一種熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體及其制備方法，首先將MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O粉碎，用NaOH水溶解，攪拌靜置后干燥，高溫焙燒，冷卻后研細(xì)成粉末狀，用熱蒸餾水和無水乙醇清洗干燥后得MZF-NP。將DPPC與膽固醇混合，然后加入氯仿和無水乙醚混合液，超聲分散溶解，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成一均勻薄膜。將PBS中加入As2O3溶液和明膠，溶解后加入MZF-NP，超聲分散，形成混懸液，加到上述含薄膜的容器中，攪拌震蕩至薄膜脫落，加甘油混勻，反復(fù)凍融及超聲處理3次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。
【專利說明】一種熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗腫瘤的納米藥物領(lǐng)域，涉及一種作為治療癌癥的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熱敏脂質(zhì)體是近年來興起的一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，它可以利用脂質(zhì)體的載藥特性和熱療的雙重優(yōu)勢來提高治療效果，降低毒副作用。其原理是當(dāng)達(dá)到相變溫度時，脂質(zhì)體中的磷脂產(chǎn)生從膠態(tài)過渡到液晶態(tài)的物理轉(zhuǎn)移，膜的流動性和通透性增加，藥物大量擴散到靶器官中，對周圍的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較強的殺傷作用，從而達(dá)到局部化療的作用，如果相變溫度處于腫瘤熱療溫度41°C到46°C之間，可以同時發(fā)揮腫瘤熱療的作用。近年來又有學(xué)者[1]將磁性材料如右旋糖酐鐵等包裹在脂質(zhì)體發(fā)展起來一種新型脂質(zhì)體-磁性脂質(zhì)體，除了具備脂質(zhì)體的特點，它可以在體外磁場的作用下，把抗癌藥物選擇性地輸送和定位于靶區(qū)，從而降低藥量，減小毒性，提高療效。包封在磁性脂質(zhì)體中的磁性材料主要用途在于將脂質(zhì)體磁性靶向到腫瘤部位，提高了治療的靶向性，但近年來納米磁性材料的升溫?zé)岑熌[瘤作用越來越受到重視，磁性納米材料能在在交變磁場下產(chǎn)熱增強熱療效果，進(jìn)而改善腫瘤區(qū)域內(nèi)的血液循環(huán)和血管的通透性，有利于治療腫瘤的藥物達(dá)到腫瘤靶向區(qū)域。還有學(xué)者直接在磁性納米材料內(nèi)加入抗癌物質(zhì)，達(dá)到熱療和藥物治療的雙重效果，此過程中磁性材料起到增強產(chǎn)熱和靶向藥物輸送的雙重作用。利用磁性納米材料的另一個突出的優(yōu)點就是它可以進(jìn)行自動控溫、恒溫。由于鐵磁性物質(zhì)本身具有居里溫度的特點，當(dāng)溫度升至居里點后鐵磁性失去磁性而降溫，低于居里點后又恢復(fù)磁性而升溫，從而達(dá)到對腫瘤熱療的自動控溫和恒溫，這對深部腫瘤的熱療具有重要的意義。我們成功研制出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的磁性錳鋅鐵氧體納米顆粒，它是一種具有較低居里溫度的軟磁鐵氧體材料，在交變磁場照射下可以強烈吸收電磁波能量而升溫；當(dāng)溫度達(dá)到居里溫度時，它轉(zhuǎn)變?yōu)榉谴判晕镔|(zhì)而失去吸收電磁波能量的能力，使溫度下降，當(dāng)溫度低于居里溫度時，又恢復(fù)升溫錳鋅鐵氧體納米微球又恢復(fù)磁性升溫，如此往復(fù)，使溫度始終控制在設(shè)定的居里溫度處，從而實現(xiàn)對腫瘤加熱治療的自動升溫和控溫，提高治療效果的穩(wěn)定性和安全性。我們也研究出了當(dāng)Mnl-XZnxFe204中的x為0.5時，其經(jīng)過交換散熱后能夠緩慢升至腫瘤治療的合適溫度(41°C_46°C)并保持恒定不變，達(dá)到抗腫瘤而又不損傷正常組織的治療效果。
[0003]磁性納米材料熱療的前景是十分廣闊的，但若是單純熱療沒有載藥，其作用仍顯單一，研究表明，化療藥物與熱療聯(lián)合具有顯著的協(xié)同作用。
[0004]在腫瘤治療的藥物中，砷及其化合物是人類最早用于治療腫瘤的，現(xiàn)在三氧化二砷注射液已作為國家二類新藥正式上市，國內(nèi)外研究其對實體瘤的作用，如乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌，確認(rèn)了其廣譜抗癌性。另外，As2O3在臨床治療白血病時，不但效果顯著，而且沒有化療藥物引起的骨髓抑制等毒副作用，無全反式維甲酸治療引起的易復(fù)發(fā)、易耐藥等缺點。但是由于全身用藥，血漿砷濃度很快升高并迅速彌散周圍組織，所以仍有少部分病人出現(xiàn)消化道癥狀、末梢神經(jīng)炎、皮膚干燥、色素沉著，甚至出現(xiàn)腎功能損害等副作用。所以，開發(fā)As2O3新劑型，提高藥物在靶區(qū)的濃度減少對其他組織的損傷是提高抗腫瘤療效迫切要解決的問題。
[0005]基于以上研究成果我們采用改良的薄膜分散加高壓勻質(zhì)法制備熱敏脂質(zhì)體，將As2O3和錳鋅鐵磁性納米粒包封于其中，解決脂質(zhì)體的相變溫度問題，制備成熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體，利用錳鋅鐵氧體在交變磁場中自動升溫、恒溫性能達(dá)到熱敏脂質(zhì)體的相變溫度(41°C -46°C )，實現(xiàn)包封于脂質(zhì)體中的As2O3的控緩釋，達(dá)到熱化療共同抗腫瘤的目的，另外，包封的磁性材料在脂質(zhì)體中起導(dǎo)向和定位作用，使脂質(zhì)體在外加磁場作用下，隨血液循環(huán)聚集到靶器官，使治療的靶向性和專一性增強。本研究期望通過脂質(zhì)體集熱療、化療、熱控釋、磁靶向等優(yōu)點為一體，為腫瘤的治療開拓了新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題:本發(fā)明提供一種將熱敏脂質(zhì)體與三氧化二砷、錳鋅鐵納米粒子有機結(jié)合，同時具有腫瘤化療熱療作用的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體，同時提供一種該納米磁性砒霜脂質(zhì)體的制備方法。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I)制備錳鋅鐵磁性納米粒子:
[0009]將MnSO4.H2O, ZnSO4.7H20、FeSO4.7H20按摩爾比1: 1:4混合，置于電動粉碎機中粉碎成末，然后根據(jù)所有金屬離子總和與氫氧根離子摩爾比為1:2.4，將NaOH水溶液加入到粉末中，用電動攪拌機攪拌三小時得糊狀物，將其靜置過夜后置80°C烤箱中干燥，再置馬弗爐內(nèi)400°C焙燒I小時 得干燥塊狀物，冷卻后將其研細(xì)成粉末狀，用熱蒸餾水進(jìn)行多次磁分離洗滌，直至用1% BaCL2溶液檢驗不到3042_后，用無水乙醇磁分離洗滌，60°C~70°C烘干，得到錳鋅鐵磁性納米粒子；
[0010]2)將DPPC與膽固醇按質(zhì)量比(10~5): 3混合后，加入氯仿和無水乙醚混合液，至DPPC與膽固醇完全溶解，超聲分散后，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在42°C下恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到有機溶劑完全揮發(fā)，在容器內(nèi)壁形成一均勻薄膜；
[0011]3)按明膠:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為(0.4~0.5):1，將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，然后按照As2O3與錳鋅鐵納米粒子的質(zhì)量比為1:60~30，先向磷酸鹽緩沖液加入IOmmoI/L的As2O3溶液，55°C~65°C水浴溶解后，再加入錳鋅鐵磁性納米粒子，室溫超聲分散，形成混懸液，其中錳鋅鐵磁性納米粒子:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為(1.5~2):1;
[0012]4)將步驟3)制備的混懸液加到步驟2)得到的含薄膜的容器中，電動攪拌震蕩至薄膜脫落，將甘油與混懸液按體積比1: (10~15)混勻，置于-20°c中冷凍I~2小時，370C融化，超聲分散30~45秒后再置于_20°C中I~2小時，如此反復(fù)凍融及超聲分散3~5次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。
[0013]本發(fā)明方法優(yōu)選方案的步驟2)中，氯仿和無水乙醚混合液中氯仿和無水乙醚體積比為2:1~10:1。
[0014]本發(fā)明的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體，是按照上述方法制備得到的。
[0015]有益效果:本發(fā)明將熱敏脂質(zhì)體與三氧化二砷、錳鋅鐵氧體相結(jié)合，形成一種新的腫瘤治療藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:[0016]1.采用本發(fā)明制備出的錳鋅鐵氧體納米磁性粒子，透射電鏡下大小為30~40nm，分散性良好(見附圖1)。體外磁感應(yīng)升溫能力良好，在頻率為200kHz、功率為4kW，輸出加熱電流為300A的交變磁場照射下，在40分鐘內(nèi)升到最高溫度45°C，并保持溫度恒定，因此可以作為一種磁感應(yīng)加熱納米粒來治療腫瘤。而其余配比下制備出的錳鋅鐵納米磁性粒子，體外升溫實驗中，溫度都過高或者過低。不適于應(yīng)用于腫瘤的治療。
[0017]2.本發(fā)明制備的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體一個重要的特點是相變溫度的實現(xiàn)是通過包封在脂質(zhì)體中的磁性材料在外界磁場的作用下自動升溫控溫完成的，不需依賴外界的升溫系統(tǒng)，當(dāng)溫度達(dá)到相變溫度后，脂質(zhì)體膜的通透性增大，實現(xiàn)磁性材料的熱控釋作用，允許藥物緩慢釋放，有效地延長作用時間，并維持有效的產(chǎn)物濃度，提高局部的抗腫瘤效果。
[0018]3.一定量的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體體外作用于人類乳腺癌細(xì)胞株聯(lián)合磁感應(yīng)加熱后對細(xì)胞具有很強的生長抑制和促凋亡作用，與單純的包藥脂質(zhì)體，單純的包磁性材料脂質(zhì)體相比，效果更加顯著(p〈0.05)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1磁性錳鋅鐵氧體的透射電鏡圖。
[0020]圖2熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的透射電鏡圖。
[0021]圖3熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的體外升溫曲線。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實施例來對本發(fā)明做進(jìn)一步詳盡具體的說明。
[0023]本發(fā)明方法包括以下步驟:
[0024]I)制備錳鋅鐵磁性納米粒子:
[0025]將MnSO4.H2O, ZnSO4.7H20、FeSO4.7H20按摩爾比1: 1:4混合，置于電動粉碎機中粉碎成末，然后根據(jù)所有金屬離子總和與氫氧根離子摩爾比為1:2.4，將NaOH水溶液加入到粉末中，用電動攪拌機攪拌三小時得糊狀物，將其靜置過夜后置80°C烤箱中干燥，再置馬弗爐內(nèi)400°C焙燒I小時得干燥塊狀物，冷卻后將其研細(xì)成粉末狀，用熱蒸餾水進(jìn)行多次磁分離洗滌，直至用1% BaCL2溶液檢驗不到3042_后，用無水乙醇磁分離洗滌，60°C~70°C烘干，得到錳鋅鐵磁性納米粒子；
[0026]2)將DPPC與膽固醇按質(zhì)量比(10~5): 3混合后，加入氯仿和無水乙醚混合液，至DPPC與膽固醇完全溶解，超聲分散后，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在42°C下恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到有機溶劑完全揮發(fā)，在容器內(nèi)壁形成一均勻薄膜；
[0027]3)按明膠:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為(0.4~0.5):1，將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，然后按照As2O3與錳鋅鐵納米粒子的質(zhì)量比為1:60~30，先向磷酸鹽緩沖液加入IOmmoI/L的As2O3溶液，55°C~65°C水浴溶解后，再加入錳鋅鐵磁性納米粒子，室溫超聲分散，形成混懸液，其中錳鋅鐵磁性納米粒子:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為(1.5~2):1;
[0028]4)將步驟3)制備的混懸液加到步驟2)得到的含薄膜的容器中，電動攪拌震蕩至薄膜脫落，將甘油與混懸液按體積比1: (10~15)混勻，置于-20°c中冷凍I~2小時，370C融化，超聲分散30~45秒后再置于_20°C中I~2小時，如此反復(fù)凍融及超聲分散3~5次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。
[0029]步驟2)中，氯仿和無水乙醚混合液中氯仿和無水乙醚體積比為2:1~10:1。
[0030]其中DPPC為二棕櫚酰磷脂酰膽堿。
[0031]實施例1:
[0032]I)制備錳鋅鐵磁性納米粒子:
[0033]將MnSO4.H2O, ZnSO4.7H20、FeSO4.7H20按摩爾比1: 1:4混合，置于電動粉碎機中粉碎成末，然后根據(jù)所有金屬離子總和與氫氧根離子摩爾比為1:2.4，將NaOH水溶液加入到粉末中，用電動攪拌機攪拌三小時得糊狀物，將其靜置過夜后置80°C烤箱中干燥，再置馬弗爐內(nèi)400°C焙燒I小時得干燥塊狀物，冷卻后將其研細(xì)成粉末狀，用熱蒸餾水進(jìn)行多次磁分離洗滌，直至用I % BaCL2溶液檢驗不到S042_后，用無水乙醇磁分離洗滌，60°C烘干，得到錳鋅鐵磁性納米粒子；
[0034]2)將DPPC與膽固醇按質(zhì)量比5:3混合后，加入氯仿和無水乙醚混合液，(氯仿和無水乙醚的體積比為2:1)至DPPC與膽固醇完全溶解，超聲分散后，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在42°C下恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到有機溶劑完全揮發(fā)，在容器內(nèi)壁形成一均勻薄膜；其中膽固醇采用惠興生化試劑有限公司生產(chǎn)的批號為20100323的產(chǎn)品。
[0035]3)按明膠:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為0.4:1，將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，然后按照As2O3與錳鋅鐵納米粒子的質(zhì)量比為1:30，先向磷酸鹽緩沖液加入lOmmol/L的As2O3溶液，55°C水浴溶解后，再 加入錳鋅鐵磁性納米粒子，室溫超聲分散，形成混懸液，其中錳鋅鐵磁性納米粒子:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為1.5:1 ;
[0036]4)將步驟3)制備的混懸液加到步驟2)得到的含薄膜的容器中，電動攪拌震蕩至薄膜脫落，將甘油與混懸液按體積比1:10混勻，置于-20°c中冷凍I~2小時，37°C融化，超聲分散30秒后再置于_20°C中I小時，如此反復(fù)凍融及超聲分散3次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。
[0037]按每種物質(zhì)不同的配比制備的其他具體實施例如下:
[0038]實施例2:基本流程同實施例1，與實施例1不同之處在于:
[0039]步驟I)中，用無水乙醇磁分離洗滌后，70°C烘干，得到錳鋅鐵磁性納米粒子；
[0040]步驟2)中，將DPPC與膽固醇按質(zhì)量比10:3混合后，加入的氯仿和無水乙醚的混合液至DPPC與膽固醇完全溶解，混合液中氯仿和無水乙醚體積比為10:1，短時超聲分散使其完全溶解，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在42°C下恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到有機溶劑完全揮發(fā)，在玻璃容器內(nèi)壁形成一均勻薄膜；
[0041]步驟3)中:按明膠:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為0.5:1，將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，然后按照As2O3與錳鋅鐵納米粒子的質(zhì)量比為1:60，先向磷酸鹽緩沖液加入IOmmol/L的As2O3溶液，65°C水浴溶解后，再加入錳鋅鐵磁性納米粒子，室溫超聲分散，形成混懸液，其中錳鋅鐵磁性納米粒子:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為2:1;
[0042]步驟4)中:將甘油與混懸液按體積比1:15混勻，置于_20°C中冷凍2小時，37°C融化，超聲分散45秒后再置于_20°C中2小時，如此反復(fù)凍融及超聲分散5次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。本實施例其他比例關(guān)系與實施例1相同。
[0043]實施例3:基本流程步驟同實施例1，與實施例不同之處在于:
[0044]步驟I)中，用無水乙醇磁分離洗滌后，65°C烘干，得到錳鋅鐵磁性納米粒子；[0045]步驟2)中，將DPPC與膽固醇按質(zhì)量比7:3混合后，加入的氯仿和無水乙醚的混合液至DPPC與膽固醇完全溶解，混合液中氯仿和無水乙醚體積比為6:1，短時超聲分散使其完全溶解，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在42°C下恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到有機溶劑完全揮發(fā)，在玻璃容器內(nèi)壁形成一均勻薄膜；
[0046]步驟3)中:按明膠:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為0.45:1，將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，然后按照As2O3與錳鋅鐵納米粒子的質(zhì)量比為1:45，先向磷酸鹽緩沖液加入IOmmol/L的As2O3溶液，65°C水浴溶解后，再加入錳鋅鐵磁性納米粒子，室溫超聲分散，形成混懸液，其中錳鋅鐵磁性納米粒子:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為1.8:1 ;
[0047]步驟4)中:將甘油與混懸液按體積比1:13混勻，置于_201:中冷凍1.5小時，371:融化，超聲分散40秒后再置于_20°C中1.5小時，如此反復(fù)凍融及超聲分散4次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。本實施例其他比例關(guān)系與實施例1相同。
[0048]1.錳鋅鐵磁性納米粒子的表征和體外升溫實驗:制備的錳鋅鐵磁性納米粒子為黑色粉末，在無水乙醇超聲分散后，用透射電鏡觀察，Mna5Zna5Fe2O4近似球形，分散性較好，粒子團聚較少，平均粒徑20-30nm左右(圖1)。不同濃度的納米磁性材料Mn。.5ZnQ.5Fe204在體外交變磁場作用下具有升溫能力，在前30分鐘升溫迅速，30-45分鐘升溫平緩，之后溫度基本保持恒定不變，且10g/l濃度的復(fù)合納米粒升溫能達(dá)到腫瘤治療的有效溫度(41°C~460C )。另外取不同配比的MnxZrvxFe2O4 (X = 0.1, 0.3，…，0.9，1.0)納米粒各IOOmg,置于直徑25mm的平底試管中用雙蒸水配成濃度為20mg/ml的磁流體，分別置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上35分鐘，給定交變磁場200kHz、4kw，輸出電流300A，每隔五分鐘暫停加熱，用TM902C數(shù)字式溫度計測溫一次，所得數(shù)據(jù)輸入計算機繪制升溫和恒溫曲線。結(jié)果顯示:不同配比的錳鋅鐵氧體在濃度為20mg/ml時，在給定交變磁場(200kHz、4kw，輸出電流300A)中 15 分鐘內(nèi)分別達(dá)到并恒定于 400C (X = 0.1) ,420C (x = 0.3) ,45°C (x = 0.5)、61°C (x=0.7)、64°C (x = 0.9)、68°C (x = 1.0),顯示出了隨居里溫度的升高而升高的規(guī)律。
[0049]2.熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的表征和相變溫度測定實驗:取少量制備的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe204.熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體，用I X PBS緩沖液稀釋分散，滴有膜銅網(wǎng)，待干后TEM觀察。制備的As203/Mna 5Zn0.5Fe204熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體分散性良好，大部分為單室脂質(zhì)體，近似球形，粒徑較小，約lOOnm。掃描電鏡下可見脂質(zhì)體脂質(zhì)薄膜較厚，大小均一(圖2)。取制備的As203/Mna5Zna5Fe204.熱控釋納米磁性舭霜脂質(zhì)體Iml,用差熱分析儀測脂質(zhì)體的相變溫度。差熱分析儀結(jié)果顯示，As203/Mn0.5Zn0.5Fe204熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的相變溫度峰值為42.52°C。
[0050]3.熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體藥物包封率的測定:取未離心的脂質(zhì)體Iml (含As2O30.1mg)置于eppendorf管中，12000轉(zhuǎn)/分離心5min,收取離心液0.8ml,再用等量PBS緩沖液洗滌上述沉淀，離心12000轉(zhuǎn)/分X 4min,重復(fù)5次，收取離心洗滌液，測定所有離心液中的As2O3含量。
[0051]配制適當(dāng)濃度的As2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5支試管，第一支試管中加去離子水1ml，其余4支試管中分別加梯度濃度的As2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，各加砷的還原液Iml,去離子水定容至25ml,充分震蕩，使終濃度分別為0mg/l、5mg/l、IOmg/
l、25mg/l、50mg/l，靜置30min后用原子熒光光譜儀采用氫化物發(fā)生法測各試管中溶液的吸光值，測試條件為=PMT電壓:270V ；HC1主陰極電流:80mA ；HC1輔陰極電流:0mA ;載氣流量:600ml/min ;進(jìn)樣體積:1.0ml ;原子化器高度:7mm ;原子化器溫度:室溫；分析信號:峰面積；讀數(shù)時間:16.0Sec ;讀數(shù)延時:1.0Sec ;流動程序方式:斷續(xù)流動；采樣泵速:70100r/min ;米樣時間:8Sec ;停泵時間:4sec ;注入泵速:100r/min ;注入時間::16Sec ；停泵時間:5Sec。建立吸光值一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；取Iml離心液，稀釋100倍，從中取1ml，加砷還原液后稀釋至25ml，30min后相同條件下測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計算出離心液中As3+的濃度，再根據(jù)As2O3 = 1.32 XAs換算出As2O3的量，此為所取Iml脂質(zhì)體混懸液中游離As2O3的量(Cf) ,As2O3的投藥量為Iml脂質(zhì)體混懸液中As2O3的總量(Co)，脂質(zhì)體的包封率=(1- Cf/Co) X100%。用原子熒光分光光度計測定的As2O3的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為:1=3.737+13.097C, r = 0.9995，其中I為分析信號峰面積，C為As2O3溶液濃度。
[0052]離心液及洗滌液中的As2O3總量為17.84 μ g, ImlAs2O3磁性脂質(zhì)體所含As2O3的總量為100 μ g，納米As2O3磁性脂質(zhì)體中As2O3的包封率為82.16%。
[0053]4.As203/Mn0.5Zn0.5Fe204熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體聯(lián)合熱療對乳腺癌細(xì)胞株MDA_MB_231的影響
[0054]4.1細(xì)胞培養(yǎng) [0055]MDA_MB_231細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37°C、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。
[0056]4.2五種細(xì)胞處理方式液的制備
[0057]分別制備As2O3ZMntl.5Zn0 5Fe204納米熱控釋脂質(zhì)體、納米As2O3脂質(zhì)體、納米Mna5Zna5Fe2O4脂質(zhì)體三種脂質(zhì)體，冷凍干燥后用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將這3種制劑配成工作液，使As2O3的濃度為5μπι01/1。準(zhǔn)備對MDA_MB_231細(xì)胞進(jìn)行五種處理，I號對照組為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液處理組，2號組為納米As2O3脂質(zhì)體工作液處理組，3號組為納米Mna 5Zn0.5Fe204脂質(zhì)體工作液聯(lián)合交變磁場熱療組，4號組為As2O3ZiMna5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體工作液非聯(lián)合交變磁場熱療組，5號組為As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe204納米熱控釋脂質(zhì)體工作液聯(lián)合交變磁場熱療組。
[0058]4.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
[0059]接種五瓶MDA_MB_231細(xì)胞，保持?jǐn)?shù)量為5 X IO5左右，24小時后分別對五瓶細(xì)胞做如下處理，I號加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，2號加入納米As2O3脂質(zhì)體工作液培養(yǎng)，3號加入納米Mna5Zna5Fe2O4脂質(zhì)體工作液并置入200KHz、4Kw、I = 300A的交變磁場中熱療40min后繼續(xù)培養(yǎng)，4號加入As2O3ZMna5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體工作液培養(yǎng)，5號加入As2CVMnci5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體工作液并置入200KHz、4Kw、I = 300A的交變磁場中熱療40min后繼續(xù)培養(yǎng)，五組的培養(yǎng)時間均為48小時，之后棄原液，I XPBS緩沖液沖洗后，置于倒置顯微鏡下觀察。納米As2O3脂質(zhì)體處理組、納米Mna5Zna 5Fe204脂質(zhì)體聯(lián)合交變磁場熱療組、As2(VMntl5Zna5Fe2C)4納米熱控釋脂質(zhì)體非聯(lián)合交變磁場熱療組、As2O3/Mna5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體聯(lián)合交變磁場熱療組均對MDA_MB_231細(xì)胞的生長表現(xiàn)出顯著的抑制，經(jīng)處理24小時后，即有少數(shù)細(xì)胞開始變圓，48小時細(xì)胞染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)濃縮，并有一些細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落懸浮于培養(yǎng)基中。與其他組相比較，As2O3ZiMna5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體聯(lián)合交變磁場熱療組處理MDA_MB_231細(xì)胞后上述變化出現(xiàn)較早而且更加顯著。而對照組MDA_MB_231細(xì)胞生長良好，細(xì)胞密度明顯較大。
[0060]4.4MTT方法測定[0061]MDA_MB_231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37°C、飽和濕度及5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%混和胰酶消化液消化，DMEM培養(yǎng)液中止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)成細(xì)胞濃度為個6 X 104/ml，將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，100 μ I/孔，分為五組，每組8個復(fù)孔，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。24小時后I號組復(fù)孔加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，2號組復(fù)孔加入納米As2O3脂質(zhì)體工作液培養(yǎng)，3號組復(fù)孔加入納米Mna Jna5Fe2OJg質(zhì)體工作液，4號組和5號組均加入As2O3ZMna5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體工作液，將此96孔培養(yǎng)板置入200KHz、4Kw、I = 300A的交變磁場中熱療40min，之后繼續(xù)培養(yǎng)48小時。48小時后每孔加MTT液20 μ I (5mg/ml, PBS配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后吸盡上清液，加二甲基亞砜(DMSO)每孔150 μ 1，振蕩溶解10分鐘。用酶標(biāo)儀在492nm下測OD值。根據(jù)公式“細(xì)胞的抑制率(％ )=(對照組OD值一各實驗組OD值)/對照組OD值X 100 % ”計算細(xì)胞抑制率。結(jié)果顯示,納米As2O3脂質(zhì)體處理組、納米Mna5Zna5Fe2O4脂質(zhì)體聯(lián)合交變磁場熱療組、As203/Mn0.5Zn0.5Fe204納米熱控釋脂質(zhì)體非聯(lián)合交變磁場熱療組、As203/Mn0 5Zn0 5Fe204納米熱控釋脂質(zhì)體聯(lián)合交變磁場熱療組可明顯抑制MDA_MB_231細(xì)胞的生長，并產(chǎn)生強烈的細(xì)胞毒性，四組的抑制率分別為20.57%,43.40%,25.49%,66.53%，從抑制率來看，As2O3/Mna5Zna5Fe2O4納米熱控釋脂質(zhì)體聯(lián)合交變磁場熱療組處理MDA_MB_231細(xì)胞后對其抑制率更明顯，這表明，As203/Mn0.5Zn0.5Fe204納米熱控釋脂質(zhì)體能依賴交變磁場達(dá)到相變溫度后產(chǎn)熱釋藥，表現(xiàn)出更強的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用。
[0062]表1各處理組對細(xì)胞MDA_MB_231的生長抑制結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)制備錳鋅鐵磁性納米粒子: 將MnSO4.H20、ZnSO4.7H20、FeSO4.7H20按摩爾比1: 1:4混合，置于電動粉碎機中粉碎成末，然后根據(jù)所有金屬離子總和與氫氧根離子摩爾比為1:2.4，將NaOH水溶液加入到粉末中，用電動攪拌機攪拌三小時得糊狀物，將其靜置過夜后置80°C烤箱中干燥，再置馬弗爐內(nèi)400°C焙燒I小時得干燥塊狀物，冷卻后將其研細(xì)成粉末狀，用熱蒸餾水進(jìn)行多次磁分離洗滌，直至用I % BaCL2溶液檢驗不到S042—后，用無水乙醇磁分離洗滌，60°C~70°C烘干，得到錳鋅鐵磁性納米粒子； 2)將DPPC與膽固醇按質(zhì)量比(10~5): 3混合后，加入氯仿和無水乙醚混合液，至DPPC與膽固醇完全溶解，超聲分散后，用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在42°C下恒溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到有機溶劑完全揮發(fā)，在容器內(nèi)壁形成一均勻薄膜； 3)按明膠:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為(0.4-0.5): 1，將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，然后按照As2O3與錳鋅鐵納米粒子的質(zhì)量比為1:60-30，先向磷酸鹽緩沖液加入10mmol/L的As2O3溶液，550C~65°C水浴溶解后，再加入錳鋅鐵磁性納米粒子，室溫超聲分散，形成混懸液，其中錳鋅鐵磁性納米粒子:(DPPC+膽固醇)的質(zhì)量比為(1.5^2):1 ； 4)將所述步驟3)制備的混懸液加到所述步驟2)得到的含薄膜的容器中，電動攪拌震蕩至薄膜脫落，將甘油與混懸液按體積比1: (10-15)混勻，置于-20°C中冷凍f 2小時，370C融化，超聲分散30-45秒后再置于_20°C中1-2小時，如此反復(fù)凍融及超聲分散3飛次即得熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，氯仿和無水乙醚混合液中氯仿和無水乙醚體積比為2: 1-10:1。
3.一種熱控釋納米磁性砒霜脂質(zhì)體，其特征在于，該納米磁性砒霜脂質(zhì)體根據(jù)權(quán)利要求I或2所述方法制備得到。
【文檔編號】A61K47/02GK103989634SQ201410190559
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】張東生, 王麗, 張皓 申請人:東南大學(xué)