用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，制備用于本發(fā)明的活性化合物。實(shí)際上，由于其較高的產(chǎn)率，重組DNA法可能更優(yōu)越。重組體生產(chǎn)過程的基本步驟是a)．分離天然的編碼GLP-1分子的DNA序列，或者構(gòu)建一個合成或半合成的GLP-1分子DNA編碼序列，b)．將此編碼序列以適合于表達(dá)單獨(dú)的蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)的方式放入一種表達(dá)載體中，c)．用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)恼婧嘶蛟怂拗骷?xì)胞，d)．在將允許表達(dá)GLP-1分子的條件下培養(yǎng)此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及e)．回收和純化重組產(chǎn)生的GLP-1分子。
如以前所述，此編碼序列可能是全合成的，或者是較大的，天然編碼胰高血糖素的DNA修飾產(chǎn)物。在Lund,et a1.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:345-349(1982)中報導(dǎo)了編碼前胰高血糖素原的DNA序列，通過將其天然序列改變成所需的序列，它可以被用作半合成產(chǎn)物的起始原料。
可以借助于本領(lǐng)域熟知的技術(shù)構(gòu)建合成基因，使之在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成GLP-1分子產(chǎn)物。由于遺傳密碼的天然簡并性，技術(shù)人員將意識到，可能需要構(gòu)建相當(dāng)大量而限定數(shù)量的DNA序列，它們?nèi)寄芫幋aGLP-1分子。
合成基因的構(gòu)建法是本領(lǐng)域熟知的。參見Brown,et al.,(1979)，酶學(xué)方法，Academic Press,N.Y.,68:109-151。可應(yīng)用遺傳密碼，根據(jù)所需要的氨基酸序列設(shè)計這種DNA序列。普通的生物學(xué)技術(shù)人員都易探明這種設(shè)計。一旦設(shè)計完成，此序列本身可用常規(guī)的DNA合成儀如380A型或380B型DNA合成儀(PE-AppliedBiosystems,Inc.,850Lincoln Center Drive,Foster City,CA94404)來產(chǎn)生。
為了表達(dá)用于本發(fā)明的化合物的氨基酸部分，可通過使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶，將所設(shè)計的合成DNA序列插入多種適當(dāng)?shù)闹亟MDNA表達(dá)載體中的任何一種。一般可參見Maniatis et al.,(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Springs Harbor Laboratory Press,N.Y.,Vol.1-3。可將限制性內(nèi)切核酸酶的作用位點(diǎn)，設(shè)計在編碼GLP-1分子的DNA的二端，以便于分離，并便于整合進(jìn)入，擴(kuò)增和表達(dá)本領(lǐng)域熟知的載體。所采用的特定內(nèi)切核酸酶將由限制性內(nèi)切核酸酶對使用的原代表達(dá)載體的切割方式來確定。選擇限制性位點(diǎn)，以便使此編碼序列與各調(diào)控序列正確定向，從而達(dá)到適當(dāng)?shù)目騼?nèi)讀碼，并表達(dá)所需要的蛋白質(zhì)。必須使此編碼序列定位在適當(dāng)?shù)淖x框內(nèi)，此讀框帶有表達(dá)載體的啟動子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，它們二者在表達(dá)此蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞內(nèi)都具有功能。
為了使此合成基因?qū)崿F(xiàn)有效的轉(zhuǎn)錄，必須使它與啟動子操縱基因區(qū)有效地相結(jié)合。因此，可將此合成基因的啟動子-操縱基因區(qū)置于與合成基因的ATG起始密碼子相同順序的取向。
本領(lǐng)域已熟知多種可用于轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的表達(dá)載體?？蓞㈤哖romega生物學(xué)研究產(chǎn)品目錄(1992)(Promega Corp.,2800Woods Hollow Road,Madison,WI,53711-5399)；和Stratagene克隆系統(tǒng)目錄(1992)(Stratagene Corp.11011 North Torrey PinesRoad,La.Jolla,CA,92037)。還有U.S.Patent No.4,710,473描述了幾種可用于在E.coli中高水平表達(dá)外源性基因的環(huán)形DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體。這些質(zhì)?？稍谥亟MDNA程序中用作轉(zhuǎn)化載體，并且(a)可使此質(zhì)粒具有在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的能力，(b)可在維持宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度下控制質(zhì)粒自主復(fù)制，(c)可使此質(zhì)粒穩(wěn)定地保留在宿主細(xì)胞群內(nèi)，(d)可指導(dǎo)合成指示質(zhì)粒在宿主細(xì)胞群內(nèi)保存的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，(e)可順序地提供該質(zhì)粒單一的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)，以及(f)可終止mRNA轉(zhuǎn)錄。這些環(huán)形DNA質(zhì)粒可在為獲得高水平外源性基因表達(dá)的重組DNA程序中用作載體。
在完成構(gòu)建用于本發(fā)明化合物的氨基酸部分的表達(dá)載體之后，下一步是將此載體置于適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，從而構(gòu)建一種可用于表達(dá)多肽的重組宿主細(xì)胞。用于以重組DNA載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，可以如Maniatis,et al.,同上的這樣一些綜合文獻(xiàn)中找到。宿主細(xì)胞可由真核細(xì)胞或原核細(xì)胞構(gòu)建。
原核宿主細(xì)胞通常以較高的速度產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并較易培養(yǎng)。在高水平細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)，特征性地凝聚成顆?；虬w，其中含有高濃度超量表達(dá)蛋白質(zhì)。對這種蛋白質(zhì)凝集物，一般都必須用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)回收，溶解，變性和重折疊，參閱Kreuger,et al.,(1990)Protein Folding,Gierasch and King,eds.,pgs 136-142,American Association for the Advancement of Science Publication No.8918S,Washington,D.C.；和U.S.Patent No.4,923,967。
為了產(chǎn)生所需的GLP-1類似物或GLP-1衍生物，對前體GLP-1或GLP-1類似物氨基酸序列的改變可通過已知的方法制備GLP-1前體的化學(xué)修飾，酶修飾，或者化學(xué)和酶修飾的組合。經(jīng)典的溶液相技術(shù)和半合成技術(shù)對于制備用于本發(fā)明的GLP-1分子，也可能是有用的。制備本發(fā)明GLP-1分子的方法，對于普通的肽化學(xué)技術(shù)人員是熟知的。
用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種，可實(shí)現(xiàn)將?；尤隠ys34的ε-氨基。參見Bioconjugate Chem.“蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾歷史和應(yīng)用”pages1,2-12(1990)，和Hashimoto et al.,PharmacueticalRes.6(2):171-176(1989)。
例如，使用在硼酸鹽緩沖液中配制的50％乙腈，可將辛酸的N-羥基-琥珀酰亞胺酯，加到賴氨酰-ε-胺中?？稍诩尤脒溥蚧?，或加入之后將此肽?；?。而且，如此肽是通過重組技術(shù)制備的，就可能在酶促斷裂之前酰化。如在WO96-29342中所描述的，GLP-1衍生物中的賴氨酸也可以被?；?，在此將此專利引入作為參考。
本領(lǐng)域?qū)Χ喾N被保護(hù)、未被保護(hù)和部分被保護(hù)的，天然的和非天然的GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)分子的功能性類似物和衍生物的存在和制備法已有論述[參見例如U.S.Pat.No.5,120,712和5,118,666，此專利被引入作為參考，以及Orskov,C.,et al.,J.Biol.Chem.,264(22):12826-12829(1989)和WO91/11457(Buckley,D.I.,et al.,1991.8.8公布)]。
任選地，可以保護(hù)GLP-1衍生物的氨基端和羧基端氨基酸殘基，或者任選地僅保護(hù)其中一端。在權(quán)威著作中論述了形成和除去這種保護(hù)基的反應(yīng)，例如“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基”，Plenum Press,Londonand New York(1973)；Green,T.H.,“有機(jī)合成中的保護(hù)基”，Wiley,New York(1981)；以及“肽”，Vol.I,Schrder and Lübke,Academic Press London and New York(1965)。代表性的氨基保護(hù)基包括例如甲?；?，乙酰基，異丙基，丁氧羰基，芴基甲氧羰基，芐氧羰基等。代表性的羧基保護(hù)基包括例如芐基酯，甲基酯，乙基酯，叔-丁基酯，對-硝基苯基酯等。
用于本發(fā)明的羧基末端低級烷基酯GLP-1衍生物，可通過在催化性酸如鹽酸存在下，使所需的(C1-C4)鏈烷醇與所需的多肽反應(yīng)來制備。這種烷基酯形成的適當(dāng)條件包括約50℃的反應(yīng)溫度，以及大約1-3小時的反應(yīng)時間。相似條件下，可形成天冬氨酸和/或谷氨酸殘基的烷基酯衍生物。
例如，按Stewart,J.M.,et al.,“固相肽合成法”，Pierce ChemicalCompany Press,1984中所述的方法，可制備用于本發(fā)明化合物的氨甲酰衍生物。
GLP-1,GLP-1類似物或GLP-1衍生物的藥劑學(xué)允許的鹽形式可用于本發(fā)明。通常用于形成酸加成鹽的酸可以是無機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸等，以及有機(jī)酸如對-甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，對-溴苯磺酸，碳酸，琥珀酸，檸檬酸，苯甲酸，乙酸等。這類鹽的實(shí)例包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽，磷酸鹽，一氫磷酸鹽，二氫磷酸鹽，偏磷酸鹽，焦磷酸鹽，氫化物，溴化物，碘化物，乙酸鹽，丙酸鹽，癸酸鹽，辛酸鹽，丙烯酸鹽，甲酸鹽，異丁酸鹽，己酸鹽，康酸鹽，丙炔酸鹽，草酸鹽，丙二酸鹽，琥珀酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，富馬酸鹽，馬來酸鹽，丁炔-1,4-二酸鹽，乙烯-1,6-二酸鹽，苯甲酸鹽，氯苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基苯甲酸鹽，羥基苯甲酸鹽，甲氧基苯甲酸鹽，鄰苯二甲酸鹽，磺酸鹽，二甲苯磺酸鹽，苯乙酸鹽，苯丙酸鹽，苯丁酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，γ-羥基丁酸鹽，乙醇酸鹽，酒石酸鹽，甲磺酸鹽，丙磺酸鹽，萘-1-磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，扁桃酸鹽等。優(yōu)選的酸加成鹽是那些與無機(jī)酸如鹽酸和氫溴酸，特別是鹽酸形成的鹽。
堿加成鹽包括那些從無機(jī)堿生成的鹽如銨或者堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽等。因此，可用于制備本發(fā)明鹽的堿包括氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，碳酸鉀等。這類鹽形式是特別優(yōu)選的。
用于本發(fā)明的GLP-1,GLP-1類似物或GLP-1衍生物，在用于本發(fā)明之前，可以用一種或幾種賦形劑形成制劑。例如，可將用于本發(fā)明的活性化合物，通過熟知的方法與二價金屬陽離子絡(luò)合。此類金屬陽離子包括例如Zn++,Mn++,Fa++,Co++,Cd++,Ni++,等。
任選地，用于本發(fā)明的活性化合物還可以用藥劑學(xué)允許的緩沖劑混合，調(diào)節(jié)pH以便提供必要的穩(wěn)定性，以及使其pH適合于非經(jīng)腸道給藥。
還可任選地加入一種或幾種藥劑學(xué)允許的抗微生物劑。偏-甲氧甲酚和苯酚是優(yōu)選的藥劑學(xué)允許的抗微生物劑。還可以加入一種或幾種藥劑學(xué)允許的鹽，以便調(diào)節(jié)其離子強(qiáng)度或張力。并可加入一種或幾種賦形劑，以便進(jìn)一步調(diào)節(jié)本制劑的等張性。甘油是等張性調(diào)節(jié)賦形劑的一個實(shí)例。
可以通過普通醫(yī)生認(rèn)為有效的任何途徑給藥。優(yōu)選的是非經(jīng)腸道給藥。在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中非經(jīng)腸道給藥通常理解為，借助于無菌注射器或某種其它醫(yī)療設(shè)備如輸注泵，將一種劑型的藥劑注射進(jìn)入體內(nèi)。非經(jīng)腸道給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、腹膜內(nèi)、椎管內(nèi)、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、動脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、和硬膜外給藥。對用于本發(fā)明的化合物，較優(yōu)選的是靜脈內(nèi)，肌肉和皮下給藥途徑。對用于本發(fā)明的化合物，更高度優(yōu)選的是靜脈內(nèi)和皮下給藥途徑。為了非經(jīng)腸道給藥，優(yōu)選的是將用于本發(fā)明的活性化合物，與適當(dāng)pH的蒸餾水組合。
另一些藥劑學(xué)方法可用于控制作用的持續(xù)時間。通過使用聚合物混合或吸附用于本發(fā)明的活性化合物，可獲得控制釋放的制劑。為了延長釋放時間，通過選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿?，并選擇大分子的濃度，以及摻入的方法，可得到適當(dāng)?shù)某掷m(xù)時間，適當(dāng)?shù)拇蠓肿影ɡ纾埘?，聚氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯醋酸乙烯酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素，或硫酸精蛋白。另一種通過控制釋放制劑而延長作用持續(xù)時間的可能方法是，將用于本發(fā)明的活性化合物摻入聚合物材料如聚酯，聚氨基酸，水凝膠，聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚體的微粒中。另一種方法不是將化合物摻入這些聚合物微粒，可能是將用于本發(fā)明的化合物捕獲進(jìn)入例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合作用制備的微囊中，例如分別進(jìn)入羧甲基纖維素或明膠微囊中，或者捕獲進(jìn)入膠體藥物投遞系統(tǒng)例如脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳劑粒，毫微顆粒，及毫維小囊中，或者捕獲進(jìn)入大乳劑粒中。在Remington′s PharmaceuticalSciences(1980)中公開了這些技術(shù)。
按照本發(fā)明的技術(shù)，病人在如下時間需要用于本發(fā)明的化合物在對該病人實(shí)行外科手術(shù)之前約1-16小時，在對該病人實(shí)行手術(shù)的過程中，以及該病人手術(shù)后不多于約5天的時間內(nèi)。
如上面所述，在手術(shù)開始之前給予用于本發(fā)明的化合物的時間長度，是從手術(shù)之前大約16小時，至手術(shù)之前大約1小時。當(dāng)為了降低分解代謝作用和胰島素抗性而應(yīng)該給予用于本發(fā)明的化合物時，手術(shù)之前給藥的時間長度，將取決于普通醫(yī)生都了解其作用的多種因素，最重要的包括在手術(shù)前的準(zhǔn)備時間，病人是否被禁食或者給予葡萄糖輸注或飲料，或者某種其它形式的食物，并且還包括，但不局限于，病人的性別，體重和年齡，不能調(diào)節(jié)血糖的嚴(yán)重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的根本原因，預(yù)計手術(shù)引起創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度，所給予化合物的給藥途徑和生物有效度，保持在體內(nèi)的時間，制劑以及藥效。開始給予用于本發(fā)明的化合物的優(yōu)選時間間隔是手術(shù)開始前約1-10小時。最優(yōu)選的開始給藥的時間間隔是手術(shù)開始之前2-8小時。
如在前面已說明，在特殊類型的外科手術(shù)，非急需的腹部手術(shù)之后，胰島素抗性在手術(shù)后第一天最為深刻，持續(xù)至少5天，并且可能存在達(dá)3周才恢復(fù)正常[Thorell.A.et al.,(1993)]。因此，手術(shù)后病人可能仍需要在手術(shù)創(chuàng)傷后的一段時間內(nèi)給予用于本發(fā)明的化合物，這將取決于普通醫(yī)生應(yīng)能理解和決定的一些因素。這些因素中有手術(shù)后病人是否被禁食，或者給予葡萄糖輸注或飲料，或者某種其它形式的食物，還包括并不局限于，病人的性別，體重和年齡，不能調(diào)節(jié)血糖的嚴(yán)重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的根本原因，手術(shù)引起創(chuàng)傷的實(shí)際嚴(yán)重程度，所給予化合物的給藥途徑和生物有效度，在體內(nèi)保持時間，制劑，以及藥效。手術(shù)后給予用于本發(fā)明化合物的優(yōu)選持續(xù)時間是不超過5天。
名詞“外科手術(shù)后的分解代謝改變”是普通外科醫(yī)生都熟知的[Shaw,J.H.F.,et al.,Ann.Surg.(1989)；Little,R.A.,et al.,(1987)；Frayn,K.N.(1986)；Brandi,L.,et al.,(1993)],在此被定義為由手術(shù)創(chuàng)傷引起的一種代謝狀態(tài)，其特征是可能具有一種或幾種如下現(xiàn)象負(fù)氮素平衡，伴有體內(nèi)氮素喪失[Wernerman,J.,et al.,J.Parent.Enter.Nutr.10:578-82(1986)；Tashiro,T.,et al.,J.Parent.Enter.Nutr.9:452-5(1985)]，外周利用脂肪優(yōu)先于利用葡萄糖，伴有呼吸商下降[Frayn,K.N.,et al.,Arch.Emerg.Med.4:91-9(1987)；Stjernstrom,H.,et al.,Clin.Physiol.1:59-72(1981)]，以及盡管已經(jīng)血糖過多，仍以消耗體內(nèi)蛋白質(zhì)和能量貯存為代價產(chǎn)生內(nèi)源性葡萄糖[Gump,F.E.,et al.,(1974)；Black,R.B.et al.,(1982)；Frayn,K.N.et al.,(1987)；Frayn,K.N.Br.Med.Bull.41(3):232-9(1985)]。
名詞“胰島素抗性”也是普通醫(yī)生都熟知的，在此被定義為正常胰島素濃度只能引發(fā)比正常反應(yīng)更小反應(yīng)的一種生理狀態(tài)。胰島素抗性可能是由于胰島素對細(xì)胞表面受體的結(jié)合降低了，或者由于細(xì)胞內(nèi)代謝過程的改變。第一種類型被認(rèn)為是對胰島素的敏感性降低了，一般可以通過增加胰島素濃度來克服。第二種類型被認(rèn)為是對胰島素的反應(yīng)性降低了，不能通過加大胰島素的量來克服。創(chuàng)傷后的胰島素抗性，可以通過給予與胰島素抗性程度成比例的胰島素劑量來克服，因此，顯然是由于對胰島素敏感性降低而引起的[Brande,L.S.,et al.,Clin.Science 79:443-450(1990)；Henderson,A.A.,et al.,Clin.Sci.80:25-32(19990)]。在選擇性腹部外科手術(shù)之后，對胰島素敏感性降低至少將持續(xù)5天，但是不會超過3周，并且在手術(shù)后第1天降低最深，可能持續(xù)3周才能恢復(fù)正常[Thorell,A.,et al.,(1993)]。對于創(chuàng)傷后所觀察到的暫時性胰島素抗性的原因尚未完全明了。
對于使病人血糖水平正?；行У腉LP-1,GLP-1類似物，或GLP-1衍生物的劑量，將取決于多種因素，其中包括，但不局限于，病人的性別，體重和年齡，不能調(diào)節(jié)血糖的嚴(yán)重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的根本原因，是否同時給予了葡萄糖或另一種碳水化合物來源，給藥途徑和生物有效度，在體內(nèi)保持時間，制劑，以及藥效。在持續(xù)給藥的情況下，適當(dāng)?shù)膭┝克俣葹?.25-6pmol/kg體重/分鐘，優(yōu)選地為約0.5-1.2pmol/kg/分鐘。在斷續(xù)給藥的情況下，每次給藥的劑量應(yīng)該考慮到給藥的間隔時間，GLP-1,GLP-1類似物，或GLP-1衍生物的生物有效度，以及達(dá)到正常血糖需要調(diào)節(jié)的水平。確定GLP-1,GLP-1類似物，或GLP-1衍生物的給藥劑量和速度，以獲得理想的臨床效果，這應(yīng)該在普通醫(yī)生的技能范圍之內(nèi)。
通過參考具體的實(shí)施例，將會更容易地理解本發(fā)明，提供這些實(shí)施例，僅為了說明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例113名預(yù)定作非急需的矯正手術(shù)(hipartroplasty)的病人參與了本項(xiàng)研究。所有的病人均沒有代謝性疾病，肝臟障礙或糖尿病的歷史或征候。13名病人都有正常的禁食血糖水平，CRP和肝功能檢測(膽紅素，堿性磷酸酶，AST和ALT)。
7名病人(胰島素組，年齡56±5歲，BMI25±1kg/m2)在禁食過夜后08:00點(diǎn)開始試驗(yàn)。先在一段30分鐘的起始基礎(chǔ)時間內(nèi)，進(jìn)行采樣測定血糖和激素，并作間接熱量測定，然后以0.8mU/kg/min的恒定速度靜脈內(nèi)輸注胰島素(Actrapid,Novo,Copenhagen)，同時給予可變的葡萄糖(200mg/ml)靜脈內(nèi)輸注，以便使血糖維持在恒定的水平(4.5mM)。再經(jīng)過1小時的穩(wěn)定狀態(tài)之后，對所有的病人實(shí)施統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù)治療(hipartroplasty)。在開始胰島素輸注后290±23分鐘開始進(jìn)行外科手術(shù)。在手術(shù)過程中保持高血胰島素，正常血糖箝制，并在手術(shù)后再持續(xù)3-4小時。將按照如下的命名提供實(shí)驗(yàn)資料基礎(chǔ)期 胰島素開始輸注前的30分鐘術(shù)前箝制手術(shù)前60分鐘的穩(wěn)定狀態(tài)高血胰島素，正常血糖箝制手術(shù)初期手術(shù)開始后的10-40分鐘手術(shù)末期手術(shù)的最后30分鐘術(shù)后箝制從手術(shù)開始后的143±30分鐘開始，穩(wěn)定狀態(tài)高血胰島素，正常血糖箝制60分鐘。
第二組病人(對照組，n=6，年齡59±3歲，BMI26±1kg/m2)的年齡和BMI與胰島素組相似，手術(shù)前7天接受了相同的術(shù)前處理方案(基礎(chǔ)時間和術(shù)前箝制)。對照組在手術(shù)當(dāng)天未接受基礎(chǔ)時間或術(shù)前箝制處理。而是每個對照組病人接受胰島素輸注(0.8mU/kg/min)時立即開始外科手術(shù)，并開始高血胰島素，正常血糖(4.5mM)箝制(術(shù)后)。
在基礎(chǔ)期，手術(shù)過程中的二段時間(手術(shù)初期和手術(shù)末期)，以及術(shù)前箝制和術(shù)后箝制的最后30分鐘內(nèi)，各進(jìn)行30分鐘間接熱量測定(DeltatracDansj,Sweden)[Frayn,K.N.J.appl.Physiol.55(2):628-34(1983)；Takala,J.,et al.,Crit.Care Med.17(10):1041-47(1989)]。按時取尿樣進(jìn)行尿中尿素排泄分析。在對尿素池容量的改變進(jìn)行校正之后[Tappy,L,et al.,Diabetes37:1212-16(1988)]，可計算出非蛋白能量消耗(EE)，呼吸商(RQ)，和底物氧化速度。
在基礎(chǔ)期，手術(shù)前，手術(shù)初期，手術(shù)末期和手術(shù)后，從加溫的手部靜脈重復(fù)采集血液樣品。血糖在采樣后用葡萄糖氧化酶法(YellowSprings Instruments,Yellow Springs,Ohio)[Hugget,A.S.,et al.,Lancet 2:368-70(1957)]立即進(jìn)行測定。放射免疫檢測法(RIA)用于測定胰島素[Grill,V.,et al.,Metabolism 39:251-58(1990)]；C-肽(Novo Research,Bagsverd,Denmark),皮質(zhì)醇[Harris,V.,et al.,Jaffe,B.M.&Behrman,H.R.,eds.Methods of hormone radioimmunoassay,Academic Press,New Yorkand London(1979)pp.643-56]；以及胰高血糖素(Euro-Diagnostica AB,Malm,Sweden)[Faloona,G.R.,et al.,胰高血糖素的放射免疫測定技術(shù)，Vol.1:Academic Press,New York(1974)]。
所有的數(shù)值都是各病人的數(shù)值，或者是平均值±SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)。分別用Wilcoxon′s signed rank檢驗(yàn)和Mann-Whitney U-檢驗(yàn)，對成對的和不成對的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以p＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)可接受的顯著性。因?yàn)閷φ战M與胰島素組相比較，手術(shù)后箝制期血清胰島素水平往往較低(p=0.06)，所以也可在60分鐘穩(wěn)定狀態(tài)期間內(nèi)，通過分離葡萄糖輸注速度(GIR)和平均血清胰島素水平，將箝制期內(nèi)的GIR校準(zhǔn)至通常的胰島素水平。
在基礎(chǔ)期和術(shù)前箝制期內(nèi)，二組的血清胰島素水平都相類似。在手術(shù)期間和術(shù)后箝制期，胰島素組的胰島素水平保持在60μU/ml上下。對照組的胰島素水平與手術(shù)期間的基礎(chǔ)水平相比保持不變。對照組在術(shù)后箝制期的胰島素水平，與術(shù)前箝制期內(nèi)的水平相比較沒有顯著性差異，對于胰島素組在術(shù)后箝制期內(nèi)的水平，與之相比也沒有差異。
二組在基礎(chǔ)期以及在術(shù)前和術(shù)后箝制期內(nèi)的C-肽水平相似(表Ⅰ)。胰島素組與對照組相比較，在手術(shù)期間顯示出較低的C-肽水平。
二組在手術(shù)后血清胰高血糖素水平都降低了(p＜0.05)(表Ⅰ)。但是，胰島素組手術(shù)后的相對改變(與手術(shù)前相比的％)比較高(與對照組相比p＜0.01)。
胰島素組手術(shù)后的血清皮質(zhì)醇水平(表Ⅰ)降低了，而在對照組其水平傾向于升高(p=0.1)。與對照組相比較，胰島素組手術(shù)后的皮質(zhì)醇水平較低(p＜0.05)。表Ⅰ． 在禁食過夜之后(對照組，n=6)，或者4小時生理性高血胰島素之后(胰島素組，n=7)經(jīng)受hipartroplasty手術(shù)的病人的激素水平。<
>*借助于Wilcoxon sigend rank檢驗(yàn)與手術(shù)前比較p＜0.05；↑借助于Mann-Whitney U-檢驗(yàn)與對照組比較p＜0.05。
手術(shù)后二組胰高血糖素水平都降低了，雖然發(fā)現(xiàn)最大的降低(％)是在胰島素組(p＜0.01，與對照組比較)。在胰島素組皮質(zhì)醇水平手術(shù)后降低了(p＜0.05，與手術(shù)前比較)，而在對照組此水平傾向于升高(p=0.1)。因此，與對照組相比較，胰島素組手術(shù)后皮質(zhì)醇的水平顯著地較低(p＜0.05)。
在胰島素組和對照組之間，術(shù)前箝制期內(nèi)的葡萄糖輸注速度(GIRs)沒有顯著差異。與術(shù)前箝制期相比較，對照組在術(shù)后箝制期為了保持正常血糖所需要的平均GIR降低了(-39±5％,p＜0.05)。相比之下，胰島素組在手術(shù)期間GIR保持不變，甚至在術(shù)后箝制期平均GIR有升高的趨勢(+16±20％,p=0.2)。最重要，并且出乎預(yù)料的是，與對照組相比較，胰島素組術(shù)后箝制期內(nèi)平均GIR顯著地較高(p＜0.05)(見圖1)。在術(shù)前箝制期和術(shù)后箝制期，所有的GIR改變都具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p＜0.05)，不管在穩(wěn)定狀態(tài)期間是否對GIR校正了其平均血清胰島素水平。
手術(shù)前二組間葡萄糖和脂肪的氧化速度相似。在胰島素組，手術(shù)期間葡萄糖氧化速度顯著地較高，而脂肪氧化速度顯著地較低(p＜0.05，與對照組相比較)。與術(shù)前箝制期相比較，在胰島素組術(shù)后箝制期，未能發(fā)現(xiàn)底物氧化速度有任何改變。二組間在手術(shù)期間或手術(shù)后，靜止態(tài)能量消耗(EE)沒有差異，并且當(dāng)與術(shù)前箝制期相比較，二組在手術(shù)后都仍然相同。
在胰島素組和對照組之間，禁食下的葡萄糖水平相類似。在胰島素輸注期間的穩(wěn)定狀態(tài)下，維持了正常血糖，引起的個體內(nèi)葡萄糖平均變異率在對照組為4.6％，在胰島素組為6.2％。
這些發(fā)現(xiàn)肯定地證明，在禁食狀態(tài)下經(jīng)受非急需性外科手術(shù)的病人，手術(shù)后將產(chǎn)生胰島素抗性，并增加了脂肪氧化作用。而且，這些發(fā)現(xiàn)還首次證明，如果病人在提高胰島素水平的情況下進(jìn)入手術(shù)應(yīng)激狀態(tài)，并在整個手術(shù)過程中維持這種高水平，則手術(shù)后的分解代謝改變可以完全消除，對應(yīng)激狀態(tài)的激素反應(yīng)也可徹底衰減。
權(quán)利要求
1．一種減弱外科手術(shù)后分解代謝改變和胰島素抗性的方法，包括在需要時對病人給予選自如下的化合物GLP-1,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，以及其藥劑學(xué)允許的鹽。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的化合物是靜脈內(nèi)給藥。
3．權(quán)利要求1的方法，其中的化合物是皮下給藥。
4．權(quán)利要求2或3的方法，其中是給藥連續(xù)的。
5．權(quán)利要求4的方法，其中該化合物的給藥速度是0.25～6pmol/kg/min。
6．權(quán)利要求5的方法，其中該化合物的給藥速度是0.5-2.4pmol/kg/min。
7．權(quán)利要求5的方法，其中所述的速度為大約0.5～1.2pmol/kg/min。
8．權(quán)利要求2的方法，其中的靜脈內(nèi)給藥是間斷性的。
9．權(quán)利要求2的方法，其中的化合物可被靜脈內(nèi)給藥，并且也可通過另一種非經(jīng)腸道的途徑給藥。
10．權(quán)利要求9的方法，其中的其它非經(jīng)腸道途徑是皮下途徑。
11．權(quán)利要求1的方法，其中被給予的化合物是GLP(7-36)酰胺，或者其藥劑學(xué)允許的鹽。
12．一種減弱外科手術(shù)后分解代謝改變和對應(yīng)激狀態(tài)激素反應(yīng)的方法，包括需要時對病人給予一種通過與某種或幾種受體相互作用而發(fā)揮促胰島素活性的化合物，GLP-1,GLP-1類似物和GLP-1衍生物可通過與這種受體相互作用而發(fā)揮它們的促胰島素活性。
13．一種減弱外科手術(shù)后分解代謝改變和對應(yīng)激狀態(tài)激素反應(yīng)的方法，包括給予一種通過與某種或幾種受體相互作用而增強(qiáng)胰島素敏感性的化合物，GLP-1,GLP-1類似物和GLP-1衍生物可通過與這種受體相互作用而增強(qiáng)胰島素敏感性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種減弱外科手術(shù)后分解代謝改變和對應(yīng)激狀態(tài)激素反應(yīng)的方法?？赏ㄟ^以能使血糖正?；挠行┝拷o予GLP－1,GLP－1類似物,或GLP－1衍生物。
文檔編號A61K38/26GK1235611SQ97199222
公開日1999年11月17日 申請日期1997年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月30日
發(fā)明者S·埃芬迪 申請人:伊萊利利公司