專利名稱：改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程生物材料，特別是涉及用于脊髓損傷修復(fù)研究的脫細(xì)胞脊髓生物衍生材料及制備方法。
背景技術(shù)：
為構(gòu)建符合脊髓解剖和生理需要的組織工程支架，學(xué)者對生物支架材料進(jìn)行了廣泛的探索。常用的脊髓生物支架材料多為可降解天然或合成高分子生物材料(JainA, Kim YTj McKeon RJ，et al.1n situ gelling hydrogels for conformalrepair ofspinal cord defects and local d elivery of BDNF after spinal cord injury.Biomaterials, 2006, 27(3) :497-504. He L，Zhang Y，Zeng C，et al. Manufacture ofPLGAmultipIe-channel conduits with precise hierarchical pore architecturesand invitro/vivo evaluation for spinal cord injury. Tissue Eng Part CMethods. 2009Jun;15(2) :243-255.)，如膠原、明膠、殼聚糖、聚乳酸、PLGA等，雖然它們在生物相容性、可塑性及可降解性等方面各有優(yōu)勢，但均難以模仿脊髓復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此極大地限制了其在脊髓修復(fù)重建中的應(yīng)用。近年來多種來源于天然脫細(xì)胞基質(zhì)的生物衍生材料被報(bào)道用于組織工程支架材料研究，這類材料去除了組織內(nèi)細(xì)胞成分，保留了細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM),因ECM具備細(xì)胞膜受體識(shí)別位點(diǎn)，利于細(xì)胞黏附生長并發(fā)揮生理功能，具有良好的細(xì)胞親和性和仿生的三維立體結(jié)構(gòu)，能夠無排斥的移植，并被宿主完全替代，已成功用于皮膚、膀胱、尿道、小腸、心瓣膜、血管、外周神經(jīng)等組織工程研究，為脊髓生物支架材料的研制提供了新的思路(Badylak SF, FreytesDO, Gilbert Tff. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structureandfunction. Acta Biomater. 2009Jan;5(I):1-13. ) 發(fā)明人在前期研究中將大鼠脊髓進(jìn)行了脫細(xì)胞處理(Guo SZ, Ren XJ1Wu B,Jiang T.Preparation of the acellular scaffold of the spinal cord and the studyofbiocompatibility. Spinal Cord. 2010 Jul; 48 (7) : 576-581.)，發(fā)現(xiàn)通過去除脊髓內(nèi)的細(xì)胞及髓鞘成分，將膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等ECM予以保留，使其具有仿生的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性，并有效降低免疫原性，可為種子細(xì)胞的粘附、增殖、遷移、分化、血管生長提供框架結(jié)構(gòu)，使脫細(xì)胞脊髓生物衍生材料應(yīng)用于脊髓修復(fù)重建成為可能。但前期建立的脫細(xì)胞方法中，脊髓主要在機(jī)械振蕩條件下利用化學(xué)去污劑TritonX-1OO和脫氧膽酸鈉進(jìn)行脫細(xì)胞處理。限于脊髓相對柔軟、機(jī)械強(qiáng)度弱的組織特性，該方法在脫去脊髓內(nèi)細(xì)胞成分的同時(shí)不可避免地影響到ECM三維結(jié)構(gòu)的完整性，容易出現(xiàn)細(xì)胞殘留和ECM三維結(jié)構(gòu)破壞的情況，對支架材料的免疫原性和細(xì)胞粘附浸潤帶來潛在的不利影響。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械振蕩是破壞脊髓ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的重要因素之一，并與機(jī)械振蕩的時(shí)間和強(qiáng)度相關(guān)(尹文化，金大地，鄧許勇，等.機(jī)械振蕩對脊髓去細(xì)胞支架形態(tài)學(xué)的影響·南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008:28(10) :1748-1751.)。前期研究還發(fā)現(xiàn)，脊髓經(jīng)脫細(xì)胞處理后其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差、易于降解而快速崩塌，難以滿足脊髓修復(fù)重建對生物支架材料的要求，需采用合適的方法來改良脫細(xì)胞脊髓生物衍生材料的生物學(xué)特性，以提高其抗酶降解能力，并較長時(shí)間地保持其良好的三維結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑，如甲醒、戍二醒(glutaraldehyde, GA)、乙醒及環(huán)氧化合物等已廣泛用于生物材料的改性處理，但其處理后的材料存在細(xì)胞毒性大、質(zhì)地僵硬及遠(yuǎn)期變性等缺點(diǎn)，使其進(jìn)一步應(yīng)用受至丨J限制(Schoen FJ, Harasaki H, Kim KM, et al. Biomaterial-associated calcification:pathology, mechanisms, and strategies for prevention. J Biomed MaterRes.1988Apr;22(Al Suppl):11-36.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是構(gòu)建一種改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料(簡稱改性材料)，該材料來源于大鼠脊髓，通過脫細(xì)胞和化學(xué)交聯(lián)處理而獲得，可以用于脊髓修復(fù)重建研究。本發(fā)明所述材料是在化學(xué)去垢劑和京尼平的聯(lián)合作用下脫去細(xì)胞及髓鞘成分并交聯(lián)改性為具有仿生三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和高孔隙率的脊髓支架材料。
本發(fā)明所述改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料具有以下特點(diǎn)(I)具有更完整的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并具備高仿生性和高孔隙率，利于種子細(xì)胞浸潤、生長、增殖以及營養(yǎng)成分的輸送和代謝產(chǎn)物的排除，有望為再生軸突提供適宜的通道，并引導(dǎo)其有序生長；(2)具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗酶解能力，能更長時(shí)間維持其有效的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)仍可在體內(nèi)完全吸收，為種子細(xì)胞增殖、分化和脊髓修復(fù)重建提供可靠的支撐環(huán)境;(3)脊髓內(nèi)細(xì)胞及髓鞘成分的殘留量更少，免疫原性微弱，生物相容性良好；(4)保留了脊髓內(nèi)天然的ECM成分，親水性高，具有良好的細(xì)胞相容性，利于種子細(xì)胞的黏附、生長并發(fā)揮生理功能；(5)具有良好的生物安全性良好，無明顯細(xì)胞毒性，可用于進(jìn)一步的脊髓修復(fù)重建研究；(6)大體形態(tài)與正常脊髓高度相似，利于在脊髓損傷修復(fù)的體內(nèi)移植中實(shí)現(xiàn)等位移植和解剖移植，即根據(jù)移植部位需要取材，并進(jìn)行解剖對接。本發(fā)明所述改性材料的取材來源于SD大鼠脊髓組織，因此材料來源充足、成本低廉，利于大量制備，可以應(yīng)用于同種異體脊髓修復(fù)重建研究。申請人對所述改性材料的形態(tài)學(xué)特征、理化性質(zhì)、細(xì)胞相容性、體內(nèi)降解性、免疫原性和生物安全性進(jìn)行了深入研究，結(jié)果顯示，該材料具有理想的脊髓生物支架材料應(yīng)具備的多種優(yōu)良特性，特別是克服了背景技術(shù)所述未改性的脊髓材料的ECM三維結(jié)構(gòu)破損、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差、極易降解的缺陷，并避免了傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)改性所帶來的支架材料細(xì)胞毒性大的問題，在脊髓修復(fù)重建研究中具有較廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料的制備方法，該方法的技術(shù)方案是(I)取凍存的大鼠脊髓，3 5°C條件下在超純水中浸泡6 8h ；(2) 3 5°C條件下在10%氯化鈉溶液中浸泡6 8h ；(3)重復(fù)步驟(I) (2);
(4)在1% TritonX-1OO溶液中振蕩脫細(xì)胞4 5h (振蕩條件20 25°C，轉(zhuǎn)速為100 120轉(zhuǎn)/min,下同)；(5)在O. OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次；(6)在I %脫氧膽酸鈉溶液中振蕩脫細(xì)胞4 5h ;(7)在O. OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次；(8) 3 5°C條件下在5g / L京尼平溶液中浸泡24 28h ；(9)在O. OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次；( 10) -500C，真空度300 μ bar條件下冷凍干燥24 28h ；(11)密封，6tlCo (16kGy)輻照滅菌，_20°C保存。上述方法對大鼠脊髓脫細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了合理優(yōu)化，增加了高低滲溶液浸泡預(yù)處理和京尼平交聯(lián)處理環(huán)節(jié)，用該方法制備出的改性材料具有更加優(yōu)良的生物學(xué)特性，以滿足脊髓修復(fù)重建對生物支架材料的高要求。本發(fā)明所述方法對脊髓進(jìn)行脫細(xì)胞處理前，先將脊髓進(jìn)行反復(fù)高低滲溶液浸泡預(yù)處理，利用高低滲溶液產(chǎn)生的滲透壓差使脊髓內(nèi)的細(xì)胞破裂，為脫細(xì)胞處理做好準(zhǔn)備。隨后，在利用機(jī)械振蕩結(jié)合化學(xué)萃取技術(shù)進(jìn)行脫細(xì)胞處理的過程中，縮短了機(jī)械振蕩結(jié)合化學(xué)萃取技術(shù)處理脊髓組織的總時(shí)間，并嚴(yán)格控制機(jī)械振蕩強(qiáng)度，避免去污劑溶液形成渦流對脊髓造成剪切力破壞，在提高脫細(xì)胞效率的同時(shí)盡力維持脊髓ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性。本發(fā)明所述方法還增加了對支架材料的化學(xué)交聯(lián)處理步驟。通過對不同化學(xué)交聯(lián)劑類型、不同交聯(lián)劑濃度和不同交聯(lián)處理時(shí)間的比較，最終確定采用5g / L的京尼平溶液對脫細(xì)胞脊髓支架材料進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)處理24 28h。該交聯(lián)方法使脫細(xì)胞脊髓支架材料的交聯(lián)率達(dá)到90%，可有效增強(qiáng)支架材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗酶解能力，并且無明顯細(xì)胞毒性。本發(fā)明所述方法中使用TritonX-1OO和脫氧膽酸鈉作為化學(xué)去垢劑，用于脫細(xì)胞處理。TritonX-1OO是一種非離子型去垢劑，在水中不解離，穩(wěn)定性高，不易受強(qiáng)電解質(zhì)無機(jī)鹽類的影響，并且不改變組織的天然結(jié)構(gòu)。TritonX-1OO結(jié)構(gòu)上的親水基團(tuán)能夠溶解細(xì)胞膜及細(xì)胞器表面膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，并能清除磷脂類物質(zhì)，使細(xì)胞成分溶于TritonX-1OO溶液中，從而達(dá)到清除組織中細(xì)胞成分的目的，其疏水端也能與膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，溶解于溶液中，因此，TritonX-1OO能徹底破壞生物膜，使細(xì)胞及其內(nèi)的細(xì)胞器溶解破壞。脫氧膽酸鈉是一種非離子型去垢劑，可以使蛋白以單體的形式被分離，且對蛋白質(zhì)的變性作用較弱，對生物材料的結(jié)構(gòu)影響不大。脫氧膽酸鈉能溶解細(xì)胞中的脂類、蛋白質(zhì)等，可有效去除神經(jīng)髓鞘和其它細(xì)胞內(nèi)容物。京尼平是一種提取于桅子果實(shí)中的天然生物交聯(lián)劑，屬環(huán)烯醚萜類化合物，具有羥基、羧基等多個(gè)活性官能團(tuán)，可以與生物材料中賴氨酸、羥賴氨酸及精氨酸等殘基的自由氨基反應(yīng)，形成雜環(huán)結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)及分子間交聯(lián)體，達(dá)到增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的目的。與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑，如甲醛、戊二醛、乙醛及環(huán)氧化合物等相比較，細(xì)胞毒性低是京尼平的最大優(yōu)勢，適用于生物材料的交聯(lián)改性。另外，經(jīng)過PBS反復(fù)漂洗,可有效減少TritonX-100、脫氧膽酸鈉及京尼平在支架材料內(nèi)的殘留量，進(jìn)一步降低其對生物組織可能產(chǎn)生的毒性風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明人建立了制備脫細(xì)胞脊髓生物衍生材料的新方法，采用該方法制備出改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料，并對該材料的形態(tài)學(xué)特征、理化性質(zhì)、細(xì)胞相容性、體內(nèi)降解性、免疫原性和生物安全性進(jìn)行了深入研究。本發(fā)明所述方法克服了背景技術(shù)中所述的容易破壞脊髓ECM三維結(jié)構(gòu)和出現(xiàn)細(xì)胞殘留的不足，使制備出的改性材料細(xì)胞及髓鞘成分去除徹底，并具有良好的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和生物相容性，顯著改善了支架材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗酶解能力，可操作性和可重復(fù)性強(qiáng)，充分體現(xiàn)了本發(fā)明所述方法的技術(shù)進(jìn)步。本發(fā)明所述改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料，適用于脊髓修復(fù)重建研究，為脊髓修復(fù)重建研究提供了一種新型的生物材料。


圖1是支架材料形態(tài)照片其中，圖1a.本發(fā)明所述改性材料；圖1b.未改性材料；圖1c.新鮮大鼠胸段脊髓；圖2是支架材料的組織學(xué)照片(HE染色X200):其中，圖2a.本發(fā)明所述改性材料，從圖中可見細(xì)胞成分去除較為徹底，偶有少量細(xì)胞碎片殘留，ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保持完整；圖2b.未改性的材料，有少量細(xì)胞殘留，ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)部分破壞；圖2c.新鮮大鼠胸段脊髓，包含大量細(xì)胞成分；
圖3是支架材料的掃描電鏡照片(SEMX400):其中，圖3a.本發(fā)明所述改性材料，基質(zhì)纖維保存完好，相互交織成網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，內(nèi)部孔洞連通；圖3b.未改性材料，部分基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)坍塌現(xiàn)像；圖3c.新鮮大鼠胸段脊髓；圖4是本發(fā)明所述改性材料的LN、FN及IV型膠原免疫組化染色照片(SABCX400):其中，圖4a. LN免疫組化染色陽性；圖4b. FN免疫組化染色陽性；圖4c.1V型膠原免疫組化染色陽性；圖5是支架材料的髓鞘染色照片(Weil髓鞘染色X400):其中，圖5a.本發(fā)明所述改性材料，無髓鞘殘留，呈陰性；圖5b.未改性材料，有少量髓鞘碎片殘留，呈弱陽性；圖5c.新鮮大鼠胸段脊髓，髓鞘組織染色呈黑色，強(qiáng)陽性；圖6是支架材料與京尼平(5g / L)和戊二醛(5g / L)的交聯(lián)度檢測曲線，24h后支架材料與兩種交聯(lián)劑的交聯(lián)度均達(dá)上限；圖7是支架材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比較；圖8是支架材料在PBS中持續(xù)振蕩7d時(shí)的組織學(xué)照片其中，圖8a.本發(fā)明所述改性材料，結(jié)構(gòu)基本完整，僅少量纖維溶解斷裂；圖8b.未改性材料，纖維溶解斷裂，結(jié)構(gòu)破壞明顯；圖9是大鼠MSC與支架材料共培養(yǎng)4h的激光共聚焦掃描照片(DAPI染色X 100):其中，圖9a.大鼠MSC與本發(fā)明所述改性材料共培養(yǎng)；圖9b.大鼠MSC與未改性材料共培養(yǎng)；圖9c.大鼠MSC與戊二醛改性材料共培養(yǎng)；圖10是大鼠MSC與支架材料共培養(yǎng)4h的細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖11是大鼠MSC與支架材料共培養(yǎng)的組織學(xué)照片(HE染色X200):其中，圖1la c.細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)4h ;圖1ld f.細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)7d ;圖11a，d.大鼠MSC與本發(fā)明所述改性材料共培養(yǎng)；圖11b，e.大鼠MSC與未交改性材料共培養(yǎng)；圖11c，f.大鼠MSC與戊二醛改性材料共培養(yǎng)；圖12是大鼠MSC與支架材料共培養(yǎng)的掃描電鏡照片(SEMX400):其中圖12a c.細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)4h ;圖12d f.細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)7d ;圖12a，d.大鼠MSC與本發(fā)明所述改性材料共培養(yǎng)；圖12b，e.大鼠MSC與未交改性材料共培養(yǎng)；圖12c，f.大鼠MSC與戊二醛改性材料共培養(yǎng)；圖13是大鼠MSC在材料浸提液中的相對生長率比較；圖14是支架材料體內(nèi)降解過程的組織學(xué)照片(HE染色X200):其中，圖14a, c, e, g.本發(fā)明所述改性材料體內(nèi)降解過程；圖14b, d, f.未改性材料體內(nèi)降解過程；圖14a，b.皮下包埋3d ;圖14c，d.皮下包埋3w ;圖14e，f.皮下包埋6w;圖14g.皮下包埋24w ；圖15是皮下包埋2w時(shí)⑶ 4和⑶8免疫組化染色照片(SABCX400):其中，圖15a, c, e, g. OT4免疫組化染色；圖15b，d, f，h. OT8免疫組化染色；圖15a，b.移植本發(fā)明所述改性材料；圖15c，d.移植未改性材料；圖15e，f.移植同種異體新鮮大鼠脊髓；圖15g，h.假手術(shù)組，未移植。
具體實(shí)施例方式一.改性的大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料的制備(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和器材-70°C凍存的完整大鼠脊髓(購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，戊巴比妥鈉(P3761，Sigma),氯化鈉(51024060，國藥集團(tuán))，TritonX-100 (ST795，碧云天)，脫氧膽酸鈉(D001601，Amresco)，京尼平(6902-77-8，臨川之信生物科技有限公司)，戊二醛(111-30-8，上海紫一試劑廠)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (AR0030,博士德)，外科手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械廠)，超純水凈化器(Millipore,美國),冷凍干燥機(jī)(Thermo Savant ModulyoD，美國)，臺(tái)式恒溫振蕩器(THZ-22，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，電冰箱(美的)，-70°C深低溫冰箱(Sanyo，日本)。(二)方法制備改性的大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料取凍存的完整大鼠脊髓，室溫下解凍后修剪成長約20mm節(jié)段，經(jīng)O. OlMPBS漂洗后，采用反復(fù)高低滲溶液浸泡預(yù)處理脊髓，預(yù)處理過程在3 5°C條件下進(jìn)行，將脊髓在超純水中浸泡6 8h,然后在10%氯化鈉溶液中浸泡6 8h,再次將脊髓在超純水中浸泡6 8h，10%氯化鈉溶液中浸泡6 8h，預(yù)處理結(jié)束。在20 25°C，100 120轉(zhuǎn)/min的振蕩條件下進(jìn)行脫細(xì)胞處理，將脊髓浸入1% TritonX-1OO溶液中，在臺(tái)式恒溫振蕩器上持續(xù)振蕩脫細(xì)胞4 5h，之后用O. OlMPBS持續(xù)振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次，再將脊髓浸入I %脫氧膽酸鈉溶液中持續(xù)振蕩脫細(xì)胞4 5h，最后用O. OlM PBS持續(xù)振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次，脫細(xì)胞處理結(jié)束。脫細(xì)胞過程須嚴(yán)格控制機(jī)械振蕩強(qiáng)度，確保脊髓懸浮于脫細(xì)胞溶液中并伴隨溶液勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，不與容器壁發(fā)生碰撞。隨后在3 5°C條件下，將脊髓浸入5g / L的京尼平溶液中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)改性處理24 28h，之后用O. OlM PBS持續(xù)振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次，最后在-50°C，真空度300 μ bar條件下冷凍干燥24 28h獲得改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料(簡稱改性材料)。將該支架材料密封，或縱行切片制成厚度約150um的片層狀結(jié)構(gòu)后密封，經(jīng)6tlCo (16kGy)輻照滅菌處理，于_20°C保存，用于后續(xù)研究。對照設(shè)置未改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料(簡稱未改性材料)的制備方法(簡稱舊方法)(1)材料準(zhǔn)備同上；(2)3 5°C條件下在超純水中浸泡6 8h ;(3)在I %TritonX-1OO溶液中振蕩脫細(xì)胞3 4h (振蕩條件20 25 °C，轉(zhuǎn)速為100 120轉(zhuǎn)/min，下同)；(4)在O. OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次；(5)在I %脫氧膽酸鈉溶液中振蕩脫細(xì)胞3 4h ; (6)在O. OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBSI次；(7)重復(fù)步驟(3) (6) —遍；(8)-50°C，真空度300 μ bar條件下冷凍干燥24 28h ; (9)密封，或縱行切片制成厚度約150um的片層狀結(jié)構(gòu)后密封,6ciCo (16kGy)福照滅菌，-20°C保存。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的脫細(xì)胞脊髓生物衍生材料制備方法與該方法基本一致(Guo SZ,RenXJ, Wu B, et al.Preparation of the acellular scaffold of the spinalcord and the study ofbiocompatibility. Spinal Cord. 2010Jul; 48 (7) : 576-581.尹文化，金大地，鄧許勇，等.機(jī)械振蕩對脊髓去細(xì)胞支架形態(tài)學(xué)的影響.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008:28(10) : 1748-1751.)，將該未改性材料用于本發(fā)明所述改性材料的部分生物學(xué)特性研究的對照。將該未改性材料米用戍二醒交聯(lián)改性處理，即將未改性支架材料浸入5g / L的戍二醛溶液中化學(xué)交聯(lián)24 28h，之后用0. OlM PBS持續(xù)振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次，在_50°C，真空度300 μ bar條件下冷凍干燥24 28h獲得戊二醛改性的大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料(簡稱戊二醛改性材料)，該材料亦將用于本發(fā)明所述改性材料的部分生物學(xué)特 性研究的對照。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本發(fā)明所實(shí)施的全部檢測內(nèi)容均重復(fù)5次，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土 S)表示,結(jié)果用SPSS 13. O統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用student-t檢驗(yàn)，P<0. 05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。二.支架材料的形態(tài)學(xué)觀察(一)試劑和設(shè)備4%多聚甲醛(AR-0211，鼎國生物)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)，普通光學(xué)顯微鏡(Leica，德國)，掃描電鏡(日立S-3400N，日本)，(二)方法與結(jié)果1.大體觀察肉眼觀察本發(fā)明所述新方法制備的改性材料的形狀、大小、顏色等，將新鮮大鼠胸段脊髓和舊方法制備的未改性材料作為對照。肉眼觀，新鮮大鼠胸段脊髓為圓柱形，直徑約2. 9±0. 1mm，呈灰白或灰黃色(圖lc)。采用新方法或舊方法制備的支架材料形態(tài)與正常脊髓相似，仍維持圓柱形，略皺縮，其中本發(fā)明所述改性材料呈淡藍(lán)色(圖la)，未改性材料呈乳白色(圖lb)。2.組織學(xué)觀察本發(fā)明所述方法制備的改性材料經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片后，HE染色，光鏡下觀察改性材料的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，將新鮮大鼠胸段脊髓和舊方法制備的未改性材料的HE染色作為對照。HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠脊髓縱切面組織結(jié)構(gòu)致密，含有大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞(圖2c)。本發(fā)明所述新方法制備的改性材料細(xì)胞成份去除較為徹底，偶有極少量細(xì)胞碎片殘留，ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保持完整(圖2a)。舊方法制備的未改性材料有少量細(xì)胞殘留，ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)部分破壞(圖2b)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述新方法的脫細(xì)胞效果和保持脊髓ECM三維結(jié)構(gòu)完整性的作用優(yōu)于舊方法。
3.超微結(jié)構(gòu)觀察本發(fā)明所述方法制備的改性材料經(jīng)固定、噴金后，掃描電子顯微鏡觀測其超微結(jié)構(gòu)特征，并用圖像分析軟件Image J 3.4 (美國，NIH)對材料孔徑進(jìn)行測量，將新鮮大鼠胸段脊髓和舊方法制備的未改性材料作為對照。掃描電鏡結(jié)果顯示新鮮脊髓縱切面基質(zhì)飽滿，無明顯孔隙結(jié)構(gòu)(圖3c)。本發(fā)明所述新方法制備的改性材料的基質(zhì)纖維保存完好，相互交織成網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，內(nèi)部孔洞連通，平均孔徑大小約為34. 5± 17. 4 μ m (圖3a)。舊方法制備的未改性材料的部分基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)斷裂、坍塌現(xiàn)像，可測量的平均孔徑大小約為37. 1±18.6μπι (圖3b)，與改性材料孔徑無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0. 05)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述方法對脊髓ECM三維結(jié)構(gòu)完整性的保持優(yōu)于舊方法。三.支架材料的理化性質(zhì)檢測(一)試劑和設(shè)備4%多聚甲醛(AR-0211，鼎國生物)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)，小鼠抗大鼠 IgG1 纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)抗體(sc-8422, SantaCruz, 1:200 稀釋)，小鼠抗大鼠IgG1層粘連蛋白(Laminin,LN)抗體(sc_28330,Santa Cruz, 1:200稀釋),兔抗大鼠 IgG IV型膠原(Collagen IV)抗體(ab6586,Abcom, 1:500 稀釋)，小鼠 IgG SABC 試劑盒(SA2001，博士德)，兔IgG SABC試劑盒(SA2002，博士德)，DAB顯色試劑盒(黃)(AR1022，博士德)，神經(jīng)組織Weil髓鞘染色試劑盒(GMS80119. 1，上海杰美)，無水乙醇(HB15-GR-0. 5L，廣州化學(xué)試劑廠)，茚三酮(N4876，Sigma)，京尼平(6902-77-8，臨川之信生物科技有限公司)，戊二醛(111-30-8，上海紫一試劑廠)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (AR0030，博士德)，胰酶(SH30042. 01B, Hyclone),普通光學(xué)顯微鏡(Leica,德國)，冷凍干燥機(jī)(Thermo SavantModulyo D,美國)，電子天平(SartoriusBP221S,德國),722型可見分光光度計(jì)(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)，臺(tái)式恒溫振蕩器(THZ-22，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。(二)方法與結(jié)果1.支架材料的成分分析本發(fā)明所述改性材料經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(厚5 μ m)后，分別行纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)、層粘連蛋白(Laminin, LN)、IV型膠原SABC免疫組織化學(xué)染色和Weil髓鞘染色，光鏡下觀察改性材料中是否含有FN、LN、IV型膠原和髓鞘成分，將新鮮大鼠胸段脊髓和舊方法制備的未改性材料作為對照。SABC免疫組織化學(xué)染色按說明書操作，現(xiàn)簡述如下石蠟切片置烤箱58-60°C 60min ;常規(guī)脫臘至水；3%的過氧化氫液室溫孵育IOmin,蒸懼水沖洗3次；抗原熱修復(fù)；滴加5%血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體，不洗；滴加一抗，4°C過夜；PBS洗滌2minX 3次；滴加生物素化二抗，37°C孵育20min，PBS洗滌2minX 3次；滴加SABC，37 °C孵育20min，PBS洗滌，5min X 4次；DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水充分沖洗，終止顯色；蘇木素輕度復(fù)染，蒸餾水充分沖洗，1%鹽酸-酒精分化；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Weil髓鞘染色法操作步驟簡述如下石蠟切片脫蠟至水，500C Weil蘇木精染色液染色12 24h，自來水洗5 10min，4%鐵明礬溶液分化，鏡下控制分化時(shí)間，約I 3min，自來水充分沖洗，使之返藍(lán)黑色為止，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。將新鮮大鼠胸段脊髓的Weil髓鞘染色作為陽性對照。LN、FN及IV型膠原免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在本發(fā)明所述改性材料內(nèi)，LN、FN及IV型膠原均呈陽性反應(yīng)，并呈網(wǎng)狀分布(圖4a、b、C)，舊方法制備的未改性材料染色結(jié)果基本相同。而Weil髓鞘染色結(jié)果顯示，在正常脊髓內(nèi)髓鞘組織染色呈黑色強(qiáng)陽性反應(yīng)，無明顯破壞，形態(tài)規(guī)則，厚度正常(圖5c)，而本發(fā)明所述改性材料髓鞘組織染色呈陰性，SP無髓鞘殘留(圖5a)，舊方法制備的未改性材料髓鞘染色呈弱陽性，有少量髓鞘成分殘留(圖5b)。上述結(jié)果表明，脊髓ECM成分在兩種脫細(xì)胞脊髓支架材料中得到有效保留，但本發(fā)明所述改性材料較舊方法制備的未改性材料髓鞘成分去除更徹底。2.支架材料的孔隙率檢測
采用液體置換法測量支架材料孔隙率，將本發(fā)明所述改性材料或舊方法制備的未改性材料放入裝有Vl體積無水乙醇的刻度試管中，反復(fù)輕輕的擠壓材料，直至無氣泡溢出為止，此時(shí)的刻度為V2，V2-V1就是材料的骨架體積。將材料移出試管，此時(shí)試管的刻度V3，V1-V3就是材料中孔隙的體積。材料的骨架體積+孔隙體積=(V2-V1) + (V1-V3) =V2_V3，孔隙率=[(V1_V3)/ (V2-V3) ] X100%?？紫堵蕶z測結(jié)果顯示，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料分別具有84. 8±4. 2%和85. 6±6. 5%的高孔隙率,利于種子細(xì)胞植入、生長、增殖以及營養(yǎng)成分的輸送和代謝產(chǎn)物的排除，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0. 05)。3.支架材料的交聯(lián)度檢測用茚三酮試劑盒測定未交聯(lián)的脫細(xì)胞脊髓支架材料與5g / L的京尼平或5g / L的戊二醛交聯(lián)3h、6h、12h、24h和48h后的交聯(lián)度。原理支架材料內(nèi)的自由氨基酸與茚三酮溶液在100°C下共熱20min后能生成藍(lán)紫色溶液，且自由氨基酸含量與藍(lán)紫色溶液的光吸收值成正相關(guān)。方法將O. 02g待測凍干材料與2ml lmg/mL的茚三酮溶液沸水浴20min，用不同濃度(1. O, 2. O, 3. O, 4. O, and 5. Omg/mL)的甘氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，722型可見分光光度計(jì)在570nm下測定光吸收值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣品中自由氨基酸的含量。按以下公式計(jì)算交聯(lián)度交聯(lián)度=(未改性支架材料中自由氨基酸含量一改性支架材料中自由氨基酸含量)/未改性支架材料中自由氨基酸含量X 100%。交聯(lián)度檢測結(jié)果顯示，未交聯(lián)的支架材料與5g / L京尼平交聯(lián)3h、6h、12h、24h和48h 時(shí)的交聯(lián)度分別為34. 6±3. 6%,57.1±4. 5%,72. 5±5. 3%,90. 6±7. 1%、90· 5±7. 6%,而與5g / L戊二醛交聯(lián)3h、6h、12h、24h和48h時(shí)的交聯(lián)度分別為45. 5±4. 1%、65. 7±5· 8%,88. 2±6· 7%、91· 2±7· 2%、91· 3±7· 8%。交聯(lián) 24h 后，支架材料在京尼平和戊二醛中的交聯(lián)度相近，均超過90%，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0. 05)(圖6)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述新方法的化學(xué)交聯(lián)處理步驟中，采用支架材料與5g / L京尼平交聯(lián)24h后可獲得與傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛(5g / L)相當(dāng)?shù)慕宦?lián)改性效果，且交聯(lián)度均已達(dá)到支架材料交聯(lián)上限。4.支架材料的含水率的檢測取本發(fā)明所述改性材料或舊方法制備的未改性材料，測得干重為W0，將材料浸泡在O. OlM PBS中(PH7. 4，4°C )，24h后取出，用濾紙吸盡表面水分，測得材料濕重W1，按公式計(jì)算支架材料的含水率，含水率=(Wl - WO) /WO X 100%。含水率檢測結(jié)果顯示，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料含水率分別為229. 7± 12. 5%和232 ± 14. 3%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0. 05)，均具有良好的親水性，利于細(xì)胞黏附。5.支架材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測取本發(fā)明所述改性材料，測得干重為W，將改性材料分別浸泡在O. OlM PBS和2. 5g/L胰酶溶液中持續(xù)振蕩(振蕩條件37°C，IOOrpm)，在第ld、3d、7d、14d取出樣品，經(jīng)冷凍干燥后測得干重為W1，以材料失重率(Wt)代表材料在PBS中的穩(wěn)定性和胰酶中的降解率，由以下公式來計(jì)量Wt= (W0-W1)/W0X 100%。將在PBS中振蕩第7d的支架材料取出，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察改性材料的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。將舊方法制備的未改性材料作為對照。PBS中的穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示，在PBS中持續(xù)振蕩ld、3d、7d、14d時(shí)，本發(fā)明所述改性材料的失重率分別為2. 4±0· 3%、3· 2±0· 2%、4· 2±0· 5%、4· 5±0· 9%，而舊方法制備的未改性材料的失重率分別為13. 2±4· 1%、37· 6±5· 0%、54· 4±4· 2%,94. 6±6· 3%。本發(fā)明所述改性材料在PBS中失重率低，14d時(shí)的失重率為4. 5±0. 9%，僅少量丟失，而未改性材料 在PBS中失重率高，到第7d失重率達(dá)54. 4 ±4. 2%，第14d失重率達(dá)94. 6 ±6. 3%，材料基本完全消失，與改性材料比較，在各時(shí)相點(diǎn)差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 05)。支架材料在PBS中持續(xù)振蕩7d時(shí)的HE染色結(jié)果可見本發(fā)明所述改性材料結(jié)構(gòu)基本完整，僅少量纖維溶解斷裂(圖8a)，而未改性材料纖維溶解斷裂，結(jié)構(gòu)破壞明顯(圖8b)。上述結(jié)果顯示，本發(fā)明所述改性材料在PBS中的失重率低于舊方法制備的未改性材料，并可較長時(shí)間保持其結(jié)構(gòu)完整，因而，改性材料在PBS中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)于未改性材料。胰酶中的降解率檢測結(jié)果顯示，在胰酶中消化ld、3d、7d、14d時(shí)，本發(fā)明所述改性材料的降解率分別為4· 4±0· 7%、7· 2±1· 5%、11· 2±3. 1%、22· 5±4. 6%，而舊方法制備的未改性材料的降解率分別為73. 4±5. 4%、100%、100%、100% (圖7)。改性材料在胰酶溶液中降解緩慢，14d時(shí)的降解率為22. 5±4. 6%，而未改性材料在胰酶中降解快，3d時(shí)已完全降解，與改性材料比較，在各時(shí)相點(diǎn)差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 05)。上述結(jié)果顯示，本發(fā)明所述改性材料抗酶解能力優(yōu)于未改性材料。四.支架材料的細(xì)胞相容性研究(一)材料和設(shè)備大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC) (RASMX-01001，廣州賽業(yè))，DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)基(SH30023. 01B，Hyclone),胎牛血清(SV30087. 01，Hyclone),青鏈霉素(SV30010，Hyclone)，胰酶(SH30042. 01B，Hyclone)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (AR0030,博士德)，4% 多聚甲醛(AR-0211，鼎國生物)，DAPI (C1005，碧云天)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)，戊二醛(111-30-8，上海紫一試劑廠)，MTT試劑盒(C0009，碧云天)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化集團(tuán))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱(Heraeus，德國)，倒置相差顯微鏡(Leica，德國)，激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國)，普通光學(xué)顯微鏡(Leica，德國)，掃描電鏡(日立S-3400N，日本)，酶標(biāo)儀(Thermo ,美國)。(二)方法與結(jié)果1.大鼠MSC的培養(yǎng)及接種大鼠MSC培養(yǎng)大鼠MSC購自廣州賽業(yè)公司，用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100U/mL青鏈霉素)在5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3d更換一次。細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，用O. 25%的胰酶傳代。接種將已制成片層狀結(jié)構(gòu)的本發(fā)明所述改性材料、舊方法制備的未改性材料和戊二醛改性材料分別放置在12孔板中，用培養(yǎng)基預(yù)濕過夜，然后將IOOul濃度為2 X IO5/ml的MSC細(xì)胞懸浮液接種到支架材料上(2xl04細(xì)胞/支架)，將細(xì)胞支架材料復(fù)合物放到5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，4h后每孔中加入3ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基每3d更換一次，培養(yǎng)I周。2.細(xì)胞在支架材料上的粘附能力檢測大鼠MSC與3種支架材料 共培養(yǎng)4h后，檢測細(xì)胞的粘附能力。將共培養(yǎng)的支架材料取出，用O. OlM PBS輕輕漂洗3次，4%多聚甲醛固定lOmin，再用O. OlM PBS漂洗3次，力口入500ul的DAPI染色lOmin，激光共聚焦顯微鏡掃描成像(100倍)，在ImageJ軟件的幫助下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)4個(gè)視野，取其均值。細(xì)胞在支架材料上的粘附能力檢測結(jié)果顯示大鼠MSC與支架材料共培養(yǎng)復(fù)合物經(jīng)DAPI染色后，細(xì)胞核在激光共聚焦顯微鏡下呈藍(lán)色，粘附在本發(fā)明所述改性材料上的細(xì)胞核數(shù)目與粘附在丨H方法制備的未改性材料上的細(xì)胞核數(shù)目相當(dāng)，均明顯多于粘附在戊二醛改性材料上的細(xì)胞核數(shù)目(圖9a, b, C)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述改性材料每個(gè)視野約205 ±62個(gè)細(xì)胞，未改性材料每個(gè)視野約256 ±46個(gè)細(xì)胞，戊二醛改性材料每個(gè)視野約94±33個(gè)細(xì)胞(圖10)。本發(fā)明所述改性材料和未改性材料粘附細(xì)胞數(shù)量較多，兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0. 05)，而粘附在戊二醛改性材料上的細(xì)胞數(shù)明顯少于前兩者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0. 05)。上述結(jié)果表明，大鼠MSC在本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料上的粘附能力明顯強(qiáng)于戊二醛改性材料，且本發(fā)明所述新方法中，京尼平改性對大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料的細(xì)胞粘附能力無明顯影響。3.細(xì)胞支架材料復(fù)合物的組織學(xué)觀察大鼠MSC與3種支架材料共培養(yǎng)4h和7d后，將共培養(yǎng)的支架材料取出，用O. OlMPBS輕輕漂洗3次，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，組織學(xué)評價(jià)大鼠MSC在材料上的粘附、生長、滲透情況以及支架材料對細(xì)胞活性的可能影響。HE染色結(jié)果顯示，大鼠MSC與3種支架材料共培養(yǎng)4h后，細(xì)胞能粘附到支架材料表面(圖11a，b，C)，7天后，細(xì)胞可完全浸入到支架材料內(nèi)部Γ150 μ m)，表明3組支架材料均支持細(xì)胞粘附、生長和浸潤。但進(jìn)一步對比則發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料上，大鼠MSC能很好的生長(圖1ld，e)，而在戊二醛改性材料上，大鼠MSC細(xì)胞數(shù)目明顯較前兩組減少，僅零星散在分布于材料內(nèi)部(圖Hf)。此外，浸潤細(xì)胞在本發(fā)明所述改性材料內(nèi)部分布更均勻(圖lld)，而舊方法制備的未改性材料由于基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)存在部分破壞，在基質(zhì)纖維斷裂崩塌區(qū)域，缺乏細(xì)胞分布(圖1le)。上述結(jié)果表明，相對于戊二醛改性材料，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料無明顯細(xì)胞毒性，更利于大鼠MSC生長、滲透，且京尼平改性處理不影響細(xì)胞在改性材料上生長、滲透。另外，本發(fā)明所述改性材料所具有的完整的基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)可為細(xì)胞依附提供更好的支持作用，可能更利于損傷組織的修復(fù)重建。4.細(xì)胞在支架材料上的形態(tài)學(xué)觀察分別于共培養(yǎng)4h，7d時(shí)，將共培養(yǎng)的支架材料取出，用O. OlM PBS輕輕漂洗3次，3%戊二醛溶液固定3h，再用O. OlM PBS漂洗3次，進(jìn)行冷凍干燥，固定，噴金，掃描電子顯微鏡成像，觀察細(xì)胞在支架材料上的形態(tài)學(xué)特征及生長狀況。掃描電鏡檢測結(jié)果顯示，大鼠MSC接種于3種支架材料上4h后，均可見細(xì)胞粘附于支架材料上，粘附細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞邊緣伸出短或長的絲狀偽足附著于支架的網(wǎng)狀纖維基質(zhì)上(圖12a、b、c)。大鼠MSC與3種支架材料共培養(yǎng)7d后，細(xì)胞在本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料表面增殖明顯，細(xì)胞融合在一起，所分泌的ECM覆蓋了支架上的大部分網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖12a、b)，而戊二醛改性材料表面，細(xì)胞增殖較少，細(xì)胞外基質(zhì)分泌不足(圖12c)。上述結(jié)果表明，相對于戊二醛改性材料，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料無明顯細(xì)胞毒性，更利于細(xì)胞粘附、生長，同時(shí)，本發(fā)明所述新方法中，京尼平改性處理未增加改性材料的細(xì)胞毒性，適宜細(xì)胞粘附、生長。5.支架材料的細(xì)胞毒性檢測
浸提液制備按細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)體積與支架材料質(zhì)量之比為O.1ml/mg(V/W)，將支架材料浸入細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C無菌條件下浸提24h作為浸提液。按該方法制備本發(fā)明所述改性材料、舊方法制備的未改性材料和戊二醛改性材料3種材料浸提液。將大鼠MSC制備成5xl04/ml濃度的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液和100 μ I材料浸提液，陰性對照組以100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)基代替材料浸提液，每組材料浸提液5個(gè)平行樣，置于5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,分別于ld、3d、5d、7d取出一個(gè)96孔板行，按MTT法檢測細(xì)胞活性(按說明書操作，用酶標(biāo)儀在490nm波長測定光密度值)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞相對生長率相對生長率=樣品溶液光密度值/陰性對照溶液光密度值X 100%。大鼠MSC在材料浸提液中的生長情況顯示，第ld、3d、5d、7d時(shí)，在本發(fā)明所述改性材料浸提液中的相對生長率分別% :101.6 + 13. 9%,99. 6 ± 11. 4%,97. 8 ± 10. 5%、98. 2±8. 9%，在舊方法制備的未改性材料浸提液中的相對生長率分別為102. 7±15. 1%、104. 3±9. 5%,98.1 ±8. 7%、100.1 ±13. 4%，在戊二醛改性材料浸提液中的相對生長率分別為71. 3±8· 6%,64. 0±5· 2%,66. 5±7· 8%,68. 5±10. 9% (圖 13)。因而，在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料浸提液不影響細(xì)胞的增殖活力，兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0. 05)，而戊二醛改性材料浸提液明顯抑制細(xì)胞的增殖，與前兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.05)。上述結(jié)果顯示，相對于戊二醛改性材料，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料對大鼠MSC無明顯細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的增殖，且本發(fā)明所述新方法中，京尼平改性處理未增加改性材料的細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的增殖活力。五·支架材料的體內(nèi)降解特性和免疫原性檢測(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和器材成年雄性SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，戊巴比妥鈉(P3761，Sigma),注射用青霉素鈉(40萬單位，華北制藥)，生理鹽水(500ml，西南藥業(yè))，4%多聚甲醛(AR-0211，鼎國生物)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)，兔抗⑶4多克隆抗體(sc-7219，Santa Cruz, 1:200 稀釋)，兔抗 CD8 多克隆抗體(sc-7188，Santa Cruz, 1:200 稀釋)，SABC試劑盒(SA2002，博士德)，DAB顯色試劑盒(黃)(AR1022，博士德)，外科手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械廠)，普通光學(xué)顯微鏡(Leica，德國)。(二)方法與結(jié)果皮下包埋將40只成年雄性SD大鼠(體重25(T300g)隨機(jī)分為A、B兩組，經(jīng)2%戊巴比妥鈉(45mg/kg體重)腹腔麻醉后，俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒、鋪洞巾，在背部棘突左偵U約Icm處作約Icm縱行切口，切開皮膚、皮下組織，以血管鉗在深筋膜下分離形成一小袋樣空隙，A組植入本發(fā)明所述改性材料，B組植入舊方法制備的未改性材料，另取10只大鼠平均分為兩組，分別進(jìn)行同種異體新鮮大鼠脊髓移植和不移植(假手術(shù)組)處理，作為材料免疫原性檢測的陽性和陰性對照。逐層縫合傷口，無菌敷料覆蓋切口。術(shù)畢，肌肉注射青霉素5萬單位/只，送SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。取材A、B組于術(shù)后3d、2w、6w、24w取材，同種異體新鮮大鼠脊髓移植組和假手術(shù)組于術(shù)后2w取材，每組5只。實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(45mg/kg體重)腹腔麻醉后，仰臥位固定，沿肋弓逐層剪開皮膚、皮下組織和肌肉，暴露腹腔，再剪開膈肌和心包膜，暴露心臟。剪開心包，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈并固定，同時(shí)在右心耳剪一小口。經(jīng)導(dǎo)管灌注37°C生理鹽水，待右心房流出清亮液體時(shí)，換4%多聚甲醛固定液繼續(xù)緩慢灌注，約15分鐘后大鼠全身僵硬，灌注完成，取皮下包埋標(biāo)本。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片。A、B組術(shù)后3d、2w、6w、24w的切片行HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。A、B組和同種異體新鮮大鼠脊髓移植組及假手術(shù)組術(shù)后2W的切片行CD4、OT8免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察，并 利用Image-pro-plus生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對400倍鏡下對⑶/和CT8+細(xì)胞的免疫組化照片進(jìn)行半定量的分析，計(jì)算平均光密度值(A0D值)。SABC免疫組織化學(xué)染色按說明書操作，步驟描述同前。支架材料皮下包埋后的HE染色結(jié)果顯示，3d時(shí)，A、B組材料內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，兩種材料的三維結(jié)構(gòu)基本保存完整，周圍無組織壞死(圖14a，b)；2w時(shí)，可見A、B組材料內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減少，有大量成纖維細(xì)胞浸潤，并被增生肉芽組織包裹，本發(fā)明所述改性材料三維結(jié)構(gòu)尚完整(圖14c)，舊方法制備的未改性材料明顯崩解，被增生肉芽組織分割(圖14d);6w時(shí)，可見A組殘留的改性材料進(jìn)一步被增生結(jié)締組織包裹、吸收、替代(圖14e )，而B組未改性材料已完全吸收(圖14f);24w時(shí)，A組改性材料完全降解吸收，未見殘留(圖Hg)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料均可在體內(nèi)吸收降解，且無組織壞死等排斥反應(yīng)發(fā)生，而本發(fā)明所述改性材料在體內(nèi)完全吸收時(shí)間明顯長于未改性材料，可在體內(nèi)更長時(shí)間發(fā)揮支撐、橋接作用。術(shù)后2周，ra4、CD8免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示A、B組僅有少量⑶/和CT8+細(xì)胞出現(xiàn)(圖15a，b，c，d)，數(shù)目略多于假手術(shù)組(圖15g，h)，但明顯少于同種異體新鮮大鼠脊髓移植組(圖15e，f)。CD:和CT8+細(xì)胞的平均光密度檢測結(jié)果也顯示，A、B組的⑶/和OT8+細(xì)胞平均光密度值強(qiáng)于假手術(shù)組(P〈0. 05)，但明顯弱于同種異體新鮮大鼠脊髓移植組(P〈0. 01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。而A、B組間，A組⑶/和CT8+細(xì)胞平均光密度值均低于B組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。平均光密度值檢測結(jié)果見表I。上述檢測結(jié)果表明，本發(fā)明所述改性材料和舊方法制備的未改性材料的免疫原性較同種異體新鮮大鼠脊髓已大大降低，免疫原性微弱，由于脫細(xì)胞更徹底，本發(fā)明所述改性材料的免疫原性略低于舊方法制備的未改性材料，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表I大鼠皮下包埋2w后⑶/和⑶/細(xì)胞平均光密度值
權(quán)利要求
1.一種改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料，其特征在于所述材料是在化學(xué)去垢劑和京尼平的聯(lián)合作用下脫去細(xì)胞及髓鞘成分并交聯(lián)改性為具有仿生三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和高孔隙率的脊髓支架材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料，其特征在于所述材料為來源于大鼠脊髓組織的脫細(xì)胞脊髓生物衍生材料。
3.權(quán)利要求1所述的改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料的制備方法，其特征在于，有以下步驟 (1)取凍存的大鼠脊髓，3 5°C條件下在超純水中浸泡6 8h; (2)3 5°C條件下在10%氯化鈉溶液中浸泡6 8h ; (3)重復(fù)步驟(I) (2)； (4)在1%TritonX-1OO溶液中振蕩脫細(xì)胞4 5h ； (5)在O.OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次； (6)在I%脫氧膽酸鈉溶液中振蕩脫細(xì)胞4 5h ; (7)在O.OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次； (8)3 5°C條件下在5g / L京尼平溶液中化學(xué)交聯(lián)處理24 28h ； (9)在O.OlM PBS中振蕩漂洗3 4h，每小時(shí)更換PBS I次； (10)-500C，真空度300 μ bar條件下冷凍干燥24 28h ； (11)密封，60Co(16kGy)輻照滅菌，_20°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于振蕩條件是20 25°C，轉(zhuǎn)速為10(Γ120轉(zhuǎn) /min0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改性大鼠脫細(xì)胞脊髓支架材料及制備方法，本發(fā)明所述制備方法優(yōu)化了脊髓脫細(xì)胞技術(shù)，增加了化學(xué)交聯(lián)處理，其制備的材料三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更完整，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及抗酶解能力更強(qiáng)，該材料在去除脊髓內(nèi)細(xì)胞和髓鞘成分基礎(chǔ)上有效保留了細(xì)胞外基質(zhì)，具有高度仿生的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和高孔隙率，免疫原性微弱，細(xì)胞相容性、生物相容性和生物安全性良好，利于在體內(nèi)移植中實(shí)現(xiàn)等位移植和解剖移植，適用于脊髓修復(fù)重建研究。
文檔編號(hào)A61L27/36GK103007350SQ201210540489
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者蔣濤, 任先軍, 陰洪 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院