五子衍宗方的新用途
【專利摘要】五子衍宗方的新用途。本發(fā)明提供了如下組合物在制備卵巢移植術(shù)術(shù)前或/和術(shù)后的輔助用藥物中的用途：所述組合物的原料藥包括如下重量配比的藥味：枸杞子30～50份、菟絲子30～50份、覆盆子15～25份、五味子3～7份、車前子7～13份。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行卵巢移植術(shù)前或/和后使用五子衍宗丸，可以促進(jìn)凍存后自體移植卵巢卵泡生長發(fā)育，恢復(fù)自體移植凍存卵巢卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，促進(jìn)體外培養(yǎng)的未成熟卵母細(xì)胞成熟，提高體外胚胎發(fā)育的2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率和桑葚胚發(fā)育率，對凍存后自體移植卵巢功能有良好的保護(hù)作用，可有效提高卵巢移植的成功率，為卵巢移植手術(shù)提供了一種新的輔助手段。
【專利說明】五子衍宗方的新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及五子衍宗方的新用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類是通過有性繁衍的物種，生命的延續(xù)，離不開男性和女性雙方的遺傳信息及 其載體-遺傳基因。女性的卵母細(xì)胞有著女性的全部遺傳基因，卵母細(xì)胞都來自卵巢。而 成熟卵母細(xì)胞更是珍稀細(xì)胞，大多數(shù)婦女一生中也僅擁有400?500個。
[0003] 隨著醫(yī)學(xué)診斷和治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床腫瘤患者的長期生存時間和生存質(zhì)量 得到提高，腫瘤患者也有年輕化趨勢，但對大多數(shù)年輕女性腫瘤患者，尤其是盆腔腫瘤患者 進(jìn)行生殖器官的切除或者使用放療或化療仍然是必要的，使這些患者在很年輕時就要承受 卵巢早衰甚至是喪失生育能力的風(fēng)險。常規(guī)放療和化療方案在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時，也直 接破壞了生殖細(xì)胞，導(dǎo)致卵巢功能下降。加之越來越多育齡人群推遲生育，使得生育年齡的 腫瘤患者，尤其是未生育的少女腫瘤患者在獲得新生的同時，又不得不面臨生育能力的喪 失和卵巢早衰的問題。在因重大意外事件-譬如汶川大地震-而喪失親人的不少再生育婦 女，也面臨同樣的痛苦窘境。
[0004] 目前，保護(hù)卵巢功能的方法主要有：激素療法、藥物干預(yù)、卵巢移位、卵巢組織凍存 移植、卵母細(xì)胞凍存植入和胚胎凍存植入。激素療法可外源性代替卵巢的內(nèi)分泌功能，卻 不能改善生育能力，且有增加激素依賴性腫瘤的發(fā)生和誘發(fā)血栓的風(fēng)險；藥物保護(hù)和卵巢 移位可短時間減少放化療對卵巢的損害，但仍無法完全保護(hù)卵巢免受化療藥和放射線的危 害；通過卵母細(xì)胞和胚胎的保存，可以收集經(jīng)自然發(fā)情周期排卵，或者經(jīng)化學(xué)藥物誘導(dǎo)后實(shí) 現(xiàn)超數(shù)排卵，并人工拾卵，隨后受精；也可以通過卵巢切除術(shù)保存部分卵巢組織或保存整個 卵巢，移植并收集各級卵泡組織獲得卵母細(xì)胞。近四十年來，得益于輔助生殖技術(shù)一體外成 熟（IVM)、體外受精（IVF)、體外培養(yǎng)（IVC)和胚胎移植（ET)等的迅速發(fā)展，使卵母細(xì)胞及 胚胎冷凍保存成為臨床上最為成熟的輔助生殖技術(shù)，但因其時效性的局限，收集前需特殊 處理，也無法恢復(fù)女性患者自身的卵巢分泌功能，且有法律、宗教及倫理的束縛，臨床使用 受到一定限制。而直接冷凍卵巢組織能保存大量不成熟卵母細(xì)胞，較之于成熟卵母細(xì)胞， 不成熟卵母細(xì)胞體積小，結(jié)構(gòu)簡單，亞細(xì)胞器較少，代謝率低，無透明帶，對低溫敏感度低， 不易受冷凍傷害，并且不需要刺激卵巢促卵泡成熟，可以在任何時候進(jìn)行冷凍保存和移植， 且不需要激素的處理，不存在倫理問題，而且可以提供生殖功能和內(nèi)分泌功能的雙重保障， 是一種理想的保存女性生育能力的方法，也是上述方法中唯一可以完全重建卵巢功能的方 法。
[0005] 卵巢凍存移植，主要分為同種自體移植、同種異體移植和異種移植，其中，同種自 體移植是較為常見的移植方法，它又包括卵巢自體原位移植和卵巢自體異位移植。卵巢自 體原位移植是將冷凍保存卵巢組織移植到卵巢解剖部位卵巢窩或卵巢蒂的位置，手術(shù)創(chuàng)傷 較大，對移植卵巢的觀察較困難?？梢曰謴?fù)自然的卵巢功能，尤其是生育能力，實(shí)現(xiàn)自然妊 娠。有報道，新鮮和凍存卵巢組織移植后，兩者在術(shù)后的內(nèi)分泌功能和生育能力的恢復(fù)無明 顯差異。已有成功自然妊娠后產(chǎn)下健康胎兒的報道。冷凍卵巢移植后4?8個月恢復(fù)卵巢 功能，月經(jīng)恢復(fù)，卵泡發(fā)育并排卵。
[0006] 卵巢自體異位移植是將卵巢或卵巢組織移植到自身卵巢非正常解剖部位。移植 部位有腎包膜下、肌肉、腹壁、腋窩、乳房和前臂等部位，只能恢復(fù)卵泡發(fā)育和卵巢內(nèi)分泌功 能，不能自然妊娠，需要借助體外受精_胚胎移植等輔助生殖技術(shù)。異位移植手術(shù)操作簡 單，便于檢測，但卵巢移植皮下，血供較差，容易缺血壞死。將人卵巢組織移植皮下是為了便 于檢測移植卵巢組織卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞采集。有報道，移植到腹部皮下，經(jīng)激素處理后， 獲得20個卵母細(xì)胞，其中8個采用胞漿內(nèi)精子注射方法，獲得一個4-細(xì)胞胚胎。移植到腹 直肌的卵巢組織內(nèi)分泌功能恢復(fù)，持續(xù)28周。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供五子衍宗方的新用途。
[0008] 具體地，本發(fā)明提供了如下組合物在制備卵巢移植術(shù)術(shù)前或/和術(shù)后的輔助用藥 物中的用途：所述組合物的原料藥包括如下重量配比的藥味：
[0009] 枸杞子15?50份、寬絲子15?50份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、車前 子7?13份。
[0010] 進(jìn)一步地，所述卵巢移植術(shù)為凍存卵巢移植手術(shù)。
[0011] 更進(jìn)一步地，所述凍存卵巢移植手術(shù)為凍存卵巢自體移植手術(shù)。
[0012] 優(yōu)選地，所述凍存卵巢自體移植手術(shù)為凍存卵巢自體異位移植手術(shù)。
[0013] 其中，所述輔助用藥物是提高移植卵巢的存活率，促進(jìn)移植卵巢中卵泡生長，改善 移植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育能力的藥物。
[0014] 進(jìn)一步地，所述組合物的原料藥包括如下重量配比的藥味：枸杞子40份、菟絲子 40份、覆盆子20份、五味子5份、車前子10份。
[0015] 進(jìn)一步地，所述組合物的原料藥重量配比如下：枸杞子15?50份、寬絲子15?50 份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、車前子7?13份。
[0016] 優(yōu)選地，所述組合物的原料藥重量配比如下：枸杞子40份、菟絲子40份、覆盆子 20份、五味子5份、車前子10份。
[0017] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行卵巢移植術(shù)前或/和后使用五子衍宗丸，可以促進(jìn)凍存 后自體移植卵巢卵泡生長發(fā)育，恢復(fù)自體移植凍存卵巢卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，促進(jìn)體外培 養(yǎng)的未成熟卵母細(xì)胞成熟，提高體外胚胎發(fā)育的2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率和桑葚胚發(fā)育率，對凍 存后自體移植卵巢功能有良好的保護(hù)作用，可有效提高卵巢移植的成功率，為卵巢移植手 術(shù)提供了一種新的輔助手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1凍存后自體異位移植第7天卵巢及鄰近區(qū)域形態(tài)變化
[0019] 圖2凍存后自體異位移植第21天卵巢及鄰近區(qū)域形態(tài)變化
[0020] 圖3凍存后自體異位移植第35天卵巢及鄰近區(qū)域形態(tài)變化
[0021] 圖4回收卵巢均重變化趨勢
[0022] 圖5凍存后自體異位移植第7天卵巢卵泡發(fā)育的組織形態(tài)學(xué)變化（HE100x):
[0023] 圖6凍存后自體異位移植第21天卵巢卵泡發(fā)育的組織形態(tài)學(xué)變化（HE100x):
[0024] 圖7凍存后自體異位移植第35天卵巢卵泡發(fā)育的組織形態(tài)學(xué)變化（HE100x):
[0025] 圖8凍存后自體異位移植第7天卵巢組織VEGF表達(dá)變化：
[0026] 圖9凍存后自體異位移植第21天卵巢組織VEGF表達(dá)變化：
[0027] 圖10凍存后自體異位移植第35天卵巢組織VEGF表達(dá)變化：
[0028] 圖11五子衍宗丸對凍存后自體異位移植卵巢組織細(xì)胞凋亡的影響
[0029] 圖12五子衍宗丸對移植卵巢卵泡及周圍組織細(xì)胞凋亡的影響
[0030] 圖13凍存后自體異位移植卵巢與在位卵巢卵母細(xì)胞形態(tài)，其中，A:五子2-21d組 卵母細(xì)胞（l〇〇x);B:五子2-21d組MII期卵母細(xì)胞（800x);C:精子（800x);D:在位卵巢卵 母細(xì)胞（l〇〇x) ;E:退化裸卵（400x) ;F:PMSG-21d組卵母細(xì)胞（200x) ;G:在位卵巢卵母細(xì) 胞（100x) ;H:MI期卵母細(xì)胞（400x) ;1 :五子2-35d組卵母細(xì)胞（200x);J:GV期卵母細(xì)胞 (400x)。
[0031] 圖14回收卵母細(xì)胞數(shù)量，與模型組比較，*p< 0. 05
[0032] 圖15補(bǔ)腎對移植卵巢卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育的影響，其中，注：A:受精 前卵母細(xì)胞（200x) ;B:受精后卵母細(xì)胞（800x) ;C:2-細(xì)胞胚胎（800x) ;D:多個桑葚胚 (200x)；E：
[0033] 桑葚胚（800x);F:退化的受精卵（800x)。
[0034] 圖16PCR擴(kuò)增程序圖
[0035] 圖17血管生成相關(guān)基因相對表達(dá)量
[0036] 圖18和圖18續(xù)卵泡閉鎖相關(guān)基因相對表達(dá)量
[0037] 圖19卵泡生長相關(guān)基因相對表達(dá)量
[0038] 圖20卵泡分化相關(guān)基因相對表達(dá)量

【具體實(shí)施方式】
[0039] 以下通過試驗(yàn)例具體說明本發(fā)明的有益效果。
[0040] 試驗(yàn)例1五子衍宗丸對凍存后自體異位移植小鼠卵巢體內(nèi)發(fā)育的影響 [0041]卵巢為雌性哺乳動物的性腺，其主要功能為產(chǎn)生卵子并排卵和分泌雌性激素。卵 巢中卵泡的發(fā)育始于胚胎時期，其內(nèi)有大量原始卵泡形成，并進(jìn)入自主發(fā)育和閉鎖的軌道， 直到發(fā)育期開始選擇征募原始卵泡進(jìn)入卵泡生長發(fā)育過程，產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞來繁殖后 代，但終生僅有少量卵子在自然繁殖過程中得到利用，其余大多數(shù)卵泡通過細(xì)胞凋亡機(jī)制 而自行退化。
[0042] 近年來，卵巢冷凍保存技術(shù)和卵巢移植技術(shù)得到了迅速發(fā)展，在人類生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域，被認(rèn)為是保存和延續(xù)女性生殖能力的一種有效方法。目前，在這一研究領(lǐng)域，以中醫(yī)藥 理論和方法進(jìn)行的研究報道尚不多見，本實(shí)驗(yàn)以腎主生殖理論為指導(dǎo)，研究左歸丸、右歸丸 和五子衍宗丸對小鼠自體異位移植凍存復(fù)蘇卵巢組織體內(nèi)發(fā)育的影響，為發(fā)展輔助生殖領(lǐng) 域的中醫(yī)藥技術(shù)積累基礎(chǔ)資料。
[0043] 1材料和方法
[0044] 1. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0045]1. 1. 1實(shí)驗(yàn)動物
[0046] 健康SPF級五周齡昆明小鼠，個體體重22-24克，購自成都達(dá)碩生物科技有限公 司。合格證號：scxk(川）2008-24。適應(yīng)性喂養(yǎng)五天，所有實(shí)驗(yàn)小鼠均采用自然光照，室溫 10?15°C，自由采食顆粒飼料和自由飲水方式飼養(yǎng)，隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0047] 1. 1. 2主要儀器與試劑
[0048] 配置試劑：冷凍液：MEM+10%FBS+1. 5MDMS0+0.lMsucrose;
[0049] 解凍液：MEM+10% FBS+1. 0MDMS0+0.lMsucrose
[0050] 解凍液：MEM+10% FBS+0. 5MDMS0+0.lMsucrose
[0051] 解凍液：MEM+10% FBS+0. lMsucrose
[0052] 解凍液：MEM+10% FBS
[0053] TBS液：三羥基氨基甲烷1. 21g+氯化鈉7. 6g+優(yōu)普水800ml，濃鹽酸調(diào)PH值至 7. 2-7. 4,定容至 1000mlTBS-T液：TBS液+Tween20 (體積比 0? 05 % )
[0054] 抗原修復(fù)液：檸檬酸0. 38g+檸檬酸三鈉2. 45g+優(yōu)普水900ml，濃鹽酸調(diào)PH值至 6. 0,定容至 1000ml
[0055] 1. 2實(shí)驗(yàn)設(shè)計
[0056] 小鼠隨機(jī)分組，摘取卵巢并凍存，7天后將凍存卵巢復(fù)蘇，自體移植到小鼠背部皮 下。實(shí)驗(yàn)從卵巢移植當(dāng)天開始計算天數(shù)，植入當(dāng)天記為〇d，分別于移植后7天、21天、35天 和（或）42天回收移植卵巢，每次回收不少于六只小鼠。
[0057] 本次實(shí)驗(yàn)中，按照補(bǔ)腎方藥煎劑灌胃時間的不同，分為1組（灌胃6天后摘除卵 巢，術(shù)后停止中藥灌胃）、2組（灌胃6天后摘除卵巢，術(shù)后繼續(xù)中藥灌胃）和3組（摘除卵 巢前不灌胃，摘除卵巢后中藥灌胃）。
[0058] 具體分組如下：
[0059] 右歸丸處理組：右歸丸煎劑每日灌胃一次，并分別于卵巢移植后7天、21天、35天 和（或）42天回收卵巢移植體，觀察移植后卵巢及卵泡發(fā)育。根據(jù)回收卵巢移植體的時間分 為右歸l-7d組、右歸l-21d組、右歸2-7d組、右歸2-21d組、右歸2-35d組、右歸3-7d組、 右歸3-21d組和右歸2-42d組。
[0060] 左歸丸處理組：左歸丸煎劑每日灌胃一次，并分別于卵巢移植后7天、21天、35天 和（或）42天回收卵巢移植體，觀察移植后卵巢及卵泡發(fā)育。根據(jù)回收卵巢移植體的時間分 為左歸l-7d組、左歸l-21d組、左歸2-7d組、左歸2-21d組、左歸2-35d組、左歸3-7d組、 左歸3-21d組和左歸2-42d組。
[0061] 五子衍宗丸處理組：五子衍宗丸煎劑每日灌胃一次，并分別于卵巢移植后7天、21 天、35天和（或）42天回收卵巢移植體，觀察移植后卵巢及卵泡發(fā)育。根據(jù)回收卵巢移植體 的時間分為五子l-7d組、五子l-21d組、五子2-7d組、五子2-21d組、五子2-35d組、五子 3-7d組、五子3-21d組和五子2-42d組。
[0062]PMSG處理組：PMSG3IU每日腹腔注射，并分別于卵巢移植后7天、21天、35天回收 卵巢移植體，觀察移植后卵巢及卵泡發(fā)育。根據(jù)回收卵巢移植體的時間分為PMSG-7d組、 PMSG-21d組和PMSG-35d組。
[0063] 模型組：生理鹽水每日灌胃一次，并分別于卵巢移植后7天、21天、35天回收卵 巢移植體，觀察移植后卵巢及卵泡發(fā)育。根據(jù)回收卵巢移植體的時間分為模型_7d組、模 型-2Id組和模型-35d組。
[0064] 正常組：定期摘取卵巢觀察卵巢及卵泡發(fā)育。分為正常_7d組、正常_21d組和正 常-35d組。
[0065] 1. 3實(shí)驗(yàn)方法
[0066] 1. 3. 1小鼠卵巢采集凍存和復(fù)蘇
[0067] 采集已編號小鼠腹腔注射1%Pentobarbital0? 25-0. 3ml/只，5-10分鐘四肢癱 軟后，在超凈臺下，背部剪毛，75%酒精消毒手術(shù)部位，沿背正中線剪開皮膚，鈍性分離皮下 組織和肌肉組織，在背肌外緣進(jìn)入腹腔，找到卵巢囊，將卵巢囊牽拉至切口外，避開血管，在 卵巢囊上撕開一小口，暴露卵巢，鈍性采取卵巢，即刻放入MEM培養(yǎng)液中，眼科鑷壓迫止血， 對合肌層和皮下組織，縫合皮膚。對手術(shù)后小鼠進(jìn)行保溫，待其蘇醒后放入小鼠飼養(yǎng)籠中 進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，不需拆線。觀察其健康狀況。
[0068] 凍存參照Gosden的冷凍程序，將MEM液清洗后的卵巢放入已加好1ml冷凍液 的1.5ml凍存管中，4°C放置30分鐘，放入程序冷凍儀中，起始溫度：4°C，樣品上機(jī)后， 以-2°C/分鐘的速率降至_7°C，soaking5分鐘，人工置冰，以-0. 3°C/分鐘的速率降 至-34°C，再以-10°C/分鐘的速率降至-140°C，樣品快速下機(jī)，迅速投入液氮中。
[0069] 復(fù)蘇將凍存管從液氮中取出，室溫放置30秒，37°C水浴加溫融化，在超凈臺下將 卵巢組織依次放入解凍液中：
[0070] MEM+10 %FBS+1. 0MDMS0+0.lMsucrose中放置 5 分鐘，MEM+10 % FBS+0. 5MDMS0+0.lMsucrose中放置 5 分鐘，MEM+10 %FBS+0.lMsucrose中放置 5 分鐘， MEM+10%FBS中放置30分鐘。
[0071] 1.3. 2凍存卵巢自體移植
[0072] 卵巢摘除7天后行自體卵巢移植術(shù)，小鼠腹腔注射1 %Pentobarbital 0. 25-0. 3ml/只，5-10分鐘后四肢癱軟后，在超凈臺下，背部剪毛，75%酒精消毒手術(shù)部位， 避開上次手術(shù)切口部位剪開皮膚，鈍性分離皮下組織，納入卵巢，縫合皮膚。對手術(shù)后小鼠 進(jìn)行保溫，待其蘇醒后放入小鼠飼養(yǎng)籠中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，不需拆線。觀察其健康狀況。
[0073] 1.3. 3移植卵巢回收
[0074] 根據(jù)各組預(yù)定時間，每組每次取樣不少于6個。先自眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血， 3000rpm離心10分鐘，血清-40°C冰箱儲存以備E2測定。小鼠斷頸后，術(shù)野75%酒精消毒， 取出移植卵巢并稱重，用于組織學(xué)檢查的卵巢放入中性福爾馬林中室溫保存，其余卵巢組 織直接放入已用DEPC處理的凍存管中，-80°C冰箱儲存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0075] 卵巢回收：取出的移植卵巢，存活，顏色紅潤，表面有血管分布或其周圍有明顯血 管生長。
[0076] 卵巢回收率（％ )=(回收卵巢數(shù)/移植卵巢數(shù)）X100%
[0077] 1. 3. 4卵巢組織的脫水包埋和切片
[0078] 卵巢組織經(jīng)中性福爾馬林液固定后，依次放入75%，80%，95%及100%乙醇梯度 脫水，二甲苯透明。放入60°C石蠟中浸漬，室溫下冷卻凝固。將石蠟塊按5um的厚度連續(xù)切 片，每間隔10張切片染色一張。將切片在40°C水中展平，平鋪于載玻片上。將載玻片放入 60°C烤箱中烤片。
[0079] 1. 3. 5石蠟切片蘇木素-伊紅染色
[0080] 二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，自來水洗片刻。蘇木素液染核10分鐘，自來水洗片 刻，1 %鹽酸酒精分化30秒，流水沖洗片刻。復(fù)染0. 5%伊紅溶液染色5分鐘。自來水洗片 亥IJ。逐級升濃度酒精脫水，二甲苯浸泡，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察。
[0081] 卵泡分級標(biāo)準(zhǔn)：原始卵泡為單層扁平顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞；初級卵泡為單層立 方顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞；次級卵泡為兩層或兩層以上立方顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞；竇狀 卵泡為卵泡內(nèi)有竇腔形成。若卵泡失去圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，顆粒細(xì)胞缺失，出現(xiàn)核固縮，排 列紊亂，卵母細(xì)胞核固縮，形態(tài)失常，均為形態(tài)異常的卵泡。
[0082] 形態(tài)正常卵泡百分率（％ )=(形態(tài)正常卵泡/總卵泡）X100%
[0083] 損傷卵泡百分率（％ )=(損傷卵泡/總卵泡）X100%
[0084] 1. 3.6VEGF免疫組化
[0085] 烤片：將待做卵巢切片置于切片架上，60°C恒溫烤箱過夜；
[0086] 脫蠟：烤好的切片依次放入二甲苯I中10分鐘，之后二甲苯II中10分鐘；
[0087] 水化：切片經(jīng)下行酒精水化，分別在無水乙醇，95%酒精，80%酒精，75%酒精中依 次浸泡各5分鐘。TBS液浸泡5分鐘；
[0088] 微波修復(fù)抗原：先將枸櫞酸抗原修復(fù)液（配制方法見1.1.2)，微波爐加熱至 92°C_98°C，再將切片浸入持續(xù)15分鐘（注意控制好溫度）。置室溫下自然冷卻后，自來水 沖洗，優(yōu)普水洗滌2X5分鐘，TBS洗滌2X5分鐘。
[0089] 封閉：滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育30分鐘；
[0090] 加一抗：滴加已稀釋好的即用型VEGF-抗，4°C濕盒過夜；
[0091] 洗滌：取出昨天過夜的濕盒，37°C復(fù)溫30分鐘，TBS-T洗滌3X5分鐘；
[0092] 封閉：滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育10分鐘；
[0093] 加二抗：滴加生物素化羊抗兔IgG(濃度0? 005mg/ml)，37°C濕盒孵育30分鐘；
[0094] 洗滌：TBS-T洗滌3X5分鐘；
[0095] 加HRP-SA:滴加HRP-SA液（濃度20nM)，37°C濕盒孵育30分鐘；
[0096] 洗滌：TBS-T洗滌3X5分鐘，TBS洗滌2X5分鐘；
[0097] 顯色：配制DAB工作液：計算好樣本數(shù)量集中配制，每個樣本用量為：50iil優(yōu)普 水加入 2. 5ii1DAB-ASolution，混勻后再加入 2. 5ii1DAB-BSolution和 2. 5ii1DAB-C Solution，即用即配；樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50ii1DAB工作液，室溫顯 色反應(yīng)30秒?2分鐘，鏡下控制反應(yīng)時間，切片從顯微鏡上拿下來后直接入優(yōu)普水終止反 應(yīng)并洗滌三次，每次5分鐘。蘇木素復(fù)染，3分鐘后流水沖洗后，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
[0098] 結(jié)果判定：細(xì)胞漿內(nèi)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色，明顯高于背景為陽性細(xì)胞。
[0099] 1. 3.HUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測分析
[0100] 烤片：將待做卵巢石蠟切片置于切片架上，60°C恒溫烤箱過夜；
[0101] 脫蠟：烤好的石蠟切片依次放入二甲苯I中10分鐘，之后二甲苯II中10分鐘；
[0102] 水化：切片經(jīng)下行酒精水化，分別在100%無水乙醇、95%酒精、80%酒精和75% 酒精中依次浸泡，每次5分鐘；
[0103] 洗滌：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘；
[0104] 促滲：用PBS液配制1%TritonX-100通透液，將切片浸入通透液中，室溫促滲5 分鐘；
[0105] 洗滌：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘；
[0106] 封閉：用甲醇+10%優(yōu)普水+10%過氧化氫（30% )，配制封閉液，將切片浸入封閉 液中，室溫（15-25°C)封閉10分鐘；
[0107] 洗滌：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘；
[0108] 通透：計算好樣本數(shù)量，集中配制ProteinaseK工作液，每個樣本按98ii1 1XPBS加入2iil50XProteinaseK的比例配制，即用即配，每個樣本上滴加lOOiil ProteinaseK工作液，37°C濕盒孵育30分鐘；
[0109] 洗滌：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘；
[0110] 制陽性片：用 60ii1DNaseI(50U/ii1)加 40ii1DNaseIBuffer制 100ii1 含 3000U的DNaseI反應(yīng)液，在一張樣本切片上滴加100ill上述配制好的DNaseI反應(yīng)液， 37°C濕盒孵育10分鐘；
[0111] 洗滌：制好的陽性片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘；
[0112] TdT酶反應(yīng)：配制TdT酶反應(yīng)液：每樣本用量：45ii1EquilibrationBuffer加 1.〇11113;[01:;[11-11-(1171?和4.01111(^￡1^50116，計算好樣本數(shù)集中配制（陰性對照片不 計），即用即配，注意避光；樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50ylTdT酶反應(yīng)液， 放入溫盒中，37°C避光濕盒孵育60分鐘（注：陰性對照樣本不加TdT酶反應(yīng)液）；
[0113] 洗滌：孵育后的切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘，注意避光；
[0114] 熒光標(biāo)記：配制Str印tavidin-FITC標(biāo)記工作液：每個樣本用量為：45ul Labelingbuffer加入5ulStreptavidin-FITC標(biāo)記液，計算好樣本數(shù)集中配置，陰性對照 片同樣計入，即用即配，注意避光；樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50yl配好的 Str印tavidin-FITC標(biāo)記工作液，放入濕盒中，37°C避光孵育30分鐘。
[0115] 洗滌：孵育后的切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘，注意避光；
[0116] DAPI復(fù)染：用DAPI室溫避光復(fù)染細(xì)胞核10分鐘；
[0117] 洗滌：孵育后的切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分鐘，注意避光；
[0118] 熒光顯微鏡檢測：激發(fā)波長450-500nm，發(fā)射波長515-565nm，上機(jī)觀察拍照。
[0119] 細(xì)胞凋亡：卵母細(xì)胞或顆粒細(xì)胞核為綠色熒光，明顯高于背景。
[0120] 卵泡凋亡率：陽性細(xì)胞卵泡與總卵泡數(shù)的比值。
[0121] 卵母細(xì)胞凋亡率：卵母細(xì)胞陽性細(xì)胞與總卵泡數(shù)的比值。
[0122] 顆粒細(xì)胞凋亡率：顆粒細(xì)胞陽性細(xì)胞與總卵泡數(shù)的比值。
[0123] 1. 3. 8小鼠雌二醇定量分析（ELISA法）
[0124] 所需試劑和微孔板條室溫平衡30分鐘后，從鋁箔袋中取出所需板條，微孔架固 定；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，移取90yL標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本至相應(yīng)微孔中（整個加樣 時間控制在10分鐘內(nèi)）；每孔加入提前復(fù)融的凍干雌二醇HRP酶結(jié)合物10iiL，充分混合10 秒，25-28°C避光孵育120分鐘；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置60秒，甩去 洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物溶液100yL，室溫（18-24°C)避 光孵育20分鐘。每孔加入終止液50yL，終止酶反應(yīng)，10分鐘內(nèi)，在450nm波長處測定各孔 的0D值。
[0125] 結(jié)果判斷在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)0D值作縱坐標(biāo)，繪制出 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
[0126] 1.3. 9制備中藥煎劑
[0127] 藥材均購自成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房。
[0128] 每劑藥置于1000ml燒杯中，加優(yōu)普水浸泡30分鐘，先大火煮沸，文火維持沸騰25 分鐘后濾出藥湯，將三次收取的藥湯濃縮后儲存?zhèn)溆谩?br> [0129] 方劑組成
[0130] 右歸丸：熟地黃24份山藥12份山茱萸9份枸杞子12份菟絲子12份鹿角膠 12份杜仲12份肉桂6份當(dāng)歸9附子6份
[0131] 左歸丸：熟地24份山藥12份枸杞子12份山茱萸12份川牛膝12份菟絲子 12份鹿膠12份龜膠12份
[0132] 五子衍宗丸：枸杞子40份、菟絲子40份、覆盆子20份、五味子5份、車前子10份。
[0133] 1.3. 10劑量設(shè)定
[0134] 按照"實(shí)驗(yàn)動物與人按表面積等效量換算比率"，算出小鼠的等效劑量。專人給小 鼠灌服，每天一次。
[0135] 各復(fù)方藥物人用劑量分別參見WS3-B-0054-89(右歸丸）、WSl-B-0053-89(左歸 丸）和《中國藥典》2010版一部532頁（五子衍宗丸項(xiàng)）。
[0136] 1. 4數(shù)據(jù)處理及分析
[0137] 運(yùn)用MicrosoftExcel2007軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和作圖。采用spss20統(tǒng)計軟 件進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，對卵巢回收率進(jìn)行卡方 檢驗(yàn)。
[0138] 2 結(jié)果
[0139] 2. 1小鼠術(shù)后一般狀態(tài)觀察
[0140] 小鼠一般術(shù)后1?3小時蘇醒，蘇醒前注意保暖。小鼠術(shù)后未見活動異常，對外界 刺激反應(yīng)靈敏，進(jìn)食水正常，性情溫順。手術(shù)切口愈合良好，未見滲出感染化膿等現(xiàn)象。
[0141] 2. 2補(bǔ)腎對自體異位移植卵巢存活及回收率的影響
[0142] 本次實(shí)驗(yàn)共有摘除卵巢后再自體異位移植昆明小鼠246只，摘除后經(jīng)凍存再自體 異位移植卵巢492個。凍存移植卵巢總有效回收率為68. 70%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組間差 異統(tǒng)計顯著性分析見表1. 1和表1. 2。
[0143] 表1. 1移植卵巢回收率（一）
[0144]

【權(quán)利要求】
1. 如下組合物在制備卵巢移植術(shù)術(shù)前或/和術(shù)后的輔助用藥物中的用途：所述組合物 的原料藥包括如下重量配比的藥味： 枸杞子15?50份、寬絲子15?50份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、車前子 7?13份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述卵巢移植術(shù)為凍存卵巢移植手術(shù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述凍存卵巢移植手術(shù)為凍存卵巢自體 移植手術(shù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述凍存卵巢自體移植手術(shù)為凍存卵巢 自體異位移植手術(shù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于：所述輔助用藥物是提高移 植卵巢的存活率，改善移植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育能力的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于：所述輔助用藥物是促進(jìn)移 植卵巢中卵泡生長的藥物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于：所述輔助用藥物是改善移 植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育能力的藥物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述組合物的原料藥包括如下重量配比 的藥味： 枸杞子40份、菟絲子40份、覆盆子20份、五味子5份、車前子10份。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述組合物的原料藥重量配比如下： 枸杞子15?50份、寬絲子15?50份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、車前子 7?13份。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述組合物的原料藥重量配比如下： 枸杞子40份、菟絲子40份、覆盆子20份、五味子5份、車前子10份。
【文檔編號】A61P15/08GK104257879SQ201410462408
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】陸華, 曹勝 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)