專利名稱：用于遞送免疫原編碼rna的peg化脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明處于用于免疫的RNA非病毒遞送領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
數(shù)年來(lái)用于免疫的核酸遞送已成為目標(biāo)。測(cè)試了多種方法，包括使用DNA或RNA、病毒或非病毒遞送載劑(或甚至沒(méi)有遞送載劑，在“裸露”疫苗中)、復(fù)制或非復(fù)制載體、病毒或非病毒載體。仍需要進(jìn)步和改善的核酸疫苗，且特別是遞送核酸疫苗的改善方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)遞送包封在脂質(zhì)體內(nèi)的RNA來(lái)完成核酸免疫。RNA編碼感興趣的免疫原。脂質(zhì)體包括PEG化脂質(zhì)，即所述脂質(zhì)通過(guò)共價(jià)結(jié)合聚乙二醇來(lái)修飾。PEG提供的脂質(zhì)體有能賦予有利藥代動(dòng)力學(xué)特征的包被，例如其能增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和防止非特異性吸收。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)PEG長(zhǎng)度能影響包封RNA的體內(nèi)表達(dá)，因此本發(fā)明使用所含PEG平均分子量為lkDa-3kDa的脂質(zhì)體。分子量較低(如500或750Da)的PEG不形成穩(wěn)定脂質(zhì)體。因此，本發(fā)明提供其內(nèi)包封感興趣免疫原的編碼RNA的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包括含聚乙二醇部分的至少一種脂質(zhì)，從而聚乙二醇在脂質(zhì)體外部出現(xiàn)，其中聚乙二醇的平均分子量為lkDa-3kDa。這些脂質(zhì)體適于體內(nèi)遞送RNA到脊椎動(dòng)物細(xì)胞，因此其用作藥物組合物組分以針對(duì)多種疾病免疫對(duì)象。本發(fā)明還提供制備含RNA的脂質(zhì)體的方法，包含混合RNA與一種或多種脂質(zhì)的步驟，所處條件使脂質(zhì)形成其內(nèi)包封RNA的脂質(zhì)體，其中至少一種脂質(zhì)包括在所述方法中位于脂質(zhì)體外部的聚乙二醇部分，其中聚乙二醇的平均分子量為lkDa_3kDa。脂質(zhì)體本發(fā)明使用其內(nèi)包封免疫原編碼RNA的脂質(zhì)體。因此，RNA (如天然病毒中)與任何外部介質(zhì)分開。發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體內(nèi)的包封保護(hù)RNA免于RNA酶消化。所述脂質(zhì)體能包括一些外部RNA(如在其表面上)，但至少一半RNA(理想上為全部)在脂質(zhì)體核心中包封。脂質(zhì)體內(nèi)的包封不同于例如參考文獻(xiàn)I所公開的脂質(zhì)/RNA復(fù)合物，其中RNA混合預(yù)形成的脂質(zhì)體。多種兩性脂質(zhì)能在水親性環(huán)境中形成雙層以包封含RNA的水性核心作為脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)可具有陰離子、陽(yáng)離子或兩性離子親水頭部基團(tuán)。從陰離子磷脂形成脂質(zhì)體可追溯到1960年代，自1990年代開始研究形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)。一些磷脂為陰離子而另一些為兩性離子且另一些為陽(yáng)離子。合適磷脂類型包括但不限于磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂列于表I。有用的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括但不限于二油?；装被?DOTAP)、1，2-二硬脂氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、
1,2- 二油氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA) ,1,2- 二亞油氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亞麻氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。兩性離子脂質(zhì)包括但不限于?；鶅尚噪x子脂質(zhì)和醚兩性離子脂質(zhì)。有用的兩性離子脂質(zhì)示例是DPPC、DOPC、DSPC、十二烷基磷酸膽堿、I，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、和I，2- 二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。所述脂質(zhì)可以是飽和或不飽和的。優(yōu)選使用至少一種不飽和脂質(zhì)以制備脂質(zhì)體。如果不飽和脂質(zhì)有2個(gè)尾，2個(gè)尾都可為不飽和，或其能具有I個(gè)飽和尾和I個(gè)不飽和尾。脂質(zhì)能包括I個(gè)尾如RV05中的類固醇基團(tuán)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有包封水性核心的脂雙層的脂質(zhì)體，其中:(i)所述脂雙層包括含聚乙二醇部分的至少一種脂質(zhì)，從而聚乙二醇在脂質(zhì)體外部出現(xiàn)，其中聚乙二醇的平均分子量為lkDa-3kDa;和(ii)水性核心包括編碼免疫原的RNA。本發(fā)明的脂質(zhì)體能從單一脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物中形成?；旌衔锟砂?i)陰離子脂質(zhì)混合物(ii)陽(yáng)離子脂質(zhì)混合物(iii)兩性離子脂質(zhì)混合物(iv)陰離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物(V)陰離子脂質(zhì)和兩性離子脂質(zhì)的混合物(vi)兩性離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物或(vii)陰離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子脂質(zhì)和兩性離子脂質(zhì)的混合物。類似地，混合物可包含飽和及不飽和脂質(zhì)。例如，混合物可包含DSPC(兩性離子,飽和)、DlinDMA(陽(yáng)離子,不飽和)、和/或DMG (陰離子，飽和)。使用脂質(zhì)混合物時(shí)，所述混合物中不是所有組成脂質(zhì)需為兩性，如種或多種兩性脂質(zhì)能與膽固醇混合。發(fā)明的脂質(zhì)體從脂質(zhì)混合物中形成時(shí)，優(yōu)選如本文所述PEG化的那些脂質(zhì)比例小于10 %的總脂質(zhì)量，如0.5-5 %、1-4%、或約2 %。例如，下面顯示有用的脂質(zhì)體，其中2 %的總脂質(zhì)為PEG-DMG。剩余物能由例如膽固醇(如35-50%膽固醇)和/或陽(yáng)離子脂質(zhì)(如30-70% )和/或DSPC (如5-15% )構(gòu)成。這種混合物在下面使用。這些百分比值是摩爾
百分?jǐn)?shù)。因此，脂質(zhì)體能從陽(yáng)離子脂質(zhì)(如DlinDMA、RV05)、兩性離子脂質(zhì)(如DSPC、DPyPE)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)中形成。DSPC、DlinDMA、PEG_DMG和膽固醇的混合物以及數(shù)種其他混合物用于示例。脂質(zhì)體內(nèi)的至少一種脂質(zhì)包括聚乙二醇部分。包括這些PEG化脂質(zhì)的脂質(zhì)體會(huì)具有PEG定向，從而其在至少脂質(zhì)體外部出現(xiàn)(但一些PEG還可暴露于脂質(zhì)體內(nèi)部，即水性核心)。此定向可通過(guò)連接PEG與合適脂質(zhì)部分來(lái)完成。例如，兩性脂質(zhì)中的PEG會(huì)結(jié)合親水頭部，因?yàn)樗鲱^部本身定向脂雙層面向水的外部。此方法中的PEG化可通過(guò)共價(jià)結(jié)合PEG與脂質(zhì)來(lái)完成，如使用參考文獻(xiàn)2和3公開的那些技術(shù)。因此，PEG化脂質(zhì)包含PEG結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種其內(nèi)包封感興趣免疫原的編碼RNA的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包括含聚乙二醇部分的至少一種脂質(zhì)，從而聚乙二醇在脂質(zhì)體外部出現(xiàn)，其中所述聚乙二醇的平均分子量為 lkDa_3kDa。
2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體包含PEG-DMG和/或具有式(X)的脂質(zhì)。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體直徑范圍為80_160nm。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體包含有陽(yáng)離子頭部基團(tuán)的脂質(zhì)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體包含有兩性離子頭部基團(tuán)的脂質(zhì)。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA是自復(fù)制RNA。
7.如權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述自復(fù)制RNA分子編碼⑴能從自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶和(ii)免疫原。
8.如權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子具有2個(gè)開放閱讀框，第一開放閱讀框編碼甲病毒復(fù)制酶且第二開放閱讀框編碼所述免疫原。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子長(zhǎng)度為9000-12000個(gè)核苷酸。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原可引起針對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌或寄生 蟲的體內(nèi)免疫應(yīng)答。
11.一種含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述脂質(zhì)體的藥物組合物。
12.一種引起脊椎動(dòng)物中保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給予脊椎動(dòng)物有效量的權(quán)利要求1-10所述脂質(zhì)體或權(quán)利要求11所述藥物組合物的步驟。
全文摘要
核酸免疫通過(guò)遞送包封在脂質(zhì)體內(nèi)的RNA來(lái)完成。所述RNA編碼感興趣免疫原。聚乙二醇的平均分子量為1kDa-3kDa。因此，本發(fā)明提供具有包封水性核心的脂雙層的脂質(zhì)體，其中(i)所述脂雙層包括含聚乙二醇部分的至少一種脂質(zhì)，從而聚乙二醇在脂質(zhì)體外部出現(xiàn)，其中聚乙二醇的平均分子量為1kDa-3kDa；和(ii)水性核心包括編碼免疫原的RNA。這些脂質(zhì)體適于遞送RNA到脊椎動(dòng)物細(xì)胞并因此其用作藥物組合物成分以針對(duì)多種疾病免疫對(duì)象。
文檔編號(hào)A61K39/39GK103179984SQ201180051891
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者A·吉爾, A·維爾瑪 申請(qǐng)人:諾華有限公司