两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):919601閱讀:355來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域,具體的說(shuō)是一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)
國(guó)際水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展表明疫苗是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)病害防控最為有效的措施之一。目前魚(yú)類(lèi)疫苗主要包括滅活疫苗、重組亞單位疫苗、核酸疫苗、減毒疫苗等類(lèi)型,其中亞單位疫苗的應(yīng)用通常需要免疫佐劑。疫苗佐劑是非特異性的免疫因子/試劑,其主要功能是協(xié)助疫苗刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng),從而增強(qiáng)疫苗誘發(fā)的特異性免疫保護(hù)效應(yīng)。研究表明細(xì)菌的鞭毛蛋白能夠通過(guò)與Toll樣受體結(jié)合而激活天然免疫系統(tǒng),因此具有免疫佐劑的潛能。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)屬于`革蘭氏陰性菌,是弧菌病的誘發(fā)因子。鰻弧菌表達(dá)5個(gè)鞭毛蛋白,即FlaA,F(xiàn)laB,F(xiàn)laC,F(xiàn)laD,和FlaE,但這些鞭毛蛋白的免疫效應(yīng)尚不清楚。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)鰻弧菌鞭毛蛋白FlaE能夠顯著提高亞單位疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng),因此具有良好的疫苗佐劑功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用,鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應(yīng)用。所述鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE重組過(guò)程為,以鰻弧菌C312為模板,采用EF/ER為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物與載體PET259連接,連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α,篩選質(zhì)粒pEFlaE,質(zhì)粒pEFlaE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3),即得到鞭毛蛋白FlaE ;所述引物為FE :5’_CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’ ;RE :5’ -CCCGGG GCGAAGTAAGGCCAATG-3’。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的鰻弧菌鞭毛蛋白作為佐劑可提高疫苗的保護(hù)效應(yīng)至20%以上。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的鞭毛蛋白(泳道2)。泳道1,分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述,而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相
應(yīng)試劑盒。 2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001);3.所有限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京,紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實(shí)施例1鰻弧菌鞭毛蛋白為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示(參見(jiàn)序列表I)。序列表IMAITVNTNVSALIAQRHLGSASEMLNQSLERLASGKRINSAKDDAAGLQISNRLESQMRGLDVAVRNANDGISIMQTAEGAMQETTSLLQRMRDLSLQSANGAN·SKADRQALQEEMGALNDELNRIAETTSFGGRKLLNGSFGQSSFQIGASSGEAVQVSLKNMRSDSLDMGGFSYVAAGMADSQWRVTQDNRQLTMSYTDAKGKQHNIQIQAKVGDDIEELATYINGQTDKVSASVNDKGQLQLFMAGKETSGTIDFKGSLANQLQMNVTGYEAVDTLDITEVGGAQRAVAVIDTAMQYVDSHRSELGALQNRFNHAINNLDNVHENLASSNSRIKDTDYAKETTQMVKQQILQQVSTSILAQAKKQPNLALALLR(a)序列特征 長(zhǎng)度377 類(lèi)型氨基酸序列籲鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(C)假設(shè)否(d)反義否Ce)最初來(lái)源鰻弧菌C312(f)特異性名稱(chēng)鞭毛蛋白FlaE結(jié)構(gòu)特征該蛋白具有一個(gè)Flagellin_N結(jié)構(gòu)(氨基酸5 — 143),—個(gè)Flagellin_IN結(jié)構(gòu)(氨基酸194-249)和一個(gè)Flagellin_C結(jié)構(gòu)(氨基酸291-376)。鰻弧菌鞭毛蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法質(zhì)粒pEFlaE的構(gòu)建以鰻弧菌C312為模板,采用FE/RE為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鰻弧菌鞭毛蛋白FlaE基因(該基因序列已被報(bào)道。具體參見(jiàn) Naka H, Dias GM, Thompson CC, Dubay C, Thompson FL, Crosa JH. Completegenome sequence of the marine fish pathogen Vibrio anguillarum harboring thepJMl virulence plasmid and genomic comparison with other virulent strainsof V. anguillarum and V. ordali1.1nfect Tmmun 2011;79:2889 - 900)。PCR 條件為94° C 60s 預(yù)變性模板 DNA,然后 94。C 40s,50。C 60s, 72° C 60s,5 個(gè)循環(huán);然后94° C 40s, 62。C 60s, 72° C 60s, 25 個(gè)循環(huán)后再在 72。C 延伸反應(yīng) lOmin。PCR 產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。將載體pET259 (pET259構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)Zheng, W.J.,Hu,Y.H. , Sun, L. , 2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit fromturbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Tmmunol. 28, 829 - 836)用 SwaI 酶切后回收5. 4kb片段,將其與上述純化的PCR片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時(shí),連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α,在含卡那霉素(30ug/mL)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí),篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒,即為質(zhì)粒pEFlaE。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化鈉,97. 5%蒸餾水;所述鰻弧菌C312保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC,保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6250,保藏日期2012. 6. 21,分類(lèi)命名為鰻弧菌(Vibrioanguillarum),保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。所述引物為FE :5’ -CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’ 和 RE :5, -CCCGGGGCGAAGTAAGGCCAATG-3,。實(shí)施例2鞭毛蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將上述的質(zhì)粒pEFlaE用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購(gòu)自于“天根生化科技有限公司”,北京),在含有卡那霉素(30ug/mL)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí),挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子,將其命名為BL21/pEFlaE。將BL21/pEFlaE于含有卡那霉素(30ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng);取ImL過(guò)夜后的培養(yǎng)液,加入IOOmL新鮮的含有卡那霉素(30ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,于37° C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至OD6tltl為O. 6,加入終濃度為O. 3mM的IPTG,30°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動(dòng)培養(yǎng)5_6h,而后以5000g,4° C離心lOmin,收集菌液,加入5mL裂解液,在室溫于搖床上緩慢搖動(dòng)1_2小時(shí),直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g,4° C離心30min,回收上清。將上清中的蛋白親和層析柱His Trap HP Columns (購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司)回收純化,純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)(8v/cm電壓下電泳25 — 30min,隨后15v/cm電壓下電泳2 —2. 5h),測(cè)定其分子量大小(參見(jiàn)圖1)。將純化的蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析,其的蛋白質(zhì)質(zhì)量、結(jié)構(gòu)與FlaE相同,證實(shí)其為具有FlaE序列的鞭毛蛋白。所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2PO4UOmMTris 和 8M 尿素,pH 8.0。 實(shí)施例3鞭毛蛋白作為佐劑的應(yīng)用步驟I)佐劑及疫苗混合液的制備。疫苗混合液制備將上述實(shí)施例純化的鞭毛蛋白在PBS中稀釋至160ug/mL,命名為FlaE ;將遲緩愛(ài)德華氏菌疫苗rEsal (其具體制備過(guò)程見(jiàn)Sun Y,LiuC,Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiellatarda DNA vaccine encoding a D15_like surface antigen. Fish ShellfishImmunol2011;30:273-9)在PBS中稀釋至160ug/mL,命名為rEsal ;將稀釋后的鞭毛佐劑與疫苗rEsal等體積混合,經(jīng)混合液命名為rEsal + FlaE。所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)0. 8% NaCl, 0. 02% KCl, 0. 358% Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4,余量為水。步驟2)免疫應(yīng)用。將120條牙鲆(每條重約12. 7g)隨機(jī)分為4組,每組30條。將這4組分別命名為A、B、C和D組。將A、B和C組的每條魚(yú)分別腹腔注射IOOul上述步驟O的FlaE,rEsal和rEsal + FlaEjf D組的每條魚(yú)分別腹腔注射IOOul PBS (對(duì)照組)。步驟3)遲緩愛(ài)德華氏菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛(ài)德華氏菌TXl至0D_為0. 8,然后離心(5000g,4° C) IOmin0收集菌體,將其懸浮于PBS中至終濃度為5xl04cfu/mLo所述菌株遲緩愛(ài)德華氏菌TXl保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCC No. 2330,保藏日期為2008年I月9日,分類(lèi)命名為遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda),保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路。步驟4)疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟2)免疫注射后的第30天,用上述步驟3)的遲緩愛(ài)德華氏菌懸液腹腔注射步驟2)的4組魚(yú),每條魚(yú)的注射量為IOOul。在以后的20天中,每天觀察并記錄各組魚(yú)的死亡情況。20天后,統(tǒng)計(jì)各組魚(yú)的總死亡數(shù)目A組,18條;B組,12條;C組,5條;D組,23條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS)RPS=100x(l 一免疫組魚(yú)的總死亡百分比/對(duì)照組魚(yú)的總死亡百分比)根據(jù)此公式算出FlaE,rEsal和rEsal + FlaE的免疫保護(hù)效率分別為21. 8%, 47. 8%和78. 2%,其中rEsal +FlaE的免疫保護(hù)效率(即78. 2%)顯著(P〈0. 05)高于rEsal的免疫保護(hù)效率(即47. 8%)0因此,所得重組鞭毛蛋白能顯著提高疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用,其特征在于鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應(yīng)用。
2.按權(quán)利要求1所述的鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用,其特征在于所述鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE重組過(guò)程為,以鰻弧菌C312為模板,采用EF/ER為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物與載體pET259連接,連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5,篩選質(zhì)粒pEFlaE,質(zhì)粒pEFlaE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3),即得到鞭毛蛋白 FlaE ;所述引物為 FE :5’-CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC_3’;RE :5’ -CCCGGG GCGAAGTAAGGCCAATG-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域,具體的說(shuō)是一種鰻弧菌重組蛋白的應(yīng)用。鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應(yīng)用。重組鞭毛蛋白FlaE構(gòu)建過(guò)程為以鰻弧菌C312為模板,采用PCR擴(kuò)增鞭毛蛋白基因,PCR產(chǎn)物與載體pET259連接,獲質(zhì)粒pEFlaE,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得表達(dá)鞭毛蛋白的菌株BL21/pEFlaE,通過(guò)親和層析純化獲得重組鞭毛蛋白。本發(fā)明的鰻弧菌鞭毛蛋白作為佐劑可提高疫苗的保護(hù)效應(yīng)至20%以上。
文檔編號(hào)A61K39/39GK103041386SQ20121044527
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者孫黎, 賈盼盼, 胡永華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
临泉县| 江安县| 梓潼县| 台南市| 曲沃县| 北宁市| 兴业县| 民乐县| 阳信县| 中江县| 金秀| 永顺县| 濮阳县| 井冈山市| 赤水市| 娄底市| 息烽县| 阿勒泰市| 昭觉县| 河源市| 泰顺县| 扬州市| 温州市| 白城市| 容城县| 元谋县| 化隆| 陵川县| 呈贡县| 金门县| 沙河市| 云阳县| 桐梓县| 贵溪市| 鄄城县| 民乐县| 木里| 丁青县| 读书| 固原市| 磐安县|