專利名稱：1α,24二羥基維生素D的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有生物活性的維生素D2化合物。具體地說，本發(fā)明涉及具有激素活性的天然代謝物1α，24二羥維生素D2及其制備方法。本發(fā)明還涉及含有效藥用量的1α，24二羥維生素D2藥用組合物，以及通過應(yīng)用有效量的上述藥用組合物來控制鈣代謝失常的方法。
已經(jīng)知道，維生素D及其活性代謝物在調(diào)節(jié)動物和人體內(nèi)鈣代謝方面起著重要作用。在動物和人體中維生素D的天然形式是維生素D3。已經(jīng)清楚，在動物(包括人體內(nèi))，維生素D3在肝臟中經(jīng)C25位羥基化而被活化，然后又在腎臟中經(jīng)1α-羥基化作用產(chǎn)生激素1α，25-二羥維生素D3[“1，25-(OH)2Da”]，參見美國專利3,880,894。維生素D3代謝物，即25-OH維生素D3和1，25-(OH)2D3的主要生理性分解代謝途徑是由C24-氧化作用引發(fā)的(Holick，M.F.，kleiner-Bossalli-er，A.，Schnoes，H.k.，Kasten，P.M.，Boyle，I.T.，and DeLuca，H.F.，J.Biol.Chem.，248，6691—6696，1973)。
維生素D2是在植物中發(fā)現(xiàn)的維生素D的主要天然形式。維生素D2在結(jié)構(gòu)上與維生素D3的區(qū)別在于前者的C24上有一個甲基并且在C22和C23之間有一個雙鍵。
在發(fā)現(xiàn)維生素D2和D3后不久，它們似顯示出即使不完全相等也是相似的生物活性?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，維生素D2有著與維生素D3一樣的代謝作用(即活化和分解代謝)[見Harrison’sPrinciples of Internal MedicinePart Seven，“Disorders of Bone andMineral MetabolismChap.35，”in E.Braunwald，K.J.Isselbacher，R.G.Petersdorf，J.D.Wilson，J.B.Martin and H.S.Fauci(eds.)，Calcium，Phosphorus and Bone MetabolismCalcium Regu-lating Hormones，McGraw-Hill，New York，pp.1860—1865.]。從這一點上講，認(rèn)為維生素D2的活性形式是1α，25-二羥維生素D2[“1，25-(OH)2D2”]。而且，從已知的25-羥維生素D2和1，25(OH)2D2的24-羥基衍生物，即24，25-二羥維生素D2及1α，24，25-三羥維生素D2是已知的表明維生素D2的分解代謝和維生素D3一樣，是通過相同的C24氧化步驟進行的(Jones，G.，Rosenthal，D.，Segev，D.，Mazur，Y.，F(xiàn)rolow，F(xiàn).，Halfon，Y.，Robinavich，D.and Shakked，Z.，Bio-chemistry，181094-1101，1979)。
近來發(fā)現(xiàn)一種維生系D2的活性同類物，即1α-羥維生素D2[“1α-(OH)D2”]，它的藥理學(xué)特性明顯不同于其維生素D3對應(yīng)物1α-羥維生素D3[“1α-(OH)D3”]。共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請07/569,412揭示，給骨質(zhì)疏松病人服用2.0μg/天或更大劑量的1α-(OH)D2，可逆轉(zhuǎn)病人的骨質(zhì)喪失。因為毒性問題，不可能安全地應(yīng)用2.0μg/day或更高劑量水平的1α-(OH)D3。
這-顯著的藥物學(xué)特性可通過本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)予以解釋，即應(yīng)用于人體的藥用劑量的1α-(OH)D2部分地代謝為具有生物活性的1α，24-二羥維生素D2[“1α，24-(OH)2D2”]。正如在下文更詳述的那樣，1-羥基化維生素D2分子的C24位羥化作用代表了一種為維生素D2分子所特有的活化途徑。
在已可以用化學(xué)方法合成1α，24-二羥維生素D3[“1α，24-(OH)2D3”](US，4,022,891)時，并未發(fā)現(xiàn)它在生物體系中系天然化合物，而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)1α，24-(OH)2D2顯示出了明顯不同于1α，24-(OH)2D3的生物活性。例如，Ishizuka等人發(fā)現(xiàn)1α，24-(OH)2D3與1，25-(OH)2D3受體位點的結(jié)合比1，25-(OH)2D3與自身受體的結(jié)合更為緊密(Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.and Hashimoto，Y.，Steroids，371，33—42，1981；Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.and Hashimo-to，Y.Steroids，391，53—62，1982)。應(yīng)用類似的試驗，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)1α，24-(OH)2D2對1，25(OH)2D3受體位點的結(jié)合比1，25-(OH)2D3對上述受體位點的結(jié)合的競爭力低2倍。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)1α，24-(OH)2D2顯示出了對血液中維生素D血清結(jié)合蛋白的相對弱的親和力。這是低毒性的很短的半衰期征兆的證據(jù)。
本發(fā)明人證實了在服用1α-(OH)D2的人體內(nèi)有循環(huán)性1α，24-(OH)2D2存在。這表明在動物和人體中，維生素D2自然代謝成為1，25-(OH)2D2和1α，24-(OH)2D2。兩種維生素D2激素的相對比根據(jù)出現(xiàn)在C24途徑中的前體和前體的含量不同而變化。因此可以說，當(dāng)1α-(OH)D2的劑量增加時，1α，24-(OH)2D2對1，25-(OH)2D2的比值也增大。
下文更加詳細(xì)述及的有關(guān)結(jié)果表明，1α，24-(OH)2D2具有高生物活性和低毒性的優(yōu)良特性。在施用藥用劑量的1α-(OH)D2后，1α，24-(OH)2D2即成為一種有重要作用的代謝物這一事實說明1α，24-(OH)2D2可以介導(dǎo)1α-(OH)D2令人滿意的藥物學(xué)作用，并可作為一種有效冶療藥物，治療包括鈣代謝在內(nèi)的各種類型機能紊亂。
本發(fā)明提供了合成的1α，24-(OH)2D2，它是維生素D2的生物活性形式。該激素也可稱作1α，24-二羥麥角骨化醇，并可以用下文給出的結(jié)構(gòu)表示。該化合物具有有效的生物活性和表現(xiàn)低毒性的快速全身清除率。
本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1α，24二羥維生素D2的新方法。它需以麥角甾醇作起始原料，生成24-羥維生素D2，然后對24-羥化合物進行1α-羥化。在這一合成過程中還產(chǎn)生新的中間產(chǎn)物。
本發(fā)明的化合物可用于治療以維生素D缺乏為特征的各種疾病和各種骨消耗性紊亂，尤其是在治療中無伴發(fā)高血鈣或高尿鈣。本發(fā)明的化合物有利于用作治療維生素D缺乏性疾病的藥用組合物中的活性成分，以逆轉(zhuǎn)或防止有繼續(xù)發(fā)生骨質(zhì)喪失趨向病人的骨質(zhì)或骨無機物成分的喪失，穩(wěn)定腎病性骨營養(yǎng)不良患者的骨質(zhì)密度。
本發(fā)明的化合物還可作治療某些皮膚疾病的局部用制劑。它益于作為局部用組合物中的活性成分，該外用組合物還可以包括其它能改善皮膚功能系亂的藥劑。
根據(jù)下文詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，并結(jié)合相應(yīng)的圖表，可以了解本發(fā)明的其它優(yōu)點，特定適用性的更全面評價，組分的變化及理化特性。
本發(fā)明將在下文結(jié)合附圖進行描述，其中相同的符號全部表示相同的元素，并且

圖1表示24-羥維生素D2合成的制備步驟。
圖2表示以24-羥維生素D2開始合成1α，24二羥維生素D2的制備步驟。
本發(fā)明提供了合成的1α，24-二羥維生素D2[1α，24-(OH)2D2]。
這時，術(shù)語“生物活性”(“biological activity”“biologicallyactive”“bioactive”或“biopotent”)是指化合物的如下生物化學(xué)性質(zhì)對代謝的影響，如影響血清鈣濃度；或與相應(yīng)受體蛋白結(jié)合，如與維生素D受體蛋白結(jié)合。
一方面，本發(fā)明包括有如下通式I的生物活性化合物 另一方面，本發(fā)明包括通式I化合物的制備。1α，24-二羥維生素D2的合成是根據(jù)示于圖1和圖2中的圖解完成的。如圖1所示，1α，24-二羥維生素D2的合成是用麥角甾醇作起始原料。用六步法將麥角甾醇轉(zhuǎn)變成24-羥麥角甾醇(5，7，22麥角甾三烯-3β，24-二醇(7))。然后應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)中已知生產(chǎn)24-羥維生素D2的方法對24-羥麥角甾醇進行輻照和熱轉(zhuǎn)變。如圖2所示，用類似于Paaren描述的方法(Paaren，et al.，J.Org.Chem.，Vol.45，p.3253，1980)，于六步法中對2，24-羥維生素D2進行羥化，生成1α，24-二羥維生素D2。
具體地說，將麥角甾醇乙?；?β-乙酸酯(2)。后者與三唑啉二酮反應(yīng)生成帶有麥角甾結(jié)構(gòu)中B環(huán)的加合物(3)。加合物(3)經(jīng)臭氧化作用截短測鏈生成C-21醛(4)。所得醛和適當(dāng)?shù)耐衔锓磻?yīng)重建側(cè)鏈生成24-烯酮(5)。然后烯酮被轉(zhuǎn)變?yōu)?4-甲基，3β，24-二羥加合物(6)。該加合物與氫化鋁鋰反應(yīng)將加合物去保護基，生成24-羥麥角甾醇(7)。24-羥麥角甾醇經(jīng)輻照和熱處理生成24-羥維生素D2。將24-羥維生素D2甲苯磺?；?4-羥維生素D2的3β-甲苯磺酰酯，經(jīng)溶劑分解作用甲苯磺酰酯被置換生成6-甲氧基-24-羥-3，5-環(huán)維生素D2。環(huán)維生素D2經(jīng)過烯丙基氧化生成1α，24-二羥環(huán)維生素衍生物。該衍生物接著進行溶劑分解作用和狄爾斯—阿德耳(Diels-Alder)反應(yīng)，去掉6-甲氧基，并使1α，24二羥維生素D2(5，6順式)和5，6反式1α，24二羥維生素D2分離。
本發(fā)明化合物可適用于各種臨床和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且特別適用于治療鈣和磷代謝失常。具體地說，通式I的化合物可應(yīng)用在如刺激成骨細(xì)胞的活性，用血清中骨鈣水平來檢測。骨鈣(Osteocalcin)是骨基質(zhì)中的主要蛋白質(zhì)，通式I的化合物與維生素D血清結(jié)合蛋白之間的結(jié)合比1，25-(OH)2D3與上述結(jié)合蛋白的結(jié)合要弱，這表明通式I化合物的快速清除率和低毒性，由此增強了其藥理特性。
另一方面，本發(fā)明提供了一種諸如治療由肝衰、腎衰或胃腸衰竭等原因引起的鈣代謝失常之類的調(diào)控鈣代謝的方法。通式I的化合物可用于預(yù)防或治療維生素D缺乏性疾病及相關(guān)疾病，例如，腎病性骨營養(yǎng)不良、脂肪痢、抗驚厥性骨軟化、低磷酸鹽血癥性維生素D抗性佝僂病、骨質(zhì)疏松癥，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、類固醇誘發(fā)性骨質(zhì)疏松，以及以骨質(zhì)喪失為特征的其它疾病，假性維生素缺乏性(即維生素依賴性)佝僂病、營養(yǎng)性和吸收障礙性佝僂病、繼發(fā)于甲狀旁腺機能減退、術(shù)后甲狀旁腺機能減退，特發(fā)性甲狀腺機能減退、假性甲狀旁腺機能減退的骨軟化和骨質(zhì)減少以及酒精中毒。
1α，24二羥維生素D2在治療諸如牛皮癬、濕疹、缺乏適當(dāng)皮膚硬度、皮膚水合以及皮脂分泌等皮膚過分增生疾患中也很有價值。
與已知的維生素D3的活性形式的同類物相比，通式I的化合物作為治療鈣代謝失調(diào)性疾病之藥用組合物中的活性成分，可減小副作用，并具有低毒性。這些藥用組合物構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
根據(jù)藥劑學(xué)常規(guī)方法加工本發(fā)明的藥理活性化合物，生產(chǎn)供哺乳動物(包括人類)患者施用的藥劑。例如，通式I的化合物可與常規(guī)性賦形劑混合，例如適用腸用(如口服)、腸外用或外部用而不與藥用活性成分起毒性反應(yīng)的藥用載體。
適宜的藥用載體包括(但不限于)水、鹽溶液、醇類、阿拉伯膠、植物油(例如杏仁油、玉米油、棉籽油、花生油、橄欖油、椰子油)、礦物油、魚肝油、油脂(如多乙氧基醚)、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、脂肪酸單甘油酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
如果需要的話，藥用制劑可進行消毒，并與下列輔劑混合潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或一種或多種其它活性成分，例如維生素D3及其1α-羥化代謝物、共軛雌激素或其等同物、抗雌激素、降鈣素、二膦酸鹽、鈣添加劑、維生素B12、百日咳毒素和硼。
特別適合于腸道外給藥的劑型有可注射消毒液，最好是油劑或水溶液，以及懸浮液、乳劑或植入物，包括栓劑。適于腸道外給藥的途徑包括皮下注射，肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，鼻咽或粘膜吸收，或經(jīng)皮吸收。安瓿是最方便的單位劑量。
特別適用腸內(nèi)應(yīng)用的劑型是片劑、糖衣丸、水劑、滴劑、栓劑、錠劑、粉劑或膠囊。如果需要甜味劑的話，可以制成糖漿、酏劑或類似物。
適于局部用藥的形式可以是非噴霧性粘稠狀、半固體狀或固體狀，它包括一種與局部應(yīng)用相容的載體，最好大于水的動態(tài)粘度，例如礦物油、杏仁油、自乳化蜂蠟、植物油、白色軟石蠟和丙二醇。適合的配方包括(但不限于)霜劑、油膏、洗劑、溶液劑、懸浮液、乳劑、粉劑、擦劑、軟膏、氣溶膠、透皮斑片等等，如果需要的話，上述外部用藥可進行消毒并與下列輔劑混合防腐劑、穩(wěn)定劑、去乳化劑、濕潤劑等。根據(jù)本發(fā)明，適合的霜劑制劑包括諸如水、杏仁油、礦物油和自乳化蜂蠟的混合物；適宜的油膏制劑包括例如杏仁油和白色軟石蠟；適宜的洗劑制劑包括如無水亞丙基二醇。
用于治療皮膚疾患的本發(fā)明化合物的外部用制劑可以含有如類視色素一類的上皮形成誘導(dǎo)劑(例如，維生素A)、維生素E這類色原烷醇、異丙基腎上腺素，或環(huán)腺苷單磷酸酯(cAMP)這類β-興奮劑，皮質(zhì)甾類(例如氫化可的松或其乙酸酯、或地塞米松)這類抗炎劑、煤焦油或蒽林這類角質(zhì)塑化劑。上述成分的有效量，如維生素A為組合物總重量的約0.003％至約0.3％；維生素E為約0.1％至約10％；異丙基腎上腺素為約0.1％至約2％；cAMP為約0.1％至約1％；氫化可的松為約0.25％至約5％；煤焦油為約0.1％至約20％，蒽林為約0.05％至約2％。
對于經(jīng)直腸給藥而言，可將化合物制成含有如可可油或其它三甘油酯的栓劑基質(zhì)的藥用組合物，為了延長保存期，組合物最好含有一種抗氧化劑，如，抗壞血酸、丁基化羥苯甲醚或氫醌。
本發(fā)明的藥用組合物經(jīng)口服給藥是治療鈣代謝失常的優(yōu)選途徑。一般說來，本發(fā)明的化合物是以每單位劑量的藥用載體中含約0.5μg至約25μg的單位劑量形式分散。根據(jù)本發(fā)明的化合物的劑量是約0.01～1.0μg/kg/day，優(yōu)選劑量是約0.04～0.3μg/kg/day。
對于外部治療皮膚疾患而言，本發(fā)明化合物在外部用組合物中的含量通常是每克組合物含約0.01～10μg。
應(yīng)該認(rèn)識到，在具體情況中活性化合物的實際優(yōu)選用量根據(jù)所用的具體化合物的效果，特定組合物的配方，應(yīng)用方式及被處理的部位及生物體的不同而異。例如，對某一病人的具體用量取決于病人的年齡、體重、一般健康狀況及性別、飲食情況、給藥的時間間隔及給藥方式、排泄率和藥劑是否聯(lián)用以及所治療疾患的嚴(yán)重程度。對于一指定對象的用藥劑量可通過常規(guī)考慮來確定，例如，對所用化合物與已知物質(zhì)的不同活性進行常規(guī)比較，如借助于一種常規(guī)評價藥物的規(guī)則。
更進一步，本發(fā)明的化合物也宜于用于獸醫(yī)用組合物中，例如，用于家畜的飼料組合物中治療或預(yù)防低鈣血癥。通常，本發(fā)明的化合物分散于動物飼料中，以保證所給飼料被正常消耗時能向動物提供約0.01～1.0μg/kg/day的本發(fā)明化合物。
下面的實施例僅僅是用來解釋本發(fā)明的例證，絕不是以任何方式限制本發(fā)明的其它方面。在下面的實施例中，質(zhì)子核磁(1H NMR)光譜是用連于3000型計算機的Bruker AM—400(400MHz)，以CHCl3作內(nèi)標(biāo)于CDCl3溶液中記錄的，化學(xué)位移用ppm表示。紫外光譜是用Hitachi U-2000分光光度計記錄，并用乙醇溶液作測檢。
實施例1在與1α-(OH)D2一起孵育的人肝細(xì)胞中生成，純化和鑒定1α，24-(OH)2D2基本純化的1α-(OH)D2從Bone Care International，Inc.of Madison，Wisconsin獲得。將1α-(OH)D2與用現(xiàn)有技術(shù)已知方法從人肝癌細(xì)胞衍生的Hep 3B細(xì)胞一起培養(yǎng)。
用已知的方法獲得脂類提取物，并以已烷/異丙醇/甲醇(91∶7∶2)展開在Zorbax-SIL上作高壓液相色譜(HPLC)處理。推定1α，24-(OH)2D2代謝物在親體1α-(OH)D2和標(biāo)準(zhǔn)品1，25-(OH)2D2(也得自Bone Care International，Inc.ofMadison，Wisconsin)之間洗脫出，在用質(zhì)譜分析對代謝物進行鑒定之前，用上述HPLC系統(tǒng)對1α，24-(OH)2D2進一步純化。
被純化的代謝物比初始材料1α-(OH)D2具有更大的極性，因而推測認(rèn)為是一種二羥維生素D2代謝物，這一代謝物還具有維生素D發(fā)色團，這表明代謝物保留了維生素D的順三烯結(jié)構(gòu)。因為該代謝物從1α-(0H)D2衍生而來，因而其結(jié)構(gòu)就是1α，X-(OH)2D2。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的已知方法制備1α，X-(OH)2D2的三甲基甲硅烷基衍生物，對TMS-衍生物和天然化合物進行質(zhì)譜分析。經(jīng)過氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法分析TMS-衍生物，識別主要源于對熱解代謝物片段類型的翻譯。分子離子的m/z值為644，代表二羥維生素D2外加額外質(zhì)量占216單位的三個TMS基團。因為1α-(OH)D2具有3β-和1α-基團，而且推定的代謝物有一個另外的羥基，因此，所有三個羥基都是衍生來的。在m/z值601，511，421，331所發(fā)現(xiàn)的特殊片段表示單獨片段或附加有1、2、3個TMS基固(每個90單位)的片段均失去一個43質(zhì)量單位。這一情形最可能的解釋是C24與C25鍵斷裂，占43質(zhì)量單位的C3H7喪失。這表示C26-C25-C27片段的喪失。而且，質(zhì)譜缺乏所有25-羥化維生素D化合物的m/z131片段特征。
質(zhì)譜還顯示了m/z513片段表明因A環(huán)斷裂伴隨C2-C3-C4喪失而使131質(zhì)量單位喪失，這也是維生維D化合物的特征。質(zhì)譜還含有m/z143，它可能衍生于C24與C23的斷裂及一個甲基的丟失。表示C24-C25鍵脆性的43單位的不尋常喪失和因C23-C24斷裂所致的片段喪失表明，在1α，X-(OH)2D2中的額外羥基是在C24上。因此，該結(jié)構(gòu)鑒定為1α，24-(OH)2D2。
通過直接探測質(zhì)譜對天然代謝物進行分析。這一分析結(jié)果與24位上有一羥基的結(jié)論是一致的，也與上文描述的對TMS-衍生物進行的氣相色譜-質(zhì)譜法分析結(jié)果一致。天然代謝物顯示出在m/z428的被預(yù)料的分子離子和在m/z367的一個特殊片段，這表明喪失了一個水分子和43質(zhì)量單位的C25-C26-C27片段。
實施例21α，24二羥維生素D2的合成乙酸(22E)-5，7，22-麥角甾三烯-3β-基酯(2)向含有50mg(0.13mol)麥角甾醇(1)的300ml無水吡啶溶液中加入33.3ml(0.35mol)乙酸酐，混合物于室溫下攪拌過夜，再加入600ml水。將沉淀物濾掉，并用每份200ml乙腈洗三次，然后于空氣中干燥，生成42.0g(74％)(2)乙酸22-氧代-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)23，24-二降膽甾-6-烯-3β-基酯。
向含有33.0g(0.075mol)乙酸麥角甾醇酯(2)的1000ml氯仿溶液中加入13.2g(0.075mol)4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5二酮。所得(3)溶液于室溫下攪拌30分鐘，然后加入5ml吡啶。該溶液冷卻至-78℃，并于該溫度下用臭氧——氧混合物處理2小時，然后用氮徹底凈化。繼而加入50ml二甲硫醚，用300ml水洗混合物，再用200ml 2N HCl洗二次，最后用300ml水洗一次。有機層被分離出來，用無水硫酸鎂干燥，并于真空中濃縮至干燥。殘留物用硅膠柱(用己烷30％乙酸乙酯洗脫)提純生成泡沫固態(tài)的標(biāo)題化合物16.0g(39％)。
1H NMR(400MHz；CDCl3)δppm 0.85(3H，s，18-CH3)，1.10(3H，s，19-CH3)，1.15(3H，d，21-CH3)，1.99(3H，s，3β-CH3CO)，5.45(1H，m，3α-H)，6.26(1H，d，7-H)，6.40(1H，d，6-H)，7.42(5H，m，ph)，9.58(1H，d，HCO)。乙酸(22E)5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)6.22-膽甾二烯-24酮-3β基酯(5)將1.6M丁基鋰溶液(含己烷8.94ml，0.014mol)加入到在通氮氣情況下經(jīng)攪拌和冷卻至0℃的含1.45g(0.014mol)二異丙胺的20ml無水四氫化呋喃溶液中。在0℃于15分鐘內(nèi)將含1.23g(0.014mol)3-甲基丁烷-2-酮的6ml無水四氫化呋喃滴加到溶液中。所得溶液于0℃攪拌1小時以上，然后冷卻至-70℃，并加入含6.0g(0.011mol)醛(4)的60ml無水四氫化呋喃溶液。將溫度升至-20℃，并持續(xù)3小時，然后于-20℃下加入20ml冰乙酸，再將溶液放置于室溫。加入800ml乙醚和400ml水，有機層分離開來，并用10％HCl(2×300ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(2×300ml)和水(2×300ml)洗滌。濃縮得粗產(chǎn)物7.5g將其溶解于含有1.5N HCl(12ml)的100ml四氫化呋喃中?；亓?.5小時后，用600ml乙醚稀釋混合物，并用5％碳酸鈉溶液(2×200ml)和水(2×200ml)洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。在減壓條件下濃縮得粗產(chǎn)品(7.0g)。經(jīng)硅膠(己烷50％乙酸乙酯洗脫)層析得到烯酮(5)4.0g(59％)。
1H NMR(400MHz)δppm 0.83(3H，s，18-CH3)，0.99(3H，s，19-CH3)，1.09(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.12(3H，d，21-CH3)，2.0(3H，s，3β-CH3CO)，2.84(1H，m，25-H)，5.45(1H，m，3α-H)，6.06(1H，d，23-H)，6.24(1H，d，7-H)，6.39(1H，d，6-H)，6.71(1H，dd，22-H)，7.42(5H，m，ph)。(22E)-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)-6，22-麥角甾二烯-3β，24-二醇(6)含3.5g(5.7mmol)烯酮的無水乙醚100ml被冷卻至0℃，然后向其中滴加3.0M的溴化甲基鎂溶液(含6.8ml乙醚，0.02mol)。上述溶液置0℃1小時后，再向其中加入100ml飽和氯化銨。有機層被分離開來，用乙醚(2×200ml)抽提水層，乙醚相結(jié)合在一起經(jīng)無水硫酸鎂干燥，并于真空中濃縮至干燥，生成3.0g(90％)(6)的粗產(chǎn)品。
(22E)-5，7，22-麥角甾三烯-3β，24-二醇(7)向含3.0g(5.1mmol)(6)的250ul無水四氫呋喃中加入3.6g(0.09mol)氫化鋰鋁?；旌衔锘亓骷訜?小時后，用冰水浴冷卻，反應(yīng)混合物經(jīng)小心滴加5ml冰水而分解。將混合物過濾，所得過濾物于真空中濃縮以去掉絕大部分四氫呋喃。殘留物溶解于200ml乙酸乙酯中，用飽和NaCl溶液洗二次(2×200ml)，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，于真空中濃縮。殘留物用硅膠柱(用己烷30％乙酸乙酯洗脫)純化，產(chǎn)生1.5g(71％)的(7)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.64(3H，s，18-H)，0.88(6H，dd，26 and 27-CH3)，0.93(3H，s，19-CH3)，1.06(3H，d，21-CH3)，1.19(3H，s，28-CH3)，3.55(1H，m，3α-H)，5.36(1H，d，7-H)，5.42(2H，m，22 and 23-H)，5.52(1H，d，6-H).UV(乙醇)λmax282nm。
24-羥維生素D2(8)
1g(2.4mmol)(7)溶解于250ml乙醚和苯(4∶1)中，在用Hanovia中壓紫外燈光照2小時的同時，通氮氣于水冷式石英浸沒井中攪拌混合物。溶液于真空中濃縮，再重新溶解于100ml乙醇溶液中，并加熱回流過夜。溶液再于真空中濃縮至干燥，殘留物用硅膠柱(用己烷30％乙酸乙酯洗脫)純化，生成0.55g(55％)的(8)。
1H NMR(400MHz)，CDCl3)δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.92(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.06(3H，d，21-CH3)，1.20(3H，s，28-CH3)，3.93(1H，m，3-H)，4.79(1H，m尖峰，19-H)，5.01(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.43(2H，m，22 and 23-H)，6.02(1H，d，7-H)，6.22(1H，d，6-H).UV(乙醇)λmax265nm。
24-羥維生素D2甲苯磺酸酯(9)向溶解有0.55g(1.3mmol)(8)的5ml無水比啶溶液中加入0.6g(3.2mmol)甲苯磺酰氯?；旌衔镌谕ǖ獨鈼l件下于5℃攪拌20小時。然后反應(yīng)混合物倒入100ml冷的飽和NaHCO3溶液中，用乙醚抽提三次(3×100ml)。結(jié)合有機抽提物，用5％HCl溶液(2×200ml)、飽和NaHCO3溶液(2×200ml)和飽和NaCl溶液(2×200ml)各洗二次，再經(jīng)無水MgSO4干燥，并于真空濃縮，生成0.62g(84％)的(9)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.92(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.08(3H，d，21-CH3)，1，24(3H，s，28-CH3)，2..43(3H，s，CH3(甲苯磺酸酯))，4.69(1H，m，3-H)，4.77(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.0(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.42(2H，m，22 and23-H)，6.03(1-H，d，7-H)，6.25(1-H，d，6-H)7.31 and 7.83(4H，d，芳烴)。
24-羥-3，5-環(huán)維生素D2(10)向溶解有0.6g(1.06mmol)(9)的50ml無水甲醇溶液中加入4.0(0.047mol)NaHCO3?；旌衔锛訜峄亓?小時。反應(yīng)混合物于真空進行濃縮。加入100ml水，接著用乙醚抽提二次(2×200ml)。結(jié)合乙醚抽提物，經(jīng)無水MgSO4干燥，再于真空中濃縮至干燥，生成油狀450mg(100％)(10)。
1α，24-二羥-3，5-環(huán)維生素D2(11)將870μl(2.61mmol)的叔丁基過氧化氫(3M甲苯溶液)在通氮條件下加入到含73mg(0.66mmol)二氧化硒的50ml無水二氯甲烷的懸浮液中。混合物在通氮條件下于室溫攪拌3小時。然后加入0.1ml無水吡啶，接著加入溶解了450mg(1.06mmol)(10)的15ml無水二氯甲烷溶液?；旌衔镌谕ǖ獥l件下于室溫攪拌10分鐘，然后加入10％NaOH溶液25ml，并用乙醚抽提混合物三次(3×100ml)。結(jié)合乙醚抽提物，用10％NaOH溶液(2×100ml)、水(2×100ml)、飽和NaCl溶液(2×100ml)各洗二次，再經(jīng)無水MgSO4干燥，并于真空濃縮至干燥，殘留物用硅膠柱(用含30％乙酸乙酯的己烷混合物洗脫)純化，生成110mg(24％)的(11)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δPPP 0.55(3H，s，18-CH3)，0.90(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.03(3H，d，21-CH3)，1.19(3H，s，28-CH3)，3.25(3H，s，-OCH3)，4.19(1H，d，6-H)，4.19(1H，m，1-H)，4.92(2H，d，7-H)，5.15(1H，m，(尖峰，19-H)，5.2(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.42(2H，m，22 and 23-H)。5，6-順式和5，6-反式-1α，24-二羥維生素D2(12，13)1α，24-二羥-3，5-環(huán)維生素D2(11)110mg(0.25mmol)溶解于2.0ml二甲亞砜和1.5ml乙酸中，并在通氮條件下于50℃加熱1小時。該溶液被傾于冰和50ml飽和NaHCO3溶液中，用乙醚抽提混合物三次(3×100ml)。結(jié)合乙醚抽提物，用飽和NaHCO3溶液(3×100ml)、水(2×100ml)、飽和NaCl溶液(2×200ml)洗，再經(jīng)無水MgSO4干燥，并于真空濃縮，生成100mg(93％)(12)和(13)的粗產(chǎn)品。
5，6-順式-1α，24-二羥維生素D2(12)向含有(12)和(13)的5ml乙酸乙酯溶液中加入20mg(0.2mmol)順式丁烯二酸if，并將混合物在通氮條件下于35℃攪拌24小時，所得溶液于真空中濃縮至干燥，殘留物用硅膠柱(以己烷50％乙酸乙酯洗脫)純化，生成20mg(22％)的(12)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.89(6H，dd，2j and 27-CH3)，1.04(3H，d，21-CH3)，1.21(3H，s，23-CH3)，4.23(1H，m，3-H)，4.40(1H，m，1-H)，5.0(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.33(1H，m，(尖峰)，19-F，5.44(2H，m，22 and 23-H)，6.01(1H，d，7-H)，6.37(1H，d，6-H).UV(乙醇)λmax265nm。
實施例3在體外增加底物濃度有利生成1α，24-(OH)2D2如上文所述，將Hep3B細(xì)胞與1α-OH-D2-起培養(yǎng)，最終濃度為1，10或100nM(實驗1)和1或10μm(實驗2)，并提取和純化1α，24-(OH)2D2。用回收放射性標(biāo)記(實驗1)或用光電二極管檢測分光光度法(實驗2)對1α，24-(OH)2D2和1，25-(OH)2D2代謝物進行定量分析。如表1所示，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r，1α，24-(OH)2D2的量相比于1，25-(OH)2D2的量有所增加。這表明，在該體系中有較高的底物濃度時，1α，24-(OH)2D2是1α-OH-D2的主要天然活性代謝物。
*N.D.表示不可檢測實施例4在施用1α-(OH)2D2的骨質(zhì)疏松婦女體內(nèi)產(chǎn)生1α，24-(OH)2D2本發(fā)明人還觀察到，在接受1α-OH-D2治療并以此作為藥物治療骨質(zhì)疏松的觀察部分的人類女性患者體內(nèi)，1α，24-(OH)2D2相對于1，25-(OH)2D2形成量也增加。在給予2μg 1α-OH-D2一次量或8μg/day的每日劑量一周后，采血并對代謝物1α，24-(OH)2D2和1，25-(OH)2D2進行分析。從血樣中抽提脂類，用標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)HPCL純化代謝物，并用Incstar(Stillwater，Minnesota)提供的放射受體試驗對代謝物定量。在給予2μg的一次劑量一天后，1α，24-(OH)2D2的量檢測不到，而1，25-(OH)2D2為約11pg/ml。相反，在給予8μg的最后一次劑量一天后，1 α，24-(OH)2D2的量平均為9pg/ml，1，25-(OH)2D2的量平均為30pg/ml。
實施例5 1α，24-(OH)2D2對維生素D受體的親和力對1α，24-(OH)2D2與哺乳動物維生素D受體(VDR)親和力評估是用商售牛胸腺VDR藥盒和得自Incstar(Stillwater，Minnesota)的標(biāo)準(zhǔn)1，25-(OH)2-D3溶液進行的。純化的1α，24-(OH)2D2經(jīng)光電二極管檢測分光光度法定量，并用放射受體試驗分析。1α，24-(OH)2D2的半最大結(jié)合量為約150pg/ml，而1α，25-(OH)2D2為80pg/ml。因此，牛胸腺VDR對1α，24-(OH)2D2的親和力比對1α，25-(OH)2D3的親和力低1/2，這表明1α。24-(OH)2D3具更有效的生物活性。
實施例6 1α，24-(OH)2D3對維生素D血清結(jié)合蛋白的親和力對1α，24-(OH)2D2與維生素D血清結(jié)合蛋白(DBP)親和力的評估是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的已知方法用維生素D缺乏小鼠血清進行的。所得數(shù)據(jù)表明，DBP與1α，24-(OH)2D2的結(jié)合至少比它與25-OH-D3的結(jié)合弱1000倍。1α，24-(OH)2D2與VDR的結(jié)合強，與DBP的結(jié)合弱說明該化合物易于被靶細(xì)胞接納，因而具有效的生物活性。此外，與DBP較弱的結(jié)合表明了一種更快的清除率，使得其毒性更低。
因此，所進行的試驗表明，新的1α，24-(OH)2D2顯示出了與眾不同的獨特活性范圍，即高生物活性和低毒性，它是明顯不同于現(xiàn)有技術(shù)已知的有關(guān)化合物。
實施例7生物學(xué)試驗。
20名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女入選公開標(biāo)記研究，所選病人年齡在55-75歲之間，由LUNAR骨密度測量儀(Lunar Corpora-tion，Madison，Wisconsin)測量顯示的L2—L3腰椎骨礦物質(zhì)密度為0.7～1.05g/cm2。
在入選本研究時，所有病人都接受了每天選用含400～600mg鈣飲食的指示。病人對這一飲食的適應(yīng)性通過每隔一周的24小時食物記錄和與每位病人的交談加以證實。
所有病人完成一周的基礎(chǔ)期、五周的治療期和一周的治療后觀察期。在治療期間，病人自行口服1α，24-二羥維生素D2，第一周的起始劑量為0.5μg/day，在接著四周中的每周中，分別以1.0，2.0，4.0和8.0μg/day不斷增加的劑量服用。所有劑量均在早餐前服用。
在整個研究中以每周為基礎(chǔ)進行血尿的化學(xué)分析。重要的血中化學(xué)分析包括空腹時血清中鈣、磷、骨鈣、肌酐和血尿素氮的水平。重要的尿中化學(xué)分析包括鈣、磷和肌酐的24小時排出量。
此項臨床研究的血尿數(shù)據(jù)表明，該化合物不對腎功能產(chǎn)生有害的影響，正如由肌酐清除率和血中尿素氮的水平所測定的；該化合物也不增加尿中羥脯氨酸的排泄，這表明它對骨質(zhì)吸收沒有任何刺激作用。該化合物對所有常規(guī)血清監(jiān)測指標(biāo)沒有任何影響，這意味著它不產(chǎn)生代謝付作用。
1α，24-二羥維生素D2對鈣自穩(wěn)態(tài)的正性作用是來自于它適度增加24小時尿鈣水平的證據(jù)，這證實該化合物增加腸道鈣吸收；其正性作用還從血清中骨鈣水平增加得到證據(jù)，這表明該化合物刺激成骨細(xì)胞。
實施例8以年齡在55～75歲之間的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松門診病人進行臨床研究。該研究涉及被隨機分為三個治療組，并連續(xù)治療24～36個月的120名病人。其中的二個治療組服用恒量的1α，24-二羥-維生素D2(u.i.d.；分別以1.0μg/day或1.0μg/day以上的兩種劑量)，另外一組配以相應(yīng)安慰劑。所有病人維持正常的飲食鈣攝入(500～800mg/day)并制止使用鈣添加劑，通過各組病人治療前后下述指標(biāo)變化的比較來評價化合物的效果(a)總的體內(nèi)鈣維持量，(b)通過雙光子吸收測定儀(DPA)或雙能X-線吸收測定儀(DEXA)確定的橈骨和脊骨礦物質(zhì)密度。通過比較尿中羥脯氨酸排泄量、血清和尿中鈣水平、肌酐清除率、血尿素氮和其它常規(guī)指標(biāo)來評價其安全性。
結(jié)果表示，用1α，24-二羥維生素D2治療的病人相對于用安慰劑治療的病人，其體內(nèi)總鈣量和橈骨、脊椎骨密度有明顯增高。監(jiān)測的安全性指標(biāo)證實，用1α，24-二羥維生素D2進行治療不會明顯產(chǎn)生高鈣血癥或高鈣尿癥，或任何其它代謝失衡。
實施例9
以年齡在55～60歲之間的絕經(jīng)后健康婦女進行臨床研究，該研究涉及被隨機分成二個治療組的80名病人，她們接受24～36個月的連續(xù)治療。一個治療組服用恒量的1α，24-二羥維生素D2(u.i.d.；1.0μg/day或大于1.0μg/day的劑量)，另外一組配以相應(yīng)安慰劑。該研究按上述實施例2所示進行。
所得結(jié)果表明，接受1α，24-二羥維生素D2治療的病人顯示出了體內(nèi)總鈣、橈骨或脊椎骨密度的喪失相對于基礎(chǔ)值減少。相反，接受安慰劑病人的上述指標(biāo)相對于基礎(chǔ)值有顯著的喪失，監(jiān)測的安全性指標(biāo)證實了長期服用上述劑量水平的1α，24-二羥維生素D2的安全性。
實施例10選擇30名患有腎性疾病且正在進行慢性血液透析的男、女性患者進行12個月的雙盲、安慰劑對照臨床試驗。所有病人都經(jīng)過8周的服用400IU/day維持劑量維生素D3的對照期。對照期之后，病人被隨機分為二個治療組一組接受恒量的1α，24-二羥維生素D2(u.i.d.，劑量大于3.0μg/day)，另一組配以相應(yīng)安慰劑。兩個治療組都接受維持劑量的維生素D3，并保證飲食中鈣的正常攝入，并制止應(yīng)用鈣添加劑。通過對兩組病人治療前后下述指標(biāo)變化的比較來評估其效果(a)腸道鈣吸收的直接測定；(b)體內(nèi)總鈣保持量；(c)撓骨和脊椎骨礦物質(zhì)密度；(d)血清鈣的檢測。安全性是通過對血清鈣的常規(guī)監(jiān)測進行評定的。
臨床數(shù)據(jù)分析表明，通過雙-同位素技術(shù)的直接測定證明了1α-24，-二羥維生素D2顯著增加腸道鈣的吸收。接受該化合物治療的病人顯示出了相對于基礎(chǔ)值而言正常的血清鈣水平、穩(wěn)定的體內(nèi)總鈣含量及穩(wěn)定的橈骨和脊椎骨骨質(zhì)密度。相反，服用安慰劑的病人表現(xiàn)出頻發(fā)的低血鈣癥，體內(nèi)總鈣含量及橈骨和脊椎骨骨質(zhì)密度的顯著降低。在治療組不產(chǎn)生明顯的高鈣血癥。
實施例11藥劑的制備局部用霜劑的制備是將1.0mg1α，24-二羥維生素D2溶解于1g杏仁油中。向該溶液中加入40mg礦物油和20mg自乳化蜂蠟。將混合物加熱液化。在加入40ml熱水后，混合物即可混均。所得霜劑每克含有約10μg的1α，24-二羥維生素D2。
實施例12油膏的制備是將1.0mglα，24-二羥維生素D2溶解于30g杏仁油中。再向該溶液中加入70mg經(jīng)加熱至液化的白色軟石蠟。將油膏混合均勻并冷卻。所制得的油膏每克含約10μg1α，24-二羥維生素D2。
實施例13將0.5g腺苷和2.0g罌粟堿溶解于最小量的二甲亞砜中，徹底混合后加入到實施例12的油膏中。其中這額外兩種成份的含量為約0.5wt％(腺苷)和2wt％(罌粟堿)。
實施例14將10,000U維生素A溶于最小量的植物油中，充分混合后加入到實施例12的油膏中。所得的油膏每克含有約100U的維生素A。
實施例15皮膚病洗劑的制備是將1.0mg1α，24-二羥維生素D2溶解于100g無水亞丙基二醇中，洗劑貯放在棕色瓶內(nèi)置于冰箱中，每克洗劑含有約10μg的1α，24-二羥維生素D2。
實施例16將0.2mg1α24-二羥維生素D2溶解于1g杏仁油中。向該溶液中加入40g礦物油和20g自乳化蜂蠟，接著再加入40ml熱水。將混合物混勻，得到的美容霜每克含約2.0μg1α，24-二羥維生素D2。
實施例17在根據(jù)實施例16制備的美容霜中加入100mg腺苷。將所得霜劑混勻，其中含有0.1wt％的腙苷。
實施例18將100μg1α，24-二羥基維生素D2溶于30g杏仁油中制備油膏。向所得溶液中加入70g經(jīng)加熱至液化的白色軟石蠟。將油膏混勻并冷卻。所得油膏每克含1.0μg1α24-二羥維生素D2。
實施例19將200U/g的維生素A溶于最小量的植物油中，充分混勻后加到實施例18的美容油膏中。
實施例20將300μg1α24-二羥維生素D2溶于100g無水亞丙基二醇中制備美容洗液。所得洗液貯于棕色瓶內(nèi)置冰箱中，每克洗液含約3.0μg1α24-二羥維生素D2。
實施例21皮膚學(xué)試驗在局部治療接觸性和異位性皮炎中評價含1α，24-二羥維生素D2組合物的治療效果。被評價的組合物是分散于凡士林-杏仁油基質(zhì)中的油膏，每克油膏含10μg1α，24-二羥維生素D2。對照組合物除了不含活性成分1α，24-二羥維生素D2外，其余成分都相同，病人在門診所接受治療，他們被教導(dǎo)每天用上述制劑二次。
油膏盡可能用于單個病變，或用于病患區(qū)域。在治療開始前對油膏及其盛器稱量，在治療結(jié)束時對沒用完的油膏再稱量。
對治療的病變區(qū)以及相當(dāng)?shù)摹皩φ铡辈∽儏^(qū)進行評價和記錄，如果需要的話，還可以拍照。“對照”病變要么選在被治療病變的附近，要么在對稱的對測部位，并最好與被治療的病變有相似的大小和發(fā)展階段。詳細(xì)記錄有關(guān)的拍照過程(如距離、光圈、角度、背景等)，以便在對病變再次拍照時能加以重復(fù)。油膏每天用二次，最好將所涂部位敞開?！皩φ铡辈∽儾贿M行治療，但如果非治不可的話，需對所行治療進行記錄。
由內(nèi)科大夫每周對紅斑、脫皮和厚度進行評估。其病患嚴(yán)重程度按0—3分級。通常在治療4～6周結(jié)束時進行最終評價，以1，24(OH)2D2治療的病變其分值低于對照病變。未觀察到明顯的高鈣血癥。
實施例22表皮細(xì)胞的分化和增殖試驗根據(jù)對Rheinwa1d和Green(Cell，6331，1975)最早描述的系統(tǒng)進行已知的改良方法來培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞。將溶解于乙醇中的1α，24-二羥維生素D2加到上述培養(yǎng)細(xì)胞中，所得一系列濃度在0.05～5μg/ml之間而乙醇的濃度不超過0.5％(V/V)。對照培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5％(V/V)的乙醇。
培養(yǎng)物中的表皮細(xì)胞的分化和增殖以下述方法檢測1、定量角化包膜；2、定量貼壁細(xì)胞的細(xì)胞密度；3、監(jiān)測轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性；或4、通過3H-胸苷摻入監(jiān)測DNA合成。
與1α，24-二羥維生素D2一起孵育的培養(yǎng)物比對照培養(yǎng)物有更多的角化包膜，較少的貼壁細(xì)胞，更高的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性和較低的DNA合成。
在對本發(fā)明進行描述和列舉一些具體實例后，本領(lǐng)域的專業(yè)人員將認(rèn)識到根據(jù)本發(fā)明的描述可作出的各種改良，包括變化、增加和省略。據(jù)此，本發(fā)明意在包括上述改良，而且，本發(fā)明的范圍僅限于與所附權(quán)利要求法律上一致的最廣泛的解釋。
權(quán)利要求
1. 1α，24-二羥基維生素D2作為制備用于治療皮膚疾病的皮膚表面抗感染藥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的藥物包含適于皮膚表面應(yīng)用的載體和所說的1，24-二羥基維生素D2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中1，24-二羥基維生素D2的量為0.01μg至10μg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的藥物進一步包含從上皮形成誘導(dǎo)劑，色原烷醇，β-促效藥，抗炎劑和角質(zhì)塑化劑中選出的一種藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有激素活性的天然代謝物-1α，24-二羥基維生素D
文檔編號A61K45/06GK1133712SQ9511818
公開日1996年10月23日 申請日期1995年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月8日
發(fā)明者C·W·畢曉普, G·瓊斯, J·C·克努森, S·施特拉格內(nèi)爾, R·M·莫里亞蒂, R·彭馬斯塔, 梁國 申請人:倫納公司