通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通經(jīng)草提取物的新用途，該新用途是通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。所述通經(jīng)草提取物是按如下方法制備的：以通經(jīng)草為原料，用50%-90%乙醇提取，通過高速逆流色譜、大孔吸附樹脂等色譜純化得到。本發(fā)明提供的通經(jīng)草提取物對制備抗癌藥物，尤其是抗肝癌、肺癌、胃癌藥物具有重要意義。
【專利說明】通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥材提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，具體是涉及通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)2010年2月衛(wèi)生部統(tǒng)計資料，每年全球癌癥死亡人數(shù)達1000萬。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌癥所致，并預(yù)測按目前的趨勢發(fā)展下去，到2050年將有二分之一的死亡者是由于患了癌癥。我國惡性癌發(fā)病率以每年2.5-5%速度增長，已成為嚴(yán)重危害人類生命的兀兇。在各種類型的癌癥當(dāng)中以肺癌、胃癌、肝癌等發(fā)病率較聞。
[0003]血管為正常組織器官的形成發(fā)生于功能維護所必需，它與人體發(fā)育失調(diào)和多種病因?qū)е碌姆N種疾病密切相關(guān)。腫瘤新血管形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)起舉足輕重作用。一系列研究表明只要有效抑制腫瘤新血管形成，就能抑制腫瘤生成、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。此外，糖尿病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病都有血管增生，其血管異常與腫瘤血管非常相似。因此，血管增生抑制劑也可用于治療糖尿病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等血管增生性疾病。近年來，人們對腫瘤血管生成機制的研究不斷深入，許多抗腫瘤血管生成的藥物如Avastin、Angiostatin等相繼被開發(fā)出來，已在臨床上推廣應(yīng)用。這類藥物不但可以用于大多數(shù)實體瘤的治療，還可以用于腫瘤的預(yù)防和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，同時對其他與血管生成有關(guān)的疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等的預(yù)防與治療，都具有一定的理論和現(xiàn)實意義。
[0004]腫瘤中的腫瘤細(xì)胞可分為兩類。一類為普通的腫瘤細(xì)胞,一類為腫瘤干細(xì)胞。普通的腫瘤細(xì)胞具有快速分裂 ，對抗腫瘤藥敏感，沒有自身更新能力等特點。因此普通的腫瘤細(xì)胞在分裂一定代數(shù)后會死亡。腫瘤干細(xì)胞則具有如下特點:通常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，及不分裂狀態(tài)，對抗腫瘤藥不敏感，具有自身更新能力，即具有無限繁殖的能力。在腫瘤化療中，大量的腫瘤細(xì)胞被殺死(因為對化療藥敏感)，然而腫瘤干細(xì)胞會生存下來(因為對化療藥不敏感)。腫瘤的復(fù)發(fā)是由于腫瘤化療藥對腫瘤干細(xì)胞無效。找能有效治療腫瘤干細(xì)胞的藥物是當(dāng)前的一個方向。能否根除腫瘤的關(guān)鍵不在于能否殺滅普通的腫瘤細(xì)胞，而在于根除腫瘤干細(xì)胞。
[0005]中醫(yī)藥治療癌癥的歷史源遠(yuǎn)流長，迄今已有紫杉、喜樹、砒霜、綠茶、靈芝、人參、長春花、天門冬、半枝蓮、天葵子等用于臨床治療癌癥，取得了一些較好的效果。長期以來，人們應(yīng)用傳統(tǒng)思維、理念和方法研發(fā)抗癌中草藥，雖然已取得了進步，但收效甚微。迄今中草藥尚未在國內(nèi)外成為首選抗癌藥物，現(xiàn)有臨床中草藥的抗癌療效丞需進一步提高。因此，研發(fā)中草藥抗癌藥物是目前治療惡性癌的當(dāng)務(wù)之急，而闡明內(nèi)源性低分子抑瘤物的化學(xué)本質(zhì)是這一領(lǐng)域研究的核心問題。
[0006]通經(jīng)草系中國蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草。秋季采收，除去雜質(zhì)曬干。收載于1998年《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊》。其性平，味微苦，具有明目、愈傷、止血、活血調(diào)經(jīng)、止咳、利濕、解毒消腫等功效，可用于目赤、視力減退、胸傷、骨傷、肺癆咳嗽、吐血。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)通經(jīng)草的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)代研究表明，通經(jīng)草含有粉背蕨酸(alepterolic acid),鹿糖(sucrose)和黃酮類化合物,其他化學(xué)成分不詳；藥理作用研究表明，通經(jīng)草黃酮是一種天然有效的自由基清除劑通經(jīng)草黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫具有很強的清除作用，其EC5tl分別為0.0099,0.0060和0.0190mg/mL，且呈濃度依賴關(guān)系，其他藥理作用未見報道。
[0007]專利申請?zhí)枮镃N96102241.8的專利公開了一種治療肝膽結(jié)石和抗復(fù)發(fā)的特效藥物組方，其中含有通經(jīng)草。專利申請?zhí)枮镃N200310110176.4的專利申請公開了公開了一種治療鼻竇炎的藥物組方，其中含有通經(jīng)草。專利申請?zhí)枮镃N200310110531.8的專利公開了一種用于治療再生障礙性貧血的中草藥劑，其由回生草、神仙草、通經(jīng)草等近20種中草藥經(jīng)水熬煮加白酒配制而成。專利申請?zhí)枮镃N97107327.9的專利公開了一種治療婦女痛經(jīng)的中草藥，配方的組成包括:通經(jīng)草、蒼術(shù)、雞內(nèi)金等。專利申請?zhí)枮镃N201210440734.2的專利公開了一種治療兒童急性良性肌炎的藥物，其原料配方和重量配比為:通經(jīng)草6~10份，絲瓜絡(luò)8~15份，走馬風(fēng)8~15份等。專利申請?zhí)枮镃N201210462718.3的專利公開了一種治療乳房疾病的藥物，其特征在于組分和重量配比是:通經(jīng)草1:燈籠草2:白術(shù)1.5
坐寸o
[0008]上述文獻及專利等，尚未見通經(jīng)草或通經(jīng)草提取物用于制備抗癌藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供通經(jīng)草提取物的一種新用途。本發(fā)明所提供的通經(jīng)草提取物的一種新用途是在制備抗 癌藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所用通經(jīng)草為中國蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea(Gmel.)Fee)的干燥全草。
[0011]通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，所述通經(jīng)草提取物的制備方法為:
(1)通經(jīng)草，用濃度50%~90%乙醇作為溶劑，在50°C~80°C溫浸提取，提取次數(shù)為I~3次，每次提取時間為I~4小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6~15倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加5~20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度30%~70%的乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ；
(4)上述通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
[0012]通經(jīng)草提取物的制備方法為:
(I)通經(jīng)草，用濃度50%~90%乙醇作為溶劑，在50°C~80°C溫浸提取，提取次數(shù)為I~3次，每次提取時間為I~4小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6~15倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ;(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加5~20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度30%~70%的乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ；
(4)上述通經(jīng)草提取物B與通經(jīng)草提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
[0013]優(yōu)選的本發(fā)明通經(jīng)草提取物制備方法:
(1)通經(jīng)草，用濃度70%乙醇作為溶劑，在70°C溫浸提取，提取2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的12倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加10倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液八，通過即0600大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度50%的乙醇溶液進行洗脫，收集50%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ；
(4)上述通經(jīng)草提取物B與通經(jīng)草提取物C混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
[0014]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物中，通經(jīng)草提取物B主要含有:粉背蕨酸(alepterolic acid) ； 8(17),13 (E)-labdadien-15,19-dioic acid ；methyl 8(17)，13 (E)-labdadien-19-oic acid-15-oate ; 15_acetoxy-8(17),13(E)-labdad1-en-19-oicacid ； 15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oic acid ;8 (17)，13 (E)-labdadien-15,19-diol ;共6個半日花烷型二萜類成分。
[0015]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物中，通經(jīng)草提取物C主要含有:金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素-2’ -O-^-D-葡萄糖苷；金粉蕨素_2’ -O-^-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；莢果蕨素(5，7- 二羥基-6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氫黃酮)；去甲氧基莢果蕨素(5，7- 二羥基-6，8- 二甲基-二氫黃酮)；共7個二氫黃酮及二氫黃酮苷類成分。
[0016]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物制備方法，其特征在于:所采用的大孔吸附樹脂為LSA-40大孔吸附樹脂、AB-8大孔吸附樹脂、HPD600大孔吸附樹脂。
[0017]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物，可以通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的各種口服劑型。
[0018]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物可用于制備抗癌藥物，尤其是抗肺癌、肝癌、胃癌藥物。
[0019]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
[0020]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物A、通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物A、通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
[0022]本發(fā)明首次探索研究以中國蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea(Gmel.) Fee)的干燥全草為原料提取制備抗癌提取物。本實驗研究表明，通經(jīng)草提取物對小鼠S180肉瘤的抑瘤率為49.2%，可見具有較強抗癌的作用，在此基礎(chǔ)上我們進一步研究其對血管生成的影響。評價癌血管生成程度的最客觀標(biāo)準(zhǔn)時癌組織內(nèi)的微血管數(shù)目，本實驗通過小鼠移植性癌模型體內(nèi)實驗，瘤體微血管標(biāo)記染色，微血管密度計數(shù)顯示，通經(jīng)草各提取物均可抑制癌血管的生成，和對照組比較，具有顯著性差異。本發(fā)明測定通經(jīng)草提取物殺傷癌細(xì)胞OfepG2、GLC、MFC)的作用結(jié)果顯示，其主要表現(xiàn)為濃度依賴型的細(xì)胞毒作用特點，即隨著藥物劑量增加，抑制作用逐漸增強。
【具體實施方式】
[0023]下面通過具體實驗例和實施例對通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用做進一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0024]實施例1:通經(jīng)草提取物及單體化合物制備
(1)通經(jīng)草20kg，用濃度70%乙醇作為溶劑，在70°C溫浸提取，提取2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的12倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加10倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過HPD600大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進行洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ；
(4)上述通經(jīng)草提取物B與通經(jīng)草提取物C混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
[0025]如上所述方法制備通經(jīng)草提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:1- 3:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，石油醚-丙酮(1:2)重結(jié)晶，分別得到粉背蕨酸(alepterolic acid) ； 8(17),13 (E)-labdadien-15, 19-dioic acid ; methyl 8(17),13(E)-labdadien-19_oicacid-15-oate ; 15_acetoxy-8(17),13(E)-labdad1-en-19-oic acid ； 15-hydroxy-8(17),13 (E) -labdadien-19-oic acid ；8 (17)，13 (E) -labdadien-15,19-diol 等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。含量經(jīng)高效液相色譜檢測粉背蕨酸等半日花烷型二萜類成分在通經(jīng)草提取物B中的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)55%。
[0026]如上所述方法制備通經(jīng)草提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-3:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素_2’ -O-^-D-葡萄糖苷；金粉蕨素_2’ -O-^-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；莢果蕨素(5，7- 二羥基-6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氫黃酮)；去甲氧基莢果蕨素(5，7-二羥基-6，8-二甲基-二氫黃酮)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。含量經(jīng)高效液相色譜檢測金粉蕨素等二氫黃酮及二氫黃酮苷類成分在通經(jīng)草提取物C中的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%。
[0027]實施例2:通經(jīng)草提取物及單體化合物制備
(I)通經(jīng)草20kg，用濃度90%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的15倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過AB-8大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ；
(4 )將上述通經(jīng)草提取物B和通經(jīng)草提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物，其中通經(jīng)草提取物B占20%，通經(jīng)草提取物C占80%。
[0028]如上所述方法制備通經(jīng)草提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:1-3:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，石油醚-丙酮(1:2)重結(jié)晶，分別得到粉背蕨酸(alepterolic acid) ； 8(17),13 (E)-labdadien-15, 19-dioic acid ; methyl 8(17),13(E)-labdadien-19_oicacid-15-oate ; 15_acetoxy-8(17),13(E)-labdad1-en-19-oic acid ； 15-hydroxy-8(17),13 (E) -labdadien-19-oic acid ；8 (17)，13 (E) -labdadien-15,19-diol 等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。含量經(jīng)高效液相色譜檢測粉背蕨酸等半日花烷型二萜類成分在通經(jīng)草提取物B中的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%。
[0029]如上所述方法制備通經(jīng)草提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-3:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素_2’ -O-^-D-葡萄糖苷；金粉蕨素_2’ -O-^-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；莢果蕨素(5，7- 二羥基-6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氫黃酮)；去甲氧基莢果蕨素(5，7-二羥基-6，8-二甲基-二氫黃酮)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。含量經(jīng)高效液相色譜檢測金粉蕨素等二氫黃酮及二氫黃酮苷類成分在通經(jīng)草提取物C中的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%。
[0030]實施例3:通經(jīng)草提取物及單體化合物制備
(1)通經(jīng)草5kg，用濃度50%乙醇作為溶劑，在80°C溫浸提取，提取次數(shù)為I次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加5倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過LSA-40大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度30%的乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ；
(4 )將上述通經(jīng)草提取物B和通經(jīng)草提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物，其中通經(jīng)草提取物B占85%，通經(jīng)草提取物C占15%。
[0031] 如上所述方法制備通經(jīng)草提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:1-3:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，石油醚-丙酮(1:2)重結(jié)晶，分別得到粉背蕨酸(alepterolic acid) ； 8(17),13 (E)-labdadien-15, 19-dioic acid ; methyl 8(17),13(E)-labdadien-19_oicacid-15-oate ; 15_acetoxy-8(17),13(E)-labdad1-en-19-oic acid ； 15-hydroxy-8(17),13 (E) -labdadien-19-oic acid ；8 (17)，13 (E) -labdadien-15,19-diol 等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。含量經(jīng)高效液相色譜檢測粉背蕨酸等半日花烷型二萜類成分在通經(jīng)草提取物B中的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%。
[0032]如上所述方法制備通經(jīng)草提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-3:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素_2’ -O-^-D-葡萄糖苷；金粉蕨素_2’ -O-^-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；莢果蕨素(5，7- 二羥基-6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氫黃酮)；去甲氧基莢果蕨素(5，7-二羥基-6，8-二甲基-二氫黃酮)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。含量經(jīng)高效液相色譜檢測金粉蕨素等二氫黃酮及二氫黃酮苷類成分在通經(jīng)草提取物C中的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%。
[0033]實施例4:通經(jīng)草提取物片劑的制備
取上述實施例1中通經(jīng)草提取物345g，加入50g淀粉，混勻，制粒，過篩，加13g微晶纖維素，0.5g硬脂酸鎂，混勻，壓制成1000片，即為本發(fā)明的通經(jīng)草提取物片劑。
[0034]實施例5:通經(jīng)草提取物膠囊的制備
取上述實施例2中通經(jīng)草提取物345g，加入淀粉80g，制粒，整粒，加入適量硬脂酸鎂，裝膠囊1000粒，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物膠囊。
[0035]實施例6:通經(jīng)草提取物顆粒的制備
取上述實施例3中通經(jīng)草提取物245g，加入糊精100g，制粒，整粒，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物顆粒。
[0036]實驗例1:通經(jīng)草各提取物對小鼠移植性S18tl肉瘤血管形成抑制作用
方法:小鼠肉瘤S18tl瘤株，腹腔傳代接種。待腹水生長旺盛時，抽出腹水，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7個細(xì)胞/毫升，在小鼠腋下sc S180肉瘤細(xì)胞，每只接種0.2ml。
[0037]實驗動物及瘤株:昆明小鼠，雌雄各半，6-8周齡，體重(20±2)g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠肉瘤S18tl由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。
[0038]藥品:通經(jīng)草提取物、通經(jīng)草提取物A、通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C為(按實施例I方法制備所得，批號分別為:20120404、20120405、20120406、20120407)，分別配置成
0.lg/ml生理鹽水溶液。
[0039]治療及分組:150只小鼠于接種當(dāng)天隨機分為5組:空白對照組、通經(jīng)草提取物組、通經(jīng)草提取物A組、通經(jīng)草提取物B組、通經(jīng)草提取物C組。通經(jīng)草提取物組、通經(jīng)草提取物A組、通經(jīng)草提取物B組、通經(jīng)草提取物C組，分別予以注射液25ml/kg。對照組予以生理鹽水0.2ml/只。治療10d后處死小鼠，剝離瘤體稱重，按公式計算抑瘤率:抑瘤率=(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重*100%。
[0040]微血管染色:免疫組化SABC法染色血管，即用微型血管染色試劑盒(一抗為人相關(guān)第八因子)為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。通經(jīng)草提取物各組和對照組瘤體剝離后，切取標(biāo)本，固定，包埋，切片。經(jīng)染色后的切片，內(nèi)皮細(xì)胞褐染，血管呈黃褐色，易于辨認(rèn)。MVD的測定按Bosari等報道的方法進行，先在低倍視野下選取癌微血管最豐富的區(qū)域，即“熱點”，再在400倍視野范圍計數(shù)被染成棕色的微血管數(shù)目，取3個數(shù)值的平均值作為MVD值。任何棕染的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與臨近的微血管、癌細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開，就視為一個血管，盡管血管腔常可看到，但并不作為判斷血管的標(biāo)準(zhǔn)。為了避免較大血管對計數(shù)的干擾，對管壁有較厚平滑肌包繞或管腔>8個紅細(xì)胞面積的血管不予計數(shù)。
[0041]VEGF、bFGF免疫組化:VEGF、bFGF免疫組化檢測試劑盒(即用型)購自武漢博士德生物公司。陽性細(xì)胞呈棕黃色，免疫組化染色評分按Rahman等的方法進行，即VEGF、bFGF的評分標(biāo)準(zhǔn)是:根據(jù)著色細(xì)胞的比例(染色范圍)及染色強度，染色范圍(陽性細(xì)胞比率)分為0-4級，陰性為0分；陽性細(xì)胞1%_25%為1分；陽性細(xì)胞26%-50%為2分；陽性細(xì)胞51%-75%為3分；陽性細(xì)胞76%-100%為1分。染色強度劃分為0_3級；陰性為0分；弱陽性為I分；中等強度為2分；強陽性為3分，得分相加為最后評分。
[0042]統(tǒng)計方法:運用SPSS統(tǒng)計軟件，采用t檢驗。
[0043]結(jié)果:
(1)荷瘤鼠對治療措施的反應(yīng)以及抑瘤率
接種后第6天，各組荷瘤鼠腋下移植瘤已有黃豆大小，小鼠活潑，飲食正常。對照組小鼠第8天后瘤體生長加快，部分小鼠不活潑，進食差；治療各組小鼠活潑，飲食正常，毛發(fā)光澤正常，瘤體生長緩慢。通經(jīng)草各提取物組對小鼠S180肉瘤均有抑制作用。見表1表1通經(jīng)草各提取物對小鼠S180肉瘤的抑制作用(n=12)
【權(quán)利要求】
1.通經(jīng)草提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，所述通經(jīng)草提取物的制備方法為: (1)通經(jīng)草，用濃度50%~90%乙醇作為溶劑，在50°C~80°C溫浸提取，提取次數(shù)為I~3次，每次提取時間為I~4小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6~15倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ; (2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加5~20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A ； 將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己燒-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度30%~70%的乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ； (4)上述通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所述通經(jīng)草提取物的制備方法為: (1)通經(jīng)草，用濃度50%~90%乙醇作為溶劑，在50°C~80°C溫浸提取，提取次數(shù)為I~3次，每次提取時間為I~4小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6~15倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ; (2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提 取物A加5~20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A ； 將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己燒-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度30%~70%的乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ； (4 )上述通經(jīng)草提取物B與通經(jīng)草提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，所述通經(jīng)草提取物的制備方法為: (1)通經(jīng)草，用濃度70%乙醇作為溶劑，在70°C溫浸提取，提取2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的12倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ; (2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加10倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A； 將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:2:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液八，通過即0600大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，再用濃度50%的乙醇溶液進行洗脫，收集50%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物C ； (4)上述通經(jīng)草提取物B與通經(jīng)草提取物C混勻，即得本發(fā)明的通經(jīng)草提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述通經(jīng)草提取物，其特征在于:所述的通經(jīng)草提取物中通經(jīng)草提取物B主要含有:粉背蕨酸(al印terolic acid) ； 8(17)，13(E)-labdadien-15, 19-dioic acid ；methyl 8(17), 13 (E)-labdadien-19-oic acid-15-oate ;15-acetoxy-8 (17), 13(E)-labdad1-en-19-oic acid ； 15-hydroxy-8(17), 13(E)-1abdadien-19-oic acid ;8 (17)，13 (E)-labdadien-15, 19-diol ;共 6 個半日花燒型二職類成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述通經(jīng)草提取物，其特征在于:所述的通經(jīng)草提取物中通經(jīng)草提取物C主要含有:金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素_2’ -O-^-D-葡萄糖苷；金粉蕨素-2’-0-3-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；莢果蕨素(5，7-二羥基-6，8-二甲基-4-甲氧基-二氫黃酮)；去甲氧基莢果蕨素(5，7-二羥基-6，8- 二甲基-二氫黃酮)；共7個二氫黃酮或二氫黃酮苷類成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的通經(jīng)草提取物的制備方法，其特征在于:所采用的大孔吸附樹脂為LSA-40大孔吸附樹脂、AB-8大孔吸附樹脂、HPD600大孔吸附樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，所述癌為肺癌、肝癌、胃癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的通經(jīng)草提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述的通經(jīng)草提取物A、通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述的通經(jīng)草提取物A、通經(jīng)草提取物B、通經(jīng)草提取物C與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
【文檔編號】A61K36/11GK103585196SQ201310526718
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司