減少或消除由暴露于uv光而引起的蛋白質(zhì)修飾和降解的方法
【專利摘要】本文提供了使包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒滅活的方法。本文還提供了在存在反應性物種如由于UV暴露而產(chǎn)生的反應性物種的情況下減少蛋白質(zhì)降解或修飾的方法。另一方面，本文提供了一種減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法。所述公開的方法可以在任何規(guī)模下進行并且根據(jù)需要可以是自動化的。
【專利說明】減少或消除由暴露于UV光而引起的蛋白質(zhì)修飾和降解的方法發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明總體上涉及用于保護基于蛋白質(zhì)的分子免受操作期間的降解和修飾并且用于在對蛋白質(zhì)沒有損害的情況下促進UV-C暴露增加的化合物和方法，所述操作涉及使所述基于蛋白質(zhì)的分子暴露于UV光，具體是使用處于UV-C波長下的光的病毒滅活方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]細胞培養(yǎng)基和上清液的病毒污染對全世界范圍內(nèi)的生物制藥制造商提出了挑戰(zhàn)。已采用了若干方法使大的或小的、包膜或未包膜的(或“裸的”)DNA或RNA病毒顆粒滅活和/或使其從細胞上清液中除去。這些方法的實例包括20nm過濾技術(shù)、陰離子交換膜色譜法、低PH孵育以及深度過濾器技術(shù)。
[0004]除了以上技術(shù)之外，還使用了紫外光來處理含有蛋白質(zhì)的溶液以便使病毒滅活。然而，為了實現(xiàn)有效的病毒滅活，必須使溶液暴露于足夠劑量的UV-C波段中的UV光。在一些例子中，所希望的水平的υν-c光暴露可以在溶液中引起蛋白質(zhì)的不希望的修飾和/或降解。例如，在一些情況下，反應性物種(reactive species)可以在溶液中形成并且在溶液中導致蛋白質(zhì)的間接氧化或修飾；其它針對由于UV-C暴露引起的間接修飾的機理也是可能的。參見，例如 Cabiscol 等，(2010) Int.Microb1l, 3:315 ;Bandyopadhyay 等(1999)Curr.Sc1.77:658-666 ；Schoneich, (2005)B1chim B1phys Actal703:111-19 ；Stadtman等，(2003) Ant1xid.Redox.Signal5:577-82 ；Stadtman, (1993) Ann.Rev.B1chem.62:797-821 ;以及 Dean 等，(1997) B1chem.J.324:1-18。
[0005]本公開通過提供在暴露于UV波段光，并且更具體地UV-C光的溶液中減少蛋白質(zhì)的氧化、修飾和降解的方法來解決這些和其它挑戰(zhàn)。如所描述的，暴露于UV-C可以是病毒滅活操作的一個部分，并且溶液中的蛋白質(zhì)可以是任何類型，例如像抗原結(jié)合蛋白這樣的蛋白質(zhì)(例如，以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fc結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)。
[0006]發(fā)明概述
[0007]一方面，提供了一種使包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒滅活的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)提供包含蛋白質(zhì)組分的樣品，其中已知或懷疑所述樣品包含病毒；(b)鑒定在其下病毒被滅活的UV光的目標劑量；(c)將保護劑添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物；(d)使穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光，持續(xù)選擇的時間段；(e)評價穩(wěn)定的混合物的UV-C暴露水平；以及(f)如果評價指出目標劑量的UV光尚未遞送至穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制波長、UV光源功率以及UV光暴露時間中的一種或多種。
[0008]在一個實施方案中，所述樣品包括色譜柱池；在具體實施方案中，所述池可以包括以下各項中的一種或多種:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。在另一個實施方案中，所述樣品包括色譜柱流出物流；在具體實施方案中，所述流出物流可以包括以下各項中的一種或多種:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
[0009]在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)組分可以包括以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fe結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；QV) Fe融合蛋白；以及(V)治療性蛋白。
[0010]在還另外的實施方案中，所述病毒包括以下各項中的一種或多種:dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒以及ssRNA病毒；在具體實施方案中，所述病毒可以包括以下一種或多種病毒科的病毒:腺病毒科(adenoviridae)、非洲豬痕病毒科(asfarviridae)、抱疫病毒科(herpesviridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、乳頭瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痕病毒科(poxviridae)、環(huán)狀病毒科(circoviridae)、嗜肝 DNA 病毒科(hepadnaviridae)、細小病毒科(parvoviridae)、雙RNA病毒科(birnaviridae)、呼腸孤病毒科(reoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、vornaviridae、布尼亞病毒科(bunyaviridae)、D型肝炎病毒科(deltaviridae)、絲狀病毒科(filoviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、彈狀病毒科(rhabdoviridae)、動脈炎病毒科(arter1viridae)、星狀病毒科(astroviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、冠狀病毒科(cornonavirdae)、黃病毒科(flaviviridae)、HEV-樣病毒、野田村病毒科(nodaviridae)、小RNA病毒科(picornaviridae)、披膜病毒科(togaviridae)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒科(tertroviridae)。在具體實施方案中，所述病毒為細小病毒MVM、逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV或布尼亞病毒CVV。
[0011]在又另一個實施方案中，以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將保護劑添加至樣品中，并且在其它實施方案中，保護劑可以包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。在具體實施方案中，保護劑包括以下各項之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
[0012]在還另外的實施方案中，UV光的波長在約200nm至約280nm的范圍內(nèi)；在具體實施方案中，UV光的波長為約254nm。在各種實施方案中，目標劑量可以是以下各項中的一種或多種:約 lmj/cm2、約 10mJ/cm2、約 25mJ/cm2、約 50mJ/cm2、約 75mJ/cm2、約 100mJ/cm2、約125mJ/cm2、約 200mJ/cm2、約 250mJ/cm2、約 300mJ/cm2、約 350mJ/cm2、約 400mJ/cm2、約 450mJ/cm2、約 500mJ/cm2、約 600mJ/cm2、約 700mJ/cm2、約 800mJ/cm2、約 900mJ/cm2、約 1000mJ/cm2 以及大于約1000mJ/cm2。
[0013]在一些實施方案中，所述方法提供了大于或等于約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5或大于約6.5的病毒對數(shù)減少值(LRV)。
[0014]在另一個實施方案中，所述方法是自動化的，并且在還另一個實施方案中，所述方法作為蛋白質(zhì)純化操作中的一個步驟而進行。
[0015]另一方面，提供了一種減少由UV暴露期間產(chǎn)生的反應性物種的存在而引起的蛋白質(zhì)降解或修飾的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)提供包含蛋白質(zhì)組分的樣品，已知或懷疑所述蛋白質(zhì)組分在存在反應性物種的情況下被降解或修飾；(b)鑒定UV光的目標劑量；(C)將保護劑添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物；(d)使穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光，持續(xù)選擇的時間段；(e)評價穩(wěn)定的混合物的UV-C暴露水平；以及(f)如果評價指出目標劑量的UV光尚未遞送至穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制波長、UV光源功率以及UV光暴露時間中的一種或多種。
[0016]在一個實施方案中，所述樣品包括色譜柱池；在具體實施方案中，所述池可以包括以下各項中的一種或多種:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。在另一個實施方案中，所述樣品包括色譜柱流出物流；在具體實施方案中，所述流出物流可以包括以下各項中的一種或多種:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
[0017]在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)組分可以包括以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fe結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；(iv)Fe融合蛋白；以及(V)治療性蛋白。
[0018]在又另一個實施方案中，以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將保護劑添加至樣品中，并且在其它實施方案中，保護劑可以包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。在具體實施方案中，保護劑包括以下各項之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
[0019]在還另外的實施方案中，UV光的波長在約200nm至約280nm的范圍內(nèi)；在具體實施方案中，UV光的波長為約254nm。在各種實施方案中，目標劑量可以是以下各項中的一種或多種:約 lmj/cm2、約 10mJ/cm2、約 25mJ/cm2、約 50mJ/cm2、約 75mJ/cm2、約 100mJ/cm2、約125mJ/cm2、約 200mJ/cm2、約 250mJ/cm2、約 300mJ/cm2、約 350mJ/cm2、約 400mJ/cm2、約 450mJ/cm2、約 500mJ/cm2、約 600mJ/cm2、約 700mJ/cm2、約 800mJ/cm2、約 900mJ/cm2、約 1000mJ/cm2 以及大于約1000mJ/cm2。
[0020]在一些實施方案中，所述方法提供了大于或等于約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5或大于約6.5的病毒對數(shù)減少值(LRV)。
[0021]在另一個實施方案中，所述方法是自動化的，并且在還另一個實施方案中，所述方法作為蛋白質(zhì)純化操作中的一個步驟而進行。
[0022]在還另一個方面中，提供了一種減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)提供包含蛋白質(zhì)組分的樣品，所述蛋白質(zhì)組分包含甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者；(b)鑒定UV光的目標劑量；(c)將保護劑添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物；(d)使穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光，持續(xù)選擇的時間段；(e)評價穩(wěn)定的混合物的UV-C暴露水平；以及
(f)如果評價指出目標劑量的UV光尚未遞送至穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制波長、UV光源功率以及UV光暴露時間中的一種或多種。
[0023]在一個實施方案中，所述樣品包括色譜柱池；在具體實施方案中，所述池可以包括以下各項中的一種或多種:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。在另一個實施方案中，所述樣品包括色譜柱流出物流；在具體實施方案中，所述流出物流可以包括以下各項中的一種或多種:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
[0024]在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)組分可以包括以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fe結(jié)構(gòu)域；
(iii)肽；QV) Fe融合蛋白；以及(V)治療性蛋白。
[0025]在又另一個實施方案中，以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將保護劑添加至樣品中，并且在其它實施方案中，保護劑可以包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。在具體實施方案中，保護劑包括以下各項之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
[0026]在還另外的實施方案中，UV光的波長在約200nm至約280nm的范圍內(nèi)；在具體實施方案中，UV光的波長為約254nm。在各種實施方案中，目標劑量可以是以下各項中的一種或多種:約 lmj/cm2、約 10mJ/cm2、約 25mJ/cm2、約 50mJ/cm2、約 75mJ/cm2、約 100mJ/cm2、約125mJ/cm2、約 200mJ/cm2、約 250mJ/cm2、約 300mJ/cm2、約 350mJ/cm2、約 400mJ/cm2、約 450mJ/cm2、約 500mJ/cm2、約 600mJ/cm2、約 700mJ/cm2、約 800mJ/cm2、約 900mJ/cm2、約 1000mJ/cm2 以及大于約1000mJ/cm2。
[0027]在一些實施方案中，所述方法提供了大于或等于約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約
2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5或大于約6.5的病毒對數(shù)減少值(LRV)。
[0028]在另一個實施方案中，所述方法是自動化的，并且在還另一個實施方案中，所述方法作為蛋白質(zhì)純化操作中的一個步驟而進行。
[0029]附圖簡述
[0030]圖1是通過SEC-HPLC測定在三種不同pH水平(pH 4.3,5.0和7.0)下監(jiān)測的作為UV-C暴露的函數(shù)的三種不同單克隆抗體樣品(Mab X、Mab Y,Mab Z)的主峰變化百分比的曲線圖；y軸被繪制為與遞送至溶液表面的OmJ劑量相比的值的變化％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量(mj/cm2)。所有樣品均為過濾型病毒滅活的池(FVIP)。
[0031]圖2是通過CEX-HPLC測定在三種不同pH水平(pH4.3、5.0和7.0)下監(jiān)測的作為UV-C暴露的函數(shù)的兩種不同單克隆抗體樣品(Mab X、Mab Z)的主峰、酸峰和堿峰純度的曲線圖；y軸被繪制為與遞送至溶液表面的OmJ/cm2劑量相比的所測量的物種的分布％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量(mj/cm2)。所有樣品均為過濾型病毒滅活的池(FVIP)。
[0032]圖3是通過SEC-HPLC測定在三種不同電導率水平(低(30mM HOAc)、標準(10mMHOAc)和高(300mMH0Ac))下監(jiān)測的作為UV-C暴露的函數(shù)的三種不同單克隆抗體樣品(MabX、Mab Y、Mab Z)的主峰變化百分比的曲線圖；y軸被繪制為與遞送至溶液表面的OmJ/cm2劑量相比的值的變化％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量(mj/cm2)。
[0033]圖4是通過CEX-HPLC測定在三種不同電導率水平(低(30mM HOAc)、標準(10mMHOAc)和高(300mM HOAc))下監(jiān)測的作為UV-C暴露的函數(shù)的兩種不同單克隆抗體樣品(MabX、Mab Z)的主峰、酸峰和堿峰純度的曲線圖；y軸被繪制為與遞送至溶液表面的OmJ/cm2劑量相比的所測量的物種的分布％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量(mj/cm2)。所有樣品均為過濾型病毒滅活的池(FVIP)。
[0034]圖5是通過SEC-HPLC測定在三種不同濃度(低(6g/L)、標準(12g/L)、高(24g/L))下監(jiān)測的作為UV-C暴露的函數(shù)的單克隆抗體(Mab X)的主峰濃度的曲線圖；y軸被繪制為與遞送至溶液表面的OmJ/cm2劑量相比的值的變化％并且X軸被繪制為當通過溶液組分解釋UV吸光度時所接受的計算的劑量(mj/cm2)。
[0035]圖6是如通過SEC-HPLC測定所監(jiān)測作為UV-C暴露的函數(shù)的單克隆抗體(Mab X)的主峰純度的一個曲線圖和三個跡線。曲線圖示出Mab X的兩個肽圖，UV暴露運行I和UV暴露運行2。y軸被繪制為與遞送至溶液表面的OmJ/cm2劑量相比的值的變化％，并且x軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量(mj/cm2)。
[0036]圖7是突出在遞送至溶液表面的10，000mj/cm2的UV-C暴露之后觀察到的對單克隆抗體(Mab X)的氨基酸殘基的氧化作用的肽圖。在此極端的UV-C劑量暴露后觀察到位置425和位置249處的甲硫氨酸殘基的氧化。
[0037]圖8 是概述了作為 OmJ/cm2、150mJ/cm2、375mJ/cm2 和 / 或 1000mJ/cm2 的 UV-C 暴露劑量的函數(shù)的針對單克隆抗體(Mab X)的純度和活性趨勢的表格。肽圖結(jié)果鑒定了隨著劑量增加而水平增加的蛋白質(zhì)上特定甲硫氨酸殘基的氧化。Mab X被稱為“對照”并且酪氨酸被稱為“添加I”。
[0038]圖9是如通過SEC-HPLC測定所監(jiān)測在存在和不存在保護劑的情況下作為UV-C暴露的函數(shù)的單克隆抗體(Mab X)的主峰純度的曲線圖；y軸被繪制為呈所測量的物種的分布的主峰％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量(mj/cm2)。曲線圖示出針對Mab X的三個肽圖:UV暴露運行I和UV暴露運行2 (未處理的重復運行)以及UV暴露“添加劑#2” (用色氨酸保護的運行)。
[0039]圖10是在存在和不存在保護劑和單克隆抗體(Mab Y)的情況下作為UV-C暴露的函數(shù)的xmuLV滅活的曲線圖。y軸被繪制為與已知病毒載量尖峰相差的相對對數(shù)減少量(對數(shù)減少值(LRV))。X軸被繪制為當通過溶液組分解釋UV吸光度時所接受的計算的劑量(mj/cm2)。樣品“對照” (Mab Y)中的蛋白質(zhì)濃度處于2g/L和30g/L，樣品“添加劑I” (MabY+酪氨酸)中的蛋白質(zhì)濃度處于2g/L和30g/L。
[0040]圖1la和圖1lb是示出要求用于DNA病毒(圖1la)和RNA病毒(圖1lb)滅活的所要求的UV-C劑量的表。
[0041]圖12是示出預測的對數(shù)減少值(LRV)與要求用于各種病毒滅活的UV劑量的表格。
[0042]圖13是示出并行運行以適應大量穩(wěn)定的樣品的多個UV-C源的示意圖。
[0043]圖14是如通過SEC-HPLC測定所監(jiān)測在存在各種保護劑(包括酪氨酸(TYR)、色氨酸(TRP)、苯丙氨酸(PHE)、葉酸、甲硫氨酸(MET)以及組氨酸(HIS))的情況下作為UV-C暴露的函數(shù)的單克隆抗體(Mab X)的主峰純度的曲線圖；y軸被繪制為呈所測量的物種的分布的主峰％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量。氨基酸與Mab X的摩爾比為20:1。還提供了 Mab X的對照。
[0044]圖15是如通過SEC-HPLC測定所監(jiān)測在存在各種保護劑(包括酪氨酸(TYR)、色氨酸(TRP)、苯丙氨酸(PHE)、葉酸、甲硫氨酸(MET)以及組氨酸(HIS))的情況下作為UV-C暴露的函數(shù)的單克隆抗體(Mab X)的主峰純度的曲線圖，并且呈現(xiàn)為與初始純度相差的變化百分比；y軸被繪制為主峰純度的歸一化的變化％并且X軸被繪制為遞送至溶液表面的計算的劑量。氨基酸與Mab X的摩爾比為20: I。還提供了 Mab X的對照。
[0045]發(fā)明詳述
[0046]本公開提供了用在紫外光范圍的C波段(UV-C，大約254nm)中的輻射處理含有蛋白質(zhì)的溶液的方法。更具體地說，本公開提供了在存在使蛋白質(zhì)穩(wěn)定或使蛋白質(zhì)修飾(例如，如甲硫氨酸和色氨酸的殘基的氧化)減至最少的化學品的情況下，用在紫外光范圍的C波段(UV-C，大約254nm)中的輻射處理含有蛋白質(zhì)的溶液的方法。
[0047]本文所提供的病毒滅活方法目標在于使蛋白質(zhì)損害、修飾或摻雜減至最少同時使病毒和與病毒相關(guān)的顆粒的滅活潛力最大化的謹慎平衡。本公開提供了對各種溶液添加劑的鑒定，所述溶液添加劑可以提供保護溶液蛋白質(zhì)免受由通過UV-C波段光處理溶液時產(chǎn)生的物種引起的間接修飾。對許多的多肽分子，特別是抗原結(jié)合蛋白(例如，單克隆抗體分子)收集數(shù)據(jù)以建立UV-C對蛋白質(zhì)修飾的作用。如通過SEC-HPLC(以檢測聚集和二聚化)、CEX-HPLC(以檢測電荷改性)、肽作圖(以檢測分子修飾、氧化和其它作用)以及生物活性(以檢測分子效力)所測量，建立劑量水平(每平方厘米透射的UV-C的毫焦耳數(shù))與蛋白質(zhì)修飾水平之間的關(guān)系。
[0048]因此，一方面，本公開涉及一種使含有蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒滅活的方法。所述方法涉及使用UV光來使病毒滅活。所公開的方法的一個有益方面是:它并入了可以使樣品的蛋白質(zhì)組分的降解或修飾的可能性減至最小的保護劑。所述方法可以涉及反饋組分，其中監(jiān)測包含保護劑的樣品以確保樣品正獲得足夠劑量的UV光以便使病毒滅活，但同時使蛋白質(zhì)組分在可以損害蛋白質(zhì)的UV光劑量下的暴露減至最小。此工藝可以有效地消除樣品中的病毒而同時使蛋白質(zhì)降解減至最少，并且當大規(guī)模(在樣品體積方面或以并行操作的方式)進行時可以具有益處，具體是因為所述方法可從實驗臺規(guī)模(所述實驗臺規(guī)模涉及大約若干升的培養(yǎng)物)擴展高達至生產(chǎn)規(guī)模(所述生產(chǎn)規(guī)模涉及成千上萬升的培養(yǎng)物)。
[0049]另一方面，本公開涉及一種在存在反應性物種如可以通過溶液暴露于UV光而產(chǎn)生的反應性物種的情況下減少蛋白質(zhì)降解或修飾的方法。已觀察到蛋白質(zhì)可以由于長時間暴露于UV光而降解或被修飾。通過在包含蛋白質(zhì)組分的樣品中包括保護劑，可以減少或消除對蛋白質(zhì)的損害。所述方法可以涉及反饋組分，其中監(jiān)測包含保護劑的樣品以確保樣品正獲得足夠劑量的UV光以便使病毒滅活，但同時使蛋白質(zhì)組分在可以損害蛋白質(zhì)的UV光劑量下的暴露減至最小。此工藝可以有效地保護樣品的蛋白質(zhì)組分免受蛋白質(zhì)降解或修飾，并且當大規(guī)模(在樣品體積方面或以并行操作的方式)進行時可以具有益處，具體是因為所述方法可從實驗臺規(guī)模(所述實驗臺規(guī)模涉及大約若干升的培養(yǎng)物)擴展高達至生產(chǎn)規(guī)模(所述生產(chǎn)規(guī)模涉及成千上萬升的培養(yǎng)物)。
[0050]在還另一方面中，本公開涉及一種減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法。已觀察到色氨酸和甲硫氨酸可以由于長時間暴露于UV光而氧化。通過在包含蛋白質(zhì)組分的樣品中包括保護劑，可以減少或消除這種氧化。所述方法可以涉及反饋組分，其中監(jiān)測包含保護劑的樣品以確保樣品正獲得足夠劑量的UV光以便使病毒滅活，但同時使蛋白質(zhì)組分在可以損害蛋白質(zhì)的UV光劑量下的暴露減至最小。此工藝可以有效地保護樣品的蛋白質(zhì)組分免受蛋白質(zhì)降解或修飾，并且當大規(guī)模(在樣品體積方面或以并行操作的方式)進行時可以具有益處，具體是因為所述方法可從實驗臺規(guī)模(所述實驗臺規(guī)模涉及大約若干升的培養(yǎng)物)擴展高達至生產(chǎn)規(guī)模(所述生產(chǎn)規(guī)模涉及成千上萬升的培養(yǎng)物)。
[0051]所公開的方法的一個優(yōu)點是:它們可以在從實驗室規(guī)模(通常毫升或升規(guī)模)、中試規(guī)模(通常成百上千升)或工業(yè)規(guī)模(通常成千上萬升)的規(guī)模范圍下進行。此外，所述工藝還可以并行地或依次地進行多次。因此，所述工藝容易適合于自動化。大規(guī)模應用所公開的方法可以是在生物分子制造工藝中特別希望的。
[0052]1.定義
[0053]如本文所使用，術(shù)語“一個(a)”和“一種(an)”意指一個(種)或多個(種)，除非另外確切地指出。
[0054]如本文所使用，術(shù)語“抗原”是指能夠被選擇性結(jié)合劑結(jié)合的分子或分子的一部分，如抗原結(jié)合蛋白(包括，例如抗體或其免疫功能性片段)，并且還可以能夠用于動物中以產(chǎn)生能夠與所述抗原結(jié)合的抗體。抗原可以擁有能夠與不同抗原結(jié)合蛋白(例如，抗體)相互作用的一個或多個表位。
[0055]如本文所使用，術(shù)語“抗原結(jié)合蛋白”是指包含與抗原或靶標結(jié)合的一個部分并且任選地包含允許抗原結(jié)合部分采用促進抗原結(jié)合蛋白與抗原結(jié)合的構(gòu)型的一個支架或框架部分的蛋白質(zhì)。抗原結(jié)合蛋白的實例包括單克隆抗體；人抗體；人源化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；雙抗體；三抗體；四抗體；結(jié)構(gòu)域抗體；Fab片段；F(ab’)2片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgGl抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體以及其片段。抗原結(jié)合蛋白可以包括，例如具有移植的CDR或CDR衍生物的替代蛋白支架或人工支架。此類支架包括，但不限于:抗體來源的支架，其包含被引入以便例如使抗原結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的突變；以及完全合成的支架，其包含例如生物相容性聚合物。參見，例如Korndorfer等，(2003)Proteins:Structure, Funct1n, and B1informatics,53(I):121-129 ；Roque等，(2004)B1technol.Prog.20:639-6540另外，肽抗體模擬物(“PAM”)可以形成支架以及利用纖連蛋白組分的基于抗體模擬物的支架。
[0056]抗原結(jié)合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)?！懊庖咔虻鞍住笔撬木垠w分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每個四聚體主要由兩個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50kDa至70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括主要負責抗原識別的具有約100至110個或更多個氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分限定了主要負責效應子功能的恒定區(qū)。人輕鏈被分類為K輕鏈和λ輕鏈。重鏈被分類為μ、δ、Υ、α或ε，并且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過具有約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，其中重鏈還包括具有約10個或更多個氨基酸的“D”區(qū)。一般參見Fundamental Immunology第2版第7章(Paul，W.編著，Raven Press, N.Y.(1989))，出于所有目的，所述參考文獻以引用的方式整體并入。每個輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點，這樣使得完整的免疫球蛋白具有兩個結(jié)合位點。
[0057]天然存在的免疫球蛋白鏈展現(xiàn)出由三個高變區(qū)連接的相對保守的框架區(qū)(FR)的相同通用結(jié)構(gòu)，所述高變區(qū)又稱為互補決定區(qū)或CDR。從N端至C端，輕鏈和重鏈均包含結(jié)構(gòu)域 FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 FR4。可以根據(jù) Kabat 等，(1991) “Sequencesof Proteins of Immunological Interest”，第 5 版，US Dept, of Health and HumanServices, PHS, NIH, NIH出版號91-3242的定義來進行每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配。雖然根據(jù)需要使用Kabat命名系統(tǒng)呈現(xiàn)出，但是本文所公開的CDR還可以根據(jù)替代的命名方案重新定義，如 Chothia (參見 Chothia&Lesk, (1987) J.Mol.B1l.196:901-917 ；Chothia 等，(1989)Nature342:878-883 或 Honegger&Pluckthun，(2001)J.Mol.B1l.309:657-670)的命名方案。
[0058]如本文所使用，術(shù)語“抗體”是指完整的免疫球蛋白或針對特異性結(jié)合與完整抗體競爭的其抗原結(jié)合部分，除非另外指明。抗原結(jié)合部分可以通過重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶促裂解或化學裂解來產(chǎn)生。抗原結(jié)合部分尤其包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、包括互補決定區(qū)(CDR)的片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體以及包含足以賦予與多肽的特異性抗原結(jié)合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。
[0059]Fab片段是具有Vh、(^和ChI結(jié)構(gòu)域的單價片段；F(ab’)2片段是在鉸鏈區(qū)具有通過二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；Fd片段具有Vh結(jié)構(gòu)域和ChI結(jié)構(gòu)域；Fv片段具有抗體的單臂的\結(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域；并且dAb片段具有Vh結(jié)構(gòu)域、Vl結(jié)構(gòu)域或Vh結(jié)構(gòu)域或\結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段(美國專利號6，846，634和6，696，245 ;以及美國申請公布號 05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958，Ward 等，Nature341:544-546(1989))。
[0060]單鏈抗體(scFv)是其中Vl區(qū)和Vh區(qū)經(jīng)由接頭(例如，具有氨基酸殘基的合成序列)連接以形成連續(xù)的蛋白質(zhì)鏈的抗體，其中接頭是足夠長的以允許蛋白質(zhì)鏈在其自身上向后折疊并且形成單價抗原結(jié)合位點(參見，例如Bird等，(1988) Science242:423-26以及 Huston 等，(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-83)。雙抗體是包含兩個多肽鏈的二價抗體，其中每個多肽鏈包含通過接頭連接的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域，所述接頭太短以致不能允許在同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間成對，由此允許每個結(jié)構(gòu)域與另一個多肽鏈上的互補結(jié)構(gòu)域成對(參見，例如 Holliger 等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-48 以及Poljak等，(1994)Structure2:1121-23)。如果雙抗體的兩個多肽鏈是相同的，則由它們成對而產(chǎn)生的雙抗體將具有兩個相同的抗原結(jié)合位點。具有不同序列的多肽鏈可以用來制造具有兩個不同抗原結(jié)合位點的雙抗體。類似地，三抗體和四抗體是分別包含三個和四個多肽鏈并且分別形成三個和四個抗原結(jié)合位點的抗體，所述抗原結(jié)合位點可以是相同的或不同的。
[0061]可以使用由Kabat 等，(1991) “Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”,第5版，US Dept, of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242所描述的系統(tǒng)來鑒定給定的抗體的互補決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)。雖然根據(jù)需要使用Kabat命名系統(tǒng)呈現(xiàn)出，但是本文所公開的CDR還可以根據(jù)替代的命名方案重新定義，如 Chothia (參見 Chothia&Lesk, (1987) T.Mol.B1l.196:901-917 ；Chothia 等，(1989)Nature342:878-883 或Honegger &Pluckthun, (2001) J.Mol.B1l.309:657-670)的命名方案?？梢怨矁r地或非共價地將一個或多個CDR并入到分子中，以使得所述分子成為抗原結(jié)合蛋白?？乖Y(jié)合蛋白可以并入一個或多個CDR作為更大的多肽鏈的部分，可以共價地使一個或多個⑶R與另一個多肽鏈連接，或可以非共價地并入一個或多個⑶R。⑶R容許抗原結(jié)合蛋白特異性地與感興趣的具體抗原結(jié)合。
[0062]抗原結(jié)合蛋白可以具有一個或多個結(jié)合位點。如果存在多于一個結(jié)合位點，則結(jié)合位點可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有兩個相同的結(jié)合位點，而“雙特異性的”或“雙功能性的”抗體具有兩個不同的結(jié)合位點。此雙特異性形式的抗原結(jié)合蛋白包括本公開的方面。
[0063]如本文所使用，術(shù)語“人抗體”是指具有一個或多個源自人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的所有抗體。在一個實施方案中，所有的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域均源自人免疫球蛋白序列(完全人抗體)。這些抗體可以用多種方式制備，所述方式的實例在以下描述，包括通過用小鼠的感興趣的抗原進行免疫，所述小鼠被基因修飾以表達源自人重鏈編碼基因和/或輕鏈編碼基因的抗體，如源自Xenomouse?、UltiMab?、
HuMAb-Mcmse?、Velocimou.se?，Velocimmune?、KyMouse 或 AlivaMab 系統(tǒng)或源自人重鏈轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因大鼠人抗體譜、轉(zhuǎn)基因兔人抗體譜或牛人抗體譜或HuTargTM技術(shù)的小鼠。還可以米用基于卩遼菌體的方法。
[0064]人源化抗體具有通過一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加與源自非人物種的抗體的序列不同的序列，這樣使得當向人受試者施用時，人源化抗體與非人物種抗體相比不太可能誘導免疫應答和/或誘導不太嚴重的免疫應答。在一個實施方案中，非人物種抗體的重鏈和/或輕鏈的框架結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸被突變以產(chǎn)生人源化抗體。在另一個實施方案中，來自人抗體的一個或多個恒定結(jié)構(gòu)域被融合至非人物種的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域中。在另一個實施方案中，當向人受試者施用時，非人抗體的一個或多個CDR序列中的一個或多個氨基酸殘基被改變以減小非人抗體的可能的免疫原性，其中改變的氨基酸殘基不是抗體與其抗原的免疫特異性結(jié)合的關(guān)鍵或做出的對氨基酸序列的改變是保守性改變，這樣使得人源化抗體與抗原的結(jié)合不明顯差于非人抗體與抗原的結(jié)合。如何制得人源化抗體的實例可以在美國專利號6，054, 297,5, 886，152和5，877，293中找到。
[0065]如本文所使用，術(shù)語“嵌合抗體”是指包含來自一種抗體的一個或多個區(qū)和來自一種或多種其它抗體的一個或多個區(qū)的抗體。在一個實施方案中，一個或多個CDR源自與選擇的靶標結(jié)合的人抗體。在另一個實施方案中，所有的CDR均源自與選擇的靶標結(jié)合的人抗體。在另一個實施方案中，混合來自與選擇的靶標結(jié)合的多于一種人抗體的CDR并且在嵌合抗體中匹配。例如，嵌合抗體可以包含來自與選擇的靶標結(jié)合的第一人抗體的輕鏈的CDR1、來自與選擇的靶標結(jié)合的第二人抗體的輕鏈的CDR2和CDR3以及來自與選擇的靶標結(jié)合的第三抗體的重鏈的CDR。此外，框架區(qū)可以源自與選擇的靶標結(jié)合的相同抗體之一，源自一個或多個不同的抗體(如人抗體)，或源自人源化抗體。在嵌合抗體的一個實例中，重鏈和/或輕鏈的一部分與來自具體物種或?qū)儆诰唧w抗體類別或子類別的抗體相同、與此同源或源自于此，而一個或多個鏈的剩余部分與來自另一種物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或子類別的一種抗體或多種抗體相同、與此同源或源自于此。還包括展現(xiàn)出希望的生物活性(例如，與選擇的靶標特異性結(jié)合的能力)的此類抗體的片段。
[0066]如本文所使用，術(shù)語“Fe”和“Fe區(qū)”可互換使用并且是指包含人或非人(例如，鼠科動物)Ch2和Ch3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的抗體的一個片段，或所述抗體的片段包含與人或非人Ch2和Ch3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域至少90 %相同的兩個連續(xù)區(qū)。通過兩個或更多個二硫鍵并且通過CH3結(jié)構(gòu)域的疏水性相互作用使兩個重鏈片段保持在一起。Fe可以但不需要具有與Fe受體相互作用的能力。參見，例如William Ε.Paul編著的Hasemann&Capra,“Immunoglobulins:Structure and Funct1n,，，F(xiàn)undamental Tmmunologv,第二版，209,210-218 (1989)，所述參考文獻以引用的方式整體并入本文。
[0067]如本文所使用，術(shù)語“Fe融合”和“Fe融合蛋白”可互換使用并且是指共價附接至Fe結(jié)構(gòu)域的肽或多肽。
[0068]如本文所使用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用，并且意指通過肽鍵連接的具有至少五個天然或非天然存在的氨基酸的任何鏈。
[0069]如本文所使用，術(shù)語“肽體”是指包含任選地經(jīng)由接頭與Fe結(jié)構(gòu)域連接在一起的一個或多個生物活性肽的多肽。參見美國專利號6，660，843、美國專利號7，138，370和美國專利號7，511，012針對肽體的實例。
[0070]如本文所使用，術(shù)語“Fab’片段”是指包含一條輕鏈和一條重鏈的一部分的結(jié)構(gòu)，所述重鏈包含Vh結(jié)構(gòu)域和ChI結(jié)構(gòu)域并且還有ChI結(jié)構(gòu)域與Ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)，這樣使得可以在兩個Fab’片段的兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
[0071]如本文所使用，術(shù)語“？(&13’)2片段”是指包含兩個輕鏈和兩個重鏈的結(jié)構(gòu)，所述重鏈包含ChI結(jié)構(gòu)域與Ch2結(jié)構(gòu)域之間的恒定區(qū)的一部分，這樣使得在兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(xiàn)(ab’)2片段主要由通過兩個重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
[0072]如本文所使用，術(shù)語“Fv區(qū)”是指包含來自重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)但是缺乏恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)。
[0073]如本文所使用，術(shù)語“結(jié)構(gòu)域抗體”是指僅包含重鏈的可變區(qū)或輕鏈的可變區(qū)的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些例子中，用肽接頭將兩個或更多個Vh區(qū)共價連接以生成二價結(jié)構(gòu)域抗體。二價結(jié)構(gòu)域抗體的兩個Vh區(qū)可以靶向相同或不同的抗原。
[0074]如本文所使用，術(shù)語“半抗體(hemibody) ”是指包含完整重鏈、完整輕鏈以及與完整重鏈的Fe區(qū)成對的第二重鏈Fe區(qū)的免疫功能性免疫球蛋白構(gòu)建體。可以但不需要采用接頭來連接重鏈Fe區(qū)和第二重鏈Fe區(qū)。在具體實施方案中，半抗體是本文所公開的抗原結(jié)合蛋白的單價形式。在其它實施方案中，可以采用帶電的殘基對來使一個Fe區(qū)與第二Fe區(qū)締合。
[0075]如本文所使用，術(shù)語“二價抗原結(jié)合蛋白”或“二價抗體”是指包含兩個抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合蛋白或抗體。在一些例子中，兩個結(jié)合位點具有相同的抗原特異性。二價抗原結(jié)合蛋白和二價抗體可以是如本文所描述的雙特異性的并且形成本公開的方面。
[0076]如本文所使用，當在蛋白質(zhì)組分的背景下使用時，術(shù)語“多特異性抗原結(jié)合蛋白”或“多特異性抗體”是靶向多于一個抗原或表位的多特異性抗原結(jié)合蛋白或多特異性抗體，并且形成本公開的另一個方面。
[0077]如本文所使用，當在抗原結(jié)合蛋白或抗體蛋白質(zhì)組分的背景下使用時，術(shù)語“雙特異性的”、“雙重特異性的”或“雙功能性的”是分別具有兩個不同抗原結(jié)合位點的雜合抗原結(jié)合蛋白或抗體。雙特異性的抗原結(jié)合蛋白和抗體是多特異性抗原結(jié)合蛋白或多特異性抗體的種類，并且可以通過多種方法包括但不限于雜交瘤融合或Fab’片段連接來產(chǎn)生。參見，例如 Songsivilai 和 Lachmann, (1990)Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 ;Kostelny 等，(1992) J.1mmunol.148:1547-1553.雙特異性抗原結(jié)合蛋白或抗體的兩個結(jié)合位點將與兩個不同的表位結(jié)合，所述表位可以存在于相同或不同的蛋白質(zhì)靶標上。
[0078]如本文所使用，術(shù)語“蛋白A”意指與葡萄球菌蛋白A相同或大致類似的任何蛋白質(zhì)，包括蛋白A的商業(yè)上可獲得的形式和/或重組形式。出于本發(fā)明的目的，蛋白A確切地包括工程化的蛋白A來源的介質(zhì),如Mab Select SuRe?介質(zhì)(GE Healthcare),其中單個亞單位(例如，B亞單位)復制兩次或更多次并且以連續(xù)順序連接以形成重組的蛋白A分子，以及其它非天然存在的蛋白A分子。
[0079]如本文所使用，術(shù)語“蛋白G”意指與鏈球菌蛋白G相同或大致類似的任何蛋白質(zhì)，包括蛋白G的商業(yè)上可獲得的形式和/或重組形式。經(jīng)常通過親和色譜法采用蛋白A和蛋白G來純化抗原結(jié)合蛋白(例如，抗體、肽體以及其它包含F(xiàn)e區(qū)的融合蛋白)。參見，例如 Vola 等(1994), Cell B1phys.24-25:27-36 ;Aybay 和 Imir (2000), J.1mmunol.Methods233(l-2):77-81 ;Ford 等(2001)，J.Chromatogr.B754:427-435。在這點上，蛋白A和蛋白G是有用的，因為它們與這些類型的蛋白質(zhì)的Fe區(qū)結(jié)合?？梢允褂妙愃品椒▉砑兓琁gG抗體的Fe區(qū)的重組融合蛋白。在所公開的方法中可以采用蛋白A和蛋白G作為分離基質(zhì)的吸附劑組分。
[0080]如本文所使用，術(shù)語“分離”和“純化”可互換使用，并且意指可能存在于包含感興趣的蛋白質(zhì)的樣品中的異質(zhì)成分的量減少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%或更多，所述異質(zhì)成分是例如生物大分子像蛋白質(zhì)或DNA?？梢酝ㄟ^任何適當?shù)姆椒òǜ咝б合嗌V法(HPLC)、凝膠電泳以及染色法和/或ELISA測定來測定異質(zhì)蛋白質(zhì)的存在。可以通過任何適當?shù)姆椒òz電泳和染色法和/或采用聚合物鏈式反應的測定來測定DNA和其它核酸的存在。
[0081 ] 如本文所使用，術(shù)語“保護劑”和“添加劑”可互換使用，并且意指具有響應于UV-C劑量水平來限制或調(diào)制蛋白質(zhì)修飾程度的能力的化合物。適合用于所公開的方法中的保護劑的非限制性列表包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。術(shù)語“保護劑”涵蓋單一化合物以及化合物的組合，如酪氨酸和色氨酸，所述酪氨酸和色氨酸可以相對于彼此以任何比率存在。如本文所描述，酪氨酸對總體UV吸光度的貢獻最低。
[0082]如本文所使用，術(shù)語“UV光的劑量”意指以UV光的形式遞送至靶標的能量的量。遞送至靶標的UV光的劑量是強度和暴露時間的函數(shù)?！癠V光的劑量”的實例的非限制性列表包括約 lmj/cm2、約 10mJ/cm2、約 25mJ/cm2、約 50mJ/cm2、約 75mJ/cm2、約 100mJ/cm2、約 125mJ/cm2、約 200mJ/cm2、約 250mJ/cm2、約 300mJ/cm2、約 350mJ/cm2、約 400mJ/cm2、約 450mJ/cm2、約500mJ/cm2、約 600mJ/cm2、約 700mJ/cm2、約 800mJ/cm2、約 900mJ/cm2、約 100mJ/cm2 以及大于約 1000mJ/cm2。
[0083]如本文所使用，術(shù)語“UV光”意指波長在至少1nm與至多400nm之間的光譜的區(qū)域。作為實例，術(shù)語“UV光”涵蓋波長在約200nm至約280nm范圍內(nèi)(包括波長為約254nm)的光。在本文所提供的方法中，可以均勻聚焦和過濾的方式遞送UV光；因此，術(shù)語“UV光”涵蓋均勻聚焦和非聚焦的UV以及過濾的UV光和未過濾的UV光。
[0084]如本文所使用，術(shù)語“包含蛋白質(zhì)組分的樣品”意指包含至少水性組分和蛋白質(zhì)組分的液體的等分試樣。在各種實施方案中，水性組分可以包含緩沖液。蛋白質(zhì)組分可以包含包括通過肽鍵連接的兩個或更多個氨基酸的任何物種。蛋白質(zhì)組分可以包含所有、一些或不包含20種天然存在的氨基酸，并且蛋白質(zhì)組分的其余部分可以包含任何非天然存在的氨基酸。因此，本文所提供的方法可以在包含包括一種或多種天然存在的氨基酸或一種或多種非天然存在的氨基酸的蛋白質(zhì)的樣品上進行。在各種實施方案中，包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的蛋白質(zhì)是抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段、Fe結(jié)構(gòu)域；肽；Fc融合蛋白；以及治療性蛋白。
[0085]如本文所使用，術(shù)語“反應性物種”意指可以或可能與另一種組分反應以引起反應中的組分的修飾或氧化的任何溶液組分。“反應性物種”的實例的非限制性列表包括氧離子(例如，O”、氫氧根離子(例如，or)以及過氧化物(例如，H2O2)。
[0086]如本文所使用，術(shù)語“水因子”是通過以下方程計算的值:水目子其中
a=溶液的吸光度并且I是路徑長度(米)。
_7] I1.用于使樣品中的病毒滅活的方法
[0088]病毒滅活是制備用于治療用途的蛋白質(zhì)溶液中的關(guān)鍵步驟。事實上，各種管理機構(gòu)已建立了用于病毒滅活的標準并且眾多賣主已在著手解決這個問題。病毒滅活技術(shù)已在許多方向上開發(fā)，包括過濾器技術(shù)、HTST和UV-C技術(shù)。雖然這些技術(shù)中的每一種都具有它的長處，但是每一種也同樣具有它的缺點。在UV-C的情況下，已觀察到雖然它是使病毒滅活的有效和高效的方法，但是蛋白質(zhì)長時間暴露于UV-C光可能導致蛋白質(zhì)降解和/或氧化。因此，雖然UV-C技術(shù)是使病毒滅活的有效方法，但是使包含蛋白質(zhì)的樣品暴露于高劑量的UV-C光可以對蛋白質(zhì)本身具有不利作用。因此，在本公開的一個方面中提供了一種方法，其中可以采用使包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒滅活所要求的高劑量的υν-c，而同時減少或消除對蛋白質(zhì)本身產(chǎn)生損害的可能。因此，提供了一種使包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒滅活的方法。在一個實施方案中，方法可以如下進行。
[0089]最初，提供了包含蛋白質(zhì)組分的樣品，其中已知或懷疑樣品包含病毒。包含蛋白質(zhì)組分的樣品可以具有任何組成，值得注意的是樣品包含蛋白質(zhì)。例如，樣品可以包含已被收集到池中的來自色譜柱的洗脫液。在此實施方案中，可以從任何類型的色譜操作中收集色譜柱池。色譜柱池的實例包括:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。
[0090]包含蛋白質(zhì)組分的樣品還可以包含色譜柱洗脫液流。例如，當洗脫液流離開色譜柱時可以獲得所述洗脫液流；因此，方法可以在原位并且實時進行。色譜洗脫液流的實例包括:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
[0091]雖然所公開的方法可以應用于包含任何類型的蛋白質(zhì)組分的樣品，但是所公開的方法可以在基于蛋白質(zhì)的治療藥物的背景下特別有益，所述基于蛋白質(zhì)的治療藥物是其中已采用病毒滅活標準的領(lǐng)域。因此，在一個實施例中，包含蛋白質(zhì)組分的樣品是包含基于蛋白質(zhì)的藥物分子的樣品。在具體實施方案中，所公開的方法的樣品的蛋白質(zhì)組分包括抗原結(jié)合蛋白(例如以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、Fiahf )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fc結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)、Fe結(jié)構(gòu)域、肽以及治療性蛋白。這些類型的分子通常被鑒定為治療性分子的形態(tài)。關(guān)于抗體抗原結(jié)合蛋白，如本文所述的術(shù)語“抗體”意味著完全人抗體、人源化抗體或完全非人(例如，鼠科動物)抗體，并且所公開的方法可以應用于所有這些類型的分子。
[0092]在所公開的方法的各種實施方案中，通過所公開的方法處理的樣品可以是其中希望使病毒滅活的包含細胞的樣品。此類樣品的實例包括其中希望使病毒滅活的包含血小板細胞、CHO細胞或細菌細胞(如大腸桿菌(E.coli))的樣品。這種樣品可以包含細胞培養(yǎng)物。在這些實施方案中，方法可以如所描述來進行，其中包含細胞的樣品代替包含蛋白質(zhì)組分的樣品。
[0093]UV-C病毒滅活被最常見地應用于包含蛋白質(zhì)組分的樣品，或應用于包含細胞如血小板的樣品，雖然這不是必要條件，并且在其它實施方案中，還可以采用所公開的方法來使病毒從不包含蛋白質(zhì)組分的樣品中除去。
[0094]一方面，所公開的方法涉及可以無意地引入到包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒的滅活。在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中無意的病毒引入的可能來源包括由制造人員引起的污染的原材料或曝光。所公開的方法的一個優(yōu)點是:可以針對任何類型的病毒采用它們，并且與病毒是否是包膜的或未包膜的無關(guān)。因此，所述方法可以應用于雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒、雙鏈RNA病毒以及單鏈RNA病毒。使用所公開的方法可以被滅活的病毒科(隱含地包括科的所有成員)的實例包括:腺病毒科、非洲豬瘟病毒科、皰疹病毒科、虹彩病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、環(huán)狀病毒科、嗜肝DNA病毒科、細小病毒科、雙RNA病毒科、呼腸孤病毒科、沙粒病毒科、vornaviridae、布尼亞病毒科、D型肝炎病毒科、絲狀病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、彈狀病毒科、動脈炎病毒科、星狀病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、HEV-樣病毒、野田村病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科以及逆轉(zhuǎn)錄病毒科。在可以與治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程特別相關(guān)的具體實施方案中，使用所公開的方法可以被滅活的病毒包括細小病毒MVM、逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV或布尼亞病毒CVV。
[0095]繼續(xù)所述方法，鑒定在其下病毒被滅活的UV光的目標劑量。為了使用UV-C最有效和高效地使病毒滅活，希望鑒定將實現(xiàn)所希望的結(jié)果的UV-C的目標劑量。雖然可以在沒有針對待滅活的病毒類型優(yōu)化UV-C暴露條件(所述UV-C暴露條件總體來說包括“UV-C劑量”)的情況下進行所公開的方法并且在任何常規(guī)的UV-C劑量下進行方法，但是可以通過鑒定特定于待滅活的病毒的目標劑量來提高方法的效率。應該注意，一些病毒可以共有在其下它們將被UV-C光滅活的條件，并且通過選擇適當?shù)谋┞稐l件，可以在所公開的方法的單個操作中使兩種或更多種類型的病毒滅活。已進行了各種研究來鑒定各種含有DNA的病毒和含有RNA的病毒的UV敏感性。參見，例如Lytle & Sagripanti, (2005) JVirol.79:14244-252 以及 Knipe 等，(2007) Field’ sVirology, Lippincott Williams&Wilkins (所述參考文獻以引用的方式并入本文)以及圖11和圖12。
[0096]接著，然后將保護劑添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物。保護劑的一個功能是為了清除可以降解或修飾樣品的組分(例如，樣品中的蛋白質(zhì))的反應性物種，以便減少或消除由于樣品暴露于UV-C光而可能發(fā)生的任何修飾或降解。更具體地說，使溶液暴露于具體操作例如病毒滅活所要求的UV-C光的劑量可以引起反應性物種。在一些情況下，樣品中存在這些反應性物種可以例如經(jīng)由樣品組分(包括蛋白質(zhì))的間接氧化而導致不希望的修飾。在其它情況下，樣品中存在反應性物種還可能有助于樣品組分的間接修飾。如本文所述，蛋白質(zhì)修飾和/或降解的可能性是與在病毒滅活方法中使用UV-C光相關(guān)的挑戰(zhàn)之一。
[0097]可以降解或修飾蛋白質(zhì)的反應性物種的實例包括反應性物種如氧離子(例如，02_)、氫氧根離子(例如，0H_)以及過氧化物(例如，H2O2)。因為這些和其它反應性物種通常在使溶液暴露于有效病毒滅活所常常要求的高劑量的UV-C光期間產(chǎn)生，所以優(yōu)選地在使樣品暴露于UV光之前添加保護劑。
[0098]不是所有的化學物種都可以充當保護劑。事實上，如在本文提出的實施例中所示，進行了詳細研究來鑒定適合的保護劑。適合的保護劑是具有清除存在于樣品中的任何反應性物種(如在UV-C暴露期間產(chǎn)生的那些)的能力的化合物，以使得這些反應性物種對樣品的組分(例如，蛋白質(zhì))的作用相對于不存在保護劑情況下的反應性物種對樣品組分的作用有所減小。在一些情況下，由于暴露于在UV-C操作期間產(chǎn)生的反應性物種而引起的樣品組分的降解或修飾可以使用保護劑來完全消除。
[0099]除了保護劑在中和存在于樣品中的任何反應性物種的不希望的結(jié)果方面的有效性之外，當選擇保護劑時的另一個考慮是與UV-C暴露之后使其從樣品中除去相關(guān)的難度。當所公開的方法應用于包含治療性分子的樣品時，這種考慮就變成非常重要的因素，所述治療性分子如抗原結(jié)合蛋白(例如以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F (ab’ ) 2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fc結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)或治療性蛋白。由于對產(chǎn)品品質(zhì)的監(jiān)管限制，保護劑的所希望的性質(zhì)是在它已表現(xiàn)出其保護性功能之后從樣品中除去其的能力。
[0100]考慮到所希望的保護劑的所有以上性質(zhì)，提供了適合的保護劑的列表并且包括但不限于酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。在各種實施方案中，保護劑包含以各種比例存在的兩種或更多種化合物。例如，保護劑可以包含以任何所要的比例存在的酪氨酸、色氨酸或酪氨酸和色氨酸兩者。可以根據(jù)經(jīng)驗和/或如本文所描述來確定保護劑的組合的精確組成和比例。
[0101]使用本公開作為指導，可以容易地鑒定另外的保護劑。在一種這樣的篩選中，可以將候選保護劑添加至暴露于適合使一種或多種病毒(圖11和圖12，以及本文所提供的參考可以用作建立相關(guān)UV-C劑量的指導)滅活的劑量的UV-C光的包含蛋白質(zhì)的樣品中，并且然后檢測以確定蛋白質(zhì)的降解或修飾的程度。在這點上，可以采用標準色譜技術(shù)和分析技術(shù)。例如，可以采用IEC來評價蛋白質(zhì)的修飾，并且可以使用SEC或質(zhì)譜法來檢測蛋白質(zhì)降解。
[0102]在所公開的方法中采用的保護劑可以任何濃度添加。在一個優(yōu)選的實施方案中，將保護劑添加至將有效減少或消除樣品的組分的修飾或降解的濃度。可以按鑒定保護劑的類似形式確定保護劑的量。那就是說，可以在初始濃度下將選擇的保護劑添加至樣品中，樣品暴露于UV-C光并且使用已建立的方法確定樣品組分(例如，蛋白質(zhì))的降解和/或修飾的程度。如在鑒定保護劑的情況下，適合的技術(shù)包括IEC、SEC和質(zhì)譜法。如果蛋白質(zhì)組分未被保護至所希望的程度，則可以重復評價直到鑒定濃度提供了所希望的保護程度。在一個具體的實施方案中，以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將保護劑添加至樣品中。以另一種方式說，可以200mM蛋白質(zhì)大于ImM保護劑(即，I: 200)的濃度比將保護劑添加至樣品中?？梢圆捎玫钠渌鼭舛缺劝?: 180、1: 170,1: 160,1: 150,1: 140、I: 130,1: 120,1: 110,1: 100,1: 90、1: 80、1:70、1: 60、1: 50、1: 40,1: 30、1: 20 或 1: 10。
[0103]雖然如所描述可以采用所提供的保護劑和保護劑濃度，但是可以使用經(jīng)驗矩陣型方法容易地進行另外的保護劑和保護劑濃度的鑒定。在這樣一種方法的一個實施例中，可以構(gòu)建矩陣，其中一個軸線體現(xiàn)各種候選保護劑并且另一個軸線體現(xiàn)各種濃度水平?？梢匀缢枋?例如，使用SEC、IEC和/或質(zhì)譜法來評價給定的保護劑和濃度的作用)進行實驗以用優(yōu)選的保護劑和針對這些保護劑的優(yōu)選的濃度填充矩陣。這種方法將提供又另外的保護劑和保護劑濃度。
[0104]形成包括包含蛋白質(zhì)組分的樣品和保護劑的穩(wěn)定的混合物，然后使穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光持續(xù)選擇的時間段。這些參數(shù)的組合在本文中總體來說是指UV-C劑量。可以在所公開的方法中采用的源的實例包括Newport Oiel.?泛光UV-C源，例如型號97536。
[0105]UV-C源優(yōu)選地被適配為調(diào)諧至功率電平的范圍。優(yōu)選的功率電平在約ImJ至約100mJ范圍內(nèi)。在具體實施例中，UV-C源能夠遞送約lmj、約10mJ、約25mJ、約50mJ、約 75mJ、約 100mJ、約 125mJ、約 200mJ、約 250mJ、約 300mJ、約 350mJ、約 400mJ、約 500mJ、約600mJ、約700mJ、約800mJ、約900mJ或約1000mJ。針對UV-C源所希望的另一個特征是能夠響應于來自監(jiān)測器的反饋自動地或通過操作者手動地使第一功率電平轉(zhuǎn)換至第二功率電平。
[0106]UV-C源還優(yōu)選地被適配為遞送在波長范圍內(nèi)的UV-C光。優(yōu)選的波長在約200nm至約280nm范圍內(nèi)，這對應于UV光譜的全部C波段。在特別優(yōu)選的實施方案中，波長為約254nm。
[0107]當保護劑或保護劑的組合被添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物時，穩(wěn)定的混合物的吸光度可以與沒有添加保護劑的樣品的吸光度不同。例如，存在于穩(wěn)定的樣品中的一種或多種添加的保護劑或其它化合物(例如，緩沖劑組分、穩(wěn)定劑等等)可以吸收樣品被暴露于其中的一些UV光。這可以導致透射至存在于樣品中的任何病毒的有效UV光減少，并且因此減少病毒滅活。
[0108]為了解釋一種或多種保護劑和/或其它溶液組分的固有吸光度并且確保目標劑量的UV-C光被穩(wěn)定的混合物接受，可以采用反饋回路，其中UV光暴露的性質(zhì)響應于UV混合物吸光度的評價而改變。因此，在評價進入UVC暴露裝置的混合物吸光度之后，裝置內(nèi)的暴露的性質(zhì)(例如，燈功率、停留時間或其它方式)可以瞬時變化以確保從裝置中出來的穩(wěn)定的混合物接受目標劑量?？梢蕴娲赝ㄟ^測量離開裝置的混合物的吸光度來進行或通過測量裝置內(nèi)的混合物來進行這樣一種評價。在一個實施方案中，可以通過在指定的波長如254nm下監(jiān)測樣品的吸光度來進行這樣一種評價。吸光度數(shù)據(jù)可以用來確定所接受的劑量并且可以被定義為所遞送的能量劑量的調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)將可能包含在樣品中的組分(例如，蛋白質(zhì)、保護劑化學品或其它溶液化學品)的紫外光的吸光度考慮在內(nèi)。在一個實施方案中，可以通過在溶液表面處測量光源功率來進行評價?；蛘?，可以在燈表面處測量光源功率。此外,可以測量由燈汲取的電功率來評價光源功率。
[0109]期望的是評價將指出由于穩(wěn)定的樣品中的一種或多種保護劑的吸光度而引起的所接受的劑量的減少。因此，如果所述評價指出目標劑量的UV光尚未遞送至穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制波長、UV光源功率以及UV光暴露時間中的一種或多種。
[0110]在一個實施方案中，針對接受校準的UVc輻射光束的混合良好的容器，可以通過采用下式調(diào)節(jié)劑量:水因子=--，其中a =溶液的吸光度并且I是路徑長度。參見，
例如Bolton，(2003) ASCE, 129(3):209-215。確定了用于給定的病毒滅活操作的水因子，將UV光的目標劑量除以水因子以確定用于處理的暴露時間。在另一個實施方案中，針對接受UVc輻射(例如，薄膜工藝反應器或等效物)的未混合的容器，可以通過采用下式調(diào)節(jié)劑量:劑量?(P/Q)exp(_al) = (PciA)ci) exp (_aQl),其中a =溶液的吸光度,并且I是環(huán)形路徑長度。在此式中，P是燈的功率輸出并且Q是具有吸光度=a的混合物的體積流速；匕和Qtl是具有吸光度=Stl的參照混合物的功率和流速。參見，例如Ye，Z (2007) “UV Disinfect1nBetween Concentric Cylinders^hD dissertat1n,Georgia Institute of Technology。
[0111]應該注意，可以手動或通過任何常規(guī)的自動化裝置如通過采用自動化的或計算機控制的系統(tǒng)來進行所公開的方法的任何步驟或所有步驟。在一些實施方案中，整個方法都可以是自動化的。在其它實施方案中，一個或多個步驟可以是自動化的。例如，對所遞送的齊IJ量和響應于離目標劑量水平的變化的調(diào)制的評價可以形成單個自動化的步驟。在一個實施方案中，穩(wěn)定的樣品被暴露于UV光并且同時監(jiān)測離目標劑量的變化。如果檢測到了離目標的變化，則控制模塊可以調(diào)制暴露時間、曝光波長或UV源的功率以使得實現(xiàn)目標劑量。這可以在反饋回路型布置中實時進行。
[0112]所公開的方法可以在任何規(guī)模下并且作為不連續(xù)的單元操作或作為連續(xù)的連接的工藝進行。在不連續(xù)的單元操作的一個實施方案中，在容器中形成任何體積的穩(wěn)定的樣品。然后使容器暴露于UV光(例如，UV-C光)并且隨后進行病毒滅活的評價?？梢灾貜筒僮髦钡酱嬖谟跇悠分械娜魏尾《颈粶缁?。或者，可以在暴露于UV光的情況下連續(xù)地進行評價。在使病毒滅活之后，可以將樣品轉(zhuǎn)移至單獨的容器用于進一步加工或包裝。
[0113]在連續(xù)的連接的工藝的一個實施方案中，可以由來自先前純化步驟的流出物形成穩(wěn)定的樣品，其中流出物流離開現(xiàn)有柱時，保護劑被添加至所述流出物流中?？梢詰{借與保護劑引入到流出物流中相關(guān)的任何剪切力使保護劑與流出物流混合。然后穩(wěn)定的樣品可以穿過被配置用于使UV光連續(xù)暴露于穿過其的樣品的裝置。一旦實現(xiàn)了目標劑量的UV光，則可以使流傳遞至第二純化操作，如除去存在于穩(wěn)定的樣品中的不希望的一種或多種保護劑或其它化合物的純化步驟。
[0114]另一方面，所公開的方法可以在任何規(guī)模上進行，從實驗臺規(guī)模至商業(yè)規(guī)模。當在商業(yè)規(guī)模上進行所述方法時，可以適宜地使穩(wěn)定的樣品分成多個等分試樣并且并行處理每個等分試樣。例如，可以并行運行多個UV-C源以適應大量的穩(wěn)定的樣品。圖13示出這樣一種配置的示意性實施例。
[0115]II1.減少由UV暴露期間產(chǎn)生的反應性物種的存在引起的蛋白質(zhì)降解或修飾的方法
[0116]如本文所描述并且在圖1至圖8中所示，包含蛋白質(zhì)組分的樣品當暴露于UV光(特別是UV-C波段中的光)時可以經(jīng)歷降解或修飾。然而，UV-C波段是用于多種目的例如使病毒滅活的最有效的光譜區(qū)域，并且在制造應用中具有特別用途。所觀察到的蛋白質(zhì)降解和/或修飾可以由反應性物種的存在而引起，所述反應性物種是通過用UV光或電離輻射對樣品的溶劑組分進行照射而產(chǎn)生的。反應性物種的實例包括氧離子(例如，O2—)、氫氧根離子(例如，OHO以及過氧化物物種(例如，H2O2)。反應性物種的存在可以對蛋白質(zhì)具有有害的作用。參見，例如 Cabiscol 等，(2010) Int.Microb1l, 3:315 以及 Bandyopadhyay 等(1999)Curr.Sc1.77:658_666。
[0117]在蛋白質(zhì)生產(chǎn)操作中，UV光的使用可以被用來使病毒滅活，但還可以促進蛋白質(zhì)降解和/或修飾。因此，一方面，本公開提供了一種減少由UV暴露期間產(chǎn)生的反應性物種的存在而引起的蛋白質(zhì)降解或修飾的方法。在一個實施方案中，所公開的方法可以如下進行。
[0118]最初，提供了包含蛋白質(zhì)組分的樣品，已知或懷疑所述蛋白質(zhì)組分在存在反應性物種的情況下降解或修飾。包含蛋白質(zhì)組分的樣品可以具有任何組成，值得注意的是樣品包含蛋白質(zhì)。例如，樣品可以包含已被收集到池中的來自色譜柱的洗脫液。在此實施方案中，可以從任何類型的色譜操作中收集色譜柱池。色譜柱池的實例包括:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。
[0119]包含蛋白質(zhì)組分的樣品還可以包含色譜柱洗脫液流。例如，當洗脫液流離開色譜柱時可以獲得所述洗脫液流；因此，所述方法可以在原位并且實時進行。色譜洗脫液流的實例包括:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
[0120]雖然所公開的方法可以應用于包含任何類型的蛋白質(zhì)組分的樣品，但是所公開的方法可以在基于蛋白質(zhì)的治療藥物的背景下特別有益，所述基于蛋白質(zhì)的治療藥物是其中蛋白質(zhì)降解和/或修飾可以具有重要關(guān)注的領(lǐng)域。因此，在一個實施例中，包含蛋白質(zhì)組分的樣品是包含基于蛋白質(zhì)的藥物分子的樣品。在具體實施方案中，所公開的方法的樣品的蛋白質(zhì)組分包括抗原結(jié)合蛋白(例如以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F (ab’ ) 2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fc結(jié)構(gòu)域；(iii)肽;(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)、Fc結(jié)構(gòu)域、肽以及治療性蛋白。這些類型的分子通常被鑒定為治療性分子的形態(tài)。關(guān)于抗體，如本文所述的術(shù)語“抗體”意味著完全人抗體、人源化抗體或完全非人(例如，鼠科動物)抗體，并且所公開的方法可以應用于所有這些類型的分子。
[0121]在所公開的方法的各種實施方案中，通過所公開的方法處理的樣品可以是其中希望使病毒滅活的包含細胞的樣品。此類樣品的實例包括其中希望使病毒滅活的包含血小板細胞、CHO細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)的樣品。這種樣品可以包含細胞培養(yǎng)物。在這些實施方案中，所述方法可以如所描述來進行，其中包含細胞的樣品代替包含蛋白質(zhì)組分的樣品。
[0122]繼續(xù)所述方法，鑒定了 UV光的目標劑量。可以出于任何原因選擇目標劑量，但是在一個優(yōu)選的實施方案中，在其下所關(guān)注的病毒被滅活的劑量被選擇為目標劑量。使用選擇對應于已知或懷疑使所關(guān)注的具體病毒滅活的UV劑量的目標劑量作為一個實施例，為了使用UV-C最有效和高效地使病毒滅活，希望鑒定將實現(xiàn)所要結(jié)果的UV-C的目標劑量。雖然可以在沒有針對待滅活的病毒的類型優(yōu)化UV-C暴露條件(所述UV-C暴露條件總體來說包括“ν-c劑量”)的情況下進行所公開的方法并且在任何常規(guī)的UV-C劑量下進行所述方法，但是可以通過鑒定特定于待滅活的病毒的目標劑量來提高方法的效率。應該注意的是，病毒可以共有在其下它們將被UV-C光滅活的條件，并且通過選擇適當?shù)谋┞稐l件，可以在所公開的方法的單個操作中使兩種或更多種類型的病毒滅活。已進行了各種研究來鑒定各種含有DNA的病毒和含有RNA的病毒的UV敏感性。參見，例如Lytle &Sagripanti (2005)J Virol79: 14244-252 以及 Knipe 等(2007)Field，sVirology, Lippincott Williams &Wilkins(所述參考文獻以引用的方式并入本文)以及圖11和圖12。
[0123]繼續(xù)所述方法，然后將保護劑添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物。保護劑的一個功能是為了清除可以降解或修飾樣品的組分(例如，樣品中的蛋白質(zhì))的反應性物種，以便減少或消除由于樣品暴露于UV-C光而可能發(fā)生的任何修飾或降解。更具體地說，使溶液暴露于所要求的υν-c光的劑量可以引起如本文所述的反應性物種。事實上，這是與在病毒滅活方法中使用UV-C光相關(guān)的挑戰(zhàn)之一。樣品中存在這些反應性物種可以導致樣品組分(包括蛋白質(zhì))的間接氧化。此外，反應性物種的存在還可以促成樣品組分的間接修飾。
[0124]可以降解或修飾蛋白質(zhì)的反應性物種的實例包括反應性物種如氧離子(例如，02_)、氫氧根離子(例如，0H_)以及過氧化物(例如，H2O2)。因為這些和其它反應性物種通常在使溶液暴露于有效病毒滅活所常常要求的高劑量的UV-C光期間產(chǎn)生，所以優(yōu)選地在使樣品暴露于UV光之前添加保護劑。
[0125]不是所有的化學物種都可以充當保護劑。事實上，如在本文提出的實施例中所示，進行了詳細研究來鑒定適合的保護劑。適合的保護劑是具有清除存在于樣品中的任何反應性物種(如在UV-C暴露期間產(chǎn)生的那些)的能力的化合物，以使得這些反應性物種對樣品的組分(例如，蛋白質(zhì))的作用相對于不存在保護劑情況下的反應性物種對樣品組分的作用有所減小。在一些情況下，由于暴露于在UV-C操作期間產(chǎn)生的反應性物種而引起的樣品組分的降解或修飾可以使用保護劑來完全消除。
[0126]除了保護劑在中和存在于樣品中的任何反應性物種的不希望的結(jié)果方面的有效性之外，當選擇保護劑時的另一個考慮是與UV-C暴露之后使其從樣品中除去相關(guān)的難度。當所公開的方法應用于包含治療性分子的樣品時，這種考慮變成非常重要的因素，所述治療性分子如抗原結(jié)合蛋白(例如以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fc結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)或治療性蛋白。由于對產(chǎn)品品質(zhì)的監(jiān)管限制，保護劑的所希望的性質(zhì)是在它已表現(xiàn)出其保護性功能之后從樣品中除去其的能力。
[0127]考慮到所希望的保護劑的所有以上性質(zhì)，提供了適合的保護劑的列表并且包括但不限于酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。在各種實施方案中，保護劑包含以各種比例存在的兩種或更多種化合物。例如，保護劑可以包含以任何所要的比例存在的酪氨酸、色氨酸或酪氨酸和色氨酸兩者。可以根據(jù)經(jīng)驗和/或如本文所描述來確定保護劑的組合的精確組成和比例。
[0128]使用本公開作為指導，可以容易地鑒定另外的保護劑。在一種這樣的篩選中，可以將候選保護劑添加至暴露于適合使一種或多種病毒(圖11和圖12，以及本文所提供的參考可以用作建立相關(guān)UV-C劑量的指導)滅活的劑量的UV-C光的包含蛋白質(zhì)的樣品中，并且然后檢測以確定蛋白質(zhì)的降解或修飾的程度。在這點上，可以采用標準色譜技術(shù)和分析技術(shù)。例如，可以采用IEC來評價蛋白質(zhì)的修飾，并且可以使用SEC或質(zhì)譜法來檢測蛋白質(zhì)降解。
[0129]在所公開的方法中采用的保護劑可以任何濃度添加。在一個優(yōu)選的實施方案中，將保護劑添加至將有效減少或消除樣品的組分的修飾或降解的濃度?？梢园磋b定保護劑的類似形式確定保護劑的量。那就是說，可以在初始濃度下將選擇的保護劑添加至樣品中，樣品暴露于UV-C光并且使用已建立的方法確定樣品組分(例如，蛋白質(zhì))的降解和/或修飾的程度。如在鑒定保護劑的情況下，適合的技術(shù)包括IEC、SEC和質(zhì)譜法。如果蛋白質(zhì)組分未被保護至所希望的程度，則可以重復評價直到鑒定濃度提供了所希望的保護程度。在一個具體的實施方案中，以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將保護劑添加至樣品中。以另一種方式說，可以200mM蛋白質(zhì)大于ImM保護劑(即，I: 200)的濃度比將保護劑添加至樣品中?？梢圆捎玫钠渌鼭舛缺劝?: 180、1: 170,1: 160,1: 150,1: 140、I: 130,1: 120,1: 110,1: 100,1: 90、1: 80、1: 70、1: 60、1: 50、1: 40,1: 30、1: 20 或 1: 10。
[0130]雖然如所描述可以采用所提供的保護劑和保護劑濃度，但是可以使用經(jīng)驗矩陣型方法容易地進行另外的保護劑和保護劑濃度的鑒定。在這樣一種方法的一個實施例中，可以構(gòu)建矩陣，其中一個軸線體現(xiàn)各種候選保護劑并且另一個軸線體現(xiàn)各種濃度水平。可以如所描述(例如，使用SEC、IEC和/或質(zhì)譜法來評價給定的保護劑和濃度的作用)進行實驗以用優(yōu)選的保護劑和針對這些保護劑的優(yōu)選的濃度填充矩陣。這種方法將提供又另外的保護劑和保護劑濃度。
[0131]形成包括包含蛋白質(zhì)組分的樣品和保護劑的穩(wěn)定的混合物，然后使穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光持續(xù)選擇的時間段。這些參數(shù)的組合在本文中總體來說是指UV-C劑量?？梢栽谒_的方法中采用的源的實例包括Newport Oriel?泛光UV-C源,例如型號97536。
[0132]UV-C源優(yōu)選地被適配為調(diào)諧至功率電平的范圍。優(yōu)選的功率電平在約ImJ至約100mJ范圍內(nèi)。在具體實施例中，UV-C源能夠遞送約lmj、約10mJ、約25mJ、約50mJ、約 75mJ、約 100mJ、約 125mJ、約 200mJ、約 250mJ、約 300mJ、約 350mJ、約 400mJ、約 450mJ、約500mJ、約 600mJ、約 700mJ、約 800mJ、約 900mJ、約 100mJ 或多于 1000mJ。針對 UV-C 源所希望的另一個特征是能夠響應于來自監(jiān)測器的反饋自動地或通過操作者手動地使第一功率電平轉(zhuǎn)換至第二功率電平。
[0133]UV-C源還優(yōu)選地被適配為遞送在波長范圍內(nèi)的UV-C光。優(yōu)選的波長在約200nm至約280nm范圍內(nèi)，這對應于UV光譜的全部C波段。在特別優(yōu)選的實施方案中，波長為約254nm。
[0134]當保護劑或保護劑的組合被添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物時，穩(wěn)定的混合物的吸光度可以與沒有添加保護劑的樣品的吸光度不同。例如，存在于穩(wěn)定的樣品中的一種或多種添加的保護劑或其它化合物(例如，緩沖劑組分、穩(wěn)定劑等等)可以吸收樣品被暴露于其中的一些UV光。這可以導致透射至存在于樣品中的任何病毒的有效UV光減少，并且因此減少病毒滅活。
[0135]為了解釋一種或多種保護劑和/或其它溶液組分的固有吸光度并且確保目標劑量的UV-C光被穩(wěn)定的混合物接受，可以采用反饋回路，其中UV光暴露的性質(zhì)響應于UV混合物吸光度的評價而改變。因此，在評價進入UVC暴露裝置的混合物吸光度之后，裝置內(nèi)的暴露的性質(zhì)(例如，燈功率、停留時間或其它方式)可以瞬時變化以確保從裝置中出來的穩(wěn)定的混合物接受目標劑量?？梢蕴娲赝ㄟ^測量離開裝置的混合物的吸光度來進行或通過測量裝置內(nèi)的混合物來進行這樣一種評價。在一個實施方案中，可以通過在指定的波長如254nm下監(jiān)測樣品的吸光度來進行這樣一種評價。吸光度數(shù)據(jù)可以用來確定所接受的劑量并且可以被定義為遞送的能量劑量的調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)將可能包含在樣品中的組分(例如，蛋白質(zhì)、保護劑化學品或其它溶液化學品)的紫外光的吸光度考慮在內(nèi)。在一個實施方案中，可以通過在溶液表面處測量光源功率來進行評價?；蛘撸梢栽跓舯砻嫣帨y量光源功率。此外,可以測量由燈汲取的電功率來評價光源功率。
[0136]期望的是評價將指出由于穩(wěn)定的樣品中的一種或多種保護劑的吸光度而引起的所接受的劑量的減少。因此，如果所述評價指出目標劑量的UV光尚未遞送至穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制波長、UV光源功率以及UV光暴露時間中的一種或多種。
[0137]在一個實施方案中，為了混合良好的容器接受校準的UVc輻射光束，可以通過采用下式調(diào)節(jié)劑量:水因子其中a =溶液的吸光度并且I是路徑長度。參見，例如Bolton，(2003)ASCE, 129(3):209_215。確定了用于給定的病毒滅活操作的水因子，將UV光的目標劑量除以水因子以確定用于處理的暴露時間。在另一個實施方案中，針對接受UVc輻射(例如，薄膜工藝反應器或等效物)的未混合的容器，可以通過采用下式調(diào)節(jié)劑量:劑量?(P/Q)exp(_al) = (PcZQci) exp (_aQl),其中a =溶液的吸光度，并且I是環(huán)形路徑長度。在此式中，P是燈的功率輸出并且Q是具有吸光度=a的混合物的體積流速Λ和Qtl是具有吸光度=a0的參照混合物的功率和流速。參見，例如Ye，Z (2007) “UVDisinfect1n Between Concentric Cylinders,，，PhD dissertat1n,Georgia Instituteof Technology。
[0138]應該注意，可以手動或通過任何常規(guī)的自動化裝置如通過采用自動化的或計算機控制的系統(tǒng)來進行所公開的方法的任何步驟或所有步驟。在一些實施方案中，整個方法都可以是自動化的。在其它實施方案中，一個或多個步驟可以是自動化的。例如，對所遞送的劑量和響應于目標劑量水平的變化的調(diào)制的評價可以形成單個自動化的步驟。在一個實施方案中，穩(wěn)定的樣品被暴露于UV光并且同時監(jiān)測離目標劑量的變化。如果檢測到了離目標的變化，則控制模塊可以調(diào)制暴露時間、曝光波長或UV源的功率以使得實現(xiàn)目標劑量。這可以在反饋回路型布置中實時進行。
[0139]所公開的方法可以在任何規(guī)模下并且作為不連續(xù)的單元操作或作為連續(xù)的連接的工藝進行。在不連續(xù)的單元操作的一個實施方案中，在容器中形成任何體積的穩(wěn)定的樣品。然后使容器暴露于UV光(例如，UV-C光)并且隨后進行病毒滅活的評價?？梢灾貜筒僮髦钡酱嬖谟跇悠分械娜魏尾《颈粶缁??；蛘?，可以在暴露于UV光的情況下連續(xù)地進行評價。在使病毒滅活之后，可以將樣品轉(zhuǎn)移至單獨的容器用于進一步加工或包裝。
[0140]在連續(xù)的連接的工藝的一個實施方案中，可以由來自先前純化步驟的流出物形成穩(wěn)定的樣品，其中流出物流離開現(xiàn)有柱時，保護劑被添加至所述流出物流中?？梢詰{借與保護劑引入到流出物流中相關(guān)的任何剪切力使保護劑與流出物流混合。然后穩(wěn)定的樣品可以穿過被配置用于使UV光連續(xù)暴露于穿過其的樣品的裝置。一旦實現(xiàn)了目標劑量的UV光，則可以使流傳遞至第二純化操作，如除去存在于穩(wěn)定的樣品中的不希望的一種或多種保護劑或其它化合物的純化步驟。
[0141]另一方面，所公開的方法可以在任何規(guī)模上進行，從實驗臺規(guī)模至商業(yè)規(guī)模。當在商業(yè)規(guī)模上進行所述方法時，可以適宜地使穩(wěn)定的樣品分成多個等分試樣并且并行處理每個等分試樣。例如，可以并行運行多個UV-C源以適應大量的穩(wěn)定的樣品。圖13示出這樣一種配置的示意性實施例。
[0142]IV.減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法
[0143]在本公開的另一個方面中，提供了一種減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法。如本文所描述和在相關(guān)文獻中，甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基易受到氧化并且可以導致蛋白質(zhì)失活。參見，例如Schoneich, (2005)B1chim B1physActal703:111-19 ；Stadtman 等，(2003)Ant1xid.Redox.Signal5:577-82 ；Stadtman, (1993) Ann.Rev.B1chem.62:797-821 ；以及 Dean 等，(1997) B1chem.J.324:1-180貫穿本公開所述，UV光在各種應用例如病毒滅活(所述病毒滅活是UV光最常見的工業(yè)應用)中有效，但可以導致蛋白質(zhì)的不希望的修飾和降解。在一些情況下，修飾和/或降解蛋白質(zhì)可以是直接或間接地由于在UV暴露期間產(chǎn)生的反應性物種的存在而引起。在分子水平上，這些反應性物種可以攻擊蛋白質(zhì)中的側(cè)鏈殘基，特別是甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基的側(cè)鏈。在基于蛋白質(zhì)的治療藥物的背景下，這些修飾可以最終導致高分子量物種(例如，聚集體和多聚體)和低分子量物種(例如，片段化的蛋白質(zhì))的形成。在治療藥物中存在這些物種可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉盟鲋委熕幬锏幕颊叩膰乐貑栴}。
[0144]鑒于這些潛在的問題，希望消除蛋白質(zhì)(具體是基于蛋白質(zhì)的治療藥物)的修飾和/或降解的可能性。因此，提供了一種減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法。在一個實施方案中，所公開的方法可以如下進行。
[0145]最初，提供了包含蛋白質(zhì)組分的樣品，所述蛋白質(zhì)組分包括甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者。包含蛋白質(zhì)組分的樣品可以具有任何組成，值得注意的是樣品包含蛋白質(zhì)并且蛋白質(zhì)包括甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者。例如，樣品可以包含已被收集到池中的來自色譜柱的洗脫液。在此實施方案中，可以從任何類型的色譜操作中收集色譜柱池。色譜柱池的實例包括:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。
[0146]包含蛋白質(zhì)組分的樣品還可以包含色譜柱洗脫液流。例如，當洗脫液流離開色譜柱時可以獲得所述洗脫液流；因此，方法可以在原位并且實時進行。色譜洗脫液流的實例包括:包含蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
[0147]雖然所公開的方法可以應用于包含任何類型的蛋白質(zhì)組分的樣品，但是所公開的方法可以在基于蛋白質(zhì)的治療藥物的背景下特別有益，所述基于蛋白質(zhì)的治療藥物是其中經(jīng)由甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的蛋白質(zhì)修飾和/或降解可以致使基于蛋白質(zhì)的治療藥物失活或?qū)颊哂泻Φ念I(lǐng)域。因此，在一個實施例中，包含蛋白質(zhì)組分的樣品是包含基于蛋白質(zhì)的藥物分子的樣品。在具體實施方案中，所公開的方法的樣品的蛋白質(zhì)組分包括抗原結(jié)合蛋白(例如以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ ) 2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fe結(jié)構(gòu)域；
(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)、Fe結(jié)構(gòu)域、肽以及治療性蛋白。這些類型的分子通常被鑒定為治療性分子的形態(tài)。關(guān)于抗體，如本文所述的術(shù)語“抗體”意味著完全人抗體、人源化抗體或完全非人(例如，鼠科動物)抗體，并且所公開的方法可以應用于所有這些類型的分子。
[0148]在所公開的方法的各種實施方案中，通過所公開的方法處理的樣品可以是其中希望使病毒滅活的包含細胞的樣品。此類樣品的實例包括包含血小板細胞、CHO細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)的樣品。這種樣品可以包含細胞培養(yǎng)物。在這些實施方案中，所述方法可以如所描述來進行，其中包含細胞的樣品代替包含蛋白質(zhì)組分的樣品。
[0149]代表所公開的方法的一個應用的UV-C病毒滅活被最常見地應用于包含蛋白質(zhì)組分的樣品，或應用于包含細胞如血小板的樣品，雖然這不是必要條件，并且在其它實施方案中，還可以采用所公開的方法來使病毒從不包含蛋白質(zhì)組分的樣品中除去。
[0150]繼續(xù)所述方法，鑒定了 UV光的目標劑量?？梢猿鲇谌魏卧蜻x擇目標劑量，但是在一個優(yōu)選的實施方案中，在其下關(guān)注的病毒被滅活的劑量被選擇為目標劑量。使用選擇對應于已知或懷疑使所關(guān)注的具體病毒滅活的UV劑量的目標劑量作為一個實施例，為了使用UV-C最有效和高效地使病毒滅活，希望鑒定將實現(xiàn)所要結(jié)果的UV-C的目標劑量。雖然可以在沒有針對待滅活的病毒的類型優(yōu)化UV-C暴露條件(所述UV-C暴露條件總體來說包括“υν-c劑量”)的情況下進行所公開的方法并且在任何常規(guī)的UV-C劑量下進行所述方法，但是可以通過鑒定特定于待滅活的病毒的目標劑量來提高方法的效率。應該注意的是，病毒可以共有在其下它們將被UV-C光滅活的條件，并且通過選擇適當?shù)谋┞稐l件，可以在所公開的方法的單個操作中使兩種或更多種類型的病毒滅活。已進行了各種研究來鑒定各種含有DNA的病毒和含有RNA的病毒的UV敏感性。參見，例如Lytle &Sagripanti，(2005)J Virol.79:14244-252 以及 Knipe 等，(2007)Field，sVirology, Lippincott Williams &Wilkins(所述參考文獻以引用的方式并入本文)以及圖11和圖12。
[0151]繼續(xù)所述方法，然后將保護劑添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物。保護劑的一個功能是為了清除可以降解或修飾樣品的組分(例如，樣品中的蛋白質(zhì))的反應性物種，以便減少或消除由于樣品暴露于UV-C光而可能發(fā)生的任何修飾或降解。更具體地說，使溶液暴露于所要求的υν-c光的劑量可以引起如本文所述的反應性物種。事實上，這是與在病毒滅活方法中使用UV-C光相關(guān)的挑戰(zhàn)之一。樣品中存在這些反應性物種可以導致樣品組分(包括蛋白質(zhì))的間接氧化。此外，反應性物種的存在還可以促成樣品組分的間接修飾。
[0152]可以降解或修飾蛋白質(zhì)的反應性物種的實例包括反應性物種如氧離子(例如，02_)、氫氧根離子(例如，0H_)以及過氧化物(例如，H2O2)。因為這些和其它反應性物種通常在使溶液暴露于有效病毒滅活所常常要求的高劑量的UV-C光期間產(chǎn)生，所以優(yōu)選地在使樣品暴露于UV光之前添加保護劑。
[0153]不是所有的化學物種都可以充當保護劑。事實上，如在本文提出的實施例中所示，進行了詳細研究來鑒定適合的保護劑。適合的保護劑是具有清除存在于樣品中的任何反應性物種(如在UV-C暴露期間產(chǎn)生的那些)的能力的化合物，以使得這些反應性物種對樣品的組分(例如，蛋白質(zhì))的作用相對于不存在保護劑情況下的反應性物種對樣品組分的作用有所減小。在一些情況下，由于暴露于在UV-C操作期間產(chǎn)生的反應性物種而引起的樣品組分的降解或修飾可以使用保護劑來完全消除。
[0154]除了保護劑在中和存在于樣品中的任何反應性物種的不希望的結(jié)果方面的有效性之外，當選擇保護劑時的另一個考慮是與UV-C暴露之后使其從樣品中除去相關(guān)的難度。當所公開的方法應用于包含治療性分子的樣品時，這種考慮變成非常重要的因素，所述治療性分子如抗原結(jié)合蛋白(例如以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii)Fc結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治療性蛋白)或治療性蛋白。由于對產(chǎn)品品質(zhì)的監(jiān)管限制，保護劑的所希望的性質(zhì)是在它已表現(xiàn)出其保護性功能之后從樣品中除去其的能力。
[0155]考慮所希望的保護劑的所有以上性質(zhì)，提供了適合的保護劑的列表并且包括但不限于酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。在各種實施方案中，保護劑包含以各種比例存在的兩種或更多種化合物。例如，保護劑可以包含以任何所要的比例存在的酪氨酸、色氨酸或酪氨酸和色氨酸兩者。可以根據(jù)經(jīng)驗和/或如本文所描述來確定保護劑的組合的精確組成和比例。
[0156]使用本公開作為指導，可以容易地鑒定另外的保護劑。在一種這樣的篩選中，可以將候選保護劑添加至暴露于適合使一種或多種病毒(圖11和圖12，以及本文所提供的參考可以用作建立相關(guān)UV-C劑量的指導)滅活的劑量的UV-C光的包含蛋白質(zhì)的樣品中，并且然后檢測以確定蛋白質(zhì)的降解或修飾的程度。在這點上，可以采用標準色譜技術(shù)和分析技術(shù)。例如，可以采用IEC來評價蛋白質(zhì)的修飾，并且可以使用SEC或質(zhì)譜法來檢測蛋白質(zhì)降解。
[0157]在所公開的方法中采用的保護劑可以任何濃度添加。在一個優(yōu)選的實施方案中，將保護劑添加至將有效減少或消除樣品的組分的修飾或降解的濃度。可以按鑒定保護劑的類似形式確定保護劑的量。那就是說，可以在初始濃度下將選擇的保護劑添加至樣品中，樣品暴露于UV-C光并且使用已建立的方法確定樣品組分(例如，蛋白質(zhì))的降解和/或修飾的程度。如在鑒定保護劑的情況下，適合的技術(shù)包括IEC、SEC和質(zhì)譜法。如果蛋白質(zhì)組分未被保護至所希望的程度，則可以重復評價直到鑒定濃度提供了所希望的保護程度。在一個具體的實施方案中，以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將保護劑添加至樣品中。以另一種方式說，可以200mM蛋白質(zhì)大于ImM保護劑(即，I: 200)的濃度比將保護劑添加至樣品中?？梢圆捎玫钠渌鼭舛缺劝?: 180、1: 170,1: 160、1:150、1: 140、I: 130,1: 120,1: 110,1: 100,1: 90、1:80、1: 70、1: 60、1:50、1: 40,1: 30、1: 20 或 1: 10。
[0158]雖然如所描述可以采用所提供的保護劑和保護劑濃度，但是可以使用經(jīng)驗矩陣型方法容易地進行另外的保護劑和保護劑濃度的鑒定。在這樣一種方法的一個實施例中，可以構(gòu)建矩陣，其中一個軸線體現(xiàn)各種候選保護劑并且另一個軸線體現(xiàn)各種濃度水平?？梢匀缢枋?例如，使用SEC、IEC和/或質(zhì)譜法來評價給定的保護劑和濃度的作用)進行實驗以用優(yōu)選的保護劑和針對這些保護劑的優(yōu)選的濃度填充矩陣。這種方法將提供又另外的保護劑和保護劑濃度。
[0159]形成包括包含蛋白質(zhì)組分的樣品和保護劑的穩(wěn)定的混合物，然后使穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光持續(xù)選擇的時間段。這些參數(shù)的組合在本文中總體來說是指UV-C劑量?？梢栽谒_的方法中采用的源的實例包括Newport Oriel.?泛光UV-C源，例如型號97536。
[0160]UV-C源優(yōu)選地被適配為調(diào)諧至功率電平的范圍。優(yōu)選的功率電平在約ImJ至約100mJ范圍內(nèi)。在具體實施例中，UV-C源能夠遞送約lmj、約10mJ、約25mJ、約50mJ、約 75mJ、約 100mJ、約 125mJ、約 200mJ、約 250mJ、約 300mJ、約 350mJ、約 400mJ、約 450mJ、約500mJ、約 600mJ、約 700mJ、約 800mJ、約 900mJ、約 100mJ 或多于 1000mJ。針對 UV-C 源所希望的另一個特征是能夠響應于來自監(jiān)測器的反饋自動地或通過操作者手動地使第一功率電平轉(zhuǎn)換至第二功率電平。
[0161]UV-C源還優(yōu)選地被適配為遞送在波長范圍內(nèi)的UV-C光。優(yōu)選的波長在約200nm至約280mn范圍內(nèi)，這對應于UV光譜的全部C波段。在特別優(yōu)選的實施方案中，波長為約254nm。
[0162]當保護劑或保護劑的組合被添加至樣品中以形成穩(wěn)定的混合物時，穩(wěn)定的混合物的吸光度可以與沒有添加保護劑的樣品的吸光度不同。例如，存在于穩(wěn)定的樣品中的一種或多種添加的保護劑或其它化合物(例如，緩沖劑組分、穩(wěn)定劑等等)可以吸收樣品被暴露于其中的一些UV光。這可以導致透射至存在于樣品中的任何病毒的有效UV光減少，并且因此減少病毒滅活降低。
[0163]為了解釋一種或多種保護劑和/或其它溶液組分的固有吸光度并且確保目標劑量的UV-C光被穩(wěn)定的混合物接受，可以采用反饋回路，其中UV光暴露的性質(zhì)響應于UV混合物吸光度的評價而改變。因此，在評價進入UVC暴露裝置的混合物吸光度之后，裝置內(nèi)的暴露的性質(zhì)(例如，燈功率、停留時間或其它方式)可以瞬時變化以確保從裝置中出來的穩(wěn)定的混合物接受目標劑量。可以替代地通過測量離開裝置的混合物的吸光度來進行或通過測量裝置內(nèi)的混合物來進行這樣一種評價。在一個實施方案中，可以通過在指定的波長如254nm下監(jiān)測樣品的吸光度來進行這樣一種評價。吸光度數(shù)據(jù)可以用來確定所接受的劑量并且可以被定義為遞送的能量劑量的調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)將可能包含在樣品中的組分(例如，蛋白質(zhì)、保護劑化學品或其它溶液化學品)的紫外光的吸光度考慮在內(nèi)。在一個實施方案中，可以通過在溶液表面處測量光源功率來進行評價?；蛘?，可以在燈表面處測量光源功率。此外,可以測量由燈汲取的電功率來評價光源功率。
[0164]期望的是評價將指出由于穩(wěn)定的樣品中的一種或多種保護劑的吸光度而引起的所接受的劑量的減少。因此，如果所述評價指出目標劑量的UV光尚未遞送至穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制波長、UV光源功率以及UV光暴露時間中的一種或多種。
[0165]在一個實施方案中，為了混合良好的容器接受校準的UVc輻射光束，可以通過采用下式調(diào)節(jié)劑量:水因子=與^，其中a =溶液的吸光度并且I是路徑長度。參見，例如
Bolton (2003) ASCE129 (3):209_215。確定了用于給定的病毒滅活操作的水因子，將UV光的目標劑量除以水因子以確定用于處理的暴露時間。在另一個實施方案中，針對接受UVc輻射(例如，薄膜工藝反應器或等效物)的未混合的容器，可以通過采用下式調(diào)節(jié)劑量:劑量?(P/Q)exp(_al) = (PcZQci) exp (_aQl),其中a =溶液的吸光度，并且I是環(huán)形路徑長度。在此式中，P是燈的功率輸出并且Q是具有吸光度=a的混合物的體積流速；匕和Qtl是具有吸光度=aQ的參照混合物的功率和流速。Ye，Z(2007) “UV Disinfect1n BetweenConcentric Cylinders,，，PhD dissertat1n, Georgia Institute of Technology。
[0166]應該注意，可以手動或通過任何常規(guī)的自動化裝置如通過采用自動化的或計算機控制的系統(tǒng)來進行所公開的方法的任何步驟或所有步驟。在一些實施方案中，整個方法都可以是自動化的。在其它實施方案中，一個或多個步驟可以是自動化的。例如，對所遞送的劑量和響應于目標劑量水平的變化的調(diào)制的評價可以形成單個自動化的步驟。在一個實施方案中，穩(wěn)定的樣品被暴露于UV光并且同時監(jiān)測離目標劑量的變化。如果檢測到了離目標的變化，則控制模塊可以調(diào)制暴露時間、曝光波長或UV源的功率以使得實現(xiàn)目標劑量。這可以在反饋回路型布置中實時進行。
[0167]所公開的方法可以在任何規(guī)模下并且作為不連續(xù)的單元操作或作為連續(xù)的連接的工藝進行。在不連續(xù)的單元操作的一個實施方案中，在容器中形成任何體積的穩(wěn)定的樣品。然后使容器暴露于UV光(例如，UV-C光)并且隨后進行病毒滅活的評價。可以重復操作直到存在于樣品中的任何病毒被滅活。或者，可以在暴露于UV光的情況下連續(xù)地進行評價。在使病毒滅活之后，可以將樣品轉(zhuǎn)移至單獨的容器用于進一步加工或包裝。
[0168]在連續(xù)的連接的工藝的一個實施方案中，可以由來自先前純化步驟的流出物形成穩(wěn)定的樣品，其中流出物流離開現(xiàn)有柱時，保護劑被添加至所述流出物流中。可以憑借與保護劑引入到流出物流中相關(guān)的任何剪切力使保護劑與流出物流混合。然后穩(wěn)定的樣品可以穿過被配置用于使UV光連續(xù)暴露于穿過其的樣品的裝置。一旦實現(xiàn)了目標劑量的UV光，則可以使流傳遞至第二純化操作，如除去存在于穩(wěn)定的樣品中的不希望的一種或多種保護劑或其它化合物的純化步驟。
[0169]另一方面，所公開的方法可以在任何規(guī)模上進行，從實驗臺規(guī)模至商業(yè)規(guī)模。當在商業(yè)規(guī)模上進行所述方法時，可以適宜地使穩(wěn)定的樣品分成多個等分試樣并且并行處理每個等分試樣。例如，可以并行運行多個UV-C源以適應大量穩(wěn)定的樣品。圖13示出這樣一種配置的示意性實施例。
[0170]已在本公開中提供了各種參考文獻。出于任何目的，本文所引用的所有參考文獻均整體并入。
實施例
[0171]以下實施例證明了所公開的方法的實施方案和方面，并且不旨在為限制性的。
[0172]實施例1
[0173]在暴露于UV-C劑暈后對過程化學關(guān)于蛋白質(zhì)修飾的評估
[0174]使包含F(xiàn)e部分的三種不同的重組蛋白質(zhì)(即IgG2單克隆抗體Mab X、Mab Y和Mab Z)在哺乳動物表達系統(tǒng)(即CHO細胞)中表達。通過離心使蛋白質(zhì)與細胞和其它固體碎片分離并且使用蛋白A色譜樹脂來純化。將蛋白質(zhì)交換到具有不同條件的溶液中，所述條件包括鹽在50mM至300mM乙酸鈉范圍內(nèi)，pH在4.3至7.4范圍內(nèi)并且蛋白質(zhì)濃度為2g/L 至 30g/L。
[0175]純化之后,通過暴露于由用戶配置的500瓦特Hg Newport ()reil.?泛光曝光源(型號97536)遞送的在254nm波長下的UV-C光來處理每一個這些蛋白質(zhì)等分試樣。配置曝光源以提供在所接受的OmJ/cm2至lOOOmJ/cm2的目標劑量范圍內(nèi)的均勻聚焦光和過濾光。所接受的劑量被定義為所遞送的能量劑量的調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)將可能包含在樣品中的組分(例如，蛋白質(zhì)、保護劑化學品或其它溶液化學品)的紫外光吸光度考慮在內(nèi)。通過下式調(diào)節(jié)劑
1~1?~α?
量:7jc0其中a =溶液的吸光度并且I是路徑長度。將所希望的接受的劑量除以水因子以確定用于處理的目標遞送的劑量設定值。通過測量溶液表面處的光源功率以及調(diào)節(jié)暴露時間來實現(xiàn)劑量給予。
[0176]通過以下各項中的一種或所有來分析每個樣品的蛋白質(zhì)修飾:用于聚集水平的SEC-HPLC、用于電荷同種型水平的CEX-HPLC、用于氨基酸殘基修飾的肽圖以及用于效力比較的基于細胞的生物活性測定。
[0177]所觀察到的結(jié)果指出pH、電導率以及蛋白質(zhì)濃度不明顯影響蛋白質(zhì)修飾的水平。這些實驗證實了蛋白質(zhì)純度和/或修飾的變化的主要來源是UV-C劑量水平。圖1至圖8概述了 UV-C暴露對所研究的三種單克隆抗體的影響。
[0178]實施例2
[0179]在暴露于UV-C劑暈后對溶液添加劑關(guān)于蛋白質(zhì)修飾和病毒滅活的評估
[0180]已建立了 UV-C暴露是造成單克隆抗體蛋白質(zhì)受試者的修飾和/或降解的原因而pH、電導率或蛋白質(zhì)濃度則不是，進行了密集的搜索以鑒定將保護蛋白質(zhì)免受與UV-C暴露相關(guān)的不希望的作用的化合物。
[0181]使包含F(xiàn)e部分的重組蛋白(單克隆抗體Mab X)在哺乳動物表達系統(tǒng)(即CHO細胞)中表達。通過離心使蛋白質(zhì)與細胞和其它固體碎片分離并且使用蛋白A色譜樹脂來純化。將蛋白A柱洗脫池調(diào)節(jié)至pH5.0并且稀釋或濃縮至濃度為2g/L、12g/L或30g/L蛋白質(zhì)濃度。
[0182]純化之后，在ImM添加劑/20mM蛋白質(zhì)的比率下將來自每種濃度的樣品與添加劑合并。添加劑包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、葉酸、苯丙氨酸、吡哆醇以及核黃素。通過暴露于由用戶配置的Newport Orei丨⑧泛光曝光源(型號97536)遞送的在254nm波長下的UV-C光來處理每一個這些蛋白質(zhì)等分試樣。配置曝光源以提供在所接受的OmJ/cm2至lOOOmJ/cm2的目標劑量范圍內(nèi)的均勻的聚焦光和過濾光。所接受的劑量被定義為所遞送的能量劑量的調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)將可能包含在樣品中的組分(例如，蛋白質(zhì)、保護劑化學品或其它溶液化學品)的紫外光吸光度考慮在內(nèi)。這是通過下式來調(diào)節(jié)的:水因子=.s-1 In ￠10) 其中a =溶液的吸光度并且I是路徑長度。將所希望的接受的劑量除以水因子以確定用于處理的目標遞送的劑量設定值。通過測量溶液表面處的光源功率以及調(diào)節(jié)暴露時間來實現(xiàn)劑量給予。
[0183]通過以下各項中的一種或所有來分析每個樣品的蛋白質(zhì)修飾:用于聚集水平的SEC-HPLC、用于電荷同種型水平的CEX-HPLC、用于氨基酸殘基修飾的肽圖以及用于效力比較的基于細胞的生物活性測定。這些測定的結(jié)果在圖1至圖9中示出。
[0184]所觀察到的結(jié)果指出一些添加劑(即葉酸和組氨酸)以積極的方式不明顯地影響蛋白質(zhì)修飾的水平，并且甲硫氨酸示出微小的益處。然而，其它添加劑(如色氨酸或酪氨酸)相對于UV輻射的劑量水平對限制蛋白質(zhì)修飾的程度具有明顯積極的作用。圖9至圖10以及圖14至圖15概述了此調(diào)查研究的結(jié)果。令人意外的是，酪氨酸和色氨酸是有效的保護劑，而組氨酸和苯丙氨酸的保護性明顯較低或沒有保護性的。在酪氨酸和色氨酸中發(fā)現(xiàn)的環(huán)結(jié)構(gòu)類似于在苯丙氨酸和組氨酸中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。酪氨酸和苯丙氨酸是結(jié)構(gòu)上非常相近的相關(guān)氨基酸。進一步令人意外的是，甲硫氨酸不是有效的保護劑，因為注意到它在用高劑量的UV-C處理的蛋白質(zhì)中被明顯氧化(圖7和圖8)，而色氨酸是有效的保護劑并且也注意到在用高劑量的UV-C處理的蛋白質(zhì)中被氧化。
[0185]此外，證明了所實現(xiàn)的病毒滅活水平(即xmuLV)響應于UV-C劑量水平并且可以是實際上明顯的(參見圖10)，無論是否存在添加劑。這些實驗的結(jié)果證明添加劑提供針對UV-C介導的修飾的保護并且不會不利地影響通過UV劑量水平進行的病毒滅活。
[0186]實施例3
[0187]UV-C處理的過稈中實施的評估
[0188]使包含F(xiàn)e部分的兩種不同的重組蛋白(即IgG2單克隆抗體Mab W和Mab X)在哺乳動物表達系統(tǒng)(即CHO細胞)中表達。通過離心和深度過濾使蛋白質(zhì)與細胞和其它固體碎片分離。純化、調(diào)節(jié)以及評價之后，形成一系列預處理樣品。生成兩種樣品成分(leg):一種源自離心的和深度過濾的材料并且另一種源自經(jīng)過蛋白質(zhì)色譜樹脂進一步純化和中和所述池。將每一種這些池與熒光劑涂覆的微球示蹤劑合并，并且然后進一步分成添加和不添加保護性添加劑(即酪氨酸)的池。評價單個的穩(wěn)定混合物在254nm波長光譜下的吸光度。然后通過暴露于不同劑量的UV-C光來處理每個這些穩(wěn)定的蛋白質(zhì)混合物。通過使混合物穿過包含33瓦特Hq燈的Atlantic UV Infinity?薄膜反應器來實現(xiàn)處理?；旌衔锪鬟^介于1.5m燈周圍的石英套筒與不銹鋼外殼之間形成的0.9_環(huán)形空間。
[0189]將每個預處理池分成單獨的劑量曝光池。通過經(jīng)由流速調(diào)節(jié)改變暴露時間來調(diào)節(jié)反應器內(nèi)遞送的劑量。通過下式調(diào)節(jié)所遞送的劑量:劑量~(P/Q)exp(-al) = (PcZQtl)θχρ(-&(ι1)，其中a =溶液的吸光度并且I是環(huán)形路徑長度。在此式中，P是燈的功率輸出并且Q是具有吸光度=a的混合物的體積流速；匕和Qtl是具有吸光度=a0的參照混合物的功率和流速。
[0190]然后通過用于聚集水平的SEC-HPLC來分析每個樣品的蛋白質(zhì)修飾(表1)。
[0191]表1具有和不具有酪氨酸保護劑的Mab W
[0192]
【權(quán)利要求】
1.一種使包含蛋白質(zhì)組分的樣品中的病毒滅活的方法，所述方法包括: (a)提供包含蛋白質(zhì)組分的樣品，其中已知或懷疑所述樣品包含病毒； (b)鑒定在其下所述病毒被滅活的UV光的目標劑量； (C)將保護劑添加至所述樣品中以形成穩(wěn)定的混合物； (d)使所述穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光，持續(xù)選擇的時間段； (e)評價所述穩(wěn)定的混合物的UV-C暴露水平；以及 (f)如果所述評價指出所述目標劑量的UV光尚未遞送至所述穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制所述波長、所述UV光源功率以及所述UV光暴露時間中的一種或多種。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包括色譜柱池。
3.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述池包括以下各項中的一種或多種:包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含所述蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含所述蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含所述蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含所述蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包括色譜柱流出物流。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述流出物流包括以下各項中的一種或多種:包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含所述蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)組分包括以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii) Fe結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；Qv) Fe融合蛋白；以及(V)治療性蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒包括以下各項中的一種或多種:dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒以及ssRNA病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒包括以下一種或多種病毒科的病毒:腺病毒科、非洲豬瘟病毒科、皰疹病毒科、虹彩病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、環(huán)狀病毒科、嗜肝DNA病毒科、細小病毒科、雙RNA病毒科、呼腸孤病毒科、沙粒病毒科、raraaririi/ae、布尼亞病毒科、D型肝炎病毒科、絲狀病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、彈狀病毒科、動脈炎病毒科、星狀病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、HEV-樣病毒、野田村病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科以及逆轉(zhuǎn)錄病毒科。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述病毒為所述細小病毒MVM、所述逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV或所述布尼亞病毒CVV。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將所述保護劑添加至所述樣品中。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述保護劑包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述保護劑包括以下各項之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
13.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述UV光的波長在約200nm至約280 nm的范圍內(nèi)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述UV光的波長為約254nm。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標劑量為以下各項中的一種或多種:約Imj/cm2、約 10 mj/cm2、約 25 mj/cm2、約 50 mj/cm2、約 75 mj/cm2、約 100 mj/cm2、約 125 mj/cm2、約 200 mj/cm2、約 250 mj/cm2、約 300 mj/cm2、約 350 mj/cm2、約 400 mj/cm2、約 450 mj/cm2、約500 mj/cm2、約600 mj/cm2、約700 mj/cm2、約800 mj/cm2、約900 mj/cm2、約1000 mj/cm2以及大于約1000 mj/cm2。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法提供了大于或等于約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5或大于約6.5的病毒對數(shù)減少值(LRV)。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法為自動化的。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法作為蛋白質(zhì)純化操作中的一個步驟而進行。
19.一種減少由UV暴露期間產(chǎn)生的反應性物種的存在而引起的蛋白質(zhì)降解或修飾的方法，所述方法包括: (a)提供包含蛋白質(zhì)組分的樣品，已知或懷疑所述蛋白質(zhì)組分在存在反應性物種的情況下被降解或修飾； (b)鑒定UV光的目標劑量； (C)將保護劑添加至所述樣品中以形成穩(wěn)定的混合物； (d)使所述穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光，持續(xù)選擇的時間段； (e)評價所述穩(wěn)定的混合物的UV-C暴露水平；以及 (f)如果所述評價指出所述目標劑量的UV光尚未遞送至所述穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制所述波長、所述UV光源功率以及所述UV光暴露時間中的一種或多種。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述樣品包括色譜柱池。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述池包括以下各項中的一種或多種:包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含所述蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含所述蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含所述蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含所述蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述樣品包括色譜柱流出物流。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述流出物流包括以下各項中的一種或多種:包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含所述蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)組分包括以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii) Fe結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；Qv) Fe融合蛋白；以及(V)治療性蛋白。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將所述保護劑添加至所述樣品中。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述保護劑包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述保護劑包括以下各項之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；或(iii)酪氨酸和色氨酸。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述UV光的波長在約200nm至約280 nm的范圍內(nèi)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述UV光的波長為約254nm。
30.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述目標劑量為以下各項中的一種或多種:約Imj/cm2、約 10 mj/cm2、約 25 mj/cm2、約 50 mj/cm2、約 75 mj/cm2、約 100 mj/cm2、約 125 mj/cm2、約 200 mj/cm2、約 250 mj/cm2、約 300 mj/cm2、約 350 mj/cm2、約 400 mj/cm2、約 450 mj/cm2、約500 mj/cm2、約600 mj/cm2、約700 mj/cm2、約800 mj/cm2、約900 mj/cm2、約1000 mj/cm2以及大于約1000 mj/cm2。
31.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述方法為自動化的。
32.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述方法作為蛋白質(zhì)純化操作中的一個步驟而進行。
33.一種減少經(jīng)受UV光的蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者的氧化的方法，所述方法包括: (a)提供包含蛋白質(zhì)組分的樣品，所述蛋白質(zhì)組分包含甲硫氨酸殘基、色氨酸殘基或甲硫氨酸殘基和色氨酸殘基兩者； (b)鑒定UV光的目標劑量； (C)將保護劑添加至所述樣品中以形成穩(wěn)定的混合物； (d)使所述穩(wěn)定的混合物暴露于通過在選擇的功率電平和選擇的波長下操作的源來提供的UV光，持續(xù)選擇的時間段； (e)評價所述穩(wěn)定的混合物的UV-C暴露水平；以及 (f)如果所述評價指出所述目標劑量的UV光尚未遞送至所述穩(wěn)定的混合物，則調(diào)制所述波長、所述UV光源功率以及所述UV光暴露時間中的一種或多種。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述樣品包括色譜柱池。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述池包括以下各項中的一種或多種:包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱洗脫液池、包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱洗脫液池、包含所述蛋白質(zhì)組分的HIC柱池、包含所述蛋白質(zhì)組分的SEC柱池、包含所述蛋白質(zhì)組分的IEC柱池以及包含所述蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱池。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述樣品包括色譜柱流出物流。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述流出物流包括以下各項中的一種或多種:包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白A柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的蛋白G柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的HIC柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的SEC柱流出物流、包含所述蛋白質(zhì)組分的IEC柱流出物流以及包含所述蛋白質(zhì)組分的羥磷灰石柱流出物流。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)組分包括以下各項中的一種或多種:(i)抗原結(jié)合蛋白，其包括以下各項中的一種或多種:單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體以及其片段；(ii) Fe結(jié)構(gòu)域；(iii)肽；Qv) Fe融合蛋白；以及(V)治療性蛋白。
39.如權(quán)利要求33所述的方法，其中以大于I份保護劑比200份蛋白質(zhì)的濃度比將所述保護劑添加至所述樣品中。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述保護劑包括以下各項中的一種或多種:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黃素。
41.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述保護劑包括以下各項之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
42.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述UV光的波長在約200nm至約280 nm的范圍內(nèi)。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述UV光的波長為約254nm。
44.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述目標劑量為以下各項中的一種或多種:約Imj/cm2、約 10 mj/cm2、約 25 mj/cm2、約 50 mj/cm2、約 75 mj/cm2、約 100 mj/cm2、約 125 mj/cm2、約 200 mj/cm2、約 250 mj/cm2、約 300 mj/cm2、約 350 mj/cm2、約 400 mj/cm2、約 450 mj/cm2、約500 mj/cm2、約600 mj/cm2、約700 mj/cm2、約800 mj/cm2、約900 mj/cm2、約1000 mj/cm2以及大于約1000 mj/cm2。
45.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述方法為自動化的。
46.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述方法作為蛋白質(zhì)純化操作中的一個步驟而進行。
【文檔編號】A61L2/00GK104136047SQ201280064731
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月26日
【發(fā)明者】J.E.舒爾茨, R.哈特, B.威爾博恩 申請人:安姆根有限公司