專利名稱：甲魚四聯(lián)疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于防治甲魚白板病、紅腫病、赤斑病和癤瘡病四種疾病的疫苗及制備方法。
由于甲魚具有滋陰補腎、強身健體、延年益壽之功效，甲魚養(yǎng)殖業(yè)愈來愈發(fā)達，正逐漸向高密度、集約化精養(yǎng)的方向發(fā)展，區(qū)域性的流通也大大加強，導致甲魚的病害亦愈來愈多，嚴重地制約了甲魚的生產(chǎn)。到目前為止，甲魚的病害以紅腫、赤斑、癤瘡、腐皮、白板、紅底板、白斑等傳染性疾病危害嚴重，其中又以紅腫、赤斑、白板、癤瘡四種病毒的傳染性最強，發(fā)病率和死亡率最高，造成的損失最大。特別是白板病，損失可高達97％。近幾年來國產(chǎn)、進口的藥物對它均無明顯療效，只能通過免疫途徑進行預防，而這種疫苗在國內(nèi)是空白，這種病毒已嚴重威脅了甲魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展前景。而赤斑病、紅腫病、癤瘡病雖有一定的藥物可以防治，但都存在著操作不便，成本較高且效果不理想的缺點。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低廉，操作方便，可有效地防治甲魚白板、赤斑、紅腫、癤瘡四種疾病，提高甲魚免疫力的四聯(lián)疫苗及其制備方法。
本發(fā)明的目的是通過下面的技術(shù)方案來實現(xiàn)的其四聯(lián)疫苗由嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、點狀氣單胞菌和鮑愛德華氏菌按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例再加入適量雙抗和防腐劑組成。制備方法是從患白板病的甲魚肝臟和血液中分離出病原菌；從患赤斑病的甲魚脾、肺、卵中分離出嗜水氣單胞菌；從患紅腫病的甲魚肌肉、血、心臟中分離出豚鼠氣單胞菌；從患癤瘡病的甲魚病肚容物中分離出點狀氣單胞菌；將上述四種菌分別以1～2×109/只的濃度注入健康幼甲魚體內(nèi)，后再從發(fā)病甲魚體內(nèi)分離出上述四種菌分別接種在普通瓊脂營養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基中進行純化，然后在25°～35°條件下取單個菌落進行擴大培養(yǎng)，當達到一定濃度后用微生物方法計數(shù)，使每毫升含菌1～2×109；再將這四種菌放入32℃和熱水中滅活72小時，將滅活后的菌置于高速離心機中用10000轉(zhuǎn)/分的速度離心濃縮3分鐘，然后按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例混合。
本發(fā)明填補了國內(nèi)防治甲魚四類疾病尤其是防治甲魚白板病方面的空白，能對甲魚白板、赤斑、紅腫、癤瘡四類疾病聯(lián)合防治，效果顯著，操作方便，易于實現(xiàn)，無任何副作用，可給甲魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
下面詳述本發(fā)明的具體步驟和過程。
①提取菌種首先從患白板病的甲魚肝臟和血液中分離出鮑愛德華氏菌(甲魚白板病病原菌)；從患赤斑病的甲魚脾、肺、卵中分離出嗜水氣單胞菌(甲魚赤斑病病原菌)；從患紅腫病的甲魚肌肉、血、心臟中分離出豚鼠氣單胞菌(甲魚紅腫病病原菌)；從患癤瘡病甲魚肚內(nèi)容物中分離出點狀氣單胞菌(甲魚癤瘡病病原菌)。其分離方法為將病甲魚上述部位的臟器或病灶部分從甲魚體內(nèi)取出，放入攪拌機內(nèi)打碎，再置于離心機中以10000轉(zhuǎn)/分的速度離心5～10分鐘，然后取上清液接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時，取典型菌落作為毒種。
②攻毒將上述方法取出的四種菌分別以1～2×109/只的濃度通過腹注接種于健康的幼甲魚體內(nèi)，以驗證其毒力和致病性。
③取材按上述提取菌種方法從具有典型發(fā)病癥狀的甲魚體內(nèi)分離出四種病原菌；④純化再將上述四種病原菌分別接種在普通瓊脂營養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基中；⑤擴大培養(yǎng)取單個菌落在25℃～30℃的條件下培養(yǎng)48～72小時；⑥計數(shù)當達到一定濃度之后用微生物的方法進行活菌計算，使每毫升溶液含相應的菌1～2×109個；⑦滅活再分別將上述四種菌放于32℃的熱水浴中72小時；⑧合成將滅活后的菌置于高速離心機中用10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心濃縮3分鐘，然后將這四種菌按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例混合，使每毫升溶液中含愛德華氏菌約3×109個；含嗜水氣單胞菌約2×109個；含豚鼠氣單胞菌約1.5×109個；含點狀氣單胞菌約2.5×109個。然后向溶液中加入雙抗(即青霉素，鏈霉素各適量)和防腐劑—福爾馬林適量；最后添加適當?shù)淖袅稀狿HA。這樣就基本上完成了甲魚四聯(lián)疫苗的制備過程。該過程完成以后還要進行分裝(每100ml一小瓶)和抽樣檢驗。
⑨檢驗檢驗包括無菌檢驗、安全檢驗和免疫效果檢驗、無菌檢驗是抽取樣本接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在25～28℃的條件下培養(yǎng)48小時，觀察是否形成菌落。若形成菌落則說明疫菌含菌，必須重新滅活。安全檢驗是用免疫量5倍的劑量去接種健康甲魚，觀察有無異樣，必須做到100％安全才能使用。免疫效果檢驗是在給健康甲魚接種疫苗二周后進行攻毒(每只攻毒MD50菌數(shù))，觀察免疫保護率，結(jié)果表明，甲魚四聯(lián)疫苗對四種病的免疫保護率均在80％以上。無論是稚鱉、幼鱉、成鱉、親鱉，甲魚四聯(lián)疫苗都可以拌飼口服，無任何副作用，且效果不受影響。因此，操作十分方便。對于30g以上的甲魚也可以通過肌注/腹注進行免疫，這樣操作用量較均，避免浪費?？诜椒槿煲粋€療程，稚、幼鱉第一天用量為100ml/kg飼料，第二、三天減半。成鱉、親鱉第一天用量為150ml/kg飼料，第二天為100ml/kg飼料，第三天為50ml/kg飼料。注射一次見效，注射劑量為幼鱉0.3～0.5ml/只；親鱉每公斤體重注射2ml。
權(quán)利要求
1.一種甲魚四聯(lián)疫苗，其特征在于它是由嗜水氣單胞菌(甲魚赤斑病病原菌)，豚鼠氣單胞菌(甲魚紅腫病病原菌)，點狀氣單胞菌(甲魚癤瘡病病原菌)鮑愛德華氏菌(甲魚白板病病原菌)按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例，再加入適量雙抗和防腐劑組成。
2.一種甲魚四聯(lián)疫苗的制備方法，其特征在于本發(fā)明由下列步驟組成1>提取菌種從患白板病的甲魚肝臟和血液中分離出病原菌；從患赤斑病的甲魚脾、肺、卵中分離出嗜水氣單胞菌；從患紅腫病的甲魚肌肉、血、心臟中分離出豚鼠氣單胞菌；從患癤瘡病的甲魚病肚容物中分離出點狀氣單胞菌；2>攻毒將上述四種菌分別以1～2×109/只的濃度接種于健康幼甲魚體內(nèi)；3>取材從發(fā)病的甲魚體內(nèi)按上述提取菌種的方法分離出上述四種菌；4>純化將上述四種菌分別接種在普通瓊脂營養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基內(nèi)；5>擴大培養(yǎng)取單個菌落在25°～30°條件下培養(yǎng)48-72小時；6>計數(shù)用微生物方法進行活菌計數(shù)，使每毫升含菌1～2×109個；7>滅活將四種菌放入32℃的熱水中72小時；8>合成將滅活后的菌置于高速離心機中用10000轉(zhuǎn)/分的速度離心濃縮3分鐘，然后按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例混合。9>檢驗進行無菌檢驗、安全檢驗和免疫效果檢驗。
全文摘要
一種甲魚四聯(lián)疫苗,其特征在于它是由嗜水氣單胞菌(甲魚赤斑病病原菌),豚鼠氣單胞菌(甲魚紅腫病病原菌),點狀氣單胞菌(甲魚癤瘡病病原菌)鮰愛德華氏菌(甲魚白板病病原菌)按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例,再加入適量雙抗和防腐劑組成。其制備方法由提取菌種,攻毒,取材,純化,擴大培養(yǎng),計數(shù),滅活,合成,檢驗九個步驟組成。本發(fā)明成本低廉,操作方便,可有效地防止甲魚白板、赤斑、紅腫、癤瘡四類疾病,提高甲魚免疫力。
文檔編號A61K35/74GK1188673SQ97107929
公開日1998年7月29日 申請日期1997年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月22日
發(fā)明者王卯光 申請人:王卯光