納絡(luò)酮用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及納絡(luò)酮用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供了納絡(luò)酮和編碼NeuroD1?cDNA的慢病毒聯(lián)用在用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。由于沒有明顯的副作用，納絡(luò)酮的使用劑量可以保證其對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力具有足夠的促進(jìn)作用。本發(fā)明納絡(luò)酮和編碼NeuroD1?cDNA的慢病毒聯(lián)用，由于阻斷了腦部?jī)?nèi)源性的嗎啡類似物對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，可以有效提高海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生的效率以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。
【專利說明】納絡(luò)酮用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納絡(luò)酮的新用途，特別涉及一種納絡(luò)酮用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]原有理論認(rèn)為在成體動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的神經(jīng)細(xì)胞。但是，隨著科學(xué)研究的進(jìn)步和深入，研究人員發(fā)現(xiàn)成體動(dòng)物體內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞。而神經(jīng)干細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)那闆r下分化成為不同種類的神經(jīng)細(xì)胞，從而補(bǔ)充生命過程中損失的神經(jīng)細(xì)胞或者為多種高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)提供支持。成體動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞分化成為不同種類的神經(jīng)細(xì)胞的過程一般稱為成體神經(jīng)發(fā)生。雖然，已有多項(xiàng)研究表明神經(jīng)干細(xì)胞以及成體神經(jīng)發(fā)生可以廣泛地存在于腦部的多個(gè)區(qū)域，但是一般認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞以及成體神經(jīng)發(fā)生主要存在和發(fā)生于海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone, SGZ)以及腦室下區(qū)(subventricular zone, SVZ)。
[0003]其中，海馬齒狀回顆粒下層的神經(jīng)干細(xì)胞以及成體神經(jīng)發(fā)生一個(gè)重要的生理功能就是為空間學(xué)習(xí)記憶提供支撐?？臻g學(xué)習(xí)記憶是檢測(cè)空間定向、反應(yīng)時(shí)間，視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評(píng)價(jià)其認(rèn)識(shí)水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場(chǎng)景和事件的學(xué)習(xí)記憶。空間學(xué)習(xí)記憶是一種簡(jiǎn)單的學(xué)習(xí)記憶，同時(shí)是動(dòng)物體很多復(fù)雜行為的基本組成部分之一，如:覓食、歸巢、躲避天敵等。因此，空間學(xué)習(xí)記憶具有重要的生理意義。
[0004]空間學(xué)習(xí)記憶受到多條信號(hào)通路、多種因子以及多種外界環(huán)境的復(fù)雜調(diào)節(jié)。其中，很多因素都是通過影響海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生影響空間學(xué)習(xí)記憶的。例如:隨著年齡的增長(zhǎng)，在成體神經(jīng)發(fā)生效率下降的同時(shí)，空間學(xué)習(xí)記憶能力也會(huì)逐漸衰退；長(zhǎng)期或者多次使用成癮類藥物如嗎啡、咖啡因、酒精等，也會(huì)在降低空間學(xué)習(xí)記憶能力同時(shí)降低機(jī)體的空間學(xué)習(xí)記憶能力。此外，在某些神經(jīng)退行性疾病如阿爾采默氏疾病(老年性癡呆)發(fā)生和發(fā)展的過程中，海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力都會(huì)受到影響。
[0005]目前來說，提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的方法十分有限。I)一定程度的運(yùn)動(dòng)可以提高海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。但是，此方法的投入產(chǎn)出比不高，往往花費(fèi)大量的時(shí)間和精力獲得的提升并不明顯。此外，這一方法對(duì)衰老、藥物以及疾病導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷效果甚微。2)適度的壓力(stress)也可以對(duì)成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生正面影響，但是，過高的壓力對(duì)成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力反而會(huì)產(chǎn)生負(fù)面的影響。同時(shí)，由于個(gè)體差異，不同機(jī)體對(duì)不同壓力的反應(yīng)也并不相同。因此機(jī)體承受壓力的程度難以控制在最佳狀態(tài)。3)在海馬齒狀回顆粒下層控制部分基因表達(dá)在理論上可以促進(jìn)成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生過程受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的特異性調(diào)控，如:NeuroDl, Doublecortin等,但是高表達(dá)這些因子對(duì)成體神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)作用仍然有待證明。4)部分藥物具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，可以延緩成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力受到衰老、藥物以及疾病影響時(shí)產(chǎn)生的降低，但是難以在正常情況下提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。
[0006]綜上，現(xiàn)有提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶的方法或多或少都存在著:效果不顯著或者個(gè)體差異性強(qiáng)等問題，在實(shí)際的生產(chǎn)生活中應(yīng)用性不強(qiáng)。因此，亟需一個(gè)效果顯著、穩(wěn)定性強(qiáng)以及個(gè)體差異不明顯的方法來提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:克服現(xiàn)有技術(shù)中提高學(xué)習(xí)記憶能力的方法促進(jìn)不顯著，以及促進(jìn)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種納絡(luò)酮用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種納絡(luò)酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的組合；包括獨(dú)立使用的編碼NeuroDl cDNA的慢病毒和納絡(luò)酮。利用編碼NeuroDl cDNA的慢病毒提高海馬齒狀回顆粒下層中轉(zhuǎn)錄因子NeuroDl的表達(dá)和活性，從而抑制或者降低由腦部?jī)?nèi)源性的嗎啡類似物導(dǎo)致的成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降。同時(shí)，利用阿片類藥物拮抗劑(納絡(luò)酮，naloxone)在阻斷腦部?jī)?nèi)源性的嗎啡類似物的生理作用的同時(shí)，提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。
[0010]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0011]本發(fā)明提供了納絡(luò)酮在用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供了納絡(luò)酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用在用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明還提供了一種提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的組合，包括獨(dú)立使用的編碼NeuroDlcDNA的慢病毒和納絡(luò)酮。
[0014]所述納絡(luò)酮的結(jié)構(gòu)式如下:
[0015]

N^\^CH2
/--\ 0?
HO°--
[0016]所述NeuroDl cDNA 序列如下(SEQ ID NO I):
[0017]atgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgggcgagcctcagccccaaggtcccccaagctggacagatgagtgtctcagttctcaggacgaggaacacgaggcagacaagaaagaggacgagcttgaagccatgaatgcagaggaggactctctgagaaacgggggagaggaggaggaggaagatgaggatctagaggaagaggaggaagaagaagaggaggaggaggatcaaaagcccaagagacggggtcccaaaaagaaaaagatgaccaaggcgcgcctagaacgttttaaattaaggcgcatgaaggccaacgcccgcgagcggaaccgcatgcacgggctgaacgcggcgctggacaac
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tacatctgggctctgtcagagatcctgcgctcaggcaaaagccctgatctggtctccttcgtacagacgctctgc
aaaggtttgtcccagcccactaccaatttggtcgccggctgcctgcagctcaaccctcggactttcttgcctgag
cagaacccggacatgcccccgcatctgccaaccgccagcgcttccttcccggtgcatccctactcctaccagtcc
cctggactgcccagcccgccctacggcaccatggacagctcccacgtcttccacgtcaagccgccgccacacgcc
tacagcgcagctctggagcccttctttgaaagccccctaactgactgcaccagcccttcctttgacggacccctc
agcccgccgctcagcatcaatggcaacttctctttcaaacacgaaccatccgccgagtttgaaaaaaattatgcc
tttaccatgcactaccctgcagcgacgctggcagggccccaaagccacggatcaatcttctcttccggtgccgct
gcccctcgctgcgagatccccatagacaacattatgtctttcgatagccattcgcatcatgagcgagtcatgagt
gcccagcttaatgccatctttcacgattag。
[0018]所述編碼NeuroDl cDNA 的慢病毒(Ientivirus)使用 “ Invitrogen” 公司的“BLOCK-1T?Lentiviral Pol II miR RNAi Express1n System，，試劑盒制備。其中，NeuroDlcDNA被克隆到試劑盒中的V5-DEST中，再與其他三個(gè)質(zhì)粒pLPl, pLP2和pLP/VSVG共同轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液；過濾后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)確定病毒的感染滴度(Transducing Unites，TU)，并最終獲得滴度在I X 109TU/ml的病毒濃縮液。
[0019]更具體地，所述編碼NeuroDl cDNA的慢病毒，利用“Invitrogen”公司的^ BLOCK-1 T?Len t i v i r a I Pol II miR RNAi Express1n System，，試劑盒制備；V5-DEST質(zhì)粒利用SpeI和XhoI內(nèi)切酶處理，獲得去除不必要片斷的質(zhì)粒骨架；利用上游包含SpeI酶切位點(diǎn)(5，-actgactagtaccatgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgg-3，)，下游包含 XhoI 酶切位點(diǎn)(5，-actgctcgagctaatcgtgaaagatggcattaagctgggcactc-3，)的引物擴(kuò)增 NeuroDlcDNA并在酶切之后與質(zhì)粒骨架進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒V5-ND ;構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒V5-ND與其他三個(gè)質(zhì)粒pLPl，pLP2和pLP/VSVG共同轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，在完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的三天內(nèi)收集細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液再經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾(0.45微米)之后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)確定病毒的感染滴度(Transducing Unites，TU)，并最終獲得滴度在lX109TU/ml的病毒濃縮液。
[0020]本發(fā)明所具有的有益效果:
[0021]本發(fā)明提供了一種納洛酮在制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的新的應(yīng)用。由于沒有明顯的副作用，納絡(luò)酮的使用劑量可以保證其對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力具有足夠的促進(jìn)作用。嗎啡鎮(zhèn)痛作用的半數(shù)有效劑量一般是lmg/kg，而本發(fā)明納絡(luò)酮的使用劑量可以完全阻斷10mg/kg嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。
[0022]由于沒有明顯的副作用，本發(fā)明編碼NeuroDl cDNA的慢病毒的使用劑量都可以保證其對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力具有足夠的促進(jìn)作用。其中，編碼NeuroDl cDNA的慢病毒可以保證海馬齒狀回顆粒下層中>95%的細(xì)胞被感染，同時(shí)提高海馬區(qū)NeuroDl表達(dá)到原有水平的300%左右。
[0023]本發(fā)明納絡(luò)酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用，由于阻斷了腦部?jī)?nèi)源性的嗎啡類似物對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，可以有效提高海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生的效率以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為V5-DEST質(zhì)粒的基本構(gòu)造圖，引自“Invitrogen”公司的“BLOCK-1T?Lentiviral Pol II miR RNAi Express1n System” 試劑盒的產(chǎn)品說明書。
[0025]圖2:V5-DEST質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)附近的DNA序列，包括NeuroDl cDNA的插入位點(diǎn)(黃色)，引自 “Invitrogen”公司的“BLOCK-1T? Lentiviral Pol II miR RNAi Express1nSystem”試劑盒的產(chǎn)品說明書。
[0026]圖3為納絡(luò)酮使用后對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響結(jié)果對(duì)比圖。
[0027]圖4為編碼NeuroDl cDNA的慢病毒對(duì)海馬區(qū)NeuroDl表達(dá)的影響結(jié)果對(duì)比圖。
[0028]圖5納絡(luò)酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的促進(jìn)作用的結(jié)果對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030]實(shí)施例1
[0031 ] 1、獲得小鼠組織中的RNA，并獲得cDNA
[0032]將小鼠組織放在液氮中研磨成粉末后，再以每10mg組織加入1mlTRIzol (Invitrogen公司)研磨,注意樣品總體積不能超過所用TRIzol體積的10%。研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1ml TRIzoI液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。取上層水相于一新的離心管，按每1ml TRIzol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。棄去上清液，按每1ml TRIzol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4°C下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55°C -60 V水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70 %乙醇并保存于_70°C。
[0033]利用Quant Reverse Transcriptase試劑盒(天根生化科技)合成cDNA。按照下表配置混合液，在37°C中孵育I小時(shí)。
[0034]

【權(quán)利要求】
1.納絡(luò)酮在用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。
2.納絡(luò)酮和編碼NeuroDlcDNA的慢病毒聯(lián)用在用于制備提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的藥物中的應(yīng)用。
3.一種提高空間學(xué)習(xí)記憶能力的組合，其特征在于:包括獨(dú)立使用的編碼NeuroDlcDNA的慢病毒和納絡(luò)酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高空間學(xué)習(xí)能力的組合，其特征在于:所述編碼NeuroDl cDNA 的慢病毒使用 “Invitrogen” 公司的 “BLOCK-1T? Lentiviral Pol II miRRNAi Express1n System”試劑盒制備。其中，NeuroDl cDNA被克隆到試劑盒中的V5-DEST中，再與其他三個(gè)質(zhì)粒pLPl，pLP2和pLP/VSVG共同轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液；過濾后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細(xì)胞確定病毒的感染滴度，并最終獲得滴度在I X 109TU/ml的病毒濃縮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提高空間學(xué)習(xí)能力的組合，其特征在于:所述編碼NeuroDl cDNA 的慢病毒，利用 “ Invitrogen” 公司的 “BLOCK-1T? Lentiviral Pol II miRRNAi Express1n System”試劑盒制備；V5_DEST質(zhì)粒利用SpeI和XhoI內(nèi)切酶處理,獲得去除不必要片斷的質(zhì)粒骨架；利用上游包含SpeI酶切位點(diǎn)(actgactagtaccatgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgg),下游包含 XhoI 酶切位點(diǎn)(actgctcgagctaatcgtgaaagatggcattaagctgggcactc)的引物擴(kuò)增NeuroDl cDNA并在酶切之后與質(zhì)粒骨架進(jìn)行連接,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒V5-ND ;構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒V5-ND與其他三個(gè)質(zhì)粒pLPl，pLP2和pLP/VSVG共同轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，在完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的三天內(nèi)收集細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液再經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾(0.45微米)之后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細(xì)胞確定病毒的感染滴度，并最終獲得滴度在I X 109TU/ml的病毒濃縮液。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK104127415SQ201410393385
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】鄭輝, 李文, 何松蔚, 孫昊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院