專利名稱：一種Tat PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種Tat PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應(yīng)用，屬于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮抑素(Endostatin, ES)是1997年O' Reilly等首次發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的強(qiáng)效抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，ES可特異性抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，并對(duì)多種起源的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成有抑制作用，且不影響靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞，無耐藥性，毒副作用小。我國(guó)已將血管內(nèi)皮抑素衍生物研制成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)家一類新藥 Endostar (恩度，YH16)，用以治療非小細(xì)胞肺癌。此外研究者們?cè)贓S防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。但是ES仍舊存在一些缺點(diǎn)，由于其體內(nèi)半衰期短，入胞能力差，臨床上的使用劑量較大，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如果能夠通過一定的手段提高其穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期、并增加其入胞能力達(dá)到提高其體內(nèi)活性從而減少給藥劑量或延長(zhǎng)給藥周期，將會(huì)大大提高ES的治療效果，促進(jìn)其在臨床上的應(yīng)用。能夠穿透細(xì)胞膜的Tat蛋白可能幫助解決使藥物透過眼球屏障進(jìn)入作用部位問題。Tat蛋白來源于人類免疫缺陷病毒HIV-I的反式激活因子，1988年Maurice和Paul發(fā)現(xiàn)Tat蛋白能夠跨膜遞送入細(xì)胞，1997年Vives等證明Tat蛋白中有一段富含堿性氨基酸、帶有正電荷的多肽片段(Tat蛋白中47-57位氨基酸序列片段)與其轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)，并稱之為Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，其序列是YGRKKRRQRRR。到目前為止研究表明，Tat PTD能夠運(yùn)載蛋白多肽、外源基因、脂質(zhì)體、無機(jī)分子等多種物質(zhì)有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。與其他運(yùn)輸載體相比，TatPTD具有其優(yōu)越性(I)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不受連接物大小的限制，且對(duì)其運(yùn)輸?shù)摹柏浳锓肿印钡幕钚圆划a(chǎn)生影響；(2)在一定范圍內(nèi)不會(huì)造成細(xì)胞損傷，不具有明顯的免疫原性、抗原性和致炎性；(3)能穿透血腦屏障，有望解決大分子藥物進(jìn)入生物屏障結(jié)構(gòu)發(fā)揮療效的問題。此外，Tat PTD與大分子蛋白質(zhì)相連以后，從結(jié)構(gòu)上來看，也可以理解為對(duì)大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行了一定的化學(xué)修飾，延長(zhǎng)了肽鏈，有望增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)生物半衰期，也有利于提聞其在治療腫瘤等疾病的療效。本發(fā)明利用穿膜肽Tat PTD的穿膜作用和內(nèi)皮抑素的抑制新生血管的生成作用，將二者通過基因工程的手段融合在一起，以期獲得能夠穿透細(xì)胞膜甚至是血腦屏障或眼球屏障的內(nèi)皮抑素，達(dá)到通過簡(jiǎn)單的局部滴眼給藥預(yù)防眼部血管增生的目標(biāo)。這一研究對(duì)探索大分子蛋白質(zhì)眼部給藥的新途徑和視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變的防治具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種Tat PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方
法與應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種Tat PTD-Endostatin重組蛋白，是由人類免疫缺陷病毒(HIV-I)的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域和人內(nèi)皮抑素構(gòu)成的融合蛋白，其中，人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Tat PTD)的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，人內(nèi)皮抑素(Endostatin)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明還提供了能夠表達(dá)Tat PTD-ES融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ IDNO. 3 (Tat PTD)和SEQ ID NO. 4 (Endostatin)所示的序列或編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡(jiǎn)并性的序列。所述Tat PTD-Endostatin重組蛋白可以通過酵母或大腸桿菌體系表達(dá),方法如下采用酵母表達(dá)Tat PTD-Endostatin重組蛋白的方法,步驟如下(I)常規(guī)方法制備含有編碼Tat PTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的TatPTD-ES融合基因，并擴(kuò)增； (2)用限制性內(nèi)切酶EcoR I ,Not I分別酶切質(zhì)粒pGAPZ a A和Tat PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶連接；(3)上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測(cè)序分析鑒定重組質(zhì)粒pGAPZ a A/Tat PTD-Endostatin,最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A/Tat PTD-Endostatin ；(4)制備感受態(tài)的酵母菌GS115，重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A/Tat PTD-Endostatin單酶切線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)的GSl 15菌中，同時(shí)以不含Tat PTD-Endostatin的pGAPZ a A電轉(zhuǎn)作對(duì)照，在含Zeocin的LB平板上培養(yǎng)2_3天篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；(5)上述陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵，分離純化得到發(fā)酵產(chǎn)物，鑒定發(fā)酵產(chǎn)物，即為TatPTD-Endostatin 重組蛋白。所述步驟(4)中的酵母菌株為畢赤酵母或釀酒酵母。采用大腸桿菌表達(dá)Tat PTD-Endostatin重組蛋白的方法,步驟如下(I)常規(guī)方法制備含有編碼Tat PTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的Tat PTD-ES融合基因，并擴(kuò)增；(2)用限制性內(nèi)切酶Nde I ,BamH I分別酶切質(zhì)粒pET28a和Tat PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶連接；(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測(cè)序分析鑒定重組質(zhì)粒pET28a/Tat PTD-Endostatin,最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/TatPTD-Endostatin ；(4)制備感受態(tài)的大腸桿菌Rossetta感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化入Rossetta感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB平板上培養(yǎng)16h，篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；(5)上述陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵，分離純化得到發(fā)酵產(chǎn)物，鑒定發(fā)酵產(chǎn)物，即為TatPTD-Endostatin 重組蛋白。所述步驟(5)具體如下①I挑選陽性轉(zhuǎn)化子，過夜培養(yǎng)后，按I :100 (體積比)接入LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至 OD600 為 O. 8-1. O (約 6h)，加入 IPTG (加入后的濃度為 O. 25mmol/L), 37°C, 200r/min,誘導(dǎo)6h，收菌；②將菌體超聲破壁(或采用高壓分散、酶裂解法破碎細(xì)胞)，采用SDS-PAGE對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定；③包涵體復(fù)性菌體超聲后離心得包涵體，采用稀釋復(fù)性或透析復(fù)性或超濾復(fù)性法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性；④分離純化Tat PTD-Endostatin融合蛋白將復(fù)性成功的蛋白質(zhì)經(jīng)親和層析或離子交換層析進(jìn)行純化，除鹽后得純度較高的目的蛋白。所述③中復(fù)性的具體方法如下菌體破壁(采用高壓分散、酶裂解法或超聲波法破碎細(xì)胞)后，IOOOOg離心30min,棄去上清得到包涵體；采用含去污劑的尿素或鹽酸胍溶液洗滌多次去除粘附的雜蛋白(去污劑溶液的濃度使其能夠溶解干擾的細(xì)胞蛋白質(zhì)和膜成分、而不溶解包涵體)；然后采用變性液對(duì)包涵體進(jìn)行溶解(包涵體在變性條件下溶解)，在室溫?cái)嚢?h后，IOOOOg離心30min，上清為包涵體溶液；然后，將包涵體溶解的、變性的無生物活性的蛋白質(zhì)復(fù)性，使其能夠折疊形成可溶的、有生物活性的構(gòu)象。所述去污劑溶液為濃度不大于2mol/L的尿素或不大于I. 5M的鹽酸胍，去污劑溶液中含有 Tritonx-100，濃度為 O. 5% (v/v)。所述變性液為5-7M濃度的鹽酸胍或6-8M濃度的尿素。 所述變性液對(duì)包涵體的溶解在還原條件下進(jìn)行。所述還原條件是指使用還原試劑，所使用的還原試劑為二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇。所述復(fù)性是通過降低變性試劑的濃度(通過緩慢地連續(xù)或逐步稀釋溶解液來降低變性試劑的濃度)至無變性作用或弱變性作用的水平來復(fù)性。所述復(fù)性時(shí)，復(fù)性緩沖液中含有至少一種還原和氧化形式的硫醇成分，硫醇成分為 GSH/GSSG。所述④中，復(fù)性成功后采用親和層析或陽離子交換層析純化目的蛋白質(zhì)。親和層析采用Ni離子親和層析，緩沖液ΡΗ5-11。陽離子交換層析采用CM-Sepharose, SP-Sepharose,緩沖液 ρΗ7_9。所述除鹽為采用G25-S印hadex，超濾，或透析的方法除鹽。本發(fā)明的TatPTD-Endostatin融合蛋白，能夠用于治療新生血管生成引起的各種疾病，包括眼部血管增生性疾病及各種腫瘤，如糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變，非小細(xì)胞肺癌
坐寸ο本發(fā)明采用酵母和大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)了 Tat PTD-ES融合蛋白，采用SDS-PAGE和Western Blot進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，并采用Ni離子親和層析分離純化后得到了純度比較高的TatPTD-ES融合蛋白，并通過CCK-8法驗(yàn)證了其抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EAHY926 )增殖的活性。本發(fā)明的Tat PTD-Endostatin融合蛋白，保留了內(nèi)皮抑素抑制新生血管的生成作用，具有較強(qiáng)的穿過細(xì)胞膜的特性，具有穿透體內(nèi)生理屏障如血腦或眼球屏障的潛力用，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、易透過血腦屏障、眼球屏障的優(yōu)點(diǎn)，克服了內(nèi)皮抑素的穿膜效果差的局限性，可發(fā)揮更好的抑制新生血管細(xì)胞生成的作用，可透過血腦屏障治療腦部腫瘤，或通過簡(jiǎn)單的局部滴眼給藥達(dá)到預(yù)防視網(wǎng)膜血管增生的目標(biāo)。


圖I為Tat PTD-ES融合基因和Endostatin基因的PCR圖譜，其中泳道I為Endostatin 的PCR產(chǎn)物，泳道2、3均為 Tat PTD-Endostain基因的 PCR產(chǎn)物，M為 DNA Marker
I (600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp)。圖2為重組質(zhì)粒的酶切后圖譜，其中泳道Ml為DNA MarkerMl (600bp, 500bp,400bp, 300bp, 200bp, IOObp)，泳道 1、3 均為 pGAPZa A/Tat PTD-Endostatin 重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物，泳道23為pGAPZ αΑ/Endostatin重組 質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物，泳道M2為IkbDNALadder(10000bp8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)。圖3為驗(yàn)證重組質(zhì)粒時(shí)的PCR圖譜,其中泳道I以重組質(zhì)粒pGAPZ a A/Endostatin為模板的PCR產(chǎn)物，泳道2、3均為以重組質(zhì)粒pGAPZ a A/Tat PTD-Endostatin為模板的PCR產(chǎn)物，泳道 M 為 DNA Marker I (600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp)。圖4為重組質(zhì)粒pGAPZ a A/Tat PTD-Endostatin的測(cè)序結(jié)果。圖5為發(fā)酵液上清的SDS-PAGE電泳圖譜，其中泳道I為蛋白質(zhì)Marker (94. OKDa,66. 2KDa、45. 0KDa、33. 0KDa、26. 0KDa、20. 0KDa、14. 4KDa)、2 為畢赤酵母菌含空質(zhì)粒發(fā)酵液的上清液，3、4為表達(dá)Tat PTD-ES的陽性畢赤酵母菌發(fā)酵的上清液，5為表達(dá)Endostatin的陽性畢赤酵母菌發(fā)酵的上清液。圖6為重組質(zhì)粒pET28a/Tat PTD-ES的測(cè)序結(jié)果。圖7為大腸桿菌超聲破壁后的SDS-PAGE結(jié)果，其中泳道I為Es包涵體；2、3. TatPTD-ES包涵體；4.空質(zhì)粒；5.空菌株；6. Marker ；7.空質(zhì)粒上清；8. Tat PTD-ES上清；9. Es上清。圖8為大腸桿菌包涵體經(jīng)復(fù)性分離純化后所得樣品的SDS-PAGE電泳圖譜，其中泳道1，泳道2為蛋白質(zhì)Marker，泳道3為經(jīng)分離純化后的樣品。圖9為純化后的重組蛋白對(duì)EAHY926細(xì)胞增殖的抑制作用。圖10為純化后的重組蛋白對(duì)雞胚尿囊膜血管生成抑制作用的影響，A為生理鹽水組為陰性對(duì)照；C為Tat PTD-ES組；D為ES組。圖11為純化后的重組蛋白入胞能力的考察，其中，A為ES，B為Tat PTD-ES0
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I采用酵母表達(dá)體系表達(dá)Tat PTD-ES融合蛋白a. Tat PTD-ES融合基因的擴(kuò)增將編碼Tat-PTDlI個(gè)氨基酸的33個(gè)密碼及選定的酶切位點(diǎn)(EcoR I )設(shè)計(jì)到上游引物的Y端，用PCR技術(shù)從含有Endostatin的pGAPZaA質(zhì)粒(本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室擁有，常規(guī)方法構(gòu)建得到的)中擴(kuò)增Tat PTD-ES融合基因，擴(kuò)增得到的融合基因片段為600左右，其PCR結(jié)果見圖I。b.構(gòu)建含有Tat PTD-ES融合基因的表達(dá)質(zhì)粒①PGAPZaA酵母表達(dá)質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取DH5a常規(guī)活化后制備感受態(tài)，取PGAPZa A質(zhì)粒DNA熱激法轉(zhuǎn)化DH5 a，轉(zhuǎn)化后將菌液涂布于含Zeocin (25 μ g/ml)的低鹽LB平板中，次日挑取單菌落，擴(kuò)增，并用試劑盒抽提質(zhì)粒。②Tat PTD-ES基因的亞克隆EcoR I ,Not I雙酶切含Tat PTD-ES基因融合基因及pGAPZaA空質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后回收Tat PTD-ES融合基因與3kb的pGAPZ α A質(zhì)粒，加入Τ4連接酶buffer，室溫連接過夜。次日取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，并涂布于含Zeocin(25 μ g/ml)的低鹽LB平板中。同時(shí)轉(zhuǎn)化不含Tat PTD-ES基因的pGAPZ a A作為空白對(duì)照。③Tat PTD-ES亞克隆的篩選及鑒定從Zeocin低鹽LB平板中挑選單克隆，接種于含Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基中，37°C避光培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA，分別以酶切、PCR法篩選含有Tat PTD-ES的重組表達(dá)載體工程菌。酶切結(jié)果見圖2，PCR結(jié)果見圖3，篩選的陽性克隆質(zhì)粒由大連寶生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖4，結(jié)果表明序列正確。c. TatPTD-ES 蛋白的表達(dá)①電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)制備感受態(tài)的畢赤酵母菌GS115，重組酵母表達(dá)質(zhì)粒PGAPZaA單酶 切線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)的GSl 15菌中，同時(shí)以不含Tat PTD-ES的pGAPZα A電轉(zhuǎn)作對(duì)照。將電轉(zhuǎn)后的GS115菌株涂布于含Zeocin (100 μ g/ml)的YPDS平板中，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天至長(zhǎng)出白色單菌落，從含Zeocin的LB平板上挑取單菌落至2mlYPD培養(yǎng)基中，30°C搖床中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，-80V凍存。②PCR及SDS-PAGE篩選陽性表達(dá)菌電轉(zhuǎn)后的單克隆凍存菌10 μ I經(jīng)過過夜活化后，以I :100接種于IOOmlYro培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至第4天時(shí)，取發(fā)酵液，分別進(jìn)行PCR及SDS-PAGE驗(yàn)證，SDS-PAGE結(jié)果見圖5，由結(jié)果可得篩選的陽性菌落能表達(dá)TatPTD-ES融合蛋白，其分子量在20KD左右。d. Tat PTD-ES融合蛋白的分離純化取第四天的重組畢赤酵母菌發(fā)酵液高速離心(8000r/min，20min),取上清液采用鎳離子親和層析和S印hadexG25從畢赤酵母表達(dá)上清液中分離純化Tat PTD-ES融合蛋白，純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，表明采用鎳離子親和層析和SephadeXG25可以將TatPTD-ES融合蛋白從發(fā)酵液中分離出來。實(shí)施例2采用大腸桿菌表達(dá)Tat PTD-ES融合蛋白a.雙酶切融合基因及空質(zhì)粒采用Nde I、BamH I對(duì)Tat PTD-ES融合基因(常規(guī)方法構(gòu)建得到)及選用的大腸表達(dá)的pET28a進(jìn)行雙酶切，并分別進(jìn)行片段回收。b.融合基因與質(zhì)粒的連接在連接體系中將回收的目的基因與質(zhì)?；靹?，4°C孵育過夜，連接產(chǎn)物用于下一步轉(zhuǎn)化。c.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞200 μ I加入上述連接反應(yīng)液，混勻，冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴2min，加入O. 8ml LB培養(yǎng)基，37°C孵育lh，將孵育液涂布于LK平板上，37°C培養(yǎng)12 16h。d.陽性重組子的鑒定隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)具有Kan抗性的轉(zhuǎn)化子菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)、小量擴(kuò)增后，抽提重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖6，結(jié)果表明序列正確。e.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入工程菌株中將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，采用熱激法轉(zhuǎn)入Rossetta菌株中，涂布LB平板(Kan 50 μ g/ml)，平板于37°C培養(yǎng)16_24h ； f.待平板上長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。g.挑選陽性轉(zhuǎn)化子，過夜培養(yǎng)后，按1:100接入LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為 O. 8-1. 0(約 6h),加入 IPTG (加入后的濃度為 O. 25mmol/L)，37°C，200r/min，誘導(dǎo) 6h，收菌。h.將菌體超聲破壁后，采用SDS-PAGE和Western Blot對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定。實(shí)施例3大腸桿菌表達(dá)的包涵體蛋白復(fù)性的工藝流程a.包涵體溶解菌體破壁超聲后，IOOOOg離心30min，棄去上清得到包涵體；采用含去污劑的尿素或鹽酸胍溶液洗滌多次以去除粘附的雜蛋白；然后采用變性液對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，在室溫?cái)嚢?h后，IOOOOg離心30min，上清為包涵體溶液。去污劑溶液為濃度2mol/L的尿素，去污劑溶液中還含有Triton χ-100，濃度為O. 5%(ν/ν)。變性液含有20-100mmol/LTris/HCl、8mol/L 尿素、5mmol/LEDTA 及 10mmol/LDTT。SDS-PAGE 結(jié)果如圖 7 所示。b.蛋白復(fù)性復(fù)性緩沖液經(jīng)過濾后，將包涵體裂解液在攪拌得同時(shí)緩慢滴入復(fù)性緩沖液中，復(fù)性體系的蛋白終濃度為O. 01-0. 2mg/ml,然后將混合物置于4°C下復(fù)性10-50h。復(fù)性緩沖液為ρΗ7· 0-9. 0，20-100mmol/Ltris/HCl、2mol/L 尿素、5mmol/L EDTA,lmmol/L GSSG、0. 2mmol/L GSH。c.分離純化Tat PTD-ES融合蛋白將復(fù)性成功的蛋白質(zhì)經(jīng)Ni離子交換層析進(jìn)行純化，除鹽后得純度較高的目的蛋白，如圖8所示。實(shí)施例4Tat PTD-ES融合蛋白的生物活性研究 考察TatPTD-ES抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活性以Es為陰性對(duì)照，采用CCK-8法考察純化后的Tat PTD-ES抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，具體實(shí)施步驟如下將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EAHY926)的凍存液在37°C水浴鍋內(nèi)快速融化，1000r/min離心15min，棄上清，沉淀細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸并輕輕吹打混勻，形成細(xì)胞懸液，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后接種于培養(yǎng)瓶中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(5%0)2，37°0培養(yǎng)24h，換液，以后每2 3天換液一次。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞用PBS清洗兩遍，然后加入0. 25%胰蛋白酶f2mL，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞回縮變圓時(shí)，立即將胰蛋白酶吸出或倒掉，加入含15%小牛血清的培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使大部分細(xì)胞脫落形成細(xì)胞懸液，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后以IO5AiL密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。采用CCK-8法測(cè)定純化后ES抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為I. O X IO4/孔，分于96孔板，每孔200 μ L，置于37°C、5%C02的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁；加入藥物(純化后的Tat PTD-ES設(shè)6個(gè)濃度梯度5 μ g/mL、20 μ g/mL、75 μ g/mLUOO μ g/mL、200 μ g/mL，用培養(yǎng)基稀釋，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；小心吸取上清，PBS洗滌，再次離心，棄上清，加入200 μ L新鮮培養(yǎng)基；每孔加入CCK-8溶液10 μ L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)2h后終止培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定各孔吸光度(A49tl)值，并計(jì)算其抑制率抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A49tl/對(duì)照組A49tl)] X 100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)五次，取平均值。不同濃度純化后的Tat PTD-ES對(duì)HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用見圖9，結(jié)果顯示純化后的Tat PTD-ES融合蛋白對(duì)HUVEC有明顯的抑制作用，隨著濃度的增大抑制作用增強(qiáng)，具有濃度依賴性，當(dāng)濃度增大到200 μ g/mL時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞大部分被抑制，抑制率達(dá)到86. 45%ο實(shí)施例5Tat PTD-ES雞胚絨毛尿囊膜血管(CAM)生成的作用
a.孵育CAM的方法，方法如下選擇來源于受精率大于90%的種雞廠、生長(zhǎng)良好的白皮種蛋(表面清潔光滑、蛋殼均勻、蛋形規(guī)范、氣孔氣室均勻)，用溫水清洗3次后，在1%。的苯扎溴酹溶液中浸泡Imin消毒后置于隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度(37±1) V,培養(yǎng)箱內(nèi)放入水盤以保持40°/Γ60%相對(duì)空氣濕度，并保持一定的通風(fēng)換氣條件。雞蛋氣室向上，長(zhǎng)軸與蛋托約呈70° -80°角。每天轉(zhuǎn)蛋3次，轉(zhuǎn)蛋角度以水平位置前俯后仰各45°為宜。雞胚孵育3天后，用照蛋燈照蛋，挑選出發(fā)育良好的雞胚。將其移至超凈臺(tái)內(nèi)，用75%酒精消毒后晾干。用牙科鉆或砂輪在蛋殼表面劃刻出凹痕，用尖針在種蛋氣室表面扎一小孔，在凹痕處滴少量生理鹽水，用吸耳球?qū)?zhǔn)氣室表面的小孔輕輕吸氣，此時(shí)可看到凹陷處的生理鹽水下陷，即該處CAM下陷，形成假氣室(區(qū)別于蛋自身的氣室)。用滅菌透明膠帶封閉假氣室，制備假氣室后穩(wěn)定48h。b.給藥方法將雞胚按重量隨機(jī)分組，生理鹽水組，陰性對(duì)照組bFGF 20 μ L(50AU) / 只 Es 組Es (50 μ g/mL) 100 μ L+bFGF 20 μ L (50AU) / 只；Tat PTD-ES (50 μ g/mL) +bFGF 20 μ L (50AU)/只。將穩(wěn)定48h的種蛋假氣室上的透明膠帶揭開，按上述劑量將供試液直接加到雞胚絨毛尿囊膜上，注意小心加藥，盡量使藥物集中于一點(diǎn)上。加藥后用無菌透明膠帶封口，標(biāo)記后放入溫度(37 ± I) V的培養(yǎng)箱中，保持40 % -60 %的相對(duì)空氣濕 度，繼續(xù)培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。Tat PTD-ES雞胚絨毛尿囊膜血管(CAM)生成的作用結(jié)果見圖10，與陰性對(duì)照組相比，Tat PTD-ES組的血管數(shù)目明顯小于陰性對(duì)照組，表明Tat PTD-ES能明顯抑制CAM血管的生成，且與Es沒有顯著性差異。實(shí)施例6熒光顯微鏡考察重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞的能力將EAHY926內(nèi)皮細(xì)胞接種于12孔板中(I X 104cells/well)，加入無血清DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含 FITC-Es、FITC-Tat PTD-ES,各用藥組按照蛋白濃度 IOOyg protein/mL) lmL。置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，孵育2h后用冰凍的PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察TatPTD-ES及ES的入胞情況。Tat PTD-ES的入胞結(jié)果見圖11，由結(jié)果可得，Tat PTD-ES進(jìn)入細(xì)胞的能力較好，具有能夠穿透生理屏障的潛力。上述活性實(shí)驗(yàn)研究證明本發(fā)明表達(dá)的TatPTD-ES融合蛋白保留了 Endostatin的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，有望用于治療由新生血管生成引起的各種疾病，包括眼部血管增生性疾病及各種腫瘤，如糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變，非小細(xì)胞肺癌等，甚至有望比Endostatin更好的發(fā)揮療效。
權(quán)利要求
1.一種TatPTD-Endostatin重組蛋白，其特征在于是由人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域和人內(nèi)皮抑素構(gòu)成的融合蛋白，其中，人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，人內(nèi)皮抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.一種表達(dá)Tat-ES融合蛋白的DNA序列，其特征在于其具有SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4所示的序列或編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡(jiǎn)并性的序列。
3.一種采用酵母表達(dá)Tat PTD-Endostatin重組蛋白的方法,其特征在于步驟如下 (1)常規(guī)方法制備含有編碼TatPTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的Tat PTD-ES融合基因； (2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、Not I分別酶切質(zhì)粒pGAPZ a A和Tat PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶連接； (3)上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測(cè)序分析鑒定重組質(zhì)粒pGAPZ a A/Tat PTD-Endostatin,最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A/TatPTD-Endostatin ； (4)制備感受態(tài)的酵母菌GS115，重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZa A/Tat PTD-Endostatin單酶切線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)的GSl 15菌中，在含Zeocin的LB平板上培養(yǎng)2_3天篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子； (5)上述陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵，分離純化得到發(fā)酵產(chǎn)物，鑒定發(fā)酵產(chǎn)物，即為TatPTD-Endostatin 重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中的酵母菌株為畢赤酵母或釀酒酵母。
5.一種采用大腸桿菌表達(dá)Tat PTD-Endostatin重組蛋白的方法,其特征在于步驟如下 Cl)常規(guī)方法制備含有編碼Tat PTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的Tat-ES融合基因，并擴(kuò)增； (2)用限制性內(nèi)切酶NdeI、BamH I分別酶切質(zhì)粒pET28a和Tat PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶連接； (3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測(cè)序分析鑒定重組質(zhì)粒pET28a/Tat PTD-Endostatin,最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/TatPTD-Endostatin ； (4)制備感受態(tài)的大腸桿菌Rossetta感受態(tài)細(xì)胞,將表達(dá)質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化入Rossetta感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)16h，篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子； (5)上述陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵，分離純化得到發(fā)酵產(chǎn)物，鑒定發(fā)酵產(chǎn)物，即為TatPTD-Endostatin 重組蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟(5)具體如下 ①挑選陽性轉(zhuǎn)化子，過夜培養(yǎng)后，按I:100接入LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至0D_為O.8-1. 0，加入 IPTG, 370C，200r/min,誘導(dǎo) 6h,收菌； ②將菌體破壁，采用SDS-PAGE對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定；③包涵體復(fù)性菌體超聲后離心得包涵體，采用稀釋復(fù)性或透析復(fù)性或超濾復(fù)性法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性； ④分離純化TatPTD-Endostatin融合蛋白將復(fù)性成功的蛋白質(zhì)經(jīng)親和層析或離子交換層析進(jìn)行純化，除鹽后得目的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述③中復(fù)性的具體方法如下菌體破壁后，IOOOOg離心30min，棄去上清得到包涵體；采用含去污劑的尿素或鹽酸胍溶液洗滌多次去除粘附的雜蛋白；采用變性液對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，在室溫?cái)嚢?h后，IOOOOg離心30min，上清為包涵體溶液；然后，將包涵體溶解的、變性的無生物活性的蛋白質(zhì)復(fù)性，使其能夠折疊形成可溶的、有生物活性的構(gòu)象。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述④中，采用G25-SephadeX、超濾或透析的方法除鹽。
9.權(quán)利要求I所述的TatPTD-Endostatin融合蛋白在治療癌癥或新生血管生成引起的疾病中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述新生血管生成引起的疾病為非小細(xì)胞肺癌、糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑盤狀變性引起的脈絡(luò)膜血管增生。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種TatPTD-Endostatin重組蛋白，是由人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域和人內(nèi)皮抑素構(gòu)成的融合蛋白，其中，人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人內(nèi)皮抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明蛋白保留了內(nèi)皮抑素抑制新生血管的生成作用，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、易透過血腦屏障、眼球屏障的優(yōu)點(diǎn)，克服了內(nèi)皮抑素的穿膜效果差的局限性，可發(fā)揮更好的抑制新生血管細(xì)胞生成的作用，能夠用于治療新生血管生成引起的各種疾病，包括眼部血管增生性疾病及各種腫瘤，如糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變，非小細(xì)胞肺癌等。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102731658SQ20121014920
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者張新科, 李妍, 王鳳山, 程艷娜, 譚海寧 申請(qǐng)人:山東大學(xué)