本發(fā)明涉及屬分子生物學(xué)和肝病防治，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種治療肝纖維化、肝硬化的基因編輯人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝硬化是各種慢性肝病進(jìn)展至以肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成、再生結(jié)節(jié)及肝內(nèi)外血管增生為特征的病理階段。代償期肝硬化無(wú)明顯臨床癥狀，失代償期以門靜脈高壓和肝功能嚴(yán)重?fù)p傷為特征，患者常因并發(fā)腹水、消化道出血、肝性腦病、肝腎綜合征或癌變等導(dǎo)致多臟器功能衰竭而死亡。目前，肝移植是國(guó)際公認(rèn)的終末期肝硬化的最佳治療手段，但受供體缺乏、排異反應(yīng)以及免疫抑制劑毒副作用等限制。因此，探尋肝移植的替代療法顯得尤為迫切。近年來(lái)，干細(xì)胞移植成為肝硬化治療研究的新熱點(diǎn)，尤其人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(huc-mscs)具有易獲取、無(wú)排異反應(yīng)及倫理問題等優(yōu)勢(shì)，已在乙肝肝硬化、酒精性肝硬化等治療中初顯成效，但如何調(diào)控移植后的huc-mscs精準(zhǔn)分化以提高療效，尚有待于深入研究。

2、numb是進(jìn)化上高度保守的干細(xì)胞命運(yùn)決定因子，通過(guò)有絲分裂時(shí)的不對(duì)稱分配控制干細(xì)胞的命運(yùn)。近年來(lái)，numb作為一種腫瘤抑制因子受到廣泛關(guān)注，如提高numb表達(dá)水平可抑制肝癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等，但對(duì)于其在肝硬化治療中的作用知之甚少。shu等報(bào)道numb基因敲除小鼠予以3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫吡啶(ddc)飲食喂養(yǎng)6w后，可見門脈周圍廣泛的肝祖細(xì)胞增殖及膽管反應(yīng)，且肝纖維化程度較野生型小鼠更為嚴(yán)重，表明numb缺失可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的進(jìn)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性肝炎、乙型肝炎和原發(fā)性膽汁性膽管炎相關(guān)肝硬化患者的肝活檢組織中numb蛋白水平顯著下降，分別為健康人群的51.9％、25.1％和25.3％，提示肝硬化患者肝臟numb蛋白水平明顯不足。根據(jù)我們的研究結(jié)果，認(rèn)為過(guò)表達(dá)numb基因的huc-mscs(huc-mscsnumb-oe)在肝纖維化、肝硬化治療中可發(fā)揮重要作用。并且經(jīng)查證目前尚無(wú)本申請(qǐng)內(nèi)容相關(guān)專利公布，亦未發(fā)現(xiàn)與本專利申請(qǐng)相同的基因編輯細(xì)胞在肝病領(lǐng)域應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種治療肝纖維化、肝硬化的基因編輯人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明提供了過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療慢性肝病藥物中的應(yīng)用。

3、作為一個(gè)優(yōu)選例，所述的慢性肝病病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞排列紊亂、廣泛性的壞死、肝小葉的結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、膽管細(xì)胞增生、纖維間隔中的一種或多種，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

4、作為另一優(yōu)選例，所述的慢性肝病為肝炎、慢加急性肝衰竭、肝纖維化、肝硬化。

5、作為另一優(yōu)選例，所述過(guò)表達(dá)numb基因的huc-mscs減輕膽管細(xì)胞增殖及膽管反應(yīng)、改善血清肝功能及膽汁淤積程度、抑制肝纖維化進(jìn)展、促進(jìn)肝組織修復(fù)。

6、作為另一優(yōu)選例，所述藥物為生物治療藥物、化學(xué)藥物或植物藥物。

7、第二方面，本發(fā)明提供了一種基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞為過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞。

8、作為一個(gè)優(yōu)選例，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

9、第三方面，本發(fā)明提供了過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞，是由下列方法制備得到的：

10、步驟a、獲取原代間充質(zhì)干細(xì)胞；

11、步驟b、原代間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；

12、步驟c、numb基因過(guò)表達(dá)慢病毒的構(gòu)建；

13、步驟d、numb基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，并篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，得到過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞。

14、第四方面，本發(fā)明提供了一種治療慢性肝病的藥物組合物，以過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞為唯一活性組分。

15、作為一個(gè)優(yōu)選例，所述的慢性肝病為肝炎、慢加急性肝衰竭、肝纖維化、肝硬化。

16、本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明中提供了一種新的治療肝纖維化、肝硬化的huc-msc：過(guò)表達(dá)numb基因的huc-mscs(huc-mscsnumb-oe)可劑量依賴性地抑制肝臟炎癥反應(yīng)及肝纖維化進(jìn)展；劑量依賴性地抑制膽管反應(yīng)，改善膽汁淤積；并可劑量依賴性地促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，提高血清白蛋白含量。且以上治療作用均優(yōu)于同等劑量的huc-mscs。表明huc-mscsnumb-oe既可直接用作治療肝纖維化、肝硬化的細(xì)胞，也可以此為工具篩選治療肝纖維化、肝硬化的生物或化學(xué)藥品。

技術(shù)特征：

1.過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療慢性肝病藥物中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的慢性肝病病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞排列紊亂、廣泛性的壞死、肝小葉的結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、膽管細(xì)胞增生、纖維間隔中的一種或多種，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的慢性肝病為肝炎、慢加急性肝衰竭、肝纖維化、肝硬化。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述過(guò)表達(dá)numb基因的huc-mscs減輕膽管細(xì)胞增殖及膽管反應(yīng)、改善血清肝功能及膽汁淤積程度、抑制肝纖維化進(jìn)展、促進(jìn)肝組織修復(fù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為生物治療藥物、化學(xué)藥物或植物藥物。

6.一種基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞為過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

8.過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞，是由下列方法制備得到的：

9.一種治療慢性肝病的藥物組合物，以權(quán)利要求6或7所述的過(guò)表達(dá)numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞為唯一活性組分。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述的慢性肝病為肝炎、慢加急性肝衰竭、肝纖維化、肝硬化。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及過(guò)表達(dá)Numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療慢性肝病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述基因工程修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞為過(guò)表達(dá)Numb基因的間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種新的治療慢加急性肝衰竭、肝纖維化、肝硬化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC?MSC)：過(guò)表達(dá)Numb基因的hUC?MSCs可劑量依賴性地抑制肝臟炎癥反應(yīng)及肝纖維化進(jìn)展；劑量依賴性地抑制膽管反應(yīng)，改善膽汁淤積；并可劑量依賴性地促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，提高血清白蛋白含量。且以上治療作用均優(yōu)于同等劑量的hUC?MSCs。表明hUC?MSCs<supgt;Numb?OE</supgt;既可直接用作治療慢加急性肝衰竭、肝纖維化、肝硬化的細(xì)胞，也可以此為工具篩選治療肝纖維化、肝硬化的生物或化學(xué)藥品。

技術(shù)研發(fā)人員：慕永平,張士豪,邢飛飛,宗夢(mèng)瑤,楊明艷,劉平,陳佳美,劉偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6