一種脂肪乳劑及其制備方法及其應(yīng)用及方法、以及一種血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種脂肪乳劑，包括：膽固醇、豬油、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、吐溫80、丙二醇和水，將所述脂肪乳劑應(yīng)用于建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型中，周期短，制得的血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型滿足實(shí)驗(yàn)需求。
【專利說(shuō)明】一種脂肪乳劑及其制備方法及其應(yīng)用及方法、以及一種血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，特別是指一種脂肪乳劑，本發(fā)明還涉及一種脂肪乳及的制備方法，本發(fā)明還涉及一種脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用及應(yīng)用方法，本發(fā)明還涉及一種血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型。
【背景技術(shù)】
[0002]高血脂癥及/或血栓形成被公認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的危險(xiǎn)因子，但其致病機(jī)理非常復(fù)雜，有些方面還不是十分清楚，為了闡明其致病機(jī)理，血栓形成前狀態(tài)(PST)動(dòng)物模型的制作尤為重要，目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常采用高脂飼料喂養(yǎng)制備血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型，該方法對(duì)于大、小鼠雜食性動(dòng)物的制備效果尚可，但由于鼠類采血量極少，不能同時(shí)檢測(cè)數(shù)個(gè)相關(guān)的指標(biāo)，并且受到動(dòng)物食性、劑量、周期等因素的影響，造成血栓形成前狀態(tài)模型質(zhì)量不穩(wěn)定，且復(fù)制時(shí)間較長(zhǎng)(達(dá)3-4個(gè)月)，因而限制了其在制備動(dòng)物模型中的應(yīng)用；而采用高脂飼料喂養(yǎng)制備家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型可以避免這方面缺陷，可以從心臟一次取血達(dá)10ml，能夠同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)相關(guān)指標(biāo)，但由于動(dòng)物食性等因素造成劑量不容易準(zhǔn)確投喂，并且喂養(yǎng)周期長(zhǎng)，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)一定的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是提出一種脂肪乳劑，制備簡(jiǎn)單，成本低。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出一種脂肪乳劑的制備方法，過(guò)程簡(jiǎn)單，適合推廣。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提出一種脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用及應(yīng)用方法，過(guò)程簡(jiǎn)單，能夠縮短建立時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出一種血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型，建立簡(jiǎn)單，滿足實(shí)驗(yàn)的需求。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種脂肪乳劑，包括:膽固醇、豬油、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、吐溫80、丙二醇和水。
[0008]優(yōu)選的，所述脂肪乳劑中，主要組分的濃度為，膽固醇100g/L，豬油200g/L，膽酸鈉20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L。
[0009]所述脂肪乳劑的制備方法，包括以下步驟:
[0010]a、取80份豬油至容器中，加熱至融化；
[0011]b、繼續(xù)加入40份膽固醇并使之融化；
[0012]C、繼續(xù)加入8份膽酸鈉和4份丙基硫氧嘧啶，攪勻；
[0013]d、加入水、84-88份吐溫80和83-84份丙二醇，攪勻；
[0014]e、繼續(xù)加入水至主要組分達(dá)到設(shè)定的濃度。
[0015]所述脂肪乳劑的在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
[0016]所述脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用，包括以下步驟:[0017]I)家兔除給予普通飼料150g/只/天喂養(yǎng)外，還取所述脂肪乳劑按照2ml/kg.d進(jìn)行灌胃，每天一次，持續(xù)兩周；
[0018]2)灌胃前后分別從耳中央動(dòng)脈6ml(采血前禁飲食12h)，然后分別進(jìn)行如下操作:
[0019]2.1)取其中 3ml 用 20g/L EDTA_Na2 抗凝(抗凝劑:標(biāo)本=1:9), 2500r/min 離心5min，取血漿低溫冰箱保存，取部分紅細(xì)胞測(cè)定:膜流動(dòng)性(Μ-Flu)、E-MDA (紅細(xì)胞-丙二醛)和E-SOD (紅細(xì)胞超氧化物歧化酶)含量；
[0020]2.2)將剩下的紅細(xì)胞酶法測(cè)定M-TC含量；
[0021]2.3)取血漿放兔法測(cè)定TXB2A-Keto-PGFp ET,酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測(cè)定GMP-140，發(fā)色底物法測(cè)定t-PA、PAI ；
[0022]2.4)另采3ml直接離心測(cè)定血清酶法TC、TG、APOA1、ΑΡ0Β，免疫濁度法vWF，
[0023]2.5)另取部分動(dòng)脈血高效薄層層析法測(cè)定PAF含量；
[0024]2.6)灌胃兩周后處死動(dòng)物做肉眼及光鏡觀察；
[0025]3)將灌胃前后測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比和分析。
[0026]其中，步驟2.1中，膜流動(dòng)性(M-Flu)采用如下方法進(jìn)行測(cè)定:
[0027]用PBS洗滌紅血球2次配成4*107細(xì)胞/ml濃度的紅細(xì)胞懸液，按照1:1與DPH(熒光探針)標(biāo)記液混勻，于25°C保溫30min，離心棄去標(biāo)記殘液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用PBS稀釋成2ml懸液，在25°C下采用熒光光度計(jì)分別測(cè)定與激發(fā)偏振光振動(dòng)方向平行、垂直時(shí)熒光偏振強(qiáng)度，根據(jù)公式計(jì)算·出M-Flu。
[0028]其中，步驟2.2中，采用如下方法進(jìn)行測(cè)定:
[0029]將剩下的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌后，溶于0.25nmol/L的CaCl2溶液中，于4°C置30min至完全溶血，然后以1400r/min離心10min，去掉溶血液，沉淀物用PH值為7.4的
0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌，再按所取的細(xì)胞體積加入50g/L氯化鈉，先在先在漩渦混合器震動(dòng)勻漿再用500r/min的速度離心5min，以上清液IOum測(cè)定紅細(xì)胞M-TC含量。
[0030]一種血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型，通過(guò)除給予家兔普通飼料150g/只/天喂養(yǎng)外，還采用所述脂肪乳劑，按照2ml/kg.d進(jìn)行灌胃，每天一次，持續(xù)兩周制備形成。
[0031]本發(fā)明的有益特點(diǎn)主要體現(xiàn)在:本發(fā)明公開(kāi)了一種脂肪乳劑，制作簡(jiǎn)單，成本低，使用方便，特別是在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型中的應(yīng)用，能夠在2周內(nèi)迅速制造出血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型，周期短，制備過(guò)程中劑量投放準(zhǔn)確等，本發(fā)明提供的脂肪乳劑，血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型及其建立的方法，均簡(jiǎn)單易行，能夠?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)提供更實(shí)用的方法，促進(jìn)相關(guān)疾病的研究進(jìn)展。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0033]圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例家兔灌胃2周后取主動(dòng)脈做光鏡檢查的光鏡圖；
[0034]圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例家兔灌胃2周后取主動(dòng)脈做電鏡檢查的電鏡圖；
[0035]圖3為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例家兔灌胃2周后取主動(dòng)脈做電鏡檢查的另一電鏡圖。【具體實(shí)施方式】
[0036]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0037]一種脂肪乳劑，包括:膽固醇、豬油、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、吐溫80、丙二醇和水。
[0038]優(yōu)選的，所述脂肪乳劑中，主要組分的濃度為，膽固醇100g/L，豬油200g/L，膽酸鈉20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L。
[0039]脂肪乳劑的制備方法，包括以下步驟:
[0040]a、取80份豬油至容器中，加熱至融化；
[0041]b、繼續(xù)加入40份膽固醇并使之融化；
[0042]C、繼續(xù)加入8份膽酸鈉和4份丙基硫氧嘧啶，攪勻；
[0043]d、加入水、84-88份吐溫80和83-84份丙二醇，攪勻；
[0044]e、繼續(xù)加入水至主要組分達(dá)到設(shè)定的濃度。
[0045]脂肪乳劑的在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
[0046]脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0047]I)家兔除給予普通飼料150g/只/天喂養(yǎng)外，還取所述脂肪乳劑按照2ml/kg.d進(jìn)行灌胃，每天一次，持續(xù)兩周；
[0048]2)灌胃前后分別從耳中央動(dòng)脈6ml (采血前禁飲食12h)，取其中3ml用20g/LEDTA-Na2抗凝(抗凝劑:標(biāo)本=1:9), 2500r/min離心5min,取血衆(zhòng)低溫冰箱保存(先取少量血液測(cè)定Hb含量)，取部分紅細(xì)胞測(cè)定:膜流動(dòng)性(M-Flu)，用PBS洗滌紅血球2次配成4*107細(xì)胞/ml濃度的紅細(xì)胞懸液，按照1:1與DPH (熒光探針)標(biāo)記液混勻，于25°C保溫30min，離心棄去標(biāo)記殘液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用PBS稀釋成2ml懸液，在25°C下采用熒光光度計(jì)分別測(cè)定與激發(fā)偏振光振動(dòng)方向平行、垂直時(shí)熒光偏振強(qiáng)度，根據(jù)公式計(jì)算出M-Flu ；E-MDA,參考Uchlyma等方法提取MDA前質(zhì)，再按鐘福孫等提供的硫代巴比妥酸比色法測(cè)定E-MDA含量；E-S0D含量采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。
[0049]將剩下的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌后，溶于0.25nmol/L的CaCl2溶液中，(體積比1:1)，于4°C置30min至完全溶血，然后以1400r/min離心10min，去掉溶血液，沉淀物用PH值為7.4的0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌，再按所取的細(xì)胞體積加入50g/L氯化鈉，先在先在漩渦混合器震動(dòng)勻漿再用500r/min的速度離心5min，以上清液IOum測(cè)定紅細(xì)胞M-TC含量，取血漿放兔法測(cè)定TXB2A-Keto-PGFp ET,酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測(cè)定GMP-140，發(fā)色底物法t-PA、PAI，鄰苯三酚自氧化法S0D。
[0050]另采3ml直接離心酶法測(cè)定血清TC、TG、APOA1、APOB，免疫濁度法vWF。另取部分動(dòng)脈血采用PAF高效薄層層析法測(cè)定PAF含量；灌胃兩周后處死動(dòng)物做肉眼及光鏡觀察。
[0051]3)將灌胃前后測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比和分析。
[0052]結(jié)果1:根據(jù)以上步驟，灌胃前后測(cè)定的血清TC、TG、ΑΡ0ΑΙ、ΑΡ0Β、vWF、血漿TXB2、6-Keto-PGFla、ET、GMP-140、t-PA、PA1、紅細(xì)胞M-Flu、M-TC、E-MDA、E-S0D 水平及 PAF 活性的
比較，得到如表1所示灌胃前后測(cè)定的家兔各項(xiàng)指標(biāo)比較(實(shí)施例中所有數(shù)據(jù)均采用S土 S表示，采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì))
[0053]表1:灌胃前后測(cè)定的家兔各項(xiàng)指標(biāo)比較G土S，11=20)
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪乳劑，其特征在于，包括:膽固醇、豬油、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、吐溫80、丙二醇和水。
2.如權(quán)利要求1中所述脂肪乳劑，其特征在于:主要組分的濃度為，膽固醇100g/L，豬油200g/L，膽酸鈉20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L。
3.如權(quán)利要求1或2中所述脂肪乳劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: a、取80份豬油至容器中，加熱至融化； b、繼續(xù)加入40份膽固醇并使之融化； C、繼續(xù)加入8份膽酸鈉和4份丙基硫氧嘧啶，攪勻； d、加入水、84-88份吐溫80和83-84份丙二醇，攪勻； e、繼續(xù)加入水至主要組分達(dá)到設(shè)定的濃度。
4.如權(quán)利要求1或2中所述脂肪乳劑的在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4中所述脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用，其特征在于:包括以下步驟: 1)家兔除給予普通飼料150g/只/天喂養(yǎng)外，還取所述脂肪乳劑按照2ml/kg.d進(jìn)行灌胃，每天一次，持續(xù)兩周； 2)灌胃前后分別從耳中央動(dòng)脈采血6ml，然后分別進(jìn)行如下操作: 2.1)取其中3ml用20g/L EDTA-Na2抗凝，2500r/min離心5min，取血漿低溫冰箱保存，取部分紅細(xì)胞測(cè)定:膜流動(dòng)性(Μ-F`lu)、E-MDA和E-SOD含量； 2.2)將剩下的紅細(xì)胞測(cè)定M-TC含量； 2.3)取血漿放兔法測(cè)定 TXB2A-Keto-PGFp ET、GMP-140, t_PA、PAI ； 2.4)另采3ml直接離心測(cè)定血清TC、TG、APOA1、APOB、SOD ； 2.5)另取部分動(dòng)脈血測(cè)定PAF含量； 2.6)灌胃兩周后處死動(dòng)物做肉眼及光鏡觀察； 3)將灌胃前后測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比和分析。
6.如權(quán)利要求5中所述脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用，其特征在于:步驟2.1中，膜流動(dòng)性(M-Flu)采用如下方法進(jìn)行測(cè)定: 用PBS洗滌紅血球2次配成4*107細(xì)胞/ml濃度的紅細(xì)胞懸液，按照1:1與DPH (熒光探針)標(biāo)記液混勻，于25°C保溫30min，離心棄去標(biāo)記殘液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用PBS稀釋成2ml懸液，在25°C下采用熒光光度計(jì)分別測(cè)定與激發(fā)偏振光振動(dòng)方向平行、垂直時(shí)熒光偏振強(qiáng)度，根據(jù)公式計(jì)算出M-Flu。
7.如權(quán)利要求5中所述脂肪乳劑在建立家兔血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型的應(yīng)用，其特征在于:步驟2.2中，采用如下方法進(jìn)行測(cè)定: 將剩下的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌后，溶于0.25nmol/L的CaCl2溶液中，于4°C置30min至完全溶血，然后以1400r/min離心10min，去掉溶血液，沉淀物用PH值為7.4的0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌，再按所取的細(xì)胞體積加入50g/L氯化鈉，先在超聲波絞碎儀上超生勻漿再用500r/min的速度離心5min，以上清液IOum測(cè)定紅細(xì)胞M-TC含量。
8.—種血栓形成前狀態(tài)動(dòng)物模型，其特征在于:通過(guò)如下方法制備形成:給予家兔普通飼料150g/只/天喂養(yǎng)，并采用權(quán)利要求1或2中所述脂肪乳劑，按照2ml/kg.d進(jìn)行灌胃，每天一次，持續(xù)兩周制備形成。
【文檔編號(hào)】A61K9/107GK103860594SQ201310639837
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】馬建林 申請(qǐng)人:馬建林