本發(fā)明涉及干細(xì)胞藥物，特別是涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法。
背景技術(shù)：
1、當(dāng)今社會(huì)生活節(jié)奏的不平衡，熬夜飲食不規(guī)律導(dǎo)致細(xì)胞損傷引起的干燥、膚色暗沉、炎癥、皮膚老化一系列問(wèn)題。研究證明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗衰老和組織再生的能力，現(xiàn)階段市場(chǎng)上所使用的大多數(shù)美白，祛痘印，填充臉部凹陷的護(hù)膚品都帶有化學(xué)成分。使用之后會(huì)有一定的副作用，比如生長(zhǎng)因子導(dǎo)致的臉部變形，玻尿酸導(dǎo)致的臉部僵硬。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明要解決的是市場(chǎng)上所使用的大多數(shù)護(hù)膚品都帶有化學(xué)成分。使用之后會(huì)有一定的副作用，比如生長(zhǎng)因子導(dǎo)致的臉部變形，玻尿酸導(dǎo)致的臉部僵硬。
2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：它包括：
3、(1)傳染病檢測(cè)；
4、使用膠體金方法和酶聯(lián)法進(jìn)行4項(xiàng)傳染病檢測(cè)，
5、(2)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備培養(yǎng)；
6、2.1、原代培養(yǎng)完全培養(yǎng)基的配制；每500ml原代培養(yǎng)基加入25ml因子，同時(shí)加入一支慶大霉素；
7、2.1、臍帶的清洗；
8、2.3、分離華通氏膠；
9、2.4、臍帶組織培養(yǎng)；
10、2.5、收獲細(xì)胞；
11、(3)自體富血小板血漿(prp)的制備；
12、3.1、用采血管采集使用者8ml靜脈血；
13、3.2、將采集好的靜脈血4℃靜置20min，靜置結(jié)束，進(jìn)行離心，吸取上層富血小板血漿(prp)于無(wú)菌儲(chǔ)存管，放入4℃保存待用；
14、(4)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備；
15、4.1、細(xì)胞培養(yǎng)3～5天之后，觀察細(xì)胞；
16、4.2、提前48h做無(wú)菌和內(nèi)毒素檢測(cè)；
17、4.3、顯微鏡下鏡檢；
18、4.4、收集培養(yǎng)上清；
19、4.5、消化細(xì)胞、細(xì)胞收集；
20、4.6、把裝有細(xì)胞懸液的50ml離心管輕輕吹打混勻，補(bǔ)足體積到40ml，2000rpm，離心5min；
21、4.7、離心后去上清，先用10ml生理鹽水重懸，吹打均勻，最后定容到40ml，2000rpm，離心5min，取適量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性測(cè)定；
22、4.8、離心后去上清，先用4ml富血小板血漿(prp)重懸，吹打均勻，取新的50ml離心管，將上述細(xì)胞懸液過(guò)70μm篩網(wǎng)，形成細(xì)胞懸液；
23、4.9、將制備好的細(xì)胞懸液裝入注射器保存待用。
24、采用以上結(jié)構(gòu)后，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過(guò)培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并制備成·1×107/ml，活率＞95％的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液。通過(guò)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射能對(duì)所述問(wèn)題進(jìn)行特異性修復(fù)，達(dá)到肌膚長(zhǎng)久高效的美白、抗衰功效，高效快速完成肌膚細(xì)胞層面的更新，使肌膚更加細(xì)膩有光澤。
25、作為改進(jìn)，步驟2.1中所述臍帶的清洗用75％酒精浸泡消毒1～2min，再用生理鹽水清洗2遍以上，用手術(shù)剪把臍帶剪成2～3cm的小段，擠出每段的血液，用生理鹽水清洗3次，洗干凈血液。
26、作為改進(jìn)，對(duì)步驟2.4中所述臍帶組織培養(yǎng)并進(jìn)行觀察：
27、培養(yǎng)0d，把剪好的臍帶組織放入7ml完全培養(yǎng)基的10mm培養(yǎng)皿中，之后放入5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
28、培養(yǎng)5d，觀察組織塊，觀察是否有少量細(xì)胞爬出，之后加入5ml完全培養(yǎng)基，搖晃使培養(yǎng)基分布均勻，放入5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
29、培養(yǎng)8d，觀察組織塊，應(yīng)有少量細(xì)胞爬出，之后每天觀察細(xì)胞爬出情況；
30、培養(yǎng)10d，觀察細(xì)胞爬出情況，之后加入5ml完全培養(yǎng)基，搖晃使培養(yǎng)基分布均勻，放入5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
31、培養(yǎng)15d，觀察細(xì)胞情況爬出情況，若細(xì)胞較少繼續(xù)加入5ml完全培養(yǎng)基，搖晃使培養(yǎng)基分布均勻，放入5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
32、作為改進(jìn)，步驟2.5中所述收獲細(xì)胞使用150mm培養(yǎng)皿和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)數(shù)量培養(yǎng)到1×107時(shí)，進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備。
33、作為改進(jìn)，步驟3.2中靜置后的靜脈血放入離心機(jī)3500rpm，離心10min。
34、作為改進(jìn)，步驟4.3中所述鏡檢在40倍(高倍)顯微鏡下進(jìn)行，觀察細(xì)胞有無(wú)均勻運(yùn)動(dòng)的黑色顆粒，是否污染。
35、作為改進(jìn)，步驟4.4中所述收集培養(yǎng)上清在超凈工作臺(tái)中操作，之后中和消化用，加入約10ml的生理鹽水輕輕清洗1次皿。
36、作為改進(jìn)，步驟4.5中在150mm的皿中加入3ml胰蛋白酶，待消化完全后加入培養(yǎng)上清，中和消化，收集消化好的細(xì)胞懸液到50ml離心管中，再用約10ml的生理鹽水清洗皿，使細(xì)胞收集更完全。
37、作為改進(jìn)，步驟4.9中所述細(xì)胞懸液裝入5ml注射器中，保存溫度在4～8℃。
1.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：它包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟2.1中所述臍帶的清洗用75％酒精浸泡消毒1～2min，再用生理鹽水清洗2遍以上，用手術(shù)剪把臍帶剪成2～3cm的小段，擠出每段的血液，用生理鹽水清洗3次，洗干凈血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：對(duì)步驟2.4中所述臍帶組織培養(yǎng)并進(jìn)行觀察：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟2.5中所述收獲細(xì)胞使用150mm培養(yǎng)皿和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)數(shù)量培養(yǎng)到1×107時(shí)，進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟3.2中靜置后的靜脈血放入離心機(jī)3500rpm，離心10min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟4.3中所述鏡檢在40倍(高倍)顯微鏡下進(jìn)行，觀察細(xì)胞有無(wú)均勻運(yùn)動(dòng)的黑色顆粒，是否污染。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟4.4中所述收集培養(yǎng)上清在超凈工作臺(tái)中操作，之后中和消化用，加入約10ml的生理鹽水輕輕清洗1次皿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟4.5中在150mm的皿中加入3ml胰蛋白酶，待消化完全后加入培養(yǎng)上清，中和消化，收集消化好的細(xì)胞懸液到50ml離心管中，再用約10ml的生理鹽水清洗皿，使細(xì)胞收集更完全。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射液的制備方法，其特征在于：步驟4.9中所述細(xì)胞懸液裝入5ml注射器中，保存溫度在4～8℃。