專利名稱：使用聚合物材料作為樣品載體直接進行pcr的方法
使用聚合物材料作為樣品載體直接進行PCR的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于采集核酸擴增反應中使用的核酸樣品的方法和器械。本發(fā)明特別涉及用于采集法醫(yī)檢定用樣品的方法和器械，所述方法和器械可在例如犯罪或事故現場或發(fā)生生物污染的場所使用，而且所述方法和器械適用于最少的手動干預。
本說明書中明顯為先前公開的文獻的列舉或討論不一定被看作是承認該文獻為現有技術的一部分或公知常識。
目前，由固體生物樣品進行分析用哺乳動物(包括人)DNA的標準實驗室制備需要部分或全部的以下處理
需要以某種方式處理樣品，通過某種形式的潤濕或應用溶液從而將細胞從所在基質(例如，織物內干燥的血或棉簽上的皮膚細胞等)移除。換句話說，通過液體增溶實現樣品轉移。
必須以某種方式處理樣品從而促進DNA與蛋白質、碳水化合物、其他核酸等的細胞基質分離(即需要分離DNA)。
分離的DNA需要清除結合的蛋白質等從而使DNA分析過程能夠開始-例如接近 DNA聚合酶以在聚合酶鏈式反應(PCR)中復制DNA，或接近其他DNA擴增過程有關的酶或限制性酶以結合和切割DNA序列(即需要清潔DNA)。
所述制備需要清除抑制劑、DNA酶等的樣品(即需要移除抑制DNA分析的化學物質)。
干樣品需要溶劑化以將細胞物質溶解到上述任一要進行的反應用溶液中(即要求細胞/DNA在溶液中)。
上述過程要求謹慎操作樣品、測量備用試劑的等份等，所有這些通常均需要實驗室設備和經培訓的專業(yè)人員來操作。
因此，通常認為，哺乳動物(包括人)細胞需要在溶液中以用于處理和/或預備性操作，并且需要預處理以制備用于DNA分析。
無需預備步驟對細胞溶液取樣直接進行DNA分析反應是可能的，但是此舉包括有限的樣品類型和/或特別處理以實現DNA分析。已確定唾液可直接放入或稀釋到PCR反應中，由此可進行基因組DNA分析。通常顯示將血直接放入或稀釋到PCR反應中需要特別的緩沖液和酶，以在任何程度成功再現的情況下進行反應。需要處理細胞溶液中的PCR抑制劑，通常經過稀釋來處理。組織培養(yǎng)細胞需要從其培養(yǎng)環(huán)境中采集且需要在放入PCR反應中之前洗滌除去介質等。
換句話說，通常溶液中的細胞可以直接放入PCR分析裝置，只要應用適當的稀釋或聚合酶法對分析進行優(yōu)化。
玻璃表面和材料長期以來被確定為細胞和DNA的親水性結合表面，并且也是適于引發(fā)或容納PCR反應的表面(例如,“Nanassy等人，Analytical Biochemistry2007,第365 卷，第240-245頁”顯示從未經處理的載玻片(適于PCR)上有效回收基因組DNA)。
W003/057910涉及一種使用具有未修飾的二氧化硅表面的材料分離DNA和隨后在未修飾的二氧化硅存在下擴增的方法。其實施例均表明先進 行裂解反應以得到DNA。
W001/14590記載了一種使用含二氧化硅的磁珠放入DNA目標混合物內并然后用外磁力將結合到二氧化硅基質的DNA從混合物中分離出來的方法。其實施例顯示通過之前的細胞裂解步驟使得DNA可用于二氧化硅。
還沒有特別研制出接觸濕或干的樣品而無需預處理即可通過接觸直接將細胞從來源轉移到PCR反應中的玻璃取樣裝置。迄今為止也還沒有制備出利用玻璃的已知性能通過將細胞/DNA應用到例如干/固體表面來將其直接轉移到DNA/RNA擴增反應中以采集和轉移細胞/DNA的取樣裝置。
已經考察了使用其他固體表面來捕集適于DNA/RNA擴增分析的細胞和DNA，并且已知由此提供微生物培養(yǎng)物，其中可直接接觸(例如用木制牙簽)所述微生物培養(yǎng)物中的細菌菌落且無需任何處理(對于質粒和基因組)而將細菌細胞轉移到PCR反應中。
粘性表面(例如郵票)，舔(lick) 一下即可結合細胞。粘性材料不適于直接放入 PCR反應中且必須先處理以溶解掉粘性物質(例如，在提取DNA前用二甲苯預處理所述郵票)。EP1972688提供一種擴增來自微生物的核酸的方法，包括在低pH值(3.00-6.00)下使用固體表面，洗滌所述表面以移除未結合的物質，然后在相同的容器內通過系列步驟將所述表面用于PCR。W02006/036243和W02006/036246教導了使用材料來結合細胞溶液以使核酸經隨后的處理后適于隨后的釋放以用于分析。優(yōu)選的固相支撐材料使用季鎗核酸結合部分。
US5, 496，562、US5, 807，527、US6, 27，226 和 US6, 645，717 涉及用化學物質預浸纖維素或玻璃纖維基質以裂解細胞從而當血或唾液置于其表面時將被吸附且同時被所述化學物質保存和被干燥。含DNA材料必須要預處理以在用于PCR反應前洗除所述化學物質。
傳統(tǒng)上認為娃酮(和山都平(Santoprene)及其他熱塑彈性體)表面對捕集DNA 的過程呈惰性且提供自然保持DNA于適合PCR分析的形態(tài)的表面。根據連接在硅-氧骨架上的側基，硅酮表現出多種形態(tài)。盡管已確定親水性側基(如羥基)能生成結合DNA的聚合物，但通常用能產生被認為生物學惰性的疏水性來源的烷基或芳基來構建硅酮。
IE20040589顯示硅酮用作惰性載體流體。JP2007244389顯示硅酮用作惰性層，其中割出凹槽以允許PCR所用的玻璃表面的流動，但是防止泄漏(S卩，推定硅酮在該過程中顯惰性)。JP2008012434顯示硅酮為可使DNA固定化于其中的基質，通過使用與有機溶劑混合的兩性溶液使DNA進入硅酮的網狀結構，然后在此通過移除溶劑而固定DNA。因為兩性溶劑具有親水和疏水部分，這不是自然`的吸附過程，因此可用來運載親水部分和/或用來運載親水性DNA進入疏水結構。然后移除溶劑以沉積DNA，由此克服了推定的對DNA吸附的抑制。發(fā)現PDMS (聚二甲基硅氧烷)內存在的未聚合硅氧烷分子改進了 PDMS作為微芯片/流體裝置內DNA溶液印刷中的郵票的用途(Thibault等人，Langmuir2007, 23，10706-10714)。 其機理還不清楚，但未聚合硅氧烷的溶劑提取降低了印壓過程中DNA的吸附和轉移(推定的)。以前沒有探索與DNA來源的干接觸。
因此，前述的專利申請和出版物看似基于硅酮和熱塑彈性體對于結合的細胞/DNA 來說是惰性材料的前提，但是惰性表面性質可以進行修飾以增加與DNA溶液液體接觸時的 DNA吸附。
一直以來認為塑料表面對捕集細胞過程呈中性且提供能進行PCR分析的表面。塑料本質上是疏水性表面且被認為需要處理以適于結合細胞或DNA。作為實例，可以考慮處理塑料表面用于組織培養(yǎng)的細胞附著。通常用強UV或臭氧處理聚碳酸酯表面以制造親水性表面。參見Yanchao等人(2007) Anal. Chem. 79，426-433，其記載了對聚苯乙烯、聚碳酸酯、 聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯的不同處理以獲得最適合的結合?！癓iu和Rauch, Analytical Biochemistry2003,第317卷，第76-84頁”中記載了塑料表面的DNA探針附著和帶有樣品振動的微流體雜交陣列通道裝置。EP0389063教導了聚苯乙烯可用于在離液序列高的物質 (如胍鹽、碘化鈉、碘化鉀、異硫氰酸鈉等)的存在下從生物物質中分離核酸。因為聚丙烯惰性高而將該材料推舉為PCR反應器的選擇材料(參見Anne van der Valk在INSights (第 13卷)2002中報道的ABgene的研究)。據估計，對于暴露于200ng人基因組DNA的整管表面來說，結合少于5ng。
因此，通常認為，未處理的 塑料在不預先處理的情況下不適于作為捕集細胞或DNA 的表面。
EP1675511記載了一種擦拭裝置，該擦拭裝置被引入廂室中，通過操作該擦拭裝置使拭子(swab)與試劑接觸及隨后與測試條接觸，但該裝置不用于核酸分析。 W02005/047451涉及一種帶有可拆卸端的匙，其被設計用于采集口部細胞并將所述口部細胞放入管內的穩(wěn)定化溶液中。從細胞回收DNA用于進一步分析。US2008/0131876記載了一種無需提取DNA而通過使細胞樣品與將細胞修飾為可用于PCR的特殊溶液接觸來擴增細胞樣品的核酸的方法。W02008/006501涉及一種直接輸送拭子到連有微流體裝置的廂室以進行PCR反應的儀器。EP1049801提及使用可帶電的聚合物膜來結合DNA，然后洗脫掉DNA。 Nikiforor 和 Rogers (1995) Anal. Biochem. 227, 201-209 涉及 96 孔聚苯乙烯板用于基于 DNA 雜交的分析的用途。Inouye 和 Hondo (1990) J. Clin. Microbiol. 28, 1469-1472 涉及擴增的病毒DNA片段的微板雜交。
目前，犯罪現場樣品經擦拭(例如血污或指印)或者從材料上切割下來(例如內褲上的精斑)，而且所述拭子或材料被放入細胞裂解緩沖液中，DNA隨后從該細胞裂解緩沖液中提取出來(參見,例如，Walsh 等人(1991)BiotechniqueslO, 506-513)。
W02005/032377記載了包含抗微生物劑的生物取樣試劑盒及其用途。
US2008/0058676記載了分段采集器擦拭系統(tǒng)。
W02010/027283記載了適于小體積提取的樣品采集裝置。
W02009/129397記載了高通量分配器。
US2003/0059345記載了雙針液體取樣裝置。
Barbany 等人(1999)Biomolecular Engineeringl6, 105-111 記載了鏈霉親和素涂覆的多支管支撐體的分子遺傳學應用。
W099/34214記載了固相尖端及其相關用途。
US2002/0110812記載核酸采集屏障方法及其器械。
US6, 103，192記載了在基質材料上固定化和處理樣品用于鑒定核酸序列。
Barbaro等人(2004)Forensic Science Internationall46S, S127-S128記載了在基于IsoCode紙的裝置上采集的體液的STR檢測。
US2004/0152085記載了用于采集和/或純化核酸的表面。
仍需要用于采集法醫(yī)檢定用含核酸樣品的方法和裝置，所述方法和裝置可在犯罪、事故或其它事件的現場中使用，且適用于“接觸并離開”(“contact and go”)或“采集并離開”(“collect and go”)方法中的最少手動干預。
其中，本發(fā)明提供僅需接觸樣品(固體或液體)就可既捕集核酸又能使核酸(通常哺乳動物DNA)在隨后放入擴增試劑中時以適于DNA擴增(PCR或其它)的形式存在的方法和裝置。試劑內存在裝置或裝置的部件既不影響擴增過程也不影響隨后的分析(例如熒光)檢測過程。
本文記載的研究證明直接捕集和輸送核酸擴增分析用的哺乳動物(包括人)細胞可僅以一個步驟通過包括塑料、硅酮和玻璃在內的某些聚合物表面的接觸轉移(“接觸并離開”或“采集并離開”)獲得，由于目標細胞捕集或轉移到核酸擴增反應中，所以不需要潤濕或溶解它們，某些簡單的常規(guī)塑料和/或硅酮表面足以(通常無需修飾，但可以使用對聚合物“DNA滅菌”的處理，如UV照射或環(huán)氧乙烷氣體處理)作為取樣裝置或取樣裝置的部件以從濕或干細胞表面或污潰處轉移細胞，在表面上捕集細胞的特點是DNA適于PCR分析并保持結合狀態(tài)，且如果需要，可放入第二個PCR反應中再利用，而且聚合物取樣裝置或至少其部件可留于擴增反應內而不對反應有任何損害。
本文記載的研究進一步提供裝置，所述裝置可使表面上的細胞不僅接觸并轉移到單DNA分析反應中，而且如果需要可接觸并轉移到多個不連續(xù)的同時進行的反應中。
與塑料、硅酮和熱塑彈性體必須經特別處理才能結合核酸否則不適于捕集哺乳動物(包括人)樣品和直接引發(fā)擴增反應的教導相反，本發(fā)明確定某些塑料和硅酮表面可作為適于引發(fā)核酸擴增反應的取樣裝置，僅通過使樣品直接與表面接觸，然后將接觸表面沉積到DNA分析反應中。可不處理這些表面，或對這些表面進行“DNA滅菌”處理，從而使它們不與任何可檢測到的會干擾核酸擴增和檢測反應的核酸結合，如下文更詳細的描述。過去嘗試將其他天然材質(如木材、膠乳和金屬)的表面直接用作取樣裝置，但發(fā)現不適合。
本文記載的方法和裝置具有便攜性、易于在短時空內以及在核酸樣品取樣現場使用和分析。
本發(fā)明的第一個方面提供一種用于制備反應器的方法，所述反應器容納反應混合物和含核酸物質且易于進行核酸擴增反應，所述方法包括
(a)提供反應器，所述反應器帶有容納進行核酸擴增反應用的反應混合物的單廂室且所述反應器是封閉的；
(b)提供取樣裝置；
(C)使所述取樣裝置與所述含核酸物質接觸以在所述接觸后使含核酸物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上；
(d)開啟所述反應器；
(e)將所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件放入所述反應器以使所述含核酸物質與所述反應混合物接觸；以及
(f)再封閉所述反應器使其密封，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件仍存在于所述反應器中。
所述反應器可為其中進行核酸擴增反應的任何適合的反應器。通常，所述反應器由塑料制成，特別是聚丙烯。適宜地，所述反應器體積為50μ l至3ml，優(yōu)選100μ l至1.5ml。通常,所述反應器的圓形橫截面為3mm至10mm,通常約5mm。
盡管可使用單反應器實施所述方法，但是將多個反應器連接在一起或以共同的支撐體支撐并且同時制備它們也很方便。因此，通常，兩個或三個或四個或六個或八個或十個反應器連接在一起形成規(guī)則陣列。各反應器可容納相同的反應混合物(例如，允許擴增和檢測相同的一個或多個基因位點的相同的PCR反應混合物)，或它們可容納不同的反應混合物(例如，允許擴增和檢測不同基因位點的不同PCR反應混合物)。反應器的規(guī)則陣列適宜地構造成與適合的裝置連接以進行核酸擴增反應和/或檢測產物。適合的裝置包括溫度循環(huán)器裝置和熒光檢測裝置。在有些實施方案中，反應器陣列可包括已容納作為對照的已知和預定的含核酸物質的反應器。
使用取樣裝置將含核酸物質放入反應器以使所述取樣裝置或其粘附有含核酸物質的部件存在于反應器中。通常，所述含核酸物質保留在取樣裝置或其部件上，并且浸沒在反應混合物內。在核酸擴增反應期間，擴增的DNA拷貝釋放到反應混合物溶液中。
當多個反應器如所討論的那樣連接在一起時，通常取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件被構造成使所述含核酸物質在多個反應器之中分布。因此，例如，當有N個反應器時，將取樣裝置適宜地構造成使所述含核酸物質分布到N個反應器的每個反應器中。 優(yōu)選地，所述物質基本上均勻分布于反應器中。通常，N可以為2、3、4、6或8。優(yōu)選地，N為4。優(yōu)選地，當N為4時，將反應器定位于正方形的角上。
可以理解的是步驟(a)提供的反應器是封閉的。通常封蓋是密封的。這意味著反應混合物可保持無污染直至使用。在使用中，封蓋在步驟(e)前解封，但是可以理解的是步驟(C)和(d)可以以任何順序進行。封蓋可以是任何適合的封蓋，適宜地可易于移除。反應器所用的通常的封蓋是可脫掉的箔或塑料膜。其他封蓋，如推入塞(push-1n stopper) 形式的，也被考慮用于步驟(a)中提供的反應器。在步驟(f)中，反應器的再封閉防止了其后分析步驟中的蒸發(fā)或溢出。含核酸物質通常與反應混合物保持接觸。
取樣裝置具有幾個重要特征。與含核酸物質接觸時，充足的含核酸物質粘附到取樣裝置以允許核酸擴增，當取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件放入反應器中時， 核酸擴增反應進行。適宜地，所述取樣裝置或至少其粘附有所述含核酸物質的部件因此能夠結合細胞物質，特別是如下更詳細記載的存在于干燥樣品中的哺乳動物細胞物質。對于 “粘附”，包括的含義是，含核酸物質直接粘附于取樣裝置或取樣裝置的部件上，無需另外的粘性物質。這通過使取樣裝置或取樣裝置的部件與含核酸物質接觸實現，例如通過在所述含核酸物質上摩擦所述裝置或所述裝置的部件。取樣裝置或取樣裝置的部件通常無孔。
取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件在核酸擴增反應期間保留在反應器中，因此必須與核酸擴增反應條件相容。
令人驚奇地，發(fā)現未經任何化學誘導或預處理的情況下下述聚合物與樣品接觸時能夠采集充足的含核酸物質，且在反應期間存在時不影響核酸擴增反應。此外，令人驚奇地，發(fā)現核酸擴增反應后充足的含核酸物質仍與這些可用于進一步核酸擴增反應的聚合物結 合。樣品可以是濕或干樣品。濕樣品可通過液體粘附和轉移粘附到所述裝置或所述裝置的部件。通常，當樣品為干樣品時，會有含核酸的細胞物質粘附。優(yōu)選地，樣品為干樣品。
所述聚合物為玻璃、環(huán)烯烴共聚物(如Topas)、丙烯酸樹脂(如聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA))、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、高密度聚乙烯(HDPE)、聚碳酸酯、中抗沖聚苯乙烯(Medium Impact Polystyrene)、聚氯乙烯(PVC)、液晶聚合物 30%(Liquid Crystal Polymer30%) > 反式丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(反式ABS)、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯乙酸乙烯共聚物 (ethylene-vinyl acetate)、娃氧燒(如聚甲基二環(huán)氧乙烯娃氧燒(PDMS))和熱塑彈性體 (如山都平(Santoprene))。優(yōu)選地,所述聚合物是下述聚合物當由所述聚合物制成的裝置或其部件與所述樣品接觸時，含核酸的干物質(如細胞物質干樣品)能粘附到該聚合物。 因此，特別優(yōu)選地，取樣裝置或至少其粘附有所述含核酸物質的部件由這些聚合物的一種或多種制成。優(yōu)選地，所述聚合物不是泡沫形式，特別是松散泡沫。所述聚合物不是膠乳。 所述聚合物可以是任何適合的用玻璃浸潰的聚合物，如任何用玻璃浸潰的上文列舉的聚合物(除了玻璃之外)。通常，聚合物能經受住100° C的溫度。例如，其在該溫度下不分解或變形。
如果聚合物是PMMA、聚丙烯、聚碳酸酯和PDMS的任一種，則是特別優(yōu)選的。尤其優(yōu)選聚碳酸酯。
很多不同設計的取樣裝置均適合用于本發(fā)明，下文較詳細地記載了其中某些。它們屬于以下兩個常類。第一類是取樣裝置或其粘附有含核酸物質的部件安裝到反應器(反應器開啟后)中且允許在步驟(f)中用單獨的封蓋再封閉反應器的那些。單獨的封蓋可以是例如，箔、塑料膜或推入塞。第二類優(yōu)選是取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件設置有能封閉步驟(f)中的反應器的封蓋。下文詳細記載了該類取樣裝置的實施方案。
適宜地，取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件直接放入反應器，在取樣后不需要額外的處理。
反應混合物用于進行任何適合的核酸擴增反應，包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)，或等溫法，如連接酶鏈式反應(LCR)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、轉錄介導的擴增 (TMA)、RNA信號介導擴增技術(SMART)、鏈置換擴增(SDA)、滾環(huán)擴增(RCA)、等溫多重置換擴增(IMDA)、解旋酶依賴性擴增(HAD)、單引物等溫擴增(SPIA)、環(huán)式解旋酶依賴性擴增 (CDHA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。優(yōu)選PCR ;然而，由實施例可看出，使DNA可用于擴增并不需要高溫處理(接近100° C)，因此低溫法(如等溫的LAMP)是適合的。
因此，反應混合物含有進行核酸擴增反應用的所有必要成分，除了待分析的核酸之外。
因此，例如，對于PCR，反應混合物含有PCR引物、脫氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2+離子和約PH7-8的緩沖液。對于其他核酸擴增方法，存在其他酶，如核糖核酸酶H或連接酶。
發(fā)現在核酸擴增反應前不必進行含核酸物質的預處理。此外，除了反應所需的那些試劑以外，核酸擴增反應混合物中也不需要有任何特殊試劑。因此，優(yōu)選地，反應混合物基本上無離液序列高的試劑。類似地，優(yōu)選地，反應混合物基本上無細胞裂解劑。然而，在某些實施方案中，可存在非離子性除垢劑，如Tween-20。對于“基本上無”所述試劑，根據具體情況，指的是所述試劑不存在，或其存在的濃度低至不會產生離液序列高的反應或細胞裂解反應。如果反應混合物基本上無尿素、胍鹽(如鹽酸胍)、除垢劑(特別是離子型除垢劑)中的任一種，則是特別優(yōu)選的。
在特別優(yōu)選的實施方案中，反應混合物還含有用于檢測核酸擴增反應的核酸產物的試劑。因此，通常反應混合物還含有可檢測的標記的核酸探針。特別優(yōu)選的探針是能夠與核酸擴增反應產物雜交的熒光標記的寡核苷酸探針。適合的寡核苷酸探針和熒光檢測系統(tǒng)記載在`例如W02001/73118、W02007/010268、W02009/053679中，這些文獻通過引用并入本文。特別優(yōu)選的是進行短串聯重復序列(STR)分析，例如在人DNA指紋分析中?？梢岳斫獾氖牵瑱z測可在封閉反應器內于核酸擴增反應期間或之后進行是有利的，原因是開啟反應器有可能引入污染。擴增結果可在反應器內直接觀察(例如通過熒光)，或通過從反應混合物溶液取樣，將取樣裝置留在反應器內并分析擴增的DNA(例如通過凝膠電泳)。
含核酸物質可以是任何來源，但優(yōu)選來自高級真核生物來源，如哺乳動物或植物。 高級真核細胞包括動物(包括脊椎動物)。優(yōu)選哺乳動物(如人)來源的核酸。優(yōu)選地， 核酸為DNA。優(yōu)選地，核酸為基因組DNA，但源自高級真核生物細胞的病毒核酸包括在術語 “高級真核生物來源”中。通常，核酸存在于哺乳動物細胞內，含核酸物質為哺乳動物細胞物質。哺乳動物(包括人)的細胞物質包括血、唾液、精液、細胞(如皮膚細胞)和固體表面上沉積的細胞物質，例如遺留下來作為指紋部分的皮膚細胞。含核酸物質可以基本上無非核酸物質。
在很多應用上，含核酸物質基本上是干的。對于“基本上是干的”，指的是樣品沒有可見的與其結合的濕跡。例如，含核酸物質可以是細胞(如皮膚細胞)、干燥的血、干燥的精液、干燥的唾液或其他干燥的體液。令人驚奇地，發(fā)現取得樣品前不必將干燥的物質溶劑化，并且發(fā)現干燥的樣品可以直接放入反應器，無需預先處理。
盡管不限于該用途，但是容易理解的是，本發(fā)明可應用于法醫(yī)學，特別是犯罪現場。還考慮到臨床應用(如遺傳病檢驗)和食物、植物和動物物質等的“來源或起源”檢驗。 類似地，本發(fā)明的方法和器械在它們范圍內包含在例如疾病感染地點的核酸取樣。作為實例，可考慮發(fā)生病毒性疾病的病原體(如引起禽流感、嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)、所謂的“豬流感”和口蹄疫的那些)感染的地點。在這些地點，快速鑒定引起感染的疾病菌株是極其重要的。
本發(fā)明的第二個方面提供一種用于擴增核酸的方法，所述方法包括根據本發(fā)明第一個方面制備反應器，和在所述反應器內進行核酸擴增反應。所述反應器一經制備，且因此容納含有進行核酸擴增反應用的試劑的反應混合物而且還容納含核酸物質時，則根據反應類型以通常的方式進行核酸擴增反應。因此，例如，PCR可以在適合的溫度循環(huán)器內進行。
如上所指出的，令人驚奇地，發(fā)現在進一步的核酸擴增反應中可以再次使用所述取樣裝置或至少其粘附有含核酸物質的部件，原因是足夠的所述物質保留到至少進一步的核酸擴增反應。因此，本發(fā)明的第三個方面提供一種用于擴增核酸的方法，所述方法包括實施本發(fā)明第一個方面的方法，移除取樣裝置(或其粘附有含核酸物質的部件)并將其放入進一步的反應器，和在進一步的反應器中進行核酸擴增反應。在本發(fā)明第三個方面的一個實施方案中，移除取樣裝置，如果需要，用溶液進行洗滌以在放入進一步反應器前去除所有第一反應混合物。如果檢測新目標序列的不同探針標記有不同顏色的熒光團，可不必對取樣裝置進行洗滌，原因是第一反應的任何殘留物對其后的分析來說都是“不可見的”。
在本發(fā)明第二個方面的另一個實施方案中，在進行第一擴增反應后從反應器中移除反應混合物，在反應器中原位洗滌所述取樣裝置或其部件，然后將第二反 應混合物添加到反應器中。在進一步的實施方案中，取樣裝置或其部件可含有磁性物質，通過施加適當的磁場可獲得反應器內的保留。
通?？苫旧先绫景l(fā)明第一個方面所述制備進一步的反應器。盡管通常可不必進行進一步的核酸擴增反應，但是本發(fā)明允許進行該進一步的核酸擴增反應，并且在進行進一步確定或獨立的核酸擴增反應的情況下，其可具有特殊的用途。該進一步的核酸擴增反應在第一核酸擴增反應后的一段時間內發(fā)生。
本發(fā)明的第四個方面提供一種擴增核酸的方法，所述核酸來自諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源，所述方法包括
(a)使取樣裝置與諸如哺乳動物或植物的高級真核生物來源核酸接觸，以致在所述接觸后含諸如哺乳動物或植物的高級真核生物核酸的物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由任何適合的聚合物材料制成；
(b)將所述取樣裝置或其粘附有含核酸物質的部件引入容納進行核酸擴增反應用反應混合物的反應器，無需對所述含核酸物質進行任何預先處理；和
(C)進行核酸擴增反應。
聚合物材料是與核酸來源接觸(例如通過摩擦)后含核酸物質粘附到其上的材料。聚合物材料也是當存在于反應混合物中時不防礙或基本上不干擾核酸擴增反應的材料?？梢源_定聚合物是否是適合的聚合物，例如如實施例中所述。特別是，實施例2中記載的方案可用于測定聚合物的適宜性，或者可使用實施例11的方案，但其中PMMA被檢驗適宜性的另一個聚合物替換并且使用D16探針。
優(yōu)選地,聚合物材料是下述任何材料玻璃、環(huán)烯烴共聚物(如Topas)、丙烯酸樹脂(如PMMA)、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物 30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物硅氧烷(如PDMS)和熱塑彈性體 (如山都平)。
適宜地，如上文所討論的，諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源基本上是干的。適宜地，取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件在步驟(C)中保留于反應器中。
本發(fā)明的第五個方面提供了一種用于擴增核酸的方法，所述核酸來自諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源，所述方法包括
(a)使取樣裝置與諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源接觸，以致在所述接觸后含諸如哺乳動物或植物的高級真核生物核酸的物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源基本上是干的；
(b)將取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件引入容納進行核酸擴增反應用反應混合物的反應器，無需對所述含核酸物質進行任何預先處理；和
(C)進行核酸擴增反應。
適宜地，取樣裝置或其粘附有含核酸物質的部件由以下任何材料制成玻璃、環(huán)烯烴共聚物(如Topas)、丙烯酸樹脂(如PMMA)、結晶聚苯乙`烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物硅氧烷(如PDMS)和熱塑彈性體(如山都平)。
適宜地，取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件在步驟(C)中保留于反應器中。
通常，本發(fā)明的第四或第五個方面中的反應混合物基本上無離液序列高的試劑和 /或基本上無細胞裂解試劑(參見上文關于本發(fā)明第一個方面的討論)。
本發(fā)明的第六個方面提供了一種制備數據載體的方法，所述數據載體記錄與含核酸物質的核酸相關的基因型，所述方法包括實施本發(fā)明第二、第四或第五個方面的方法， 測定所述含核酸物質內核酸的基因型并在數據載體上記錄所述基因型。所述基因型可與 SNP (單核苷酸多態(tài)性)有關或其可與STR(短串聯重復序列)有關?；蛐涂梢允恰癉NA指紋”。數據載體可以是任何數據載體，但通常是電子數據載體，如計算機磁盤或閃存。可以理解的是，數據載體及其上的數據可用于對所分析的樣品的核酸基因型與其他樣品的基因型、或與數據庫內儲存的基因型進行比較。這對本發(fā)明的犯罪檢測和法律執(zhí)行實施方案特別有用。
本發(fā)明的第七個方面提供一種核酸取樣裝置的用途，所述核酸取樣裝置的用途是從諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源獲得核酸，然后將所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物核酸來源引入含有核酸擴增反應混合物的反應器,無需對所述核酸來源預先處理，其中所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源基本上是干的。優(yōu)選地，核酸粘附到取樣裝置或其部件上，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由以下任何材料制成玻璃、環(huán)烯烴共聚物(如Topas)、丙烯酸樹脂(如PMMA)、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、硅氧烷GnPDMS)和熱塑彈性體(如山都平)。適宜地，在核酸擴增反應過程中核酸取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件保留于反應器中。
本發(fā)明的第八個方面提供一種試劑盒，所述試劑盒包含(a)反應器，所述反應器容納進行核酸擴增反應用的反應混合物，所述反應器是封閉的；和(b)取樣裝置，所述取樣裝置與含核酸物質接觸后，所述含核酸物質可粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件可被引入所述反應器中，且可在取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件存在下在所述反應器內進行核酸擴增反應。反應器、反應混合物、取樣裝置和含核酸物質等可為本發(fā)明前述各方面中記載的任一種。這些特征的參數與本發(fā)明此方面中的相同。
通常，所述試劑盒含有連接在一起的多個反應器，如上文本發(fā)明第一個方面中所討論的。通常，可將取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件構造成使所述含核酸物質分布于多個反應器之中，如上文本發(fā)明第一個方面中所討論的。
適宜地，在有些實施方案中，當初始封蓋被移除時，取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件設置有反應器封蓋。優(yōu)選地，取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件由以下任何材料制成玻璃、環(huán)烯烴共聚物(如Topas)、丙烯酸樹脂(如PMMA)、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚 物、乙烯-乙酸乙烯共聚物硅氧烷(如PDMS)和熱塑彈性體(如山都平)。適宜地，反應器中存在的反應混合物是本發(fā)明前述各方面中記載的任一種反應混合物。
根據本發(fā)明的第九個方面，提供一種核酸取樣器械，其包括至少一個支撐核酸樣品用的探頭；和操縱器，所述操縱器可附接到所述探頭以允許操縱所述探頭，所述探頭與所述操縱器是可分離的。
任選地，所述器械包括探頭和用于容納一種或多種試劑和核酸樣品的容器，所述容器包括可封閉的開口，操縱器操作導致或允許探頭經由開口插入從而在容器中定位樣品；所述探頭包括封罩，所述封罩在容器中樣品位置上關閉所述容器使含核酸物質不漏出或進入。
本發(fā)明器械進一步任選的方面在從屬權利要求中有所限定。特別地，在本發(fā)明范圍內的任選配置中，所述器械包括用于容納一種或多種試劑和核酸樣品的容器，所述容器包括可封閉的開口，操縱器操作導致或允許探頭經由開口插入從而在容器中定位樣品。
參照以下非限定性實施例、實施方案和附圖，將對本發(fā)明做出更為詳細的描述。在附圖中


圖1示出了由SGMPlus (Applied Biosystems)分析獲得的一系列用于轉移來自口部拭子的口腔細胞和DNA的塑料“珠?！钡姆甯摺Ｋ芰现榱?以一式三份進行分析)是I)Topas,2)丙烯酸樹脂、3)結晶聚苯乙烯、4)聚丙烯、5)HDPE、6)聚碳酸酯、7)中抗沖聚苯乙烯、8)PVC、9)聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、10)乙烯丙烯酸共聚物、11)乙烯醇乙烯共聚物、12)乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝馬來酸酐、13)液晶聚合物30%、14)反式ABS、 15)環(huán)烯烴共聚物、Topasl6)乙縮醛共聚物、17)聚酯、18)聚醚酰亞胺、19)聚乙烯、20)尼龍、21)聚醚聚氨酯、22)苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、23)聚丙烯無規(guī)共聚物和24)乙烯-乙酸乙烯共聚物。
圖2示出了通過SGMP lus分析產生的一系列用于轉移來自口部拭子的口腔細胞和 DNA的塑料“珠?！钡姆逯?。塑料珠粒(以一式三份進行分析)是l)Topas、2)丙烯酸樹脂、3)結晶聚苯乙烯、4)聚丙烯、5)HDPE、6)聚碳酸酯、7)中抗沖聚苯乙烯、8)PVC、9)聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、10)乙烯丙烯酸共聚物、11)乙烯醇乙烯共聚物、12)乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝馬來酸酐、13)液晶聚合物30%、14)反式ABS、15)環(huán)烯烴共聚物、16) 乙縮醛共聚物、17)聚酯、18)聚醚酰亞胺、19)聚乙烯、20)尼龍、21)聚醚聚氨酯、22)苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、23)聚丙烯無規(guī)共聚物和24)乙烯-乙酸乙烯共聚物。如果全部 目標 DNA成功擴增，則應當產生21個DNA產物。
圖3顯示了 D16S539HyBeacon試驗產生的熔融峰數據，A)由PMMA使用摩擦法通過接觸對織物上的血和對玻璃上的唾液取樣得到的結果。B)由PDMS使用摩擦法對織物上的血、玻璃上的血、織物上的唾液和玻璃上的唾液取樣得到的結果。C)由山都平 (8281-75MED)再次使用摩擦動作對織物上的血、玻璃上的血、織物上的唾液和玻璃上的唾液取樣得到的結果。
圖4示出了由D16S539HyBeacon試驗獲得的熔融峰，A)在提取的DNA存在下由 PMMA得到的結果。B)在提取的DNA存在下由PDMS得到的結果。C)在提取的DNA存在下由山都平(8281-75MED)得到的結果。較深的跡線代表提取的DNA對照。
圖5示出了由D16S539試驗獲得的熔融峰，A)在表達的(expressed) 口腔拭子存在下由PMMA得到的結果。B)在表達的口腔拭子存在下由PDMS得到的結果。C)在表達的口腔拭子存在下由山都平(8281-75MED)得到的結果。較深的跡線代表所述拭子對照。
圖6示出了 i)由D16S539試驗獲得的熔融峰。A)由PMMA使用摩擦法對玻璃上的唾液取樣得到的結果。B)使用PDMS對玻璃上的唾液取樣得到的結果。C)使用山都平(8281-75MED)對玻璃上的唾液取樣得到的結果。
圖7示出了由D18S51HyBeacon試驗獲得的熔融峰。從D16S539試驗移除取樣表面，輕柔洗滌，放入D18S51反應并擴增。A)由PMMA使用摩擦法對玻璃上的唾液取樣得到的結果。B)使用PDMS對玻璃上的唾液取樣得到的結果。C)由山都平(8281-75MED)在玻璃上的唾液上摩擦得到的結果。
圖8示出了使用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)試驗分析部分SLC6A4基因獲得的A)擴增曲線和B)熔融峰。通過在玻璃上的干燥唾液污潰上摩擦PDMS獲得樣品。
圖9示出了用乙醇通過索氏提取移除未結合的硅氧烷的PDMS的對比。
圖1Oa-1Od為本發(fā)明核酸取樣器械第一實施方案的部件的側視圖(圖1Oa和 IOd)、俯視圖(圖1Ob)和透視圖(圖1Oc)。
圖11-16示出了本發(fā)明器械另一個實施方案的部件的透視圖。
圖17示出了圖11-16配置的一個變體的透視圖。
圖18-20示出了本發(fā)明的進一步的實施方案的側視圖和橫截面圖，其中各取樣探頭可以從操縱器中噴射出。
圖21-24顯示了另一個配置，其中機械凸輪配置可用于使初始鄰近的尖端部件在它們從操縱器噴射出前散布開(spreading)。
圖25示出玻璃可用于從樣品獲得含核酸物質而不影響擴增反應。
圖26示出為了對聚合物“DNA滅菌”而進行的UV照射對與樣品接觸后獲得含核酸物質的能力和要進行的擴增沒有任何影響。
圖27是PMMA與KOH蝕刻的PMMA之間用于D16反應的比較。曲線圖示出取自8 個重復分析的平均熔融峰。
為了顯示本發(fā)明原理的廣泛適用性，在本說明書中，某些術語可互換使用。以下索引表總結了含義相同的術語
權利要求
1.一種用于擴增核酸的方法，所述核酸來自諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源，所述方法包括(a)使取樣裝置與所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源接觸，以致在所述接觸后，含諸如哺乳動物或植物的高級真核生物核酸的物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由聚合物材料制成；(b)將所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件引入容納有進行核酸擴增反應用反應混合物的反應器，無需對所述含核酸物質進行任何預先處理；和(C)進行核酸擴增反應。
2.—種核酸取樣裝置的用途，所述核酸取樣裝置的用途是從高級真核生物來源獲得含核酸物質的樣品，并且將所述樣品引入容納有核酸擴增用反應混合物的反應器，無需對所述樣品進行預先處理，其中，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由聚合物材料制成，該聚合物材料在接觸時粘附所述含核酸物質。
3.根據權利要求1所述的方法或根據權利要求2所述的用途，其中所述聚合物材料選自以下任何材料聚碳酸酯、玻璃、諸如Topas的環(huán)烯烴共聚物、諸如PMMA的丙烯酸樹脂、 結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、諸如PDMS的硅氧烷和諸如山都平的熱塑彈性體。
4.根據權利要求1或3所述的方法或根據權利要求2或3所述的用途，其中所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源基本上是干的。
5.一種用于擴增核酸的方法，所述核酸來自諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源，所述方法包括(a)使取樣裝置與所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源接觸，以致在所述接觸后，含諸如哺乳動物或植物的高級真核生物核酸的物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源基本上是干的；(b)將所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件引入容納有進行核酸擴增反應用反應混合物的反應器，無需對所述含核酸物質進行任何預先處理；和(C)進行核酸擴增反應。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由以下任何材料制成玻璃、聚碳酸酯、諸如Topas的環(huán)烯烴共聚物、諸如PMMA的丙烯酸樹脂、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、諸如PDMS的硅氧烷和諸如山都平的熱塑彈性體。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法或用途，其中所述反應混合物基本上無離液序列聞的試劑。
8.根據權利要求1-7任一項所述的方法或用途，其中所述反應混合物基本上無細胞裂解劑。
9.根據權利要求1-8任一項所述的方法或用途，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件設置有用于所述反應器的封蓋。
10.一種核酸取樣裝置的用途，所述核酸取樣裝置的用途是從諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源獲得核酸，然后將所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源引入容納有核酸擴增反應混合物的反應器中，無需對所述核酸來源進行任何預先處理，其中所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源基本上是干的。
11.根據權利要求10所述的用途，其中所述核酸粘附到所述取樣裝置或其部件上，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由以下任何材料制成聚碳酸酯、玻璃、諸如 Topas的環(huán)烯烴共聚物、諸如PMMA的丙烯酸樹脂、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、諸如PDMS 的硅氧烷和諸如山都平的熱塑彈性體。
12.一種用于制備反應器的方法，所述反應器容納反應混合物和含核酸物質且易于進行核酸擴增反應，所述方法包括(a)提供反應器，所述反應器帶有容納進行核酸擴增反應用的反應混合物的單廂室且所述反應器是封閉的；(b)提供取樣裝置；(c)使所述取樣裝置與所述含核酸物質接觸以在所述接觸后使含核酸物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上；(d)開啟所述反應器；(e)將所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件放入所述反應器以使所述含核酸物質與所述反應混合物接觸；以及(f)再封閉所述反應器使其密封，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件仍存在于所述反應器中。
13.根據權利要求12所述的方法，其中多個反應器連接在一起，且同時制備。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件被構造成使所述含核酸物質在多個反應器之中分布。
15.根據權利要求12或13所述的方法，其中在所述取樣裝置與所述含核酸物質接觸 (步驟(C))前開啟所述反應器(步驟(d))。
16.根據權利要求12-15任一項所述的方法，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件設置有步驟(f)中的反應器的封蓋。
17.根據權利要求12-16任一項所述的方法，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由以下任何材料制成玻璃、諸如Topas的環(huán)烯烴共聚物、諸如PMMA的丙烯酸樹脂、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、諸如PDMS的硅氧烷和諸如山都平的熱塑彈性體。
18.根據權利要求12-17任一項所述的方法，其中所述反應混合物基本上無離液序列聞的試劑。
19.根據權利要求12-17任一項所述的方法，其中所述反應混合物基本上無細胞裂解劑。
20.根據權利要求12-19任一項所述的方法，其中將所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件直接放入所述反應器，取樣后無額外處理。
21.根據權利要求12-20任一項所述的方法，其中所述反應混合物用于進行以下任一種反應聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、轉錄介導擴增(TMA)、RNA信號介導擴增技術(SMART)、鏈置換擴增(SDA)、滾環(huán)擴增(RCA)、等溫多重置換擴增(MDA)、解旋酶依賴性擴增(HAD)、單引物等溫擴增(SPIA)、環(huán)式解旋酶依賴性擴增(⑶HA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。
22.根據權利要求12-21任一項所述的方法，其中所述含核酸物質是來自于諸如人的哺乳動物的來源。
23.根據權利要求12-22任一項所述的方法，其中所述含核酸物質基本上是干的。
24.一種用于擴增核酸的方法，所述方法包括根據權利要求12-23任一項所述的方法制備反應器，和在所述反應器內進行核酸擴增反應。
25.一種用于擴增核酸的方法，所述方法包括實施權利要求12-23任一項所述的方法， 移除所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件并將其放入進一步的反應器中，以及在所述進一步的反應器中進行核酸擴增反應。
26.根據權利要求25所述的方法，其中根據權利要求1制備所述進一步的反應器。
27.根據前述權利要求任一項所述的方法或用途，其中所述含核酸樣品是諸如皮膚細胞、干燥的血、干燥的精液、干燥的唾液的任何細胞、或沉積在所接觸表面的細胞物質。
28.—種試劑盒，所述試劑盒包含(a)反應器，所述反應器容納進行核酸擴增反應用反應混合物，所述反應器是封閉的；和(b)取樣裝置，所述取樣裝置與含核酸物質接觸后， 所述含核酸物質可粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中，所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件可被引入所述反應器中，且可在所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件存在下在所述反應器內進行核酸擴增反應。
29.根據權利要求28所述的試劑盒，所述試劑盒包含連接在一起的多個反應器。
30.根據權利要求28或29所述的試劑盒，其中所述取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件被構造成使所述含核酸物質在多個反應器之中分布。
31.根據權利要求28-29任一項所述的試劑盒，其中所述取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件在初始封蓋移除時設置有所述反應器的封蓋。
32.根據權利要求28-31任一項所述的試劑盒，其中所述取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件由以下任何材料制成聚碳酸酯、玻璃、諸如Topas的環(huán)烯烴共聚物、 諸如PMMA的丙烯酸樹脂、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物 30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、諸如PDMS的硅氧烷和諸如山都平的熱塑彈性體。
33.根據權利要求28-31任一項所述的試劑盒，其中所述反應器中存在的所述反應混合物如權利要求18、19或21任一項中所限定。
34.一種制備數據載體的方法，所述數據載體記錄與所述含核酸物質的核酸相關的基因型，所述方法包括實施權利要求1、5或24任一項所述的方法，測定所述含核酸物質中的核酸的基因型并在所述數據載體上記錄所述基因型。
35.一種核酸取樣裝置，包括探頭，用于支撐核酸樣本；和操縱器，能夠附接到所述探頭，從而允許操縱所述探頭，所述探頭能夠與所述操縱器分離，其中，所述探頭包括多個探頭元件，所述探頭元件能夠相對于彼此在鄰接結構與相互隔開的結構之間運動，每個探頭元件均包括尖端部件，當所述探頭元件采取其鄰接結構時，所述尖端部件其它尖端部件組合而限定拼合尖端，所述拼合尖端能夠接觸核酸以轉移該核酸的樣本。
36.根據權利要求35所述的裝置，其中被限定時的所述拼合尖端包括多個核酸觸頭， 所述核酸觸頭被分別固定到所述尖端部件并在數量上與所述尖端部件對應，使得在所述拼合尖端接觸核酸時，所述核酸觸頭中的每一個均接合大致相同量的核酸。
37.根據權利要求35或36所述的裝置，其中所述操縱器包括探頭元件啟動器，用于使所述探頭元件在鄰接結構與相互隔開的結構之間選擇性地運動。
38.根據權利要求36所述的裝置，其中所述操縱器包括細長的柄；并且所述探頭元件啟動器沿著所述柄是可移動，從而使得所述探頭元件在鄰接與相互隔開的結構之間選擇性地運動。
39.根據權利要求38所述的裝置，其中所述柄是中空的，并且所述探頭元件啟動器基本上位于所述柄的內部并且在所述柄的內部的內側可移動。
40.根據權利要求39所述的裝置，其中所述柄包括在其中形成的通孔；并且所述探頭元件啟動器經由所述通孔能夠被接觸以使所述探頭元件啟動器在所述柄的內側移動。
41.根據權利要求37所述的裝置，其中所述操縱器包括可旋轉構件，所述可旋轉構件被操作性地連接到所述探頭元件啟動器，使得所述可旋轉構件的旋轉導致所述探頭元件啟動器使所述探頭元件在鄰接結構與相互隔開的結構之間移動。
42.根據權利要求37或者引用其的任一項前述權利要求所述的裝置，其中每個探頭元件均包括在一端具有所述尖端部件的可彈性變形的細長構件；其中所述細長構件以一捆的形式設置成通過該捆的相同端處的尖端部件而靠攏彼此延伸；其中每個探頭元件是彎曲的，使得所述尖端部件趨于彼此分開；并且其中所述探頭元件啟動器包括鞘部，所述鞘部環(huán)繞該捆并且沿著該捆的元件可移動，當所述鞘部接近所述尖端部件時，所述鞘部使得所述尖端部件沿著與所述探頭元件的彈性變形方向相反的方向匯聚而限定所述拼合尖端，并且當所述鞘部沿著該捆與所述尖端部件隔開時，所述鞘部允許所述尖端部件因其彎曲的形狀和彈性變形而彼此分開。
43.根據權利要求42所述的裝置，包括一個或多個的可釋放的定位裝置，用于將所述鞘部保持在預定的位置中。
44.根據權利要求37或者引用其的權利要求38到41中的任一項所述的裝置，包括可彈性變形的薄片，所述薄片支撐多個所述探頭元件，每個所述探頭元件限定包括所述尖端部件的自由端，其中所述薄片在所述尖端部件彼此分開的結構與所述探頭元件鄰接的變形結構之間可變形，使得所述尖端部件限定所述拼合尖端。
45.根據權利要求35到44中任一項所述的裝置，還包括容器，所述容器包括可密封的開口，用于容納一種或多種試劑和核酸樣本；所述操縱器的操作導致或允許所述探頭經由所述開口插入，以便使樣本位于所述容器中。
46.根據權利要求45所述的裝置，其中所述裝置的所述探頭包括封罩，在將樣本定位在所述容器中時，所述封罩封閉所述容器而防止含核酸材料離開或進入。
47.根據權利要求46所述的裝置，其中所述封罩是不透液體的密封件或者包括不透液體的密封件，其被固定到所述探頭或者與該探頭是一體的。
48.根據權利要求46所述的裝置，包括被固定到多個所述探頭或者與多個所述探頭一體的封罩。
49.根據權利要求45到48中任一項所述的裝置，其中所述封罩和所述操縱器選擇性地彼此分尚。
50.根據權利要求35到49中任一項所述的裝置，其中所述操縱器包括保持多個所述探頭使得它們與周圍的環(huán)境隔離的源部件；以及分配機構，用于相繼地顯示所述探頭，以使與核酸接合的每一個的至少一部分露出。
51.根據權利要求50所述的裝置，其中所述源部件是容納一個或多個探頭的廂室或者包括所述廂室，所述廂室包括廂室開口，在所述分配機構操作時，所述探頭經由所述廂室開口伸出。
52.根據權利要求51所述的裝置，其中在分配時，伸出的探頭關閉所述廂室開口。
53.根據權利要求34或者引用其的任一項前述權利要求所述的裝置，其中所述操縱器包括一個或多個排出器，用于在它與所述探頭分離時從所述操縱器排出至少一個所述探頭，所述排出器或者每個排出器均能夠從所述操縱器上的遠離待排出的探頭的位置來操作。
54.根據權利要求53所述的裝置，包括多個所述探頭以及用于從所述操縱器排出一個以上的探頭的共用排出器。
55.根據權利要求53所述的裝置，包括多個所述探頭以及對應的多個排出器，各個所述排出器能夠被操作成排出每個所述探頭。
56.根據權利要求35到55中任一項所述的裝置，其中所述探頭或者每個探頭均包括尖端，或者能夠被構造成限定尖端，所述尖端能夠用于接觸核酸，從而在操作所述操縱器時， 將核酸的樣本引入到容器中。
57.根據權利要求56所述的裝置，其中至少所述尖端由含DNA或高級真核生物核酸物質能夠粘附的聚合材料制成或者包含所述聚合材料。
58.根據權利要求56所述的裝置，其中，所述聚合物材料選自聚碳酸酯、玻璃、諸如 Topas的環(huán)烯烴共聚物、諸如PMMA的丙烯酸樹脂、結晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、中抗沖聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙縮醛共聚物、聚酯、聚醚酰亞胺、聚乙烯、尼龍、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯無規(guī)共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、諸如PDMS 的硅氧烷和諸如山都平的熱塑彈性體。中抗沖聚苯乙烯乙烯-乙酸乙烯共聚物
59.根據前述權利要求任一項所述的方法、用途、試劑盒或裝置，其中，所述取樣裝置或其可粘附有所述含核酸物質的部件被處理成DNA滅菌的，或用于支撐所述核酸樣品的探頭被處理成DNA滅菌的。
全文摘要
一種用于擴增核酸的方法，所述核酸來自諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源，所述方法包括(a)使取樣裝置與所述諸如哺乳動物或植物的高級真核生物的核酸來源接觸，以致在所述接觸后含諸如哺乳動物或植物的高級真核生物核酸的物質粘附到所述取樣裝置的至少部件上，其中所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件由適合的聚合物材料制成；(b)將所述取樣裝置或其粘附有所述含核酸物質的部件引入容納有進行核酸擴增反應用反應混合物的反應器，無需對所述含核酸物質進行任何預先處理；和(c)進行核酸擴增反應。
文檔編號A61B10/00GK103069008SQ201180039888
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權日2010年6月18日
發(fā)明者保羅·杰拉爾德·德貝納姆, 戴維·約翰·莫爾 申請人:Lgc有限公司