專利名稱：新型生理活性物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從內(nèi)在、外在應(yīng)激子(ストレツサ一)而導(dǎo)致活性化的組織中提取的新型活性物質(zhì)。
生物體相應(yīng)在于體內(nèi)、體外環(huán)境的變化，將生物體的物理、化學(xué)狀態(tài)調(diào)節(jié)、維持在某一穩(wěn)定的生理?xiàng)l件內(nèi)，并維持作為個(gè)體的生命。
生物體為了維持并調(diào)節(jié)這種恒常性，平常在體內(nèi)產(chǎn)生各種物質(zhì)的同時(shí)，當(dāng)病毒和細(xì)菌等侵入時(shí)或產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞時(shí)，在體內(nèi)還要一并產(chǎn)生對抗這些體內(nèi)、體外侵襲的抵抗物質(zhì)。
然而，由于某些原因破壞了這種生物體功能的平衡，一旦這種現(xiàn)象慢性化，就會(huì)發(fā)現(xiàn)作為所謂病態(tài)的各種疾病。
疾病的理想治療法，是復(fù)活并調(diào)節(jié)生物體的恒常性功能，從而將紊亂了的生物體功能的病態(tài)不平衡恢復(fù)到正常狀態(tài)。關(guān)于生物體功能的維護(hù)和正?；?，眾所周知，是通過特別是細(xì)胞表面的各種受體和鈉、鉀、鈣等的離子途徑進(jìn)行。
已知隨著年齡的增長，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中DNA的損傷修復(fù)力降低，游離基在體內(nèi)產(chǎn)生，促進(jìn)老化和膠原病以及致癌，而且骨膠原是廣泛存在于皮膚和血管、軟骨和眼球、腎臟等臟器中的非細(xì)胞物質(zhì)，隨著年齡增加，膠原質(zhì)的交聯(lián)化加重，失去彈力以致變硬。眾所周知，對于糖尿病患者來說，持續(xù)的高血糖結(jié)果，導(dǎo)致膠原質(zhì)過度交聯(lián)化的加重，特別是產(chǎn)生白內(nèi)障、動(dòng)脈粥樣性動(dòng)脈硬化、腎臟病、末梢性神經(jīng)障礙等。
本發(fā)明者們著眼于調(diào)節(jié)這種病態(tài)時(shí)和隨年齡增長產(chǎn)生的生物體細(xì)胞機(jī)能不全而導(dǎo)致的神經(jīng)系和免疫系、內(nèi)分泌系的變形，并對它進(jìn)行修復(fù)的生物體恒常性維持機(jī)構(gòu)，對生物體內(nèi)特別是對抗生物的體內(nèi)、體外應(yīng)激反應(yīng)的抵抗期，即生物體組織活化時(shí)所產(chǎn)生的物質(zhì)，為提高生物體的自然治愈力、對生物體功能的正?；鹱饔玫奈镔|(zhì)進(jìn)行了深入的研究，從而完成了本發(fā)明。
作為生物體內(nèi)復(fù)雜的功能調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)之一，已知有血管舒緩素·激肽系構(gòu)成的酶系。關(guān)于這種血漿血管舒緩素·激肽系，一般認(rèn)為是在生物體內(nèi)由于對組織的傷害和侵害刺激而引起的血液凝固第Ⅻ因子活性化，由此導(dǎo)致一系列酶反應(yīng)系。也就是說，活性化的活性型血液凝固第Ⅻ因子，同樣對血漿中存在的血漿前血管舒緩素起作用，將它變換成活性型酶的血漿血管舒緩素，然后這種血漿血管舒緩素對血漿中的高分子激肽原起作用，從而使舒緩激肽游離。
作為血漿血管舒緩素·激肽系生成產(chǎn)物的舒緩激肽，具有末梢血管擴(kuò)張、血管透過性亢進(jìn)、致痛、發(fā)炎、白血球游走等種種生理活性，已知可作為致痛、發(fā)炎、變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)的介體。因此，通過抑制過度的舒緩激肽游離產(chǎn)生，就能緩和疼痛、發(fā)炎、變應(yīng)性癥狀等，從而可以使這些病態(tài)狀態(tài)恢復(fù)正常。
如上所述，舒緩激肽是通過血漿血管舒緩素對高分子激肽原起作用而游離產(chǎn)生，因此能阻斷血漿血管舒緩素·激肽系中血管舒緩素的生成，從而能抑制過度的舒緩激肽生成并使之正常化的物質(zhì)，因此它有可能作為鎮(zhèn)痛劑、抗炎癥劑、抗變應(yīng)性劑使用，作為醫(yī)藥等，其實(shí)用性極高。
本發(fā)明涉及在各種動(dòng)物或動(dòng)物組織上接種作為應(yīng)激子(ストレツサ-)的病毒(ウイルス)和腫瘤細(xì)胞使組織活性化后，從這些活性化組織中提取出來的新型生理活性物質(zhì)，它具有血漿血管舒緩素生成阻斷活性和末梢血流改善作用，是修復(fù)病態(tài)時(shí)產(chǎn)生的功能異常并使之正?；纳锕δ苷{(diào)節(jié)和維持的物質(zhì)。
本發(fā)明的目的在于，涉及從動(dòng)物的活性化組織中提取生理活性物質(zhì)，提供具有末梢血流改善作用、鎮(zhèn)痛、消炎，抗變應(yīng)性作用等的物質(zhì)。
本發(fā)明物質(zhì)，是將動(dòng)物的活性化組織磨碎，添加萃取溶劑以除去組織片后，進(jìn)行除蛋白處理，將它吸附在吸附劑中，然后溶出吸附成分而得到的生理活性物質(zhì)。
以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明中的所謂動(dòng)物組織，是指以人及各種動(dòng)物的病毒感染培養(yǎng)組織，培養(yǎng)細(xì)胞及病毒感染炎癥組織或孵化雞卵的漿尿膜等，作為用于動(dòng)物組織活性化的應(yīng)激子的病毒中，有菌苗病毒、牛痘病毒、痘瘡病毒、小鼠脫腳病病毒、猿猴痘病毒等的正痘病毒、オ-フ病毒、副菌苗病毒、牛乳頭狀口內(nèi)炎病毒等的副痘病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒、塊皮病病毒等的山羊痘病毒、雞痘病毒、野兔纖維腫瘤病毒等的鳥痘病毒、兔粘液腫瘤病毒、兔纖維腫瘤病毒等的兔痘病毒，此外還有豬痘病毒、Yaua猴腫瘤病毒、Tara痘病毒等的痘病毒科中所屬的病毒類。作為應(yīng)激子的腫瘤細(xì)胞，可以使用來自人或各種動(dòng)物細(xì)胞的腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞，也可以是接種在上述動(dòng)物、動(dòng)物組織中的細(xì)胞。
作為用于獲得活性化組織的動(dòng)物，可以采用兔、牛、馬、綿羊、山羊、豬、雞等家畜、家禽類、或者是猴、大白鼠、小鼠、豚鼠、田鼠等哺乳動(dòng)物，可以根據(jù)使用的應(yīng)激子種類和目的適宜地選擇。作為培養(yǎng)細(xì)胞，只要是使用應(yīng)激子就可能增殖培養(yǎng)的細(xì)胞就行，例如可列舉出人血球和胎盤等的各種組織以及上述動(dòng)物及它們的胎兒的腎臟、皮膚、肺、睪丸、肝臟、肌肉、腎上腺、甲狀腺、腦、神經(jīng)細(xì)胞，血球等各種組織的培養(yǎng)細(xì)胞。
無菌地采取這些活性化組織后將其磨碎，添加1-5倍量的萃取溶劑，制成乳化懸濁液，作為萃取溶劑，可以使用蒸餾水，生理食鹽水、弱酸性至弱堿性的緩沖液等，還可以適宜地添加甘油等穩(wěn)定劑，苯酚等殺菌·防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等無機(jī)鹽類等。此時(shí)，通過凍結(jié)融解、超聲波、細(xì)胞膜溶解酶或界面活性劑的處理就可以破壞細(xì)胞組織，很容易地進(jìn)行提取。
將所得乳狀提取液經(jīng)過濾或離心分離除去組織片后，進(jìn)行除蛋白處理。除蛋白，可用公知的方法進(jìn)行，可以適用加熱、超聲波、蛋白質(zhì)變性劑，例如用酸、堿、尿素、胍、有機(jī)溶劑、界面活性劑等的處理、等電點(diǎn)沉淀、鹽析等方法。然后通過用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃過濾器、硅藻土、塞氏過濾板等的過濾、超過濾、凝膠過濾、離子交換樹脂、離心分離等除去析出的不溶性蛋白質(zhì)。
將如此得到的提取部分，用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸調(diào)節(jié)其酸性，最好調(diào)節(jié)到pH3.5-5.5，并進(jìn)行吸附操作使之吸附在吸附劑上。作為可以使用的吸附劑，可列舉活性炭、高嶺土、離子交換樹脂等，通過在提取液中添加吸附劑并攪拌之，或者是使之通過充填有吸附劑的柱子，即可吸附有效成分。
從吸附劑中洗提出本發(fā)明物質(zhì)時(shí)，在上述吸附劑中添加萃取溶劑，例如堿性水溶液，或乙醇等的水混合性溶劑或者是它們的混合溶液，優(yōu)選pH9-12，在室溫下或適宜加熱或者經(jīng)攪拌后洗提，用過濾等普通方法除去吸附劑后即可完成此步驟。然后根據(jù)需要，利用色譜法，超過濾法，逆浸透過濾法等的透析法等慣用方法或者是通過脫鹽處理，就可得到更精制的本發(fā)明生理活性物質(zhì)。
本發(fā)明生理活性物質(zhì)中含有硅類是水溶性的硅酸或硅酸鹽或者是它們聚合而成的硅酸聚合物，它們可以是原硅酸、偏硅酸、中二硅酸(ソ ニ イ酸)，中三硅酸、中四硅酸等硅酸和它們的鈉、鉀等堿金屬的鹽等以單體或聚合的形態(tài)存在，作為本發(fā)明物質(zhì)中的硅換算量，可含有1-20μg/mg，優(yōu)選1.5-15μg/mg。
以下是本發(fā)明物質(zhì)的制造方法實(shí)施例。但這些實(shí)施例并不是限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1在健康成熟的家兔皮膚上接種菌苗病毒，活性化后，無菌地剝出活性化的皮膚，將它切細(xì)加水，用勻漿器磨碎成乳狀物。然后將它加壓過濾，將所得濾液用鹽酸調(diào)節(jié)成pH5.0后，于流通蒸汽下100℃加熱處理。過濾并除去蛋白質(zhì)，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH9.1，進(jìn)一步于100℃加熱處理后過濾。濾液用鹽酸調(diào)至pH4.1，加活性炭2%再攪拌2小時(shí)后過濾。濾液再加活性炭5.5%攪拌2小時(shí)后過濾。在最初濾取的活性炭中加水，用氫氧化鈉調(diào)至pH9.9，于60℃經(jīng)1.5小時(shí)攪拌后過濾。在最初的活性炭及以后的活性炭中加水，用氫氧化鈉調(diào)至pH10.9，于60℃經(jīng)1.5小時(shí)攪拌后過濾。合并濾液并用鹽酸中和后，用分子量為100的逆浸透過濾膜進(jìn)行脫鹽處理，減壓下進(jìn)行干燥固化。從1kg活性化皮膚中得到的收獲量為3g。用這種方法制得的本發(fā)明生理活性物質(zhì)具有以下性質(zhì)。
(1)性狀淡黃褐色無定形的吸濕粉末，將1mg中硅類作為硅的換算量，含有2-10μg。
(2)溶解性可溶于水、甲醇、乙醇、不溶于苯、乙醚。
(3)pH7.5。
(4)紫外區(qū)吸收λmax＝270nm(5)呈色反應(yīng)氨基酸(茚三酮反應(yīng)陽性)糖(苔黑酚-氯化鐵Ⅲ-鹽酸法陽性)磷(鉬藍(lán)法陽性)蛋白質(zhì)(三氯乙酸法陰性)酚(氯化鐵試驗(yàn)法陰性)實(shí)施例2將L細(xì)胞(小鼠肉瘤細(xì)胞)皮下移植到C3H小鼠上，10日后在同一部位接種菌苗病毒后，過5日后摘出腫瘤炎癥部位。將摘出組織100g切細(xì)后，加入經(jīng)過pH7.0緩沖化的70%甘油溶液，用旋轉(zhuǎn)混合機(jī)磨碎，進(jìn)行三次凍結(jié)融解操作。將乳狀的磨碎液用2000×g經(jīng)1小時(shí)離心分離，除去沉淀后，將上清液的pH調(diào)至5.0，加熱至100℃并過濾以除去不溶物。將冷卻后的濾液調(diào)至pH4.5，通過充填了活性炭的柱子，用蒸餾水洗凈后，再用N/25氨水洗提。與實(shí)施例1相同，進(jìn)行中和、脫鹽處理等操作后，減壓下進(jìn)行干燥固化、從而獲得粉末狀的目的物。由這種方法制得的本發(fā)明生理活性物質(zhì)含有稍多的硅酸類，將1mg吸溫粉末中的硅類作為硅換算量，含有5-14μg。
以下，對本發(fā)明生理活性物質(zhì)的藥理作用進(jìn)行敘述。
(1)對血漿血管舒緩素生成的阻斷作用根據(jù)文獻(xiàn)記載的方法測定本發(fā)明生理活性物質(zhì)對血漿血管舒緩素生成的阻斷作用。[基礎(chǔ) 臨床)第20卷，第17號，399-405頁(1986)]。
也就是，在用生理食鹽水稀釋的正常人血漿中添加高嶺土懸浮液，一定時(shí)間后添加リマ豆胰蛋白酶抑制劑使血管舒緩素的生成反應(yīng)停止后，使生成的血管舒緩素在用合成基質(zhì)D-Pro-Phe-Aug-P-硝基苯胺定量的系統(tǒng)中與被檢物質(zhì)共存，由此求出該被檢物質(zhì)的血管舒緩素生成阻斷活性。
表1中示出結(jié)果的一例。用阻斷50%血漿血管舒緩素生成的濃度(IC50)來表示活性的強(qiáng)度。
表1被檢物質(zhì) IC50(μg/ml)本發(fā)明物質(zhì)35消炎痛370苯酮苯丙酸400布洛芬700鎮(zhèn)痛新1600(2)對末梢循環(huán)障礙的改善作用作為本發(fā)明物質(zhì)的異常知覺改善作用的指標(biāo)，測定由于氯碘羥喹引起的末梢血液循環(huán)障礙的改善作用。也就是，對大白鼠在27天內(nèi)漸增地腹腔投入氯碘羥喹以引起末梢循環(huán)障礙后，將后肢放入5℃水中浸漬2分鐘給予低溫負(fù)荷，然后用溫度自計(jì)器將其后肢溫度回復(fù)過程進(jìn)行圖象分析，由此評價(jià)末梢循環(huán)障礙的改善作用。本發(fā)明物質(zhì)在氯碘羥喹投入的第21天開始連續(xù)7天靜脈內(nèi)投入。
表2中示出結(jié)果的一列。
表2低溫負(fù)荷解除15分鐘后的后肢平均皮膚溫度(℃)無處理群27.3±0.8對象群氯碘羥喹處置24.1±0.3本發(fā)明物質(zhì)投入群50mg/kg25.7±0.3100mg/kg26.2±0.7從表1結(jié)果可清楚地看出，本發(fā)明生理活性物質(zhì)具有非常優(yōu)良的血漿血管舒緩素生成阻斷作用。如前所述，已知血管血漿舒緩素對高分子激肽原起作用以致使舒緩激肽游離產(chǎn)生，這種舒緩激肽將成為末梢血管擴(kuò)張、疼痛、發(fā)炎、變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)的介體。也就是，通過阻斷血漿血管舒緩素的生成阻斷活性的本發(fā)明物質(zhì)，例如作為鎮(zhèn)痛劑、抗炎癥劑、抗變應(yīng)性等的藥劑，其實(shí)用性極高。此外，關(guān)于本發(fā)明生理活性物質(zhì)的藥理活性，使用體外及體內(nèi)的各種試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果，表明本發(fā)明物質(zhì)具有優(yōu)良的末梢血流改善、鎮(zhèn)痛、抗炎癥、抗變應(yīng)性等的藥理作用。
本發(fā)明生理活性物質(zhì)，可以與醫(yī)藥用的各種載體或稀釋劑適宜地組合用普通的方法制成各種制劑，可以適合口服或非口服投入的固體、半固體、液體或噴霧劑等劑型處方。處方時(shí)，可單獨(dú)使用本發(fā)明物質(zhì)，也可與其它醫(yī)藥活性成分適宜組合的方式處方。
作為注射劑，可以用水性溶劑或非水性溶劑，例如注射用蒸餾水，生理食鹽水，林格氏溶液、植物油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯、丙二醇等制成溶液或懸浮液、調(diào)整pH，等滲壓化。
作為口服制劑，可以直接口服或者是與適當(dāng)?shù)奶砑觿?，例如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、結(jié)晶纖維素等慣用的賦形劑一起，與纖維素衍生物，阿拉伯樹膠，玉米淀粉、明膠等粘結(jié)劑、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、羥甲基纖維素、羥甲基纖維素鈣等崩解劑、滑石粉、硬脂酸鎂等潤滑劑，其它增量劑、濕潤劑、緩沖劑、防腐劑、香料等適宜組合后制成的片劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑。還可以相應(yīng)于患者的狀態(tài)和疾患的種類，制成除上述劑型以外的最適于其治療的劑型，例如坐劑、吸入劑、噴霧劑、軟膏、泥敷劑、點(diǎn)眼劑等。
權(quán)利要求
1.一種新型生理活性物質(zhì)，它是從活性化組織中提取出來的，并具有以下性質(zhì)(1)性狀淡黃褐色無定形的吸濕性粉末，將1mg中的硅類作為硅換算量，含有1-20μg。(2)溶解性可溶于水、甲醇、乙醇，不溶于苯、乙醚，(3)pH6.00-8.3，(4)紫外區(qū)吸收λmax=265-275nm，(5)呈色反應(yīng)氨基酸(茚三酮反應(yīng)陽性)糖(苔黑酚-氯化鐵Ⅲ-鹽酸法陽性)磷(鉬藍(lán)法陽性)蛋白質(zhì)(三氯乙酸法陰性)酚(氯化鐵試驗(yàn)法陰性)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生理活性物質(zhì)，其中，作為硅的換算量，含有2-10μg/mg的硅類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生理活性物質(zhì)，其中，作為硅的換算量，含有5-14μg/mg的硅類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的生理活性物質(zhì)，其中，活性化組織是病毒感染和/或腫瘤細(xì)胞接種組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的生理活性物質(zhì)，其中，活性化組織是菌苗病毒感染組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的生理活性物質(zhì)，其中，活性化組織是兔的皮膚組織。
7.含有權(quán)利要求1-6的生理活性物質(zhì)作為有效成分的生物體功能調(diào)節(jié)劑。
8.作為末梢血流改善劑的權(quán)利要求7所述的生物體功能調(diào)節(jié)劑。
9.作為鎮(zhèn)痛劑的權(quán)利要求7所述的生物體功能調(diào)節(jié)劑。
10.作為抗炎癥劑的權(quán)利要求7所述的生物體功能調(diào)節(jié)劑。
11.作為抗變應(yīng)性劑的權(quán)利要求7所述的生物體功能調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型生理活性物質(zhì)。它具有血漿血管舒緩素生成阻斷作用和末梢血流改善作用、鎮(zhèn)痛、抗炎癥、抗變應(yīng)性作用。本發(fā)明生理活性物質(zhì)是在各種動(dòng)物或動(dòng)物組織中接種作為應(yīng)激子的病毒和腫瘤細(xì)胞使之活性化后，從這些活性化組織中提取有效因子，具有血漿血管舒緩素生成阻斷活性的藥理作用，修復(fù)病態(tài)時(shí)產(chǎn)生的功能異常并使之正?；纳矬w功能的調(diào)節(jié)、維持物質(zhì)。作為末梢血流改善劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎癥劑、抗變應(yīng)性劑等藥物是極有用的。
文檔編號A61P29/00GK1107365SQ9411658
公開日1995年8月30日 申請日期1994年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月28日
發(fā)明者小西甚右衛(wèi)門, 浜田義一 申請人:日本臟器制藥株式會(huì)社