專利名稱：胃安素口服液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用以治療胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍的藥物-胃安素口服液；本發(fā)明也是CN92105643.5的后續(xù)專利。
在CN92105643.5中，我們已提出了大約在七十年代初期，Goldstein等人從小牛胸腺中分離出一組能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的多肽，生化分析表明，上述胸腺肽是具有活性的單一肽類，其分子量均小于15000道爾頓。七十年中期，Hooper等人在小牛胸腺肽的制備中第一次采用超濾技術(shù)截留分子量小于15000道爾頓的胸腺肽組份；在以后的幾年中，許多學(xué)者對(duì)小牛胸腺肽的生物活性大量的工作，并從胸腺肽組織中分離的具有免疫活性成份的分子量如如77年Goldstein提出的分子量為3108道爾頓的制品α；79年Ahmed提出的分子量為2500道爾頓的制品α7；以及81年Low提出的分子量為4982道爾頓的制品α。
92年，我們提出了從乳豬胸腺中提取出一組中分子量水溶性胸腺蛋白，并對(duì)其進(jìn)行促細(xì)胞增殖活性的研究。
對(duì)在先專利所述的中分子量水溶性胸腺蛋白的各種物化參數(shù)的進(jìn)一步研究所得出的本發(fā)明所述的胃安素口服液為分子量5萬以下的水溶性胸腺蛋白，其主要活性為3～5萬的中分子量水溶性胸腺蛋白，本發(fā)明所述的胃安素口服液胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍的治療有非常明顯的效果。
本發(fā)明的主要目的是提供一種用于治療胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍的藥物-胃安素口服液，它是由主要活性為3～5萬的中分子量水溶性胸腺蛋白，加上具有部分活性的3萬以下的小分子量水溶性胸腺蛋白組成。
本發(fā)明所述的胃安素的制備方法簡述如下選用40-60天健康乳豬(或其它幼齡脯乳動(dòng)物)的胸腺，拔除胸腺上的脂肪組織，將胸腺低溫高速搗碎，將搗碎后的勻漿在80-90℃之間保持10-30分鐘，然后，離心分離去沉淀，留上清液，進(jìn)行透析，截留分子量為5萬以下的水溶性胸腺蛋白，再經(jīng)過除菌、分裝，凍干等常規(guī)處理，就得到了胃安素口服液。


圖1是不同濃度的胃安素口服液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的增殖狀況。
圖2是不同濃度的胃安素口服液對(duì)小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)的增殖狀況。
圖3是胃安素口服液、成豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
圖4是胃安素口服液、成豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
圖3、圖4中1是胃安素口服液、2是成豬胸腺蛋白(TF)、3是胸腺肽注射液(TF)、4是肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)；方框中空白是試樣，陰影為對(duì)照。
圖5是本發(fā)明所述的胃安素口服液單獨(dú)或和其它藥物組合以及本發(fā)明所述的胃安素口服液不同劑量互相或和鹽水對(duì)照下愈合率的比較；圖6、7是胃安素口服液在不同條件下的高效液相色譜圖；圖8是胃安素的紫外掃描圖譜，由中山醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)試；將上述方法制備的胃安素口服液進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)，具體內(nèi)容如下。
樣品包括胃安素口服液；胸腺肽注射液(TF)，由廣東省生物制品研究所提供；促肝細(xì)胞生長素注射液，由廣東省陽江制藥廠提供。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的制備與在先專利相同。
傳代培養(yǎng)時(shí)，用D-Hanks'液輕洗細(xì)胞單層2-3遍。用0.06%胰蛋白酶在室溫下消化1-2分鐘，棄消化液，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打20-30次，制成細(xì)胞懸液。以12-3比率傳代。用于實(shí)驗(yàn)的為2-3代細(xì)胞，經(jīng)V因子相關(guān)抗原(VR.Ag)的抗體檢測(cè)，確認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞后方作為生物效應(yīng)測(cè)定用細(xì)胞。
小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)由第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院提供(培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基加20%小牛血清)。
本發(fā)明的胃安素口服液生物效應(yīng)測(cè)定和CN92105643.5相同，即將各檢測(cè)樣品[胃安素口服液、成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)]，按不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)分別加入3孔細(xì)胞中平行檢測(cè)。每份樣品設(shè)立3孔空白對(duì)照(與鹽水做對(duì)照)。
不同濃度的胃安素口服液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖狀況見圖1.圖2.
圖1、圖2提示，本發(fā)明的胃安素口服液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)均有明顯的促增殖生物效應(yīng)，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，而且增殖效應(yīng)與乳豬胸腺蛋白(TP)的最佳濃度有關(guān)(0.2mg-0.4mg/ml)。
各種不同檢測(cè)樣品對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖效應(yīng)的影響比較，結(jié)果見圖3，圖4。
圖3、4表明本發(fā)明的胃安素口服液有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖的作用；而成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、促肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)三種被檢樣品均無明顯促內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖活性，與對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)；另外，促肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)雖然有低水平的刺激現(xiàn)象，但與胃安素口服液相比仍有顯著性差異，與成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)結(jié)果比較無明顯意義。說明其中確存在著一組能提高內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖的活性組份。
正如圖6、7以及相應(yīng)的表1和表2中所給出的數(shù)據(jù)，本發(fā)明述的胃安素口服液經(jīng)高效液相色譜分析共有6個(gè)組份峰、6條電泳帶，這是在波長261nm的條件下測(cè)定的六個(gè)主要吸收峰；其具體測(cè)定值見表1、2，圖譜見圖6、7。
表1本發(fā)明的胃安素口服液高效液相色譜(圖6)9310:30:23[261nmThreshold950]261nmNo.RTMatchArea[AU*min]LefttimeRighttimetime[%]PeakPurePeakPurePeakPure12.7133.560.3327710.1116831.972.634.792.7925.1475.210.0387920.0291754.794.986.075.2736.4583.290.0092980.0077446.106.236.956.6647.5958.500.0586970.0343376.957.469.147.75610.1399.940.0010070.0010079.789.8110.5310.53711.4310.280.0156310.00160610.5311.4111.6511.46811.8631.330.0375610.01176711.6511.8112.2911.89912.4734.720.0103920.00360812.2912.4512.8212.531012.9884.480.0365780.03090212.7712.9313.1713.111114.0593.250.2034580.18972913.2513.7014.6914.211216.2995.860.6255590.59963214.7115.4616.5516.501318.1870.120.0018030.00126417.7818.0518.3718.291418.9544.650.0050320.00224718.3718.8519.1719.171519.3860.270.0030610.00184519.1719.2219.8619.54
表2BASELINE(C)1987DynamioSolution.DivisionofMilliporeBASELINE810PEAKINTEGRATIONREPOSAMPLE:KV-61Type:UNKN#1inMethod:DEMOMETHOD1Instrument:Instrument1RATE:2.0points/secFilename:KV-61Duration:28.000minutesIndex:DiskInjectionVolume:5.0DETECTOR:detector1PK#ID#PeakStartPeakEndRetentionTypePeakAreaPeakHei(min)(min)(min)(microvolt-sec)(microvolt)(ComponentName175.7926.8086.475BP240111.276765.12801.371.96P7D126.8087.2336.950PP189439.135714.89400.801.65387.2338.9427.567PP441108.907094.86092.522.05P8D148.94210.9339.900PP4105228.2132086.6523.4338.21510.93313.15811.308PP2583546.623773.19614.756.88613.15813.89213.650PP632159.1615103.7003.6104.37713.89216.25815.108PP2399322.426578.78713.697.69816.25819.04217.358PP3252509.740426.25918.5611.70919.04220.32519.575PP331481.696614.68581.891.911020.32522.91721.117PP2943270.068682.56016.8019.871122.91723.74223.425PP67105.1561714.01230.380.511223.74224.50024.167PP114374.273274.32190.650.951324.50025.45824.875PP194417.635611.89721.111.621425.45826.70025.758PP64365.5171819.96840.370.531526.70027.73327.417PB11581.512349.283260.070.10TOTAL17520021345643.20胃安素口服液紫外掃描在波長297.7nm中有一主要吸收峰，此結(jié)果是委托中山醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)試得出的；CN92105643中所述的中分子蛋白在波長280nm有一主要吸收峰，而本發(fā)明所述的胃安素口服液是一組中小分子的混和蛋白；具體的圖譜見圖8。
本發(fā)明所述的胃安素口服液提取方法簡便，性質(zhì)穩(wěn)定，成本低；從提取胃安素口服液的材料、工藝和物質(zhì)分子量結(jié)果分析推測(cè)，本發(fā)明的胃安素口服液與目前國內(nèi)外報(bào)道的小分子(分子量＜1.8萬)多肽類物質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，胸腺肽注射液(TF)，促肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)差異較大，而本發(fā)明圖3，圖4結(jié)果也表明，胃安素口服液與成年豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、促肝細(xì)胞生長素注射液(HGF)的作用效應(yīng)不同。
胃安素表現(xiàn)出良好的抗感染和明顯促進(jìn)肉芽組織生長效果。研究初步表明本發(fā)明胃安素口服液在實(shí)驗(yàn)室促內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖效應(yīng)與臨床外用治療促進(jìn)傷口愈合的結(jié)果相吻合。
研究結(jié)果還表明，胃安素口服液的劑量與療效也存在一定的關(guān)系(可參見圖5)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)得出胃安素口服液的劑量以10mg(蛋白)/kg/日為宜。大劑量的胃安素口服液(50mg/kg/日)治療反而對(duì)潰瘍面的愈和造成不良的影響，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的胃安素口服液對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞或成纖細(xì)胞的增值起著抑制作用。
我們認(rèn)為胃安素口服液主要是通過營養(yǎng)局部受損粘膜并促進(jìn)內(nèi)表皮細(xì)胞、成纖細(xì)胞增生而達(dá)到治療目的，因此，它適應(yīng)范圍廣，為解決目前抑酸藥所造成的胃酸過低的不良反應(yīng)等問題起到積極作用。
為了進(jìn)一步反應(yīng)本發(fā)明所述的胃安素口服液與現(xiàn)有的治療胃潰瘍的藥物的效果比較。
表3胃安素口服液治療10天大鼠胃潰瘍面積的變化及其與鹽水對(duì)照組的比較組別劑量(mg/kg/n)動(dòng)物數(shù)n潰瘍面積(mm2)X±SDNS0.5ml105.23±3.59TP1 10 10 1.56±1.36a-TP2 15 10 .40±1.47b-與對(duì)照組比較,aP<0.01,bP<0.05。
表4不同劑量的胃安素口服液、西咪替叮及鹽水喂藥20天，大鼠胃潰瘍完全愈和率比較組別劑量(mg/kg/n)動(dòng)物數(shù)n愈合例數(shù)(%)NS0.5ml203(15.00)TP1 10 20 15(75.00)aTP2 15 18 9(50.00)bTP350201(5.00)Cimet. 500 20 11(55.00)c
Cimet.+TP1 500/10 19 18(94.47)d與對(duì)照組比較,aP<0.01,>bP<0.05,cP<0.05,dP<0.005。
進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)所用的胃安素口服液是本發(fā)明所述的胃安素口服液，所述的西咪替叮是廣州市橋制藥廠出口；胃潰瘍的模型是參照Okabe等設(shè)計(jì)和董秀云的改良法，即，用50%的乙酸涂胃壁以造成潰瘍模型。
喂藥處理術(shù)后第一天即開始經(jīng)口灌入胃內(nèi)，每天二次(上午9時(shí)，下午3時(shí)，)共給藥10天及20天，大鼠分為6組，第一組為對(duì)照組(30只)，給生理鹽水；第二組(30只)為TP1組(10mg/kg/日)；第三組(30只)為TP2組(15mg/kg/日)；第四組(20只)為TP3組(50mg/kg/日)；第五組(20只)為Cimetidine組(500mg/kg/日)；第六組(20只)為二聯(lián)組(即Cimetidine500mg/kg/日+TP10mg/kg/日)。觀察藥物對(duì)潰瘍對(duì)愈合的影響如下給藥材10天后將第一、第二、第三組的各10只動(dòng)物處死以1%的福爾馬林固定胃壁沿大剪開，測(cè)量潰瘍面積并進(jìn)行比較；給藥20天后同樣處理并于病變部位做組織學(xué)切片觀察大鼠的胃潰瘍愈和情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。
對(duì)胃安素口服液的進(jìn)一部的分析表明，本發(fā)明所述的胃安素口服液還含有一定量的微量元素和十七種氨基酸，所述的微量元素和氨基酸的命稱和含量，由表5和表6列出表5胃安素口服液微量元素分析檢測(cè)儀器HITACHI180-70AAS檢驗(yàn)結(jié)果(單位mg/L)胃安素胸腺肽Zn14.10.24Cu0.230.04K398188Na1262376Mn0.150.02Fe0.140.14Mg21.611.1Ca27.114.6Co0.040.03
Se<0.01<0.01表6氨基酸檢驗(yàn)樣品處理游離氨基酸用5%磺基水楊酸法處理分析方法高壓液相色譜檢驗(yàn)結(jié)果含量單位(mg/g)天冬氨酸(Asp.)1.82蘇氨酸(Thr.)12.43絲氨酸(Ser.)7.22谷氨酸(Glu.)16.23脯氨酸(Pro.)4.12甘氨酸(Gly.)2.32丙氨酸(Ala.)5.69胱氨酸(Cys.)/頡氨酸(Vsl.)6.36蛋氨酸(Mer.)2.75異亮氨酸(Ileu.)4.58亮氨酸(Leu.)13.97酪氨酸(Tyr.)7.23苯丙氨酸(Phe.)7.59賴氨酸(Lys.)14.85組氨酸(His.)4.19精氨酸(Arg.)10.34總含量121.71表5、6的檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)因原料來源及其它條件的變化而有所誤差，誤差率約為±10%。
上述內(nèi)容都是對(duì)動(dòng)物、或在實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)或檢驗(yàn)結(jié)果，具體用于臨床的效果究竟如何？自1992年10月至1993年5月，我們進(jìn)行胃安素治療消化性潰瘍的臨床驗(yàn)證工作，共觀察消化性潰瘍41例，全部病例均經(jīng)纖維胃鏡檢查確診為胃、十二指腸球部潰瘍(活動(dòng)期)，療程結(jié)束后再經(jīng)纖維胃鏡檢查評(píng)價(jià)治療效果。
在總數(shù)為41例的病人中，男36例，女5例；年齡最小為18歲，最大為70歲，其中20歲以下3例，20-30歲17例，31-40歲5例，41-50歲12例，51歲以上為4例，平均年齡為36.4歲，病程最短1個(gè)月，最長30年，平均為3.78年；41例中有胃潰瘍4例，十二指腸球部潰瘍35例，復(fù)合潰瘍2例；41例患者共57個(gè)潰瘍，其中僅1個(gè)潰瘍者32例，2個(gè)潰瘍者4例，3個(gè)潰瘍者4例，5個(gè)潰瘍者1例(其中球內(nèi)有2個(gè)潰瘍，胃內(nèi)有3個(gè)潰瘍)。全部病例無幽門梗阻，癌變并發(fā)癥，其中10例合并有小量出血。
治療方法-凡附合觀察病例條件者可住院或門診治療。41例均服胃安素每次6ml，每日2次，15天為一個(gè)療程，服胃安素期間不得使用其他治療消化性潰瘍的藥物，全部病例均觀察一個(gè)療程的治療效果。
療效判斷標(biāo)準(zhǔn)-治療結(jié)果分為痊愈、顯效、有效、無效4個(gè)組，經(jīng)胃安素治療15天后潰瘍完全愈合或轉(zhuǎn)為紅色瘢痕期為治愈；潰瘍面積較治療前縮小50%以上者為顯效；潰瘍面有縮小，但縮小不到50%者為有效；潰瘍面無縮小或增大或出現(xiàn)新的潰瘍者為無效。
臨床癥狀-胃安素口服液能有效改善消化性潰瘍的臨床癥狀，特別是能較快緩解上腹痛癥狀，最快者服藥1-2天腹痛消失，一周內(nèi)腹痛消失率為97.36%(34例/38例)，改善反酸，噯氣癥狀次之，反酸消失率64.21%(18例/28例)，噯氣消失率為65.48%(17例/26例)；10例伴有黑便者亦多在一周內(nèi)大例轉(zhuǎn)黃，出血停止。
潰瘍愈合率-痊愈為65.85%(27例/41例)，顯效24.39%(10例/41例)，有效2例占4.89%，無效2例4.89%?？傆行蕿?5.12%。
對(duì)胃酸度的影響-本組部分病例觀察了服用胃安素后對(duì)胃液游離酸，PH值的影響，結(jié)果表明胃安素對(duì)胃內(nèi)酸環(huán)境影響不大。
付作用-全部觀察病例均對(duì)比觀察了胃安素治療前后患者肝功能、腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)的改變，故本藥在治療范圍內(nèi)無毒付作用，安全可靠。
本文觀察了單用胃安素治療消化性潰瘍41例，其中胃潰瘍4例，十二指腸球部潰瘍35例，復(fù)合性潰瘍2例，多數(shù)為一個(gè)潰瘍面，少數(shù)為多發(fā)性潰瘍，最多達(dá)5個(gè)潰瘍。服胃安素治療15天，治愈率為65.48%，總有效率為95.12%，療效滿意，其療效類似于H2受體阻滯劑類藥物。但本藥具有療程短，緩解癥狀快，無任何毒付作用的特點(diǎn)，深受患者歡迎。因此胃安素不失為一種新開辟的較好的治療潰瘍病新藥物，值得大力推廣使用。
異常毒性試驗(yàn)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的動(dòng)物最大耐受量為20000mg/kg(即LD50＞20000mg)。
兔皮膚、眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)本品對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的皮膚、眼結(jié)臘無刺激作用。
權(quán)利要求
1.一種胃安素口服液，它是從乳豬(或其它哺乳動(dòng)物)胸腺中提取出的一組分子量5萬以下的水溶性胸腺混合蛋白，它是由主要活性為3～5萬的中分子量水溶性胸腺蛋白，配合具有部分活性的3萬以下的小分子量水溶性胸腺蛋白組成；另外，胃安素口服液還含有多種微量元素和17種氨基酸，本發(fā)明所述的胃安素口服液經(jīng)高效液相色譜在波長261nm的條件下分析共有6個(gè)主要吸收(組份)峰、6條電泳帶；胃安素口服液在波長297.7nm的紫外掃描中有一主要吸收峰；其使用劑量為5～15mg(蛋白)/kg/日。
2.權(quán)利要求1所述的一種胃安素口服液，它包括如下的微量元素(單位mg/L)Zn14.1Cu0.23K398Na126Mn0.15Fe0.14Mg21.6Ca27.1Co0.04Se＜0.01
3.權(quán)利要求1所述的一種胃安素口服液，它還包括如下氨基酸(含量單位mg/g)天冬氨酸(Asp.)1.82蘇氨酸(Thr.)12.43絲氨酸(Ser.)7.22谷氨酸(Glu.)16.23脯氨酸(Pro.)4.12甘氨酸(Gly.)2.32丙氨酸(Ala.)5.69胱氨酸(Cys.)/頡氨酸(Vsl.)6.36蛋氨酸(Mer.)2.75異亮氨酸(Ileu.)4.58亮氨酸(Leu.)13.97酪氨酸(Tyr.)7.23苯丙氨酸(Phe.)7.59賴氨酸(Lys.)14.85組氨酸(His.)4.19精氨酸(Arg.)10.34總含量121.71
4.權(quán)利要求2或3所述的一種胃安素口服液，其氨基酸和微量元素的含量的誤差率約為±10%。
5.權(quán)利要求1所述的一種胃安素口服液，其優(yōu)選使用劑量是10mg(蛋白)/kg/日。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種用以治療胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍的藥物——胃安素口服液，它是從乳豬胸腺中提取出一組分子量5萬以下的水溶性胸腺混合蛋白，它是由主要活性為3～5萬的中分子量水溶性胸腺蛋白，加上具有部分活性的3萬以下的小分子量水溶性胸腺蛋白組成，另外還含有多種微量元素和17種氨基酸，本發(fā)明所述的胃安素口服液對(duì)胃潰瘍、十二指腸球部潰湯的治療有非常明顯的效果。
文檔編號(hào)A61K35/26GK1101834SQ9311933
公開日1995年4月26日 申請(qǐng)日期1993年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月22日
發(fā)明者陳光明, 謝汝錦, 楊富強(qiáng), 王東曉, 張宜俊, 黃英, 邵巖 申請(qǐng)人:中國人民解放軍空軍廣州醫(yī)院