專利名稱：一種眼斑擬石首魚的抗蟲肽及其基因克隆方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海洋動(dòng)物抗蟲肽及基因克隆方法，尤其是涉及一種眼斑擬石首魚的抗蟲肽piscidin及其基因克隆方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
刺激隱核蟲是目前嚴(yán)重威脅海洋魚類的一種傳播性極強(qiáng)的寄生蟲，已被列為農(nóng)業(yè)部2008年12月11日發(fā)布的新版《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》(農(nóng)博，2009。農(nóng)業(yè)部發(fā)布《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》，漁業(yè)致富指南6 :6)中的二類動(dòng)物疫病，它所引發(fā)的“白點(diǎn)病”和繼發(fā)性細(xì)菌性感染給我國(guó)海水魚類養(yǎng)殖帶來了巨大的損失。尤其以大黃魚 (Pseudosciaena crocea)、石斑魚(Epinephelussp.)、卵形鯧錄(Trachinotus ovatus)等 “白點(diǎn)病”危害最為嚴(yán)重，每年都帶來了數(shù)億元的經(jīng)濟(jì)損失，寄生蟲的防治是目前魚類養(yǎng)殖急需解決的重大難題。目前，防治海水魚類“白點(diǎn)病”的方法十分有限，化學(xué)殺蟲藥物的長(zhǎng)期使用可使海洋污染加劇和海洋魚類健康嚴(yán)重受損，這已成為“白點(diǎn)病”問題年趨惡化的重要因素之一， 探索健康安全的新型防控方式是水產(chǎn)業(yè)迫切需要的產(chǎn)業(yè)技術(shù)需求。海洋動(dòng)物自身存在著宿主防御肽(Host Defense Peptide, HDP)以應(yīng)對(duì)魚類自身面臨的疾病威脅，其中海洋動(dòng)物自身的抗蟲活性物質(zhì)為解決海水養(yǎng)殖魚類自身的寄生蟲難題提供了重要啟示。2008年，國(guó)外首次報(bào)道雜交斑紋S盧(hybrid striped bass)的抗菌肽 piscidin(源自英文單詞Piscine,意為魚的)具有較強(qiáng)的抗外寄生蟲的作用。我國(guó)也發(fā)現(xiàn)藍(lán)子魚(Siganus ConcatenaluJ)的血清(王方華，2010。黃斑藍(lán)子魚血清抗寄生蟲及細(xì)菌活性物質(zhì)的研究，中山大學(xué)博士學(xué)位論文)中存在著抗蟲活性物質(zhì)。從豐富的海洋動(dòng)物抗蟲活性物質(zhì)資源庫(kù)中篩選具有特殊殺蟲效果的抗蟲肽，進(jìn)行抗蟲相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)或者提高魚類自身抗蟲水平，具有巨大的科學(xué)價(jià)值、市場(chǎng)需求和發(fā)展前景。魚類piscidin是一類非常重要的抗菌肽，對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲同時(shí)具有抗性，因此，它作為重要的抗蟲肽資源，對(duì)于解決刺激隱核蟲重大產(chǎn)業(yè)技術(shù)難題具有潛在價(jià)值和重要意義。在利用基因工程技術(shù)制備生產(chǎn)過程中，抗蟲肽piscidin是否具有外源基因毒性， 是決定能否低成本生產(chǎn)制備的技術(shù)關(guān)鍵之一。因?yàn)槎拘曰蚩赡軐?duì)工程菌株(大腸桿菌或酵母菌)自身造成毒性，使產(chǎn)率偏低，成本大幅上升。我國(guó)尚未有海洋動(dòng)物抗蟲肽的相關(guān)公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是針對(duì)現(xiàn)有存在的嚴(yán)重危害海洋魚類的刺激隱核蟲病，提供既能有效殺滅刺激隱核蟲，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成不良影響，又能容易借助基因工程技術(shù)生產(chǎn)制備抗蟲肽產(chǎn)品的眼斑擬石首魚的抗蟲肽piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的核苷酸序列。本發(fā)明的第二目的在于提供眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列。本發(fā)明的第三目的在于提供眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆方
本發(fā)明的第四目的在于提供眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin在制備防治刺激隱核蟲病藥物中的應(yīng)用。所述眼斑擬石首魚的抗蟲肽piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列，其核苷酸序列記為序列 I，所述序列I為ttctcttactgagaatacagtctacagtctacagactatccatcagtgaaaggatgaagt60
gtactgcggtctttcttgtgttgttcatggtcgttctcatggctgaacctggagagtgta120
tctggggactgatcgcccatggagtcgcgcatgttggttcgttgatccatgggcttgtca180
atgggaaccatggcgggaaccaggcggaggagcagcaggagcagctcaacaaacgttcac240
tttcttatgaccacccgtaggagcttcaacggcgagactgaagatgaagcaacgtcagaa300
agaaacgtgtctatgaactggtggaaacacttcttgaaaatatatatacgatttcaagtc360
agttgttcagaataaatttggatctcagcaC C420 423 所述眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列記為序列2，所述序列2為MetLysCysThrAlaValPheLeuValLeuPheMetValValLeuMet
-20-15-10
AlaGluProGlyGluCysHeTrpGlyLeuHeAlaHisGlyValAla
-5-II510
HisValGlySerLeuHeHisGlyLeuValAsnGlyAsnHisGlyGly
152025
AsnGlnAlaGluGluGlnGlnGluGlnLeuAsnLysArgSerLeuSer
303540
TyrAspHisPro所述眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列是根據(jù)所述眼斑擬石首魚的抗蟲肽piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列推導(dǎo)獲得的。所述氨基酸序列組成的多肽包含信號(hào)肽、成熟肽和優(yōu)勢(shì)域三個(gè)部分。眼斑擬石首魚piscidin的成熟肽序列，即抗蟲肽(功能肽)，是編碼22個(gè)氨基酸， 具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)，含有豐富的堿性氨基酸。具體的序列命名為So-Piscidin :Ile Thr Gly Leu He Ala His Gly Val Ala His Val Gly Ser Leu He His Gly Leu Val Asn Gly0所述眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆方法包括以下步驟I)利用刺激隱核蟲感染眼斑擬石首魚，誘導(dǎo)并提高抗蟲肽piscidin的表達(dá)水平；2)利用感染后鰓部出現(xiàn)明顯“白點(diǎn)”的眼斑擬石首魚的頭腎提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板，此模板能有效擴(kuò)增出抗蟲肽的cDNA或片段；3)參考魚類piscidin的cDNA序列設(shè)計(jì)同源引物，利用RT-PCR和RACE等技術(shù)，克隆眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列。所述抗蟲肽的多肽產(chǎn)物具有殺滅刺激隱核蟲的作用，具有較弱的殺菌活性，能應(yīng)用于制備防治刺激隱核蟲病的藥物。本發(fā)明所提供的抗蟲肽基因的多肽產(chǎn)物(成熟肽)能有效殺滅刺激隱核蟲，僅具有較弱的抗菌作用，多肽產(chǎn)物的制備方法、殺蟲活性及抗菌作用如下(I)固相化學(xué)合成法制備抗蟲肽So-piscidin利用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀制備So-Piscidin,以便進(jìn)行抗菌活性與抗蟲特性的研究。人工合成抗蟲肽So-Piscidin的固相化學(xué)法包括以下步驟固相化學(xué)法合成、剪切、純化和質(zhì)譜分析等步驟，具體方法見實(shí)施例3。(2)所制備抗蟲肽So-Piscidin能夠有效殺滅刺激隱核蟲從受刺激隱核蟲感染的卵形鯧鰺中收集寄生蟲包囊，孵化出的感染幼蟲用于殺蟲實(shí)驗(yàn)。開展所制備抗蟲肽So-Piscidin殺滅刺激隱核蟲的時(shí)間效應(yīng)與劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn),觀察實(shí)驗(yàn)過程中感染幼蟲死亡率及死亡過程的形態(tài)學(xué)變化，具體方法見實(shí)施例4。(3)所制備抗蟲肽So-Piscidin僅具有較弱的抗菌活性將本發(fā)明所制備的抗蟲肽按O. 5mg/管分裝冷凍保存用于抗菌活性測(cè)定?？咕钚詼y(cè)定采用微量肉湯稀釋法，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌、哈維氏弧菌等革蘭氏陰性菌作為試驗(yàn)菌種，測(cè)定本發(fā)明所提供抗蟲肽So-Piscidin的抗菌活性，確定其最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。具體方法見實(shí)施例5。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了眼斑擬石首魚的抗蟲肽基因piscidin，首次發(fā)現(xiàn)它的成熟肽 So-Piscidin具有較強(qiáng)的殺滅刺激隱核蟲的作用，但其殺菌活性較弱，特別適合構(gòu)建基因工程菌批量制備抗蟲肽，可廣泛應(yīng)用于新型醫(yī)藥、獸藥、飼料添加劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖的研發(fā)領(lǐng)域，特別對(duì)于解決目前非常嚴(yán)重的海洋魚類“白點(diǎn)病”提供了重要的思路。本發(fā)明提供的抗蟲肽基因的克隆方法也可借鑒應(yīng)用到篩選其它抗蟲肽基因的研究之中。本發(fā)明首次從眼斑擬石首魚中克隆了一種抗蟲肽piscidin，它具有較高的抗蟲活性及較弱的抗菌活性，非常便于用基因工程菌株表達(dá)，可用于殺蟲的新型藥物研究及開發(fā)之中。


圖I為中間片斷PCR擴(kuò)增的結(jié)果。其亮度表明，通過刺激隱核蟲誘導(dǎo)法獲得的反轉(zhuǎn)錄cDNA的模板能有效擴(kuò)增出眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin基因片段。圖2為So-piscidin殺滅刺激隱核蟲的動(dòng)力學(xué)曲線。在圖2中，橫坐標(biāo)為時(shí)間 (min)，縱坐標(biāo)為死亡率(% );曲線I 7表示So-piscidin添加濃度分別為0、3、6、12、24、 48>96 μ M ;結(jié)果表明，24 96 μ M的So-piscidin殺蟲效果非常明顯。圖3為So-piscidin的殺菌活性。由圖3表明，合成的So-piscidin不能有效殺滅試驗(yàn)中的大腸桿菌；扇形I區(qū)是未加大腸桿菌的陰性對(duì)照，2 9區(qū)分別表示So-piscidin 濃度為3、6、12、24、48、96μΜ，扇形10區(qū)為氨芐青霉素陽性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不作為本發(fā)明對(duì)權(quán)利范圍的限制。實(shí)施例I :眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆I)刺激隱核蟲感染實(shí)驗(yàn)將3條美國(guó)紅魚養(yǎng)O. 5m3的玻璃鋼桶中，以每尾魚10000個(gè)的劑量加入刺激隱核蟲的感染幼蟲進(jìn)行感染，對(duì)感染后鰓部出現(xiàn)明顯“白點(diǎn)”的眼斑擬石首魚的頭腎取材；2)采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法提取頭腎的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；3)中間片斷擴(kuò)增(參見圖I):根據(jù)其它魚類Piscidin的基因序列進(jìn)行同源比對(duì)后，設(shè)計(jì)出一對(duì)同源引物 Pisciding-F GCGGTCTTTCTTGTGTTGTT ；Piscidin-R GCTGAGATCCAAATTTATTCTG ;采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法擴(kuò)增眼斑擬石首魚piscidin的中間片斷。4)再根據(jù)常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，利用RACE技術(shù)獲得3’與5’序列，拼接為cDNA 全長(zhǎng)序列，見序列表中的序列I ;實(shí)施例2 生物信息學(xué)分析，確定成熟肽序列根據(jù)已獲得眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列，通過生物信息學(xué)分析，利用 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 上的 BLAST 軟件比對(duì)，確定 ORF 共 204bp,編碼 68 個(gè)氨基酸，由信號(hào)肽(22個(gè)aa)、成熟肽(22個(gè)aa)與優(yōu)勢(shì)域(24個(gè)aa)三部分組成。Piscidin基因家族中成熟肽的結(jié)構(gòu)特征為兩親性的陽離子多肽，含有豐富的 His,具備α螺旋結(jié)構(gòu)。經(jīng)推導(dǎo)得出的成熟肽So-piscidin序列為L(zhǎng)le Thr Gly Leu lie Ala His Gly Val Ala His Val Gly Ser Leu lie His Gly Leu Val Asn Gly0實(shí)施例3 So-Piscidin人工合成肽的制備本發(fā)明提供的眼斑擬石首魚piscidin的基因序列和多肽序列，可用于化學(xué)合成法、基因工程技術(shù)制備抗蟲肽piscidin的多肽產(chǎn)物,所以涉及到眼斑擬石首魚piscidin的 DNA序列或多肽序列的任何化學(xué)合成方法、重組表達(dá)載體、基因工程菌或細(xì)胞系，均在此保護(hù)范圍內(nèi)。本實(shí)施例中將介紹化學(xué)合成法制備So-Piscidin人工合成肽的方法。本實(shí)施例采用固相化學(xué)法合成So-Piscidin，所用儀器為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (AppliedBiosystems)生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經(jīng)過高濃度的三氟乙酸 (TFA)剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過質(zhì)譜鑒定。具體試驗(yàn)步驟參照ABI多肽合成系統(tǒng)。鑒定結(jié)果制備的抗蟲肽經(jīng)過質(zhì)譜分析，根據(jù)質(zhì)譜圖計(jì)算出的So-piscidin的分子量為2220. 63。由多肽序列計(jì)算出的理論值為2219. 60Da。證明制備的多肽即為設(shè)計(jì)的 So-piscidin抗蟲肽。鑒定合格的抗蟲肽產(chǎn)物備用。實(shí)施例4 :人工合成抗蟲肽So-piscidin殺滅刺激隱核蟲幼蟲的實(shí)驗(yàn)從嚴(yán)重感染“白點(diǎn)病”的卵形鯧鰺收集包囊，分別移入裝有3ml滅菌過濾海水的24 孔組織培養(yǎng)板中，27°C培養(yǎng)，待其孵化過夜后用于試驗(yàn)。收集和計(jì)數(shù)脫包的活躍幼蟲，用滅菌過濾海水把幼蟲濃度調(diào)整為約1000 1500個(gè)幼蟲/πιΓ1，用于檢測(cè)So-piscidin抗蟲肽對(duì)幼蟲的殺滅效果。利用二倍稀釋法將合成的So-piscidin抗蟲肽溶解于溶液I (0. 01%乙酸,0. 2% BSA)中，每孔的終濃度分別為0、3、6、12、24、48、96μΜ。試驗(yàn)在96孔組織培養(yǎng)板上進(jìn)行， 每孔先加入100 μ I幼蟲液，再加入11μ I的So-piscidin抗蟲肽溶液，將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察，分別在5、10、15、30、60、120、180、240min記錄幼蟲死亡狀況。以不加 So-piscidin抗蟲肽的溶液I作為對(duì)照組。試驗(yàn)時(shí)每組設(shè)2個(gè)重復(fù)，至少重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果顯示(參見圖2) ,So-piscidin抗蟲肽對(duì)刺激隱核蟲有較強(qiáng)的殺滅效果，24 96 μ M在短時(shí)間內(nèi)即可殺死全部的刺激隱核蟲。實(shí)施例5 :人工合成抗蟲肽So-piscidin的抗菌活性測(cè)定本發(fā)明人工合成肽So-Piscidin的抗菌活性測(cè)定采用微量肉湯稀釋法，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌，以及大腸桿菌、哈維氏弧菌等革蘭氏陰性菌作為試驗(yàn)菌種，測(cè)定So-piscidin抗蟲肽的抗菌活性。將被測(cè)試菌劃線于MHA平板上，28°C倒置培養(yǎng)24h。從平板上挑取I個(gè)單菌落接種于MHA斜面培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。次日用500 1000 μ I磷酸鈉緩沖液(pH = 7. 2 7. 4)洗脫斜面培養(yǎng)物，再用MHB和磷酸鈉緩沖液調(diào)整菌懸液濃度至OD = O. 0018。首先取冷凍干燥的So-piscidin抗蟲肽溶解于無菌水中，濃度約為480 μ Μ。利用二倍稀釋法稀釋后，將不同濃度的抗蟲肽溶液分別加到96孔組織培養(yǎng)板中，每孔的終濃度分別為3、6、12、24、48、96μΜ。然后加入50 μ I OD = O. 0018的測(cè)試菌液。對(duì)照組設(shè)兩組， 陽性對(duì)照為氨芐青霉素代替抗蟲肽So-piscidin，陰性對(duì)照以MHB和NaPB緩沖液代替待測(cè)菌液。28°C培養(yǎng)24h后肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。并涂平板觀察。結(jié)果表明，合成的So-piscidin不能有效殺滅試驗(yàn)中的革蘭氏陽性菌和陰性菌的生長(zhǎng)。圖3結(jié)果表明，So-piscidin對(duì)大腸桿菌無有效殺滅。
權(quán)利要求
1.眼斑擬石首魚的抗蟲肽PiSCidin的CDNA全長(zhǎng)序列，其特征在于其核苷酸序列記為序列I，所述序列I為ttctcttactgagaatacagtctacagtctacagactatccatcagtgaaaggatgaagt60gtactgcggtctttcttgtgttgttcatggtcgttctcatggctgaacctggagagtgta120tctggggactgatcgcccatggagtcgcgcatgttggttcgttgatccatgggcttgtca180atgggaaccatggcgggaaccaggcggaggagcagcaggagcagctcaacaaacgttcac240tttcttatgaccacccgtaggagcttcaacggcgagactgaagatgaagcaacgtcagaa300agaaacgtgtctatgaactggtggaaacacttcttgaaaatatatatacgatttcaagtc360agttgttcagaataaatttggatctcagca420423。
2.眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列，其特征在于記為序列2，所述序列2為MetLysCysThrAlaValPheLeuValLeuPheMetValValLeuMet-20-15-10AlaGluProGlyGluCysIleTrpGlyLeuIleAlaHisGlyValAla-5-II510HisValGlySerLeuIleHisGlyLeuValAsnGlyAsnHisGlyGly152025AsnGlnAlaGluGluGlnGlnGluGlnLeuAsnLysArgSerLeuSer303540TyrAspHisProt)
3.如權(quán)利要求2所述的眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列組成的多肽包含信號(hào)肽、成熟肽和優(yōu)勢(shì)域三個(gè)部分。
4.如權(quán)利要求2所述的眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列，其特征在于所述成熟肽序列，即抗蟲肽，是編碼22個(gè)氨基酸，具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)，含有堿性氨基酸，具體的序列命名為 So-Piscidin :Ile Thr Gly Leu He Ala His Gly Val Ala His Val Gly Ser Leu He His Gly Leu Val Asn Gly0
5.眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆方法,其特征在于包括以下步驟1)利用刺激隱核蟲感染眼斑擬石首魚，誘導(dǎo)并提高抗蟲肽piscidin的表達(dá)水平；2)利用感染后鰓部出現(xiàn)明顯“白點(diǎn)”的眼斑擬石首魚的頭腎提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成 cDNA作為PCR模板，此模板能有效擴(kuò)增出抗蟲肽的cDNA或片段；3)參考魚類piscidin的cDNA序列設(shè)計(jì)同源引物，利用RT-PCR和RACE等技術(shù)，克隆眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列。
6.眼斑擬石首魚的抗蟲肽piscidin在制備防治刺激隱核蟲病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種眼斑擬石首魚的抗蟲肽及其基因克隆方法和應(yīng)用，涉及一種海洋動(dòng)物抗蟲肽及基因克隆方法。眼斑擬石首魚的抗蟲肽piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的核苷酸序列為序列1；眼斑擬石首魚抗蟲肽piscidin的氨基酸序列為序列2。眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆方法利用刺激隱核蟲感染眼斑擬石首魚，誘導(dǎo)并提高抗蟲肽的表達(dá)水平；利用感染后鰓部出現(xiàn)明顯“白點(diǎn)”的眼斑擬石首魚的頭腎提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板；參考魚類piscidin的cDNA序列設(shè)計(jì)同源引物，利用RT-PCR和RACE等技術(shù)，克隆眼斑擬石首魚piscidin的cDNA全長(zhǎng)序列。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102586258SQ20121005885
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者毛勇, 牛素芳, 王軍, 鄔陽, 金媛 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)