專利名稱：高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨修復(fù)支架材料的制備方法，尤其是涉及一種高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，是一種制備高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的方法，屬于生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
家蠶絲素蛋白、柞蠶絲素蛋白和蜘蛛絲蛋白具有優(yōu)良的力學(xué)性能、生物相容性、無免疫排斥或者炎癥反應(yīng)、可降解性以及本質(zhì)是天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點，在生物材料領(lǐng)域受到高度的關(guān)注。絲蛋白可用作骨組織修復(fù)、創(chuàng)面覆蓋材料、藥物緩釋材料、微膠囊、人造器官等不同形狀與功能的生物材料，以滿足人類對生物材料的不同需求。天然絲蛋白在昆蟲體內(nèi)合成、分泌，并且以高濃度(家蠶中部絲腺蛋白可達(dá)30wt%)的絲蛋白溶液的形式貯存在各種絲腺中。然而,一旦經(jīng)過昆蟲噴出的絲纖維凝固之后，便很難再溶于水中，只能溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、HFA、HFIP、LiBr、LiSCN等化學(xué)溶劑中，這些溶劑都屬于材料制備當(dāng)中的腐蝕性溶液，不僅對生物體有毒副作用，有違于相應(yīng)的生物安全標(biāo)準(zhǔn)，而且廢棄的溶劑對環(huán)境也有很大的污染性，溶劑的成本高。經(jīng)過化學(xué)試劑處理得到的再生絲蛋白，因為其分子量大為下降，制備得到的生物支架材料機(jī)械性能也顯著降低。有研究采用化學(xué)交聯(lián)法來制備不溶性絲素多孔支架，但也可能帶來交聯(lián)劑在生物體內(nèi)殘留影響生物相容性。這些缺點一直以來都制約著絲蛋白材料在生物材料中的應(yīng)用，如何消除生物材料中殘留的化學(xué)試劑以及如何提高其力學(xué)性能，是絲蛋白多孔支架材料制備中亟待解決的難題，并對絲素蛋白在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。現(xiàn)在也有一些其他方式來制備絲素蛋白材料，如
公開日為2009年12月09日，公開號為CN101596327的中國專利中，公開了一種三維絲素蛋白多孔支架材料的制備方法，該制備方法是將體積濃度為·2% 50WT%的絲素蛋白水溶液置于容器中，然后在20°C 80°C不斷攪拌的情況下在絲素溶液中加入氯化鈉，其中氯化鈉顆粒的質(zhì)量(單位為克)與絲素溶液的體積(單位為ML)比為I 20: I ;絲素溶液經(jīng)凝膠、靜置、沉淀后,取沉淀部分，繼續(xù)攪拌將沉淀物混合均勻，然后將其放入所需形狀的模具中，烘干；最后經(jīng)蒸餾水洗去支架中的氯化鈉，即得到具有三維多孔結(jié)構(gòu)的絲素支架材料。該方法雖然沒有使用任何有機(jī)溶劑，對生物體無毒副作用，但是制備而成的絲素支架材料的力學(xué)性能較差。又如
公開日為2010年10月20日，公開號為CN101864177A的中國專利中，公開了一種多孔蠶絲絲素蛋白材料的制備方法，該制備方法將蠶絲脫膠、溶解、透析獲得絲素蛋白溶液；按摩爾比，將等比例的羧酸或羧酸溶液與檸檬酸混合，加熱溶解后再加入聚乙二醇，得到促膠凝劑；將絲素蛋白溶液與促膠凝劑混合后倒入模具中，得到絲素蛋白凝膠，在10 100°C的溫度條件下加熱干燥后得到多孔絲素蛋白材料。該方法中使用的有機(jī)溶劑對生物存在一定的毒副作用。綜上所述，目前還沒有一種加工工藝簡單，制備條件溫和，絲素支架材料的力學(xué)性能強(qiáng)，成本低廉，對環(huán)境無污染的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，而提供一種加工工藝簡單，制備條件溫和，絲素支架材料的力學(xué)性能強(qiáng)，成本低廉，對環(huán)境無污染的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法。本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是:該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法的特點在于:該制備方法包括如下步驟:
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白；
(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物；
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然后置于搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液；
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。由此使得本發(fā)明的加工工藝簡單，制備條件溫和，生產(chǎn)過程環(huán)保，制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能強(qiáng)，而且成本低廉，對環(huán)境無污染。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%-20wt%，然后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在25-35°C的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，·以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向β_折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在-30- (-10) °C的條件下冷凍1-3個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥14-34個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。由此使得本發(fā)明制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能更好。作為優(yōu)選，本發(fā)明將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時，此過程作為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，以及延緩高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(I)中，含有絲腺蛋白的昆蟲為家蠶、野蠶或蜘蛛。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(3)中，將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa ;所述步驟(4)中，所述高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(4)中，將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(2)和(3)均在0°C的環(huán)境中進(jìn)行。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%-20wt%,然后滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準(zhǔn)，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向β -折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在_20°C的條件下冷凍2個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥24個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。作為優(yōu)選，本發(fā)明將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述家蠶為五齡第7天的家蠶幼蟲。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果:1、優(yōu)良的機(jī)械性能:與再生家蠶絲素材料或者混合有家蠶絲素蛋白做成的多孔支架材料相比，其力學(xué)性能優(yōu)良，具有很高的彈性模量。2、良好的生物相容性:材料本身或者降解產(chǎn)物對細(xì)胞無毒性反應(yīng)，水溶性絲素蛋白具有較高的細(xì)胞粘附率和增殖率，表現(xiàn)出良好的生物相容性。3、操作簡單，生產(chǎn)周期短:加工工藝簡單，沒有復(fù)雜繁瑣的提取材料過程，時間上大為節(jié)省。4、經(jīng)濟(jì)環(huán)保:制備過程中未使用其它成本高的化學(xué)試劑，制備條件溫和，成本低廉，相對于使用化學(xué)試劑制備的材料來說，對環(huán)境無污染。本發(fā)明制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、孔徑尺寸和孔隙大小均勻，連通性好，有利于骨細(xì)胞的粘附分化增殖等。而且，隨著水溶性絲素蛋白濃度的增加，其孔隙率逐漸降低。本發(fā)明制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。本發(fā)明中絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa，即得到的水溶性絲素蛋白分子量高于250 kDa，與完整的絲素蛋白重鏈的分子量相近。本發(fā)明制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的最大抗壓強(qiáng)度可高達(dá)6.9±0.4MPa，具有很強(qiáng)的力學(xué)性能，不僅沒有細(xì)胞毒性，而且對細(xì)胞具有粘附和促進(jìn)作用。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施·例。實施例1。本實施例中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法包括如下步驟。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天的家蠶幼蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。本發(fā)明也可以使用含有絲腺蛋白的其他昆蟲，如野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)在0°C的環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然后置于搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液。步驟(3)在0°C的環(huán)境中進(jìn)行。(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%_20wt%，然后滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準(zhǔn)，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白。將絲素蛋白放在-20°C的條件下冷凍2個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥24個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，以及延緩高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。
本實施例制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例2。本實施例中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然后置于搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液。(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。本實施例制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例3。本實施例中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的家蠶中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌三次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然后置于搖床上輕輕振搖1.5個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到20wt%，然后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在25-35 V的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向β_折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白。將絲素蛋白放在-30- (-10) 0C的條件下冷凍1-3個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥14-34個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料，該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。本實施例制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例4。

本實施例中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。本發(fā)明中含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛，優(yōu)選為五齡第7天的家蠶幼蟲。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)在0°C的環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。本發(fā)明可以將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖
0.3-4個小時得到溶液。步驟(3)在0°C的環(huán)境中進(jìn)行。(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%，然后滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準(zhǔn)，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在_20°C的條件下冷凍2個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥24個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料，該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。再將步驟(4)制得的·多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，以及延緩高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。本發(fā)明可以將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時。本實施例制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。當(dāng)然，本發(fā)明可以先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%-20wt%，然后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，可以在25-35°C的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白?？梢詫⒔z素蛋白放在-30- (-10) °C的條件下冷凍1-3個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥14-34個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。本發(fā)明可以將步驟(3 )得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。實施例5。本實施例中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)可以在-5°C至5°C的低溫環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然后置于搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。步驟(3)可以在-5°C至5°C的低溫環(huán)境中進(jìn)行。(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。再將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時，此過程作為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，以及延緩高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。本實施例制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例6。本實施例中高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料制備方法依次包括如下步驟。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到2wt%濃度，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12小時，使絲素蛋白水溶液中的水分減少，及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C冰箱中冷凍2個小時，之后真空冷凍干燥24小時，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。(8)步驟(7)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量達(dá)5Mpa以上。實施例7。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌三次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖I小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到2wt%濃度，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12小時，使絲素蛋白水溶液中的水分減少，及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變。(6)將步 驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C的冰箱中冷凍2個小時，之后真空冷凍干燥24小時，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長。實施例8。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.2小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到2wt%濃度，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12小時，使絲素蛋白水溶液中的水分減少及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C冰箱中冷凍2個小時，之后真空冷凍干燥24小時，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例9。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌三次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為21條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖I小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到5wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風(fēng)干24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟 (6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。(8)步驟(7)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量達(dá)5Mpa以上。
實施例10。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為22條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到5wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風(fēng)干24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長。實施例11。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為21條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.2小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到5wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風(fēng)干24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。

實施例12。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為18條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖0.95小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5 )將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到10wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風(fēng)干24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，干燥后得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例13。(I)用醫(yī)用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖I小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5 )將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到10wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風(fēng)干24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中。干燥后得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長。實施例14。本實施例中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌3次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物，此過程在0.1°C環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物 ，然后置于搖床上輕輕振搖1.3個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。此過程在0.1°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料，再將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為70%的酒精中12.5個小時，此過程作為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，以及延緩高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。本實施例制備而成的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，將該高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進(jìn)骨組織的生長。實施例15。本實施例中高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料制備方法依次包括如下步驟。(I)用醫(yī)用鉗將野蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌一次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為25條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在1°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到13wt%濃度，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12.2小時,使絲素蛋白水溶液中的水分減少，及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C冰箱中冷凍2個小時，之后真空冷凍干燥24小時，得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。(7)將步驟(6)中的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，及延緩支架材料在生物體內(nèi)的降解速度，得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量達(dá)5Mpa以上。實施例16。(I)用醫(yī)用鉗將蜘蛛解剖后取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環(huán)境中進(jìn)行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當(dāng)解剖的家蠶數(shù)量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.3小時，所得溶液經(jīng)過離心分離去除不溶物后，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環(huán)境中進(jìn)行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。(5 )將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調(diào)整到13wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶 液混合均勻，滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風(fēng)干24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，干燥后得到高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料，得到的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長。 雖然本發(fā)明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何熟悉該項技術(shù)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)所作的更動與潤飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
權(quán)利要求
1.一種高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:該制備方法包括如下步驟: (1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白； (2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物； (3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然后置于搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液； (4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%-20wt%，然后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在25-35°C的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在-30- (-10) °〇的條件下冷凍1-3個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥14-34個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時，此過程作為后處理過程，目的是提高高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的力學(xué)性能，以及延緩高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料在生物體內(nèi)的降解速度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中，含有絲腺蛋白的昆蟲為家蠶、野蠶或蜘蛛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經(jīng)過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa ;所述步驟(4)中，所述高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中，將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(2 )和(3 )均在O V的環(huán)境中進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調(diào)整到lwt%-20wt%，然后滴加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準(zhǔn)，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)向折疊轉(zhuǎn)變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在_20°C的條件下冷凍2個小時，再經(jīng)過真空冷凍干燥24個小時，從而得到多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:將多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于:所述家蠶為五齡第7天的 家蠶幼蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法。目前還沒有一種制備條件溫和，對環(huán)境無污染的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料的制備方法。本發(fā)明的特點在于該制備方法包括如下步驟(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，得絲腺蛋白；(2)將絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1-5次，除去可溶性的絲膠蛋白，得絲素蛋白膠狀物；(3)將絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，置于搖床上振搖0.3-4個小時得到溶液，將溶液經(jīng)離心分離以去除不溶物，得絲素蛋白水溶液；(4)將絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強(qiáng)度絲素骨修復(fù)支架材料。本發(fā)明制備條件溫和，對環(huán)境無污染。
文檔編號A61L27/22GK103223193SQ20131012295
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者楊明英, 帥亞俊, 周官山, 朱良均, 閔思佳 申請人:浙江大學(xué)