一種黑根霉胞外多糖在制備治療或預(yù)防消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黑根霉胞外多糖在制備治療或預(yù)防消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的黑根霉胞外多糖的制備方法如下：(1)取菌種保藏號(hào)為CGMCC?NO.8436的黑根霉，經(jīng)活化和發(fā)酵培養(yǎng)，制得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液經(jīng)分離純化，制得粗提液；(3)將粗提液經(jīng)樹脂柱脫色，Seveage試劑振蕩脫蛋白，Sephadex?G-50葡聚糖凝膠柱層析純化，制得黑根霉胞外多糖。本發(fā)明利用黑根霉胞外多糖通過建立動(dòng)物腫瘤模型，對(duì)黑根霉胞外多糖的實(shí)體抗消化道系統(tǒng)腫瘤活性進(jìn)行探究，動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)抗腫瘤結(jié)果表明，黑根霉胞外多糖可以明顯抑制胃癌腫瘤小鼠、結(jié)腸癌腫瘤小鼠的腫瘤塊的生長(zhǎng)，并且和現(xiàn)有化療藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥抗腫瘤療效明顯高于環(huán)磷酰胺單獨(dú)用藥的抗腫瘤效果。
【專利說明】一種黑根霉胞外多糖在制備治療或預(yù)防消化道腫瘤藥物中 的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑根霉胞外多糖在制備治療或預(yù)防消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬 于醫(yī)藥及保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)的快速提高，人民的生活節(jié)奏加快、方式多樣化，以及大氣 環(huán)境污染的日趨加重、人口老齡化加劇等因素，導(dǎo)致亞健康人群劇增，我國(guó)的惡性腫瘤的發(fā) 病率及死亡率不斷增長(zhǎng)，如今癌癥死亡率已經(jīng)上升到首位，且成為人民日益關(guān)注的社會(huì)問 題。消化道腫瘤是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤，主要包括胃癌、食管癌、大腸癌以及肝癌。隨 著我國(guó)人民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改善及不良生活習(xí)慣的日積月累，我國(guó)已經(jīng)成為 消化道腫瘤高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和死亡率抑制位于惡性腫瘤前列。據(jù)統(tǒng)計(jì)，平均每小時(shí)就有 120個(gè)中國(guó)人死于消化道癌癥，其中肝癌的發(fā)病率已經(jīng)是世界之首，結(jié)直腸癌以每年3. 9% 的幅度不斷攀升，胃癌患者人數(shù)占世界的50%，消化道腫瘤嚴(yán)重威脅著中國(guó)人的生命和健 康。腫瘤的治療方法主要包括藥物治療，放射治療和手術(shù)治療。各種治療均能夠殺死一定的 腫瘤細(xì)胞，但是都存在各自的弊端，不能徹底治愈腫瘤。化療是消化道治療常用的方法，但 化療藥物對(duì)靶點(diǎn)的選擇性差，在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)對(duì)機(jī)體的正常免疫細(xì)胞也具有殺傷作用， 同時(shí)化療藥物可引起惡心和嘔吐，引起營(yíng)養(yǎng)不良，使患者免疫力嚴(yán)重下降?；熕幬锂a(chǎn)生的 副作用和其引發(fā)的過敏反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用，并且上述化療治療方法費(fèi)用昂貴、預(yù)后較 差。所以尋求一種針對(duì)消化道系統(tǒng)癌癥療效顯著、副作用小、費(fèi)用低廉的抗腫瘤藥物和治療 方法具有重要意義。
[0003] 真菌多糖抗腫瘤藥物屬于中醫(yī)藥抗腫瘤藥物的重要組成部分，我國(guó)真菌資源豐 富，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就對(duì)赤芝草、茯苓等真菌的扶正固本效用做了介紹。真菌多糖是 真菌發(fā)揮功效的主要成分，分離于真菌子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液中，由10個(gè)以上單糖分子 主要以β_1，3和β-1，6糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物。很多研究表明多種真菌多 糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗輻射等多種生物活性且毒性很低，現(xiàn)已成為開 發(fā)癌癥治療藥物的重要來(lái)源之一。我國(guó)對(duì)真菌多糖的研究近年取得很大的進(jìn)展。有實(shí)驗(yàn)研 究表明，香菇多糖已應(yīng)用于治療胃腸道腫瘤，治療過程中機(jī)體的免疫球蛋白含量提高，相關(guān) 細(xì)胞因子、⑶3、⑶4、⑶4/⑶8比值明顯升高，血小板和白細(xì)胞含量也有所提高，并且香菇多 糖、云芝多糖、灰樹花多糖等作為抗腫瘤輔助藥物已進(jìn)入臨床應(yīng)用。
[0004] 除了傳統(tǒng)的大型真菌來(lái)源的真菌多糖，許多研究表明霉菌來(lái)源的多糖也同樣具有 多種生物學(xué)活性，因其成本低廉、培養(yǎng)易操作等優(yōu)勢(shì)，開始受到關(guān)注。
[0005] 黑根霉（R. nigricans Ehrenb.)是一種絲狀真菌，具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)，液體發(fā)酵培 養(yǎng)過程中分泌大量的胞外多糖。黑根霉胞外粗多糖包含多種組分，采用不同的分離純化方 法可以獲得不同的均一多糖。前期研究表明黑根霉胞外多糖具有顯著體外抗人胃癌細(xì)胞 SGC-7901、人白血病細(xì)胞K562、小鼠腹水瘤細(xì)胞S180體外增殖的活性，并且促進(jìn)脾淋巴細(xì) 胞體外增殖和IL-2的分泌。目前，黑根霉胞外多糖的功能性研究已成為黑霉菌研究的熱 點(diǎn)，但黑根霉胞外多糖對(duì)抗實(shí)體瘤，特別是抗消化道系統(tǒng)腫瘤活性的研究還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有抗消化道類腫瘤藥物不足，提供一種黑根霉胞外多糖在制備治療 或預(yù)防消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0007] 一種黑根霉胞外多糖在制備治療或預(yù)防消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于， 所述的黑根霉胞外多糖的制備方法如下：
[0008] (1)取菌種保藏號(hào)為CGMCC N0. 8436的黑根霉接種于PDA培養(yǎng)基中，在25?30°C 的條件下活化培養(yǎng)3?5d，制得活化后的菌絲；將活化后的菌絲轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，在 25?30°C、100?200rpm/min的條件下培養(yǎng)5?10d，制得發(fā)酵液；
[0009] (2)將步驟（1)制得的發(fā)酵液經(jīng)固液分離，收集分離后的液體，經(jīng)濃縮后，在室溫 條件下，向濃縮液中加入3?4倍體積的體積百分比為95%的酒精，靜置后，分離沉淀，將沉 淀溶于蒸餾水中，再次分離沉淀，取上清液，制得粗提液；
[0010] (3)將步驟（2)制得的粗提液經(jīng)D301-R型樹脂柱脫色，收集洗脫液，然后加入洗脫 液體積1/4的Seveage試劑振蕩脫蛋白，取上清液，除去有機(jī)溶劑，制得粗糖溶液，然后將粗 糖溶液經(jīng)過S印hadex G-50葡聚糖凝膠柱層析純化，經(jīng)蒸餾水洗脫，流度為5mL/min，檢測(cè)合 并收集高峰區(qū)的多糖洗脫液，將洗脫液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥，制得黑根霉胞外多糖。黑根霉 胞外多糖為淡黃色粉末狀固體。
[0011] 所述步驟（1)中，PDA培養(yǎng)基每升組分如下：
[0012] 馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15g，自來(lái)水定容至1L。
[0013] 液體培養(yǎng)基每升組分如下：
[0014] 液體PDB發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下：馬鈴薯200g，蔗糖20g，自來(lái)水定容至1L。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，濃縮為在55?60°C的條件下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn) 行濃縮。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，濃縮后濃縮液體積為濃縮前液體體積的三 分之一。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，分離沉淀為在12000rpm/min的條件下離心 15min〇
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中，Seveage試劑為氯仿與正丁醇按體積比4:1 的比例混合制得。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中，檢測(cè)為采用苯酚-硫酸法檢測(cè)糖含量。
[0020] 所述的黑根霉胞外多糖由兩種多糖組分EPS-1和EPS-2構(gòu)成，又進(jìn)一步從EPS-1 中分離純化出了 EPS1-1。EPS1-1和EPS-2為組分均一的多糖，分子量分別為9682Da 和1.979X 105Da。EPS1-1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖組成，其摩爾比例為： 5. 89:3. 64:3. 2:1。EPS-2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及少量未知化合物組成，半乳 糖、鼠李糖、阿拉伯糖、摩爾比例為：17.8:2. 3:1。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的腫瘤藥物包括藥效成分為黑根霉胞外多糖與環(huán)磷酰胺 以及藥學(xué)上可接受的輔料。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的黑根霉胞外多糖與環(huán)磷酰胺的質(zhì)量比為1 : (3. 5?4);最優(yōu)的，黑根霉胞外多糖與環(huán)磷酰胺的質(zhì)量比為1 :3. 75。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的消化道腫瘤為胃癌與結(jié)腸癌。
[0024] 有益效果
[0025] 本發(fā)明利用黑根霉胞外多糖（EPS)通過建立動(dòng)物腫瘤模型，如裸鼠胃癌模型、裸 鼠結(jié)腸癌模型，sl80昆明鼠肉瘤模型等，對(duì)黑根霉胞外多糖的實(shí)體抗消化道系統(tǒng)腫瘤活性 進(jìn)行探究，動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)抗腫瘤結(jié)果表明，黑根霉胞外多糖可以明顯抑制胃癌腫瘤小鼠、結(jié) 腸癌腫瘤小鼠的腫瘤塊的生長(zhǎng)，并且和現(xiàn)有化療藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥抗腫瘤療效明顯高 于環(huán)磷酰胺單獨(dú)用藥的抗腫瘤效果。結(jié)果表明EPS對(duì)消化道系統(tǒng)腫瘤有顯著治療作用，同 時(shí)提高荷瘤小鼠的免疫功能，與多糖劑量呈正相關(guān)性。同時(shí)，在sl80腹水瘤小鼠的壽命延 長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)過程中，服用EPS的腹水小鼠生存質(zhì)量提高，壽命明顯延長(zhǎng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1EPS1-1的高效凝膠滲透色譜圖
[0027] 圖2EPS-2的高效凝膠滲透色譜圖
[0028] 圖3EPS1-1標(biāo)準(zhǔn)單糖液相色譜圖
[0029] 圖4EPS1-1單糖組成液相色譜圖
[0030] 圖5EPS-2標(biāo)準(zhǔn)單糖液相色譜圖
[0031] 圖6EPS-2單糖組成液相色譜圖
[0032] 圖7黑根霉胞外多糖預(yù)防給藥途徑對(duì)S180荷瘤小鼠實(shí)體瘤的抑制作用
[0033] 圖8黑根霉胞外多糖治療給藥途徑對(duì)S180荷瘤小鼠實(shí)體瘤的抑制作用
[0034] 圖9預(yù)防末次給藥后腫瘤模型組（A)與多糖高劑量組⑶小鼠對(duì)比；
[0035] 其中：*表示t檢驗(yàn)后，與對(duì)照組相比呈顯著性差異（P〈0. 05)
[0036] **表示t檢驗(yàn)后，與對(duì)照組相比呈極顯著性差異（P〈0. 01)

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0038] 生物材料來(lái)源：
[0039] 實(shí)施例中所述的黑根霉來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號(hào)： CGMCCN0. 8436。
[0040] 實(shí)施例1黑根霉胞外多糖的制備
[0041] (1)取黑根霉接種于PDA培養(yǎng)基中，在28°C的條件下活化培養(yǎng)3d，制得活化后的菌 絲；將活化后的菌絲轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，在28°C、120rpm/min的條件下培養(yǎng)7d，制得發(fā)酵 液；
[0042] PDA培養(yǎng)基每升組分如下：
[0043] 馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15g，自來(lái)水1000mL，pH自然。
[0044] 液體培養(yǎng)基每升組分如下：
[0045] 液體PDB發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下：馬鈴薯200g，蔗糖20g，自來(lái)水1000mL，pH自 然。
[0046] (2)用四層紗布過濾發(fā)酵液，除去菌絲和孢子，收集過濾后的發(fā)酵液，在4000rpm/ min條件下離心15min，收集上清，將收集到的上清置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，60°C濃縮至原 體積的三分之一，冷卻至室溫，制得濃縮液，向濃縮液中加入其3倍體積的體積百分比為 95%的酒精靜置過夜，在12000印 111/1^11的條件下離心151^11，收集沉淀，將收集的沉淀溶于 蒸餾水，相同條件下再次離心取上清，并過D301-R型樹脂柱脫色，收集洗脫液，然后加入洗 脫液體積1/4的Seveage試劑（氯仿：正丁醇=4:1，V/V)振蕩脫蛋白，將上清蒸饋除去有 機(jī)溶劑，制得粗糖溶液，然后經(jīng)過Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，用蒸 餾水進(jìn)行洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，流度為5mL/min，采用苯酚-硫酸法檢測(cè)糖含量，合并 收集高峰區(qū)的多糖洗脫液，將洗脫液進(jìn)行濃縮，然后冷凍干燥，制得黑根霉胞外粗多糖，其 為淡黃色粉末狀固體。
[0047] 高效凝膠色譜（HPGPC)分析與測(cè)定，制得的黑根霉胞外粗多糖可分為兩種多糖組 分EPS-1和EPS-2,進(jìn)一步分離純化出兩種組分均一的多糖組分，EPS1-1和EPS-2。經(jīng)過 高效凝膠色譜（HPGPC)分析與測(cè)定，它們的分子量分別為9682Da和1. 979X 105Da(見圖 1和圖2)。采用高效液相色譜法其單糖組成進(jìn)行了分析，EPS1-1主要由葡萄糖、半乳糖、 甘露糖以及果糖組成，其摩爾比例為：5. 89:3. 64:3. 2:1 (見圖3和圖4) ;EPS-2主要由鼠 李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及少量未知化合物組成，半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、摩爾比例為： 17. 8:2. 3:1(見圖 5 和圖 6)。
[0048] 實(shí)施例2黑根霉胞外多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用
[0049] 通過對(duì)裸鼠接種胃癌細(xì)胞株，建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，采用灌胃方法，對(duì)胃癌 裸鼠進(jìn)行治療，觀察黑根霉胞外多糖聯(lián)合化療藥物對(duì)胃癌荷瘤小鼠的作用。
[0050] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0051] 收集對(duì)數(shù)期的胃癌MGC803細(xì)胞，PBS稀釋至5X 107個(gè)/mL。無(wú)菌條件下，裸鼠左 腋下接種〇. 2mL細(xì)胞懸浮液，觀察3-5d，等腋下出現(xiàn)米粒大小較硬的結(jié)節(jié)作為建模成功的 標(biāo)準(zhǔn)。
[0052] 待腫瘤快生長(zhǎng)至直徑為5_時(shí)，隨機(jī)4分組，每組6只，開始給藥治療實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn) 組分別為：生理鹽水對(duì)照組，黑根霉組（75mg/kg，實(shí)施例1制得的黑根霉胞外粗多糖），環(huán)磷 酰胺組（20mg/kg，CY)，聯(lián)合給藥組（75mg/kgEPS+20mg/kgCY)。每天灌胃給藥一次，連續(xù)給 藥10d。治療期間每天觀察動(dòng)物的精神、活動(dòng)、飲食、皮毛等征象。最后一次給藥后，禁食不 禁水24h后，結(jié)束稱重并處死動(dòng)物。剝?nèi)『闪鲂∈蟮哪[瘤組織并稱重，計(jì)算抑瘤率。
[0053] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
[0054] 腫瘤模型建立開始，小鼠皮毛光滑，進(jìn)食進(jìn)水正常，反應(yīng)靈活，組間差異不明顯。
[0055] 隨著腫瘤組織的增大，和給藥治療，組間出現(xiàn)不同程度的差異；對(duì)照組小鼠攝食量 明顯下降，精神萎靡加重，活動(dòng)遲緩甚至不動(dòng)。單獨(dú)給藥黑根霉組出現(xiàn)不同程度的皮毛失去 光澤，行動(dòng)緩慢。環(huán)磷酰胺組小鼠有些消瘦，但活動(dòng)和攝食量較對(duì)照組和單獨(dú)給藥組比較靈 活。聯(lián)合給藥組小鼠，體質(zhì)較好，瘤體積也較小，活動(dòng)較靈活。
[0056] 由表1可知，環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合給藥組小鼠的瘤重與腫瘤對(duì)照組的差異顯著 (P〈0. 05)，黑根霉組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合給藥組對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞小鼠實(shí)體瘤的抑瘤率分 別為 28. 11%、33· 09%和 44. 12%。
[0057] 表1EPS聯(lián)合CY治療對(duì)裸鼠胃癌模型的抑瘤作用（11=6，χ士j)
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種黑根霉胞外多糖在制備治療或預(yù)防消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所 述的黑根霉胞外多糖的制備方法如下： (1) 取菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 8436的黑根霉接種于PDA培養(yǎng)基中，在25?30°C的條 件下活化培養(yǎng)3?5d，制得活化后的菌絲；將活化后的菌絲轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，在25? 30°C、100?200rpm/min的條件下培養(yǎng)5?10d，制得發(fā)酵液； (2) 將步驟（1)制得的發(fā)酵液經(jīng)固液分離，收集分離后的液體，經(jīng)濃縮后，在室溫條件 下，向濃縮液中加入3?4倍體積的體積百分比為95%的酒精，靜置后，分離沉淀，將沉淀溶 于蒸餾水中，再次分離沉淀，取上清液，制得粗提液； ⑶將步驟⑵制得的粗提液經(jīng)D301-R型樹脂柱脫色，收集洗脫液，然后加入洗脫液體 積1/4的Seveage試劑振蕩脫蛋白，取上清液，除去有機(jī)溶劑，制得粗糖溶液，然后將粗糖溶 液經(jīng)過Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱層析純化,經(jīng)蒸饋水洗脫，流度為5mL/min,檢測(cè)合并收 集高峰區(qū)的多糖洗脫液，將洗脫液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥，制得黑根霉胞外多糖。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟⑵中，濃縮為在55?60°C的條 件下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2)中，濃縮后濃縮液體積為濃縮 前液體體積的三分之一。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2)中，分離沉淀為在12000rpm/ min的條件下離心15min。
5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（3)中，Seveage試劑為氯仿與正 丁醇按體積比4:1的比例混合制得。
6. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（3)中，檢測(cè)為采用苯酚-硫酸法 檢測(cè)糖含量。
7. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤藥物包括藥效成分為黑根霉胞 外多糖與環(huán)磷酰胺以及藥學(xué)上可接受的輔料。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖與環(huán)磷酰胺的質(zhì)量 比為1 :(3. 5?4)。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，黑根霉胞外多糖與環(huán)磷酰胺的質(zhì)量比為1 : 3. 75。
10. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的消化道腫瘤為胃癌與結(jié)腸癌。
【文檔編號(hào)】A61K31/715GK104042623SQ201410256219
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】陳靠山, 侯東, 于志丹, 禹文茜, 陳國(guó)創(chuàng), 石磊, 周南 申請(qǐng)人:山東大學(xué)