專利名稱：呈可溶和結(jié)晶形式的長(zhǎng)效胰島素類似物制劑的制作方法
呈可溶和結(jié)晶形式的長(zhǎng)效胰島素類似物制劑相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求于2010年2月22日提交的未決美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/306，722的權(quán)益。關(guān)于聯(lián)邦政府資助研發(fā)的聲明
本發(fā)明在政府支持下完成，合作協(xié)議由國(guó)立衛(wèi)生研究院授予，合約號(hào)為NIH ROlDK40949、R01DK069764和ROl - DK74176。美國(guó)政府可享有本發(fā)明一定的權(quán)利。發(fā)明背景 用于I型糖尿病治療的胰島素強(qiáng)化療法需要皮下注射胰島素制劑或胰島素類似物制齊U。治療方案可包括每天多次注射或連續(xù)皮下輸注胰島素或胰島素類似物(“泵療法”)。尋求在進(jìn)餐期間、餐后和餐與餐之間及整個(gè)醒睡周期都對(duì)血糖濃度進(jìn)行控制。因?yàn)閮H由少數(shù)患者使用可以連續(xù)輸注的泵，所以做了大量的努力來(lái)開發(fā)短效、中效和長(zhǎng)效制劑，其通常被限定為有效作用時(shí)間分別在約4、12和18 - 24小時(shí)但可潛在持續(xù)至7、16和30小時(shí)的人胰島素制劑、哺乳動(dòng)物胰島素制劑或胰島素類似物制劑。出于避免夜間低血糖癥和/或早晨高血糖癥的需要，激發(fā)了對(duì)長(zhǎng)效胰島素制劑或長(zhǎng)效胰島素類似物制劑的特別關(guān)注。本發(fā)明涉及新型長(zhǎng)效胰島素類似物制劑的制備方法。該類制劑亦可用于治療2型糖尿病。胰島素給藥是長(zhǎng)期以來(lái)建立的糖尿病治療法。胰島素是小的球狀蛋白質(zhì)，在脊椎動(dòng)物的新陳代謝中起著重要作用。胰島素含有兩條鏈含21個(gè)殘基的A-鏈和含30個(gè)殘基的B-鏈。該激素作為Zn2+ -穩(wěn)定的六聚體儲(chǔ)存于胰腺P細(xì)胞中，但在血流中以無(wú)Zn2+的單體發(fā)揮作用。胰島素是單鏈前體胰島素原的產(chǎn)物，胰島素原中的連接區(qū)域(35個(gè)殘基)將B鏈的C-末端殘基(殘基B30)連接到A鏈的N-末端殘基上(

圖1A)。最近通過(guò)核磁共振確定，正如長(zhǎng)期想象的那樣，作為工程改造的單體的胰島素原的結(jié)構(gòu)含有胰島素-樣核心和無(wú)序的連接肽(圖1B)。認(rèn)為三個(gè)特異性二硫鍵(A6 - All、A7 - B7和A20 - B19,圖1B)的形成與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中胰島素原的氧化折疊偶聯(lián)。從ER輸出到高爾基體后，胰島素原立即裝配形成可溶的Zn2+ -配位的六聚體。在不成熟的分泌顆粒中發(fā)生內(nèi)源蛋白分解的消化并轉(zhuǎn)化成為胰島素，接著是形態(tài)上的凝聚。已用電鏡(EM)觀測(cè)到成熟貯藏粒中的鋅-胰島素六聚體的結(jié)晶體。本發(fā)明闡述胰島素類似物制劑，所述制劑引導(dǎo)新型含鋅的多六聚體裝配以改變皮下注射的活性胰島素類似物作用的持續(xù)時(shí)間。用于治療糖尿病的胰島素類似物的設(shè)計(jì)，利用了胰島素單體、二聚體和六聚體的三維結(jié)構(gòu)。胰島素單體含有三個(gè)a -螺旋、兩個(gè)P -轉(zhuǎn)角和兩個(gè)延伸片段。A-鏈由N-末端a -螺旋(殘基Al-AS)、不規(guī)則轉(zhuǎn)角(A9-A12)、第二個(gè)a -螺旋(A12-A18)和C-末端延伸(A19-A21)組成。B鏈含有N-末端臂(B1-B6)、^ -轉(zhuǎn)角(B7-B10)、中央a -螺旋(B9 - B19)、P -轉(zhuǎn)角(B20 - B23)、P -鏈(B24 - B28)和柔性C -末端殘基B29 - B30。兩條鏈組裝形成由三個(gè)二硫鍵(胱氨酸A6 - All、A7 - B7和A20 - B19)穩(wěn)定的致密球狀結(jié)構(gòu)域。已對(duì)多種晶格形式的Zn2+ -配位的胰島素六聚體進(jìn)行了廣泛的X-射線晶體學(xué)研究；多晶形限定了命名為R6的三個(gè)結(jié)構(gòu)家族。在每種情況下，都發(fā)現(xiàn)兩個(gè)Zn離子位于沿六聚體中心軸的位置(“軸鋅離子”)，每一個(gè)Zn離子與三個(gè)組氨酸側(cè)鏈(Hi Sb10)配位；在一些晶形中，已觀測(cè)到另外的低親和カ或部分被占據(jù)的鋅結(jié)合位點(diǎn)。T-態(tài)原體類似于溶液中胰島素單體的結(jié)構(gòu)。R-態(tài)原體在B-鏈的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出變化中央a -螺旋延伸至BI (R態(tài))或至B3 (破損的(fray) Rf態(tài))。三個(gè)家族的六聚體在側(cè)鏈組裝的細(xì)微特點(diǎn)上亦有差別。胰島素六聚體的皮下解體可以是注射的胰島素藥代動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素(driver) 0因此，藥用胰島素制劑設(shè)計(jì)通?；阡\胰島素六聚體的裝配或解體。例如，速效類似物可限制胰島素六聚體的自我裝配或加速六聚體的解體。另ー方面，長(zhǎng)效類似物通常減緩皮下忙庫(kù)(depot)的解體,或促進(jìn)沉淀和自我裝配。例如，關(guān)于Humalog 和NovoLog 的設(shè)計(jì)和藥代動(dòng)力學(xué)，構(gòu)成的胰島素類似物以六聚體注射，其必須解體以吸收到毛細(xì)血管中。那些類似物中的取代有助于六聚體解體以使速效胰島素制劑成為可能。相比之下，長(zhǎng)效Lantus 以初始単體和ニ聚體溶液注射，注射之后因皮下組織和體液的 緩沖，注射液的pH升高，単體和ニ聚體沉淀形成無(wú)定形的或微晶形的貯庫(kù)。這些策略取決于ー個(gè)共同原則-皮下貯庫(kù)中游離胰島素單體或ニ聚體的利用度和毛細(xì)血管對(duì)其的吸收速率之間的關(guān)系。如此開發(fā)的多種胰島素制劑提供多種藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。聯(lián)合短效、中效和長(zhǎng)效胰島素制劑或胰島素類似物制劑使得可設(shè)計(jì)日常方案來(lái)抑制血糖濃度的波動(dòng)，并因此優(yōu)化血糖控制。臨床制劑的主要種類有
普通胰島素一拓キ私PH下將速效胰島素制劑配制為可溶的鋅胰島素六聚體的透明溶液。起初作為抗微生物防腐劑引入的苯酚、間甲酚或?qū)αu基苯甲酸甲酷，亦與六聚體結(jié)合以誘導(dǎo)T — R結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。R6六聚體表現(xiàn)出比經(jīng)典的T6六聚體更高的熱力學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。類似的基于鋅的六聚體胰島素類似物制劑用于速效產(chǎn)品Humalog (Eli Lilly和Co.)和 Novolog (Novo - Nordisk)。NPH胰島素一中效胰島素制劑(NPH,中性魚精蛋白鋅胰島素(neutral protamineHagedorn))，基于R6鋅胰島素六聚體的斜方晶體的混懸液，其含有苯酚(或間甲酚)和亞化學(xué)計(jì)量濃度的精蛋白，所述精蛋白為含有多個(gè)精氨酸殘基的小的堿性肽的混合物。NPH胰島素晶體的X-射線晶體學(xué)研究表明了這些堿性肽在其與鋅胰島素六聚體結(jié)合模式的晶體中的位置。已開發(fā)了另外類似的NPH制劑-速效賴脯胰島素(insulin lispro) (Humalog 的活性組分)以允許混合方案。然而，NPH胰島素的制備很困難并昂貴精蛋白是很多衍生自精子通常為牛精子的堿性肽；產(chǎn)生NPH晶體是艱難和復(fù)雜的過(guò)程，該過(guò)程圍繞最先產(chǎn)生的均一晶種而建立。此外，NPH胰島素易于纖維化。慢胰島素(Lente Principle)一亦指胰島素鋅混懸液(IZS),通過(guò)向T6胰島素六聚體混懸液中加入過(guò)量的鋅離子(通常為20 - 30個(gè)/六聚體)來(lái)獲得人胰島素或動(dòng)物胰島素的延長(zhǎng)作用。這種大幅度的過(guò)量導(dǎo)致與低親和カ位點(diǎn)結(jié)合，并產(chǎn)生鋅胰島素絡(luò)合物的無(wú)定形沉淀(無(wú)定形的半緩慢(Semilente)或IZS)或菱形的鋅T6胰島素微晶混懸液(結(jié)晶的超緩慢(Ultralente)或IZS)。通常將對(duì)羥基苯甲酸甲酯用作防腐剤，并與T6鋅胰島素六聚體的一個(gè)面結(jié)合。超緩慢制劑比半緩慢制劑更為長(zhǎng)效，可通過(guò)混合無(wú)定形和結(jié)晶顆粒(緩慢或IZS，混合)來(lái)獲得中間時(shí)程。制造中采用了下列兩個(gè)步驟
(I)盧對(duì)游海ノ系碁# 一第一步在無(wú)防腐劑存在和PH 5. 5時(shí)，采用鋅離子和高(超過(guò)生理學(xué)上的)濃度的氯離子(1.2 M NaCl)形成微晶種混懸液。前體晶體屬于空間群R3且含有T3Rf3鋅胰島素六聚體，其中每個(gè)六聚體共結(jié)合四個(gè)鋅離子(電荷為+8)和七個(gè)氯離子(電荷為-7)，共同提供的六聚體的形式電荷為+1。和普通制劑的R6六聚體不同，該前體六聚體僅含有一個(gè)軸向的鋅離子，其位于T6三聚體之中。其它三個(gè)鋅離子在Rf3三聚體內(nèi)離軸。HisB1°與HisB5及兩個(gè)氯離子一致轉(zhuǎn)動(dòng)而改變(flip)其構(gòu)象以形成四面體的鋅離子結(jié)合位點(diǎn)。這些離軸的位點(diǎn)鄰近典型R6六聚體中的苯酚結(jié)合袋。超緩慢前體晶體的六聚體內(nèi)部的離軸鋅離子結(jié)合位點(diǎn)與本發(fā)明的界面/六聚體之間的鋅結(jié)合位點(diǎn)無(wú)關(guān)。(2)產(chǎn)緩漫籍海蓄邊貧一為獲得超緩慢微結(jié)晶混懸液，將晶種稀釋到含對(duì)羥基苯甲酸甲酯、較低濃度氯離子(120 mM)和較高濃度鋅離子的pH 7. 4的緩沖液中。晶體由空間群R3中的T6胰島素六聚體組成。由于制劑中非常高的鋅離子濃度(例如>5個(gè)/胰島素分子)，在每個(gè)六聚體中觀測(cè)到額外的鋅離子。除正常的兩個(gè)軸向鋅離子外，觀測(cè)到相互排斥的非典型、弱結(jié)合的兩個(gè)位點(diǎn)之一的部分占據(jù)亦位于六聚體的中心。無(wú)足夠質(zhì)量的電子密度來(lái)分析結(jié)合的氯離子。成熟超緩慢晶體的六聚體內(nèi)部的離軸鋅離子結(jié)合位點(diǎn)亦與本發(fā)明的界面/六聚體之間的鋅結(jié)合位點(diǎn)無(wú)關(guān)。 亦已知具延伸B -鏈的胰島素類似物，其用超過(guò)2個(gè)鋅/六聚體形成六聚體。具以下取代組的人胰島素分別與6. 5,5. 3,6. 7和5個(gè)鋅/六聚體形成穩(wěn)定絡(luò)合物GlyA21 -HisB31 - HisB32、GlyA21 - HisB31 - HisB32 - ArgB33、GlyA21 - AlaB31 - HisB32 - HisB33和 GlyA21 - AlaB31 - HisB32 - HisB33 - ArgB34。這些絡(luò)合物(尤其是 GlyA21 - AlaB31 -HisB32-HisB33-ArgB34)在狗中亦顯示長(zhǎng)期的藥代動(dòng)力學(xué)。這可能是由于在各六聚體中，額外的鋅離子與A-鏈的a -氨基和B-鏈C-末端的新組氨酸之間結(jié)合。算它一通過(guò)在皮下注射透明的酸性胰島素類似物溶液(甘精胰島素(insulinglargine), Lantus 的活性組分,Sanofi - Aventis)來(lái)實(shí)現(xiàn)作用的延長(zhǎng),其中胰島素類似物的等電點(diǎn)已通過(guò)修飾人胰島素的多肽序列偏移到7.0至7. 4之間。因在皮下組織pH (pH
7.4)下的沉淀而形成長(zhǎng)效貯庫(kù)。亦可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)作用的延長(zhǎng)通過(guò)非極性部分共價(jià)修飾胰島素(地特胰島素(insulin detemir)，Levimir 的活性組分；Novo - Nordisk)，以增強(qiáng)其在皮下貯庫(kù)中的疏水性，并使之與血清白蛋白結(jié)合以延遲從血流中的清除。過(guò)去感興趣的有動(dòng)物胰島素(例如豬的和牛的)的混合物，所述混合物利用它們?cè)谌芙庑陨系牟町?。本發(fā)明創(chuàng)新利用非軸鋅離子(non-axial zinc ion)來(lái)延長(zhǎng)本文提供的胰島素類似物制劑作用的持續(xù)時(shí)間。本領(lǐng)域所知的先前對(duì)鋅離子的利用如下。普通胰島素制劑和相應(yīng)的速效制劑Humalog 和Novalog 利用鋅離子來(lái)引導(dǎo)和穩(wěn)定胰島素六聚體的裝配。六聚體由通過(guò)中心三重對(duì)稱軸相聯(lián)的三個(gè)胰島素二聚體組成。每一胰島素六聚體或胰島素類似物六聚體含有兩個(gè)位于六聚體三重對(duì)稱軸的鋅離子。這些“軸鋅離子”與HisB1°的咪唑環(huán)進(jìn)行配位。在R6六聚體中，認(rèn)為配位幾何結(jié)構(gòu)是四面體；因此每一個(gè)鋅離子結(jié)合三個(gè)對(duì)稱相關(guān)的HisB1°殘基，且氯離子占據(jù)第四個(gè)配位點(diǎn)。兩個(gè)軸鋅離子(電荷+4)和兩個(gè)配位氯離子(電荷-2)共給六聚體的總形式電荷增加+2。該結(jié)構(gòu)中沒有非軸鋅離子。野生型NPH胰島素微晶體的單晶X -射線衍射研究顯示，每個(gè)六聚體中有兩個(gè)軸鋅離子而沒有另外的鋅離子。晶格為具有空間群斜方晶，這導(dǎo)致與本發(fā)明不一致的六聚體-六聚體組裝模式(如下)。目前治療糖尿病使用的大部分胰島素產(chǎn)品含有序列不同于天然人胰島素序列的胰島素類似物。已廣泛研究了胰島素A-和/或B-鏈中氨基酸的取代對(duì)皮下注射后胰島素作用的藥代動(dòng)力學(xué)的可能有利的影響。本領(lǐng)域所知的實(shí)例含有加速或延緩吸收時(shí)程的取代。前者的類似物總體定義為“進(jìn)餐時(shí)間”胰島素類似物，因?yàn)樘悄虿』颊呖赡茉谶M(jìn)餐時(shí)注射所述速效制劑；而延緩吸收的野生型人胰島素或動(dòng)物胰島素(例如豬胰島素或牛胰島素)使得有必要在餐前30 - 45分鐘注射這些制劑。設(shè)計(jì)取代以通過(guò)改變亞単位界面的空間或靜電互補(bǔ)性而使鋅胰島素六聚體去穩(wěn)定化，并從而有助于皮下給予后鋅胰島素六聚體的快速解離。將進(jìn)餐時(shí)間胰島素類似物配制成鋅-胰島素類似物六聚體的透明溶液(pH7. 4) (Humalog 和Novalog ),或配制為處于平衡的含有單體、ニ聚體、三聚體、四聚體和六聚體的無(wú)鋅溶液(Apidra ；Sanofi - Aventis)。雖然在磷酸鹽緩沖的鋅溶液(類似于在人胰島素和動(dòng)物胰島素的普通制劑中長(zhǎng)期采用的)中配制Humalog 和Novalog ,但不像本領(lǐng)域所知的先前普通制劑，其裝配為鋅胰島素六聚體需要苯酚、間甲酚或其它特異性配體的結(jié)合以穩(wěn)定突變型胰島素六聚體。本領(lǐng)域已知，用多種多樣的氨基酸取代物(除半胱氨酸外)來(lái)取代ProB28，使鋅胰島素六聚體不穩(wěn)定，其程度類似于Aspb28和LysB28，所述取代任選包括B29的脯氨酸取代。本領(lǐng)域亦知長(zhǎng)效胰島素類似物，其在12 - 24小時(shí)內(nèi)的緩慢吸收意欲提供對(duì)血糖濃度的基礎(chǔ)控制。所述類似物例如但不限于[GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰島素(甘精胰島 素或Lantus )，可設(shè)計(jì)含有氨基酸取代和/或A-或B-鏈的延伸，以將胰島素類似物的等電點(diǎn)偏移至PH 7.0和7. 4之間。通常在pH < 5下，將類似物配制成含有可溶的胰島素單體、ニ聚體和高階低聚體的透明溶液，在PH < 5的條件下鋅-介導(dǎo)的裝配因HisB1°的質(zhì)子化作用而受損。通過(guò)因PH偏移到7. 4而致的皮下組織中胰島素類似物的聚集和沉淀來(lái)實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)的吸收。以Lantus 出售的胰島素制劑含有在pH 4的溶液中制為0. 6 mM的活性類似物[GlyA21, ArgB31, ArgB32]-胰島素(甘精胰島素)，其通過(guò)在無(wú)活性的組分間甲酚(2.7mg/ml 或 25 mM)、甘油(17 mg/ml 或 185 mM)、聚山梨醇酯-20 (20 y g/ml)和(30 iig 鋅離子/ml或0. 52 mM)存在下加入等分試樣的稀HCl或NaOH來(lái)制備。Lantus 的U - 100溶液含有0.60 mM [GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰島素。因?yàn)楸绢I(lǐng)域已知在野生型胰島素中，AsnA21經(jīng)受酸催化的化學(xué)變化，所以GlyA21取代的目的是避免在酸性溶液中的所述化學(xué)降解。本領(lǐng)域亦已知，另ー類型的長(zhǎng)效胰島素類似物的示例為地特胰島素(商品名Levemi/)，其中殘基ThrB3°已缺失，C14脂肪酸鏈與LySB29的側(cè)鏈(分子量5912. 9道爾頓)連接。脂肪酸鏈增加胰島素分子的疏水性，而疏水性與皮下貯庫(kù)中的延遲吸收有夫。脂肪酸鏈亦介導(dǎo)胰島素類似物與血清白蛋白的結(jié)合，并因此延長(zhǎng)其循環(huán)壽命。將地特胰島素配制成可溶的鋅-胰島素類似物六聚體(14. 2 mg/ml或2. 5 mM胰島素單體單位，定義為U - 100溶液)透明溶液，其在無(wú)活性的賦形劑氯化鈉(I. 17 mg/ml)、間甲酚(2.06 mg/ml)、苯酚(I. 80 mg/ml mM)、甘露醇(30 mg/ml)和鋅離子(65. 4 u g/ml或I. I mM)存在下，用磷酸鈉(0. 89 mg/ml ニ鈉ニ水合物)將pH緩沖為7. 4。鋅離子濃度相當(dāng)于每個(gè)六聚體大約2. 6個(gè)鋅離子的比率。相對(duì)于野生型人胰島素，地特胰島素的摩爾活性降低約4倍。在鋅離子和苯酚存在吋，des - ThrB30/C14 - Lyse29 -修飾的胰島素類似物的晶體結(jié)構(gòu)類似但不等同于存在于其制劑中的結(jié)構(gòu)，所述制劑描述了在晶體晶格中的六聚體之間填充有脂肪酸的天然樣R6六聚體。在皮下貯庫(kù)中形成的地特胰島素的物理狀態(tài)和結(jié)構(gòu)尚不為本領(lǐng)域所知。因此，有必要對(duì)胰島素類似物進(jìn)行聯(lián)合取代，其可在鋅胰島素類似物的六聚體表面和六聚體之間聯(lián)合產(chǎn)生新的鋅-結(jié)合位點(diǎn)，并借此提供長(zhǎng)效皮下蛋白貯庫(kù)的形成。
胰島素屬于脊椎動(dòng)物胰島素-相關(guān)蛋白超家族，包括(除胰島素自身外)胰島素-相關(guān)生長(zhǎng)因子I和II (IGF - I和IGF - II)、松弛素和松弛素-相關(guān)因子。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出同源的a -螺旋結(jié)構(gòu)域和二硫鍵。IGF是含有A-和B結(jié)構(gòu)域、間插連接的(C)結(jié)構(gòu)域和C-末端D結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽；由于蛋白水解加工，胰島素和松弛素-相關(guān)因子含有兩條鏈(命名為A和B)。然而，在整個(gè)脊椎動(dòng)物胰島素-相關(guān)超家族中，六個(gè)基序特異性的半胱氨酸和所選的核心殘基大體保守，其它殘基受限于特定蛋白質(zhì)，這賦予其功能特異性。胰島素和IGF充當(dāng)受體酪氨酸 激酶(胰島素受體(IR)和I類IGF受體(IGF - IR))的配體，而松弛素和相關(guān)因子與G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合。胰島素與IR的結(jié)合最強(qiáng)，與IGF- IR的結(jié)合弱，與GPCR無(wú)可檢測(cè)的結(jié)合。IGF - I與IGF - IR的結(jié)合最強(qiáng)，與IR的結(jié)合弱，與GPCR無(wú)可檢測(cè)的結(jié)合。胰島素與IGF - IR的交叉結(jié)合可觸發(fā)有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括與癌細(xì)胞增殖有關(guān)的途徑。通過(guò)使用含有氨基酸取代(其降低所述交叉結(jié)合程度)的胰島素類似物，可提高糖尿病治療中胰島素補(bǔ)償療法的長(zhǎng)期安全性。所述氨基酸取代將提高胰島素類似物對(duì)IR的親和力與對(duì)IGF - IR的親和力的比率。因此，需要長(zhǎng)效胰島素類似物制劑，其中活性組分(單體形式的胰島素類似物組分)表現(xiàn)出對(duì)IGF - IR的固有親和力降低，胰島素類似物對(duì)IR的親和力與對(duì)IGF - IR的親和力的比率增加，其中每種情況均相對(duì)于野生型人胰島素而言。甘精胰島素與胰島素-樣生長(zhǎng)因子I (IGF - I)的I型受體的結(jié)合比人胰島素更強(qiáng)。該受體(IGF-IR)可介導(dǎo)有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并抑制凋亡。估計(jì)IGF- IR結(jié)合及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)程度在因數(shù)I. 4和14之間，這取決于所采用的體外測(cè)定或基于細(xì)胞的測(cè)定。所述IGF- IR結(jié)合及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)與培養(yǎng)物中人癌細(xì)胞系增殖的增加有關(guān)。在配制條件下的或在皮下貯庫(kù)中形成的[GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰島素的物理狀態(tài)或分子結(jié)構(gòu)尚不為本領(lǐng)域所知。十多年前，首次提出了對(duì)表現(xiàn)出對(duì)IGF-IR的相對(duì)或絕對(duì)親和力增加的胰島素類似物的安全性憂慮，這是因?yàn)槿税┘?xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)研究中AspB1°-胰島素(相對(duì)于人胰島素)的有絲分裂原活性(mitogenicity)增強(qiáng)以及因?yàn)橛肁spB1° -胰島素處理(相對(duì)于用人胰島素處理)的Sprague - Dawley大鼠的乳腺癌發(fā)病率的增加，因此，不繼續(xù)將Aspmo -胰島素作為臨床上人用的胰島素類似物制劑。最近，對(duì)Lantus 也提出了類似的擔(dān)憂，Lantus 亦表現(xiàn)出與IGF - IR的交叉結(jié)合增強(qiáng)并在人細(xì)胞培養(yǎng)物中的有絲分裂原活性增力口。最近對(duì)超過(guò)120，000例經(jīng)Lantus 治療的歐洲糖尿病患者的回顧性病例研究表明，各種癌癥的發(fā)病率為劑量依賴性增加，所述癌癥包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌。不僅與IGF- IR交叉結(jié)合水平的升高可增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的程度，而且Lantus 與IR親和力的降低亦可增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的程度。因此，在目前的臨床使用中，相對(duì)于野生型胰島素或其它胰島素類似物，[GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰島素的受體結(jié)合選擇性(IR締合常數(shù)與IGF - IR締合常數(shù)之比)反常地降低。人胰島素本身可與IGF - IR結(jié)合，但其在體外與去垢劑溶解的和凝集素純化的受體親和力比其與IR的結(jié)合低333倍。進(jìn)餐時(shí)間胰島素類似物例如Humalog 和Novolog 表現(xiàn)出相似的與IGF - IR的交叉結(jié)合水平(已報(bào)道賴脯胰島素與IGF - IR (Humalog 的活性組分)的交叉結(jié)合有輕微的增加)。流行病學(xué)研究顯示了內(nèi)源性超高胰島素血癥(在代謝綜合征中和2型糖尿病早期階段中對(duì)胰島素抗性的代償性反應(yīng))和癌癥(特別是結(jié)直腸癌)流行増加的關(guān)聯(lián)性。用高劑量的人胰島素或胰島素類似物來(lái)治療胰島素抗性的患者亦與癌癥風(fēng)險(xiǎn)的増加有關(guān)，這可反映與IGF - IR交叉結(jié)合的基線水平。對(duì)于所述患者，關(guān)于累積的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，有可能即使是人胰島素和進(jìn)餐時(shí)間胰島素類似物的基線受體特異性仍不足以嚴(yán)格確保長(zhǎng)期治療的安全性。不希望受理論的限制，慎重建議，為治療糖尿病而設(shè)計(jì)的胰島素類似物的受體結(jié)合選擇性應(yīng)等于或大于野生型人胰島素受體結(jié)合的選擇性。胰島素類似物對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)不需要精確水平的人胰島素與IR結(jié)合。在體內(nèi)可通過(guò)延緩從血液中清除類似物來(lái)補(bǔ)償類似物對(duì)IR親和カ的降低。發(fā)生所述補(bǔ)償是因?yàn)橐葝u素的清除由其與IR的結(jié)合介導(dǎo)。但與IR的親和カ降低三倍的胰島素類似物在體內(nèi)仍可表現(xiàn)出與人胰島素相似的效價(jià)?？赏ㄟ^(guò)增加類似物的注射量來(lái)補(bǔ)償親和力的進(jìn)ー步降低。具有所述降低的親和カ的胰島素類似物的實(shí)例為甘精胰島素(Lantus )和地特胰島素(Levemi/)。胰島素類似物與IR的親和カ的變化通常反映解離速率的變化親和カ降低與激素在受體上的駐留時(shí)間縮短有關(guān)，而親和カ的增強(qiáng)與駐留時(shí)間的延長(zhǎng)有夫。尚不知駐留時(shí)間和代謝效カ之間或駐留時(shí)間與有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的總體關(guān)系。業(yè)已提議，延長(zhǎng) Aspmo -胰島素在IR復(fù)合物上的駐留時(shí)間至少部分引起其有絲分裂原活性增強(qiáng)。不希望受理論的限制,過(guò)去的經(jīng)驗(yàn)教導(dǎo),在體外與IR的相對(duì)親和力為人胰島素的20%至200%之間的胰島素類似物可有效治療哺乳動(dòng)物糖尿病。因此，在控制血糖濃度中，需要表現(xiàn)出與IGF - IR的交叉結(jié)合降低、且作用的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)同時(shí)又保持類似物的至少部分生物學(xué)活性的胰島素類似物。具體而言，在控制血糖濃度中，需要表現(xiàn)出從皮下貯庫(kù)的吸收延遲，但一旦吸收到血液中，又表現(xiàn)出與IGF-IR的親和カ降低，同時(shí)還保持類似物的至少部分生物學(xué)活性的胰島素類似物。在控制血糖濃度中，還需要表現(xiàn)出等電點(diǎn)朝向中性值增加而與IGF-IR的親和カ不增加，同時(shí)保持類似物的至少部分生物學(xué)活性的胰島素類似物。與人胰島素相比，由于A -鏈和/或B -鏈中氨基酸取代的存在，或因A -鏈和/或B-鏈的可能延伸以產(chǎn)生更大分子，因而可以改變胰島素類似物的生物學(xué)、物理學(xué)和化學(xué)性質(zhì)。胰島素類似物的研究表明，含有兩個(gè)或多個(gè)修飾的類似物的性質(zhì)無(wú)法基于含有相應(yīng)單個(gè)修飾的類似物組的性質(zhì)來(lái)可靠地預(yù)測(cè)。因?yàn)榉肿又幸粋€(gè)位點(diǎn)的氨基酸取代或鏈延伸可導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象、動(dòng)力學(xué)或溶劑化的傳遞改變，所以分子中另ー個(gè)位點(diǎn)的氨基酸取代的影響與不存在第一修飾時(shí)的相同取代的影響可不同。ArgA°-胰島素晶體結(jié)構(gòu)的變形，提供了不曾預(yù)料到的傳遞修飾效應(yīng)的實(shí)例，所述變形與受體結(jié)合的降低有夫。因此，包括ArgA°的A -鏈的N-末端延伸，改變了殘基A4、A8和其它位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)環(huán)境?？傮w上插入了ー個(gè)或多個(gè)堿性殘基(Arg或Lys)的氨基酸取代或鏈延伸導(dǎo)致等電點(diǎn)往中性的向上偏移；偏移的程度受結(jié)構(gòu)、溶劑化和伴隨修飾的構(gòu)象變化傳遞的影響，所以經(jīng)驗(yàn)教導(dǎo)，単獨(dú)氨基酸的性質(zhì)不能良好預(yù)測(cè)實(shí)測(cè)的P〗。不希望受理論的限制，經(jīng)驗(yàn)教導(dǎo)，基于含有單個(gè)修飾的類似物的性質(zhì)，不可預(yù)期兩個(gè)或多個(gè)修飾的聯(lián)合效應(yīng)。因此有可能的是，新的修飾組合可一起具有這樣的性質(zhì)，其為胰島素類似物在治療糖尿病的治療用途中提供獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及含有多個(gè)組氨酸取代的胰島素類似物制劑，所述多個(gè)組氨酸取代可在鋅胰島素類似物的六聚體表面和六聚體之間組合產(chǎn)生新的鋅-結(jié)合位點(diǎn)，并借此使得能夠形成長(zhǎng)效皮下蛋白貯庫(kù)。更具體地，本發(fā)明提供含有在A4和AS的成對(duì)組氨酸取代且在A21有或沒有取代的胰島素類似物，并且提供用于皮下給予以實(shí)現(xiàn)作用持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)的制劑。不希望限制(condition)關(guān)于任何特定理論的專利性,認(rèn)為這些位點(diǎn)的各側(cè)鏈在其裝配成胰島素六聚體時(shí)從A-鏈表面伸向溶劑，從而提供部分新的鋅-離子-結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與毗鄰六聚體中的互補(bǔ)側(cè)鏈突出聯(lián)合，使得在毗鄰的胰島素類似物六聚體之間產(chǎn)生鋅-離子-橋聯(lián)相互作用。如圖IE所示，野生型T3Rf3胰島素六聚體包含上列(T3H聚體；圓角矩形)和下列(Rf3三聚體；尖角矩形)，其中每一列含有中軸鋅離子(灰色圓圈)。圖IF提供晶格中變體六聚體的堆積示意圖，認(rèn)為所述堆積因本發(fā)明制劑中HisA4和HisA8的取代而發(fā)生。每一橋連鋅離子層(黑色圓圈)由每一個(gè)T-態(tài)原體(未顯示)的HisA4和HisA8及上述Rf-態(tài)原體的HisA4側(cè)鏈(垂直片段)配位。同樣不希望限制關(guān)于任何特定理論的專利性，這種取代組合亦增強(qiáng)胰島素類似物的受體結(jié)合選擇性并降低與IGF - IR的絕對(duì)親和力。本發(fā)明的另一方面提供了約pH 4下的長(zhǎng)效胰島素類似物制劑，當(dāng)其pH偏移為6-7.4時(shí)，其形成微結(jié)晶混懸液。在一個(gè)具體實(shí)例中，制劑以至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的相對(duì)濃度含有鋅離子。因此，該制劑能夠皮下注射給個(gè)體，然后在暴露于生 理PH時(shí)形成皮下貯庫(kù)。該制劑與同一物種的野生型胰島素相比，可另外表現(xiàn)出對(duì)IGF受體的親和力降低，并保持野生型胰島素對(duì)同物種胰島素受體的親和力的至少20%。在胰島素的天然結(jié)構(gòu)中，殘基Al-AS包含a -螺旋。認(rèn)為該片段促成胰島素和胰島素類似物與IR和IGF - IR 二者的結(jié)合。不希望限制關(guān)于任何特定理論的專利性，認(rèn)為暴露于溶劑中的殘基GIua4和ThrA8 (在IGF - I中不保守)的取代可良好容忍胰島素類似物與IR的結(jié)合，并仍然接近激素-受體界面。本領(lǐng)域已知，當(dāng)在酸性條件下配制時(shí)，通過(guò)Gly取代AsnA21可延緩胰島素類似物的化學(xué)降解。因此，希望提供這樣的胰島素類似物，其提供鋅-依賴性的長(zhǎng)效皮下蛋白貯庫(kù)，并在降低與I型IGF受體的交叉結(jié)合時(shí)保留對(duì)胰島素受體的高親和力。不希望受理論的限制，亦希望提供這樣的胰島素類似物，其中胰島素類似物六聚體中結(jié)合的非軸鋅離子的兩個(gè)正電荷促成其裝配-依賴性等電點(diǎn)的進(jìn)一步偏移。亦希望提供這樣的胰島素類似物，其中在位點(diǎn)A4和AS的成對(duì)組氨酸側(cè)鏈可促成晶格中胰島素類似物六聚體之間新界面的鋅-離子結(jié)合位點(diǎn)。再次不希望受理論的限制，所述界面的鋅離子可延遲六聚體之間和六聚體之中的高階接觸的解體，以延長(zhǎng)胰島素類似物作用的持續(xù)時(shí)間。胰島素或胰島素類似物的Al-A8 a -螺旋通過(guò)其帶電位點(diǎn)、中性位點(diǎn)、a -螺旋偶極矩和相互的靜電相互作用來(lái)促成其等電點(diǎn)(PD。再次不希望受理論的限制，通過(guò)去除酸性殘基(發(fā)生在用His取代GIua4時(shí))將預(yù)期pi向上偏移但不超過(guò)pH 6. 5。pi的微小變化可能與在位點(diǎn)A4或AS的組氨酸殘基的插入有關(guān)，這取決于所取代的組氨酸的局部PKa (通常為6和7之間)。再次不希望受理論的限制，在人胰島素的A4位點(diǎn)觀測(cè)到了酸性殘基。預(yù)期用Gly、Ala或其它中性側(cè)鏈來(lái)取代AsnA21，將不會(huì)導(dǎo)致pi的顯著變化；預(yù)期用堿性側(cè)鏈(Arg或Lys)來(lái)取代，將會(huì)導(dǎo)致pi的進(jìn)一步向上偏移；預(yù)期用Asp來(lái)取代(可發(fā)生在在酸性溶液中儲(chǔ)存時(shí)天然AsnA21側(cè)鏈的脫酰胺化時(shí))，將會(huì)導(dǎo)致pi的下移。結(jié)合到胰島素類似物六聚體表面或結(jié)合在鋅胰島素類似物六聚體之間界面位點(diǎn)的非軸鋅離子，亦可促成六聚體或多-六聚體復(fù)合物的總電荷，并因此影響其在皮下貯庫(kù)中的PH 7. 4下的溶解性。
因此，亦希望提供這樣的胰島素類似物，其表現(xiàn)出上述受體結(jié)合性質(zhì)，亦表現(xiàn)出等電點(diǎn)向上偏移但不超過(guò)中性，以便在非典型鋅離子結(jié)合在胰島素類似物六聚體表面或六聚體之間時(shí)，氨基酸取代和另外結(jié)合的鋅離子的聯(lián)合效應(yīng)使得復(fù)合物在皮下貯庫(kù)中的PH 7. 4下不可溶。因此，亦希望提供在酸性pH下為透明溶液的胰島素類似物的可溶制劑，其在用注射器皮下注射時(shí)便于操作、便于精確調(diào)整劑量，并可通過(guò)計(jì)量筆(pen)進(jìn)行精確計(jì)量的遞送。亦希望提供作為用于中性PH下胰島素類似物微結(jié)晶混懸液的基礎(chǔ)的結(jié)晶方法，該方法可賦予在首次使用產(chǎn)品后于室溫下増加的貯藏期限和穩(wěn)定性。一般而言，治療患者的方法包括將生理學(xué)上有效量的胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽給予患者，其中所述類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有經(jīng)修飾的胰島素A-鏈序列，所述修飾為在位點(diǎn)A4和A8被成對(duì)的組氨酸取代，且可能在A21有另外的修飾。在一個(gè)實(shí)例中，A21側(cè)鏈?zhǔn)翘烊坏腁sn殘基。在另ー個(gè)實(shí)例中，A21側(cè)鏈?zhǔn)荊ly。在另ー個(gè)實(shí)例中，A21取代可為Ala、Thr或Ser。 胰島素類似物可為任何脊椎動(dòng)物胰島素的類似物，或含有本領(lǐng)域所知的經(jīng)修飾B -鏈以改變皮下注射后吸收的胰島素類似物。在一個(gè)實(shí)例中，胰島素類似物是哺乳動(dòng)物胰島素類似物，例如人、鼠、嚙齒動(dòng)物、牛、馬或犬的胰島素類似物。在另外的實(shí)例中，胰島素類似物為羊、鯨、大鼠、象、豚鼠或毛絲鼠胰島素的類似物。具體胰島素類似物包括含有如SEQ. ID. NO. 4 - 6或14中任ー個(gè)所提供的A-鏈序列和如SEQ. ID. NO. 7-12中的任ー個(gè)的B-鏈序列的胰島素類似物。核酸可編碼具有這些序列之一的多肽。所述核酸可以是可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的一部分。附圖中數(shù)個(gè)視圖的簡(jiǎn)述
圖IA是人胰島素原序列的示意圖，包括A-鏈和B-鏈及顯示有側(cè)翼ニ堿基切割位點(diǎn)的連接區(qū)域(實(shí)心圓圈)和C -肽(空心圓圈)。圖IB提供胰島素原的結(jié)構(gòu)模型，由胰島素-樣部分和無(wú)序的連接肽(虛線)組成。圖IC提供了所提出的經(jīng)由單體的部分解折疊而使胰島素的原纖維形成的途徑示圖。天然態(tài)受典型的自我裝配的保護(hù)(最左邊)。解體導(dǎo)致天然単體和部分折疊單體(分別為空心三角形和梯形)之間的平衡。該部分折疊可因途徑中斷事件(off-pathway event)而完全解折疊(空心圓圈)，或聚集形成核并轉(zhuǎn)變?yōu)?en route to)原絲(最右邊)。圖ID為人胰島素序列的示意圖，其標(biāo)示了 A -鏈中殘基AS的位置和本領(lǐng)域所知的賦予皮下注射后快速吸收的B-鏈中的取代位點(diǎn)。圖IE是野生型T3Rf3胰島素六聚體的示意圖，其包含上列(T3三聚體；圓角矩形)和下列(Rf3三聚體；尖角矩形)，其中每一列含有軸鋅離子(灰色圓圈)。圖IF是晶格中變體六聚體堆疊的示意圖，其中三個(gè)橋連鋅離子層(黒色圓圈)的每ー個(gè)均由每ー個(gè)T-態(tài)原體(圓角矩形)的HisA4和HisA8以及來(lái)自Rf-態(tài)原體(尖角矩形)的HisA4側(cè)鏈(垂直片段)配位。圖2a提供野生型胰島素序列和(上面組)甘精胰島素(Lantus' Sanofi -Aventis)的修飾位點(diǎn)及(下面組)本發(fā)明類似物。以黑色和灰色表示野生型A -鏈和B-鏈序列；以黑線標(biāo)示ニ硫鍵(A6 - All、A7 - B7和A20 - B19)。甘精胰島素含有B -鏈的兩個(gè)殘基延伸(ArgB31和ArgB32)和AsnA21 — Gly取代(上面組紅色)。內(nèi)源的皮下蛋白酶可從甘精胰島素延伸B-鏈中緩慢去除一個(gè)或兩個(gè)Arg殘基，這部分緩和了其增強(qiáng)的有絲分裂原活性。本發(fā)明類似物含有成對(duì)的(i，i+4)取代GIua4 — His和Th, — His (下面組)。長(zhǎng)效類似物地特胰島素(Levemir ,Novo - Nordisk)通過(guò)附著于白蛋白_結(jié)合元件而起作用(未顯示)。圖2b提供胰島素單體的帶狀模型，其描繪通過(guò)在Al-ASa -螺旋的外表面形成的推定的鋅-離子結(jié)合位點(diǎn)部分。A-鏈和B-鏈條帶分別用黑色和灰色表示。圖2c描繪野生型T3Rf3胰島素六聚體的結(jié)構(gòu)。六聚體中兩個(gè)軸鋅離子在中心對(duì)齊，通過(guò)三聚體-相關(guān)HisB1°側(cè)鏈(淺灰色)來(lái)配位。A-鏈以黑色表示，B-鏈以灰色表示(Rf-特異性的BI-B8 a -螺旋)。從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)1TRZ)獲得野生型的結(jié)構(gòu)。 圖2d描繪變體[HisA4，HisA8]T3Rf3胰島素六聚體的結(jié)構(gòu)。六聚體中兩個(gè)軸鋅離子在中心對(duì)齊，通過(guò)三聚體-相關(guān)HisB1°側(cè)鏈(淺灰色)來(lái)配位。變體六聚體在T3三聚體表面(表面球體)含有三個(gè)非-典型的鋅離子?；疑@示的為來(lái)自毗鄰六聚體HisA4、HisA8和第三HisA4’的側(cè)鏈。每種情況下都以黑色表示A -鏈，以灰色表示B -鏈(Rf -特異性的BI -B8 a -螺旋)。圖2e闡明2F。- F。電子密度圖(在I s處用輪廓表示的立體配對(duì)(stereo pair)),其顯示T-態(tài)原體中由HisA4和HisA8形成的新的鋅-離子結(jié)合位點(diǎn)。由殘基A4’(屬于毗鄰六聚體中的Rf-態(tài)原體)完成變形的四面體配位。圖3A描繪野生型六聚體-六聚體的組裝。(左)在每一六聚體中上面的三聚體具有丁3構(gòu)象，下面的三聚體為Rf3。顯示了鄰近殘基A4和AS的界面水分子(較小的球體)和軸鋅離子(較大的球體)。以灰色表示A -鏈，以黑色表示B -鏈。T -和R原體在BI - B9的二級(jí)結(jié)構(gòu)上不同，其為延伸的(T)或螺旋的(R);殘基BI和B2在“破損”Rf態(tài)中是無(wú)序的。(右)左邊加框區(qū)域的放大?？拷撞康妮^大球體為底部六聚體中T3H聚體的軸鋅離子。箭頭標(biāo)示了上面的Rf3三聚體中的Rf-態(tài)殘基GluA4’。圖3B描繪鋅-介導(dǎo)的[HisA4，HisA8]-胰島素的六聚體_六聚體組裝上面的三聚體具有T3構(gòu)象，下面的三聚體為Rf3。顯示了軸鋅離子和A4-A8-A4’配位的鋅離子。以灰色表示A-鏈，以黑色表示B-鏈。(右)加框區(qū)域的放大。在六聚體-六聚體界面處觀測(cè)到三個(gè)新的鋅離子。箭頭標(biāo)示了 Rf-態(tài)側(cè)鏈HisA4’(來(lái)自頂部六聚體的底部三聚體)，其使界面的鋅-結(jié)合位點(diǎn)完善。圖3C提供顯示[HisA4，HisA8]-胰島素六聚體的T和Rf面的CPK模型{左和右)。視圖相對(duì)于組圖3b旋轉(zhuǎn)了 90°。顯示了三個(gè)非-典型鋅離子與HisA4和HisA8的側(cè)鏈結(jié)合。白色十字叉標(biāo)示氯離子的位置；其它的圖解同圖3B。圖3D提供立體配對(duì)，其顯示與Rf原體的HisA4’和T原體的HisA4 - HisA8有關(guān)的非-典型鋅離子(深灰色的大球體)、氯離子(重疊的淺灰色球體)和三個(gè)結(jié)合的水分子(較小球體)。結(jié)合的水分子參與Rf中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，其涉及GluB4’的側(cè)鏈羧基(carboxylate)、TyrB26的對(duì)位_ OH和ProB28的羰基氧(標(biāo)記的)。圖3E描繪探測(cè)胰島素或胰島素類似物與IR的高親和力結(jié)合(左邊三條曲線；實(shí)線)以及與IGF-IR的低親和力交叉結(jié)合(右邊三條曲線；虛線)的競(jìng)爭(zhēng)性取代測(cè)定結(jié)果。顯示了每一組中的結(jié)果野生型胰島素U)、甘精胰島素_i和HisA4，HisA8_胰島素IT)。HisA4，HisA8_胰島素的受體結(jié)合選擇性的提高是因?yàn)槠銲R -結(jié)合滴定向左偏移及其IGF - IR -結(jié)合滴定向右偏移。表2和3提供了相對(duì)親和力和解離常數(shù)。在無(wú)鋅離子存在下進(jìn)行測(cè)定。圖3F提供體內(nèi)測(cè)定的結(jié)果。用野生型胰島素(X)、甘精胰島素《 、HisA4，HisA8-胰島素げ丨或緩沖液對(duì)照(Lilly稀釋液； )皮下注射鏈脲佐菌素(str印tozotocin)-誘導(dǎo)的糖尿病雄性大鼠。在0時(shí)的劑量為3.44納摩爾野生型胰島素(loo - m注射體積中20 mg)、12納摩爾甘精胰島素(相當(dāng)于2.0 U Lantus )、13. 7納摩爾[Hi sA4, Hi sA8]-胰島素和100 - W無(wú)蛋白緩沖液(Lilly稀釋液)。在指定的時(shí)間測(cè)量來(lái)自尾巴尖端的血糖濃度。在5只大鼠中測(cè)試每一類似物(平均值土 SEM);實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，具有相似結(jié)果。注射后6 -8小時(shí)大鼠進(jìn)食。圖4提供鏈脲佐菌素-誘導(dǎo)的糖尿病雄性大鼠在注射以下物質(zhì)后血糖水平(mg/dL)隨時(shí)間變化的圖示作為對(duì)照的胰島素稀釋液(圓形)、甘精胰島素(Lantus ，方形)、 賴脯胰島素(Humalog ，“X”)，或含有位點(diǎn)A4和A8的His取代和Humalog的Iispro取代的胰島素類似物(A4A8 - lispro+Zn，倒三角形)，其它與上圖3f所提供的一祥。圖5是使用組氨酸取代以允許鋅-介導(dǎo)的蛋白質(zhì)締合以產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的長(zhǎng)效貯庫(kù)的示意圖。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及創(chuàng)新利用胰島素六聚體之間的非軸界面鋅離子，以延長(zhǎng)胰島素類似物制劑作用的持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生延長(zhǎng)的皮下貯庫(kù)的新系統(tǒng)。其利用新的非軸鋅離子在胰島素類似物六聚體表面和胰島素類似物六聚體之間結(jié)合，并延長(zhǎng)這些類似物貯庫(kù)釋放單體胰島素類似物到血流中所需的時(shí)間。本發(fā)明亦提供與I型IGF受體的絕對(duì)和相對(duì)結(jié)合同時(shí)降低的胰島素類似物。該性質(zhì)的聯(lián)合將提高糖尿病治療的功效和安全性，尤其是在癌癥的風(fēng)險(xiǎn)方面。為此目的，本發(fā)明提供在位點(diǎn)A4和AS含有成對(duì)組氨酸氨基酸取代的胰島素類似物及含鋅的制劑，其為PH 4下的透明溶液，或?yàn)榧s中性pH下的微結(jié)晶混懸液。成對(duì)的A4 - A8取代可與位點(diǎn)A21的取代(例如Gly、Ala、Ser或Thr)聯(lián)合。本發(fā)明胰島素類似物亦可含有其它修飾。如本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所用，可按照慣例來(lái)注釋胰島素類似物的各種取代，所述慣例標(biāo)示被取代的氨基酸，接著是氨基酸的位置，任選以上標(biāo)的形式。目的氨基酸位置包括取代所處的胰島素A-鏈或B-鏈。例如，本發(fā)明胰島素類似物亦可含有天冬氨酸(Asp或D)或賴氨酸(Lys或K)對(duì)B-鏈的氨基酸28 (B28)即脯氨酸(Pro或P)的取代，或Pro對(duì)B -鏈的氨基酸29 (B29)即Lys的取代或其組合。這些取代亦可分別記為AspB28、LysB28和ProB29。相似地，本發(fā)明胰島素可在A -鏈的氨基酸AO (即N -末端到GlyA1)含有精氨酸(Arg或R)、組氨酸(His或H)或賴氨酸(Lys或K)添加。這些添加可分別記為ArgA°、HisA°或LysA°。而且，本取代可與取代Phem — His的引入聯(lián)合。除非另外或上下文任何地方明顯指出，否則應(yīng)認(rèn)為本文所指的氨基酸為L(zhǎng)-氨基酸。本文所用“金屬—釘(metal-staple) ”或“金屬-拉鏈(metal-zipper) ”是當(dāng)來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)分子或分子復(fù)合物中的兩條或多條氨基酸側(cè)鏈與目的金屬締合時(shí)形成的金屬-結(jié)合位點(diǎn)。例如，來(lái)自第一分子的一條側(cè)鏈可與來(lái)自第二分子的兩條側(cè)鏈聯(lián)合以形成鋅-結(jié)合位點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域熟知，胰島素三聚體為由軸鋅離子連在一起而具有“鋅-釘”。然而，先前并不知道可引入鋅-鍵合點(diǎn)來(lái)引起某些胰島素類似物六聚體形成六聚體之間的鋅-釘。本發(fā)明提供胰島素類似物，該胰島素類似物形成新型具“鋅-釘”胰島素六聚體-復(fù)合物，表現(xiàn)出對(duì)IGF - IR的親和力降低但保持其對(duì)IR的至少部分親和力并因此保持生物學(xué)活性。本發(fā)明亦提供具有高相對(duì)濃度的鋅的這些類似物的制劑，其形成具“鋅-釘”六聚體復(fù)合物，甚至在更高濃度的鋅時(shí)，形成這些六聚體-復(fù)合物的緩慢-樣晶體。在一些實(shí)施方案中，胰島素類似物含有至少4、至少5、至少6、至少7或至少8個(gè)鋅離子/胰島素類似物六聚體。用于治療患者的方法包括將胰島素 類似物給予患者。在一個(gè)實(shí)例中，胰島素類似物為含有A-鏈修飾的胰島素類似物，其伴隨性導(dǎo)致等電點(diǎn)(pi)向中性上移，容許具鋅-釘胰島素六聚體的裝配。在另一實(shí)例中，所述修飾亦降低無(wú)鋅單體對(duì)IGF - IR的親和力。在另一實(shí)例中，胰島素類似物亦在位點(diǎn)A21含有取代，其保護(hù)在酸性條件下制成的胰島素類似物免受化學(xué)降解。用注射器、計(jì)量筆或其它適宜裝置通過(guò)皮下注射來(lái)給予所述胰島素類似物。亦設(shè)想有可能的是,將在位點(diǎn)A4和A8引入的成對(duì)組氨酸取代應(yīng)用到用足夠濃度鋅離子在酸性條件下制成的類似物中，這可能通過(guò)兩種共存機(jī)制使得類似物在PH 7. 4時(shí)不可溶向較高等電點(diǎn)(約6. 5 - 6. 6)的偏移，其主要是由于GIua4中負(fù)電荷的去除；和鋅胰島素六聚體的凈等電點(diǎn)的進(jìn)一步偏移，其由除典型軸鋅離子外的非軸鋅離子的結(jié)合所致。為了降低皮下貯庫(kù)中胰島素類似物的溶解度而引入的在A4和AS的相同取代，亦可降低可能的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，已提出所述可能的癌癥風(fēng)險(xiǎn)與胰島素和胰島素類似物與I型IGF受體的交叉結(jié)合相關(guān)。還設(shè)想有可能的是，將在位點(diǎn)A4和AS引入的聯(lián)合取代，以及具有或不具有在A21的取代，應(yīng)用到其它種類的胰島素類似物制劑中(例如但不限于普通、NPH、半慢性和慢性胰島素，包括這些類型的混合物)，以實(shí)現(xiàn)降低所述類似物與I型IGF受體的交叉結(jié)合目的中的一種或多種。為了在PH 7. 4下形成普通可溶制劑，成對(duì)的組氨酸取代必須與A-鏈或B-鏈中其它位置的取代聯(lián)合，所述其它位置的取代去除一個(gè)或多個(gè)正電荷或添加一個(gè)或多個(gè)負(fù)電荷，從而充分降低Pl以使在本領(lǐng)域所知的賦形劑存在時(shí)，在PH 7. 4下的溶解性與人胰島素相似，所述賦形劑包括但不限于氯化鋅、苯酚、間甲酚、甘油、磷酸鈉緩沖液和注射用水。當(dāng)與A4和AS的成對(duì)組氨酸取代聯(lián)合時(shí)將降低pi的取代的實(shí)例包括但不限于G1uA14、AspA21、G1uA21、AspB9、G1uB9、AspB1°、Glumo, AlaB22、SerB22、AspB28、AspB28 - ProB29、AspB28 - AlaB29、AlaB29 和 ProB29,或其組合。業(yè)已發(fā)現(xiàn)在位點(diǎn)A4和AS的成對(duì)的組氨酸取代可降低胰島素類似物與I型IGF受體的交叉結(jié)合，并在保持對(duì)胰島素受體的天然親和力的同時(shí)引起Pl向中性向上偏移。亦發(fā)現(xiàn)在pH 7. 4的無(wú)鋅條件下制得的[HisA4，HisA8]-胰島素高度可溶，而每6個(gè)胰島素類似物分子中加入4-6個(gè)鋅離子導(dǎo)致鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物的沉淀。這種復(fù)合物在pH 7. 0 - 8. 4時(shí)不可溶或微溶,但在約pH 4時(shí)可溶。不希望受理論的限制,很可能這種pH-依賴性的不溶性是由于含有軸和非-軸結(jié)合的鋅離子二者的鋅蛋白質(zhì)復(fù)合物的體外等電沉淀所致。亦發(fā)現(xiàn)在pH 4. 0的非緩沖溶液中制成的、含有摩爾比為5. 2個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的[HisA4，HisA8]-胰島素，在經(jīng)皮下注射雄性Lewis大鼠(用鏈脲佐菌素使其患糖尿病)后，將以類似于Lantus 的藥理作用的持續(xù)時(shí)間和范圍，引導(dǎo)血糖濃度的延長(zhǎng)控制。不希望受理論的限制，可能這種延長(zhǎng)作用是由于含有軸和非-軸結(jié)合的鋅離子二者的鋅蛋白質(zhì)復(fù)合物的皮下等電沉淀所致。亦發(fā)現(xiàn)[HisA4，HisA8]-胰島素晶體可易于生長(zhǎng)成為鋅胰島素類似物六聚體，其含有兩個(gè)軸鋅離子/六聚體和三個(gè)非-軸鋅離子(結(jié)合在R3晶格中的連續(xù)六聚體之間)；后者的界面鋅離子表現(xiàn)出由一個(gè)六聚體中的HisA4和HisA8、毗鄰六聚體的HisA4’和結(jié)合的氯離子的四面體配位。三個(gè)結(jié)合的鋅-和氯離子分別給六聚體添加+6和_3的形式電荷(formal charge),凈形式電荷為+3。這些另外的電荷通過(guò)用His取代GIua4而擴(kuò)大+6的形式電荷。不希望受理論的限制，很可能三個(gè)非-軸鋅離子/六聚體的存在導(dǎo)致上述PH-依賴性的不溶性和推測(cè)的鋅蛋白質(zhì)復(fù)合物的皮下等電沉淀。一般而言，脊椎動(dòng)物胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽，包含含有胰島素A -鏈和胰島素B-鏈的胰島素類似物。本發(fā)明的胰島素類似物亦可含有其它修飾，例如B- 鏈殘基BI和/或B31的堿性氨基酸延伸的取代。在一個(gè)實(shí)例中，脊椎動(dòng)物胰島素類似物是哺乳動(dòng)物胰島素類似物，例如人、豬、牛、貓、犬或馬的胰島素類似物。本發(fā)明的胰島素類似物亦可含有其它修飾，例如B-鏈的C-末端和A-鏈的N-末端之間的系鏈(tether)，其在共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2/419，169中更詳細(xì)闡述，所述專利的公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。藥物組合物可包含所述胰島素類似物，為了獲得延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間，必須包括鋅離子或另ー種能引導(dǎo)蛋白質(zhì)裝配和六聚體界面縫合(stapling)的ニ價(jià)金屬離子。鋅離子可以以摩爾比為4. 0-7. 0或5. 0-6. 0個(gè)鋅離子/胰島素類似物六聚體的水平包括在所述組合物之中。亦可包括以更高摩爾比的鋅離子以產(chǎn)生甚至更慢吸收的六聚體-復(fù)合物，在所述高摩爾比下，除界面[HisA4，HisA8]-相關(guān)的鋅-釘結(jié)合位點(diǎn)外，鋅離子還將占據(jù)弱的鋅-結(jié)合位點(diǎn)。在所述制劑中，胰島素類似物的濃度通常為約0.1-約0.3 mM。賦形劑可包括甘油、甘氨酸、其它緩沖劑和鹽及抗微生物防腐劑例如苯酚和間甲酚；已知后者防腐劑可增強(qiáng)胰島素六聚體的穩(wěn)定性?？墒褂盟鏊幬锝M合物以通過(guò)將生理學(xué)上有效量的組合物給予患者來(lái)治療患有糖尿病或其它醫(yī)學(xué)病況的患者。包含編碼多肽的序列的核酸編碼胰島素類似物，所述核酸含有編碼在A4和AS具有組氨酸聯(lián)合取代、在A21具有或不具有另外取代的A-鏈的序列。具體的序列可取決于將要引入所述核酸序列的物種中偏好的密碼子選擇。核酸亦可編碼野生型胰島素的其它修飾。核酸序列可編碼在多肽或修飾的胰島素原類似物的其它位點(diǎn)含有不相關(guān)取代或延伸的經(jīng)修飾A-鏈或B-鏈序列。核酸序列亦可為表達(dá)載體的一部分，可將該載體插入到宿主細(xì)胞中，例如原核宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌佐coli)細(xì)胞系，或真核細(xì)胞系，例如釀酒酵母{S. cereviciae)或巴斯德畢赤酵母(Pischia pastoris)菌株或細(xì)胞系。還設(shè)想的是，不相關(guān)的取代或鏈延伸可與本發(fā)明的類似物聯(lián)合，以改變其等電點(diǎn)，所述等電點(diǎn)通過(guò)位點(diǎn)B13的取代或通過(guò)位點(diǎn)AO、A22、BO或B31的Arg或Lys的鏈延伸而進(jìn)ー步上升，或通過(guò)插入負(fù)電荷或去除正電荷的取代而下降。例如，取代可與AlaB31 -HisB32 - HisB33 - ArgB34、HisB31 - HisB32、HisB31 - HisB32 - ArgB33 或 AlaB31 -HisB32-HisB33聯(lián)合。在這些較后的情況中，另外的六聚體內(nèi)的鋅結(jié)合補(bǔ)充本發(fā)明六聚體之間的鋅結(jié)合，以提高鋅與六聚體的比率并進(jìn)一步穩(wěn)定六聚體-復(fù)合物。本發(fā)明的取代亦可與增加IGF - IR交叉結(jié)合的B -鏈修飾聯(lián)合以減輕這種不利性質(zhì)，實(shí)例包括用一個(gè)或兩個(gè)堿性殘基(例如ArgB31、LysB31、ArgB31 - ArgB32> ArgB31 - LysB32、LysB31 - ArgB32和LysB31 - LysB32)延伸B -鏈，或用Asp或Glu取代Hism0o提供的實(shí)例(但不限于)為甘精胰島素(Lantus )，其在pH 4下制成，但在生理pH下在皮下貯庫(kù)中遭受聚集。還設(shè)想的是，本發(fā)明成對(duì)的組氨酸取代亦可與現(xiàn)有的胰島素類似物或修飾的胰島素中存在的任何變化，或與各種藥物制劑例如普通胰島素、NPH胰島素、慢性胰島素或超慢胰島素聯(lián)合利用。本發(fā)明的胰島素類似物亦可含有存在于人胰島素類似物中的取代，其盡管在臨床上未使用，但在實(shí)驗(yàn)上有用，例如含有取代AspB1°、LysB28和ProB2 9或AspB9取代的DKP-胰島素。然而，本發(fā)明不限于人胰島素及其類似物。亦設(shè)想這些取代亦可在動(dòng)物胰島素例如(作為非限制性實(shí)例)豬、牛、馬和犬胰島素中進(jìn)行。此外，考慮到人和動(dòng)物胰島素之間的相似性，和過(guò)去將動(dòng)物胰島素用于人糖尿病患者，亦設(shè)想可在胰島素序列中引入其它較小修飾，尤其是那些被認(rèn)為是“保守”取代的取代。例如，可在具有相似側(cè)鏈的氨基酸組內(nèi)進(jìn)行另外的氨基酸取代而不偏離本發(fā)明。這些包括中性疏水氨基酸丙氨酸(Ala或A)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(lie或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同樣地，中性極性氨基酸可在組內(nèi)相互替代甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。認(rèn)為堿性氨基酸包括賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)。酸性氨基酸為天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。為比較目的提供了人胰島素原的氨基酸序列，其為SEQ. ID. NO. I。提供了人胰島素A-鏈的氨基酸序列，其為SEQ. ID. NO. 2。為比較目的提供了人胰島素B -鏈的氨基酸序列，其為SEQ. ID. NO. 3。SEQ. ID. NO. I (胰島素原)
Phe-Val - Asii<lIn4ii^Lee^y^-Cif y-Ser-His-Leii-Val-Cllu-Ala-i-eu-Tyr-Ley-Val-Cy^"
Cl I y -Cl I u- A rg-G Iy-Ph e- Ph e -T y r-Th r- Pro ~ I -Th r- A rg- A rg -Cl Iu-Ai a- 0 Iu-A sp-1 .e u-Ciln- Val<Hy4lln-Vai^iki-Le Ii 4jly<iIy4jly"Pro<ily Ala4lly'-Ser-Leu-Ciln-Pro-LeLi-Ab- Ltni-Glu-Gly-Ser-Leu-GI!vLy:s-Arg-Gly-l!e-Vd-Glu-Glii-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile^
Le u -Tyr-G I n-Leu-G Iu-A^ rt-Tyr-C ys- Asn
SEQ. ID. NO. 2 (A -鏈)
Gly-lle-Val<ilii-GtriCys<%yH Thr-Stn-lle-Cy^Ser-lxii T>ir*Cln-Leu-Gli,i"A^n-T>T-Cys^
Asn
SEQ. ID. NO. 3 -鏈)
Phe-Val'%Asii-Gln-Hi s-l.A4iJ Cys-GIy*Scr*4---Ib-L4sii* Val-Gf o* Ala-Leu-Tyr*Le ii* VaIwCy^*
GI y-G In-A ra G I y-Ph e-Phe-T yr Thr Pro- Lys -Th r
設(shè)想本發(fā)明的胰島素類似物具有與天然胰島素相似的對(duì)胰島素受體的親和力，但表現(xiàn)出與I型IGF受體的親和力降低。胰島素或胰島素類似物的活性可通過(guò)下文中更為詳盡描述的受體結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定。相對(duì)活性可以以激素-受體解離常數(shù)(Kd)來(lái)定義，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性取代測(cè)定的曲線擬合來(lái)獲得；或以ED5。值來(lái)定義，即取代50%的特異性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記人胰島素例如放射性標(biāo)記的人胰島素(例如1251 -標(biāo)記的胰島素)或放射性標(biāo)記的高親和カ胰島素類似物所需的未標(biāo)記胰島素或胰島素類似物的濃度?；蛘?，活性可簡(jiǎn)單地表示為正常胰島素的百分比。對(duì)胰島素-樣生長(zhǎng)因子受體的親和カ亦可用與所測(cè)量IGF-IR的取代的同樣方式來(lái)測(cè)定。具體而言，期望胰島素類似物具有的活性為胰島素活性的20 - 200%,例如正常胰島素的25、50、110、120、130、140、150或200%或更多，同時(shí)具有對(duì)IGF- IR的親和カ小于或等于正常胰島素的50%，例如正常胰島素的10、20、30或50%或更少。即使體外受體-結(jié)合活性因較慢清除而低至20%，胰島素類似物在糖尿病的治療中仍有用。胰島素類似物的合成。在0.1M甘氨酸緩沖液(pH 10.6,10 ml)中，在ニ硫蘇糖醇(7 mg)存在下,通過(guò)A鏈(41 mg)和B -鏈類似物(21 mg)的S -磺化衍生物的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)鏈聯(lián)合。每ー種聯(lián)合混合物的CM - 52纖維素色譜法可部分分離被游離B -鏈污染的氫氯化物形式的蛋白質(zhì)。最終純化由反相HPLC來(lái)完成。MALDI質(zhì)譜證實(shí)了所預(yù)測(cè)[HisM, HisA8]-胰島素的分子量。最終產(chǎn)量(6. I mg)與對(duì)照野生型胰島素的合成所獲得的最終產(chǎn)量相似。[HisA4，HisA8] -DKP-胰島素的相應(yīng)產(chǎn)量為8. 8 mg。等電點(diǎn)聚焦電泳。用預(yù)制的pH 3 - 10的IEF凝膠(125 x 125 mm, 300 ym，來(lái)自 SERVA Electrophoresis GmbH,Heidelberg的SERVALYT Precotes ,從Crescent ChemicalCo. Hauppauge, NY獲得)通過(guò)IEF凝膠電泳，來(lái)測(cè)量天然狀態(tài)胰島素和胰島素類似物的pi值。根據(jù)廠商實(shí)驗(yàn)方案，將Precotes 放置在水平IEF裝置Multiphor II (PharmaciaBiotech)中。用循環(huán)式水浴鍋(Brinkman)將該元件預(yù)冷至4°C，然后將PREC0TE IEF凝膠放到用輕質(zhì)礦物油包被以實(shí)現(xiàn)有效熱交換的電泳床上。在凝膠的兩端用經(jīng)PH 3的陽(yáng)極液和pH 10的陰極液(都來(lái)自SERVA)浸濕的濾紙條將凝膠與電極連接。點(diǎn)樣之前，用高壓電源(LKB型號(hào)2197)以初始電壓設(shè)置200伏和最終設(shè)置500伏將凝膠預(yù)聚焦30分鐘。點(diǎn)完樣品和IEF標(biāo)準(zhǔn)品(5-10 u L，裝載蛋白質(zhì)濃度5-10 Ug)后，在500 - 2000伏下實(shí)施等電聚焦達(dá)2小時(shí)或直至達(dá)到最終電壓2000伏，此后再繼續(xù)聚焦15分鐘。IEF之后，根據(jù)SERVA手冊(cè)的實(shí)驗(yàn)方案，將凝膠用200 ml 20%的三氯こ酸固定20分鐘，用200 ml去離子水漂洗I分鐘，用Serva Violet 17溶液染色，用86%的磷酸脫色。使用的IEF標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(來(lái)自SERVA)如下，括號(hào)中為其各自的pi值馬心細(xì)胞色素C (10. 7)、牛胰核糖核酸酶A(9. 5)、小扁豆外源凝集素(8. 3,8. 0,7. 8)、馬肌肉肌紅蛋白(7. 4,6. 9)、牛紅細(xì)胞碳酸酐酶(6.0)、牛奶P -乳球蛋白(5. 3、5. 2)、大豆胰蛋白酶抑制劑(4. 5)、黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖氧化酶(4. 2)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶(3. 5)。通過(guò)比較遷移距離對(duì)IEF標(biāo)準(zhǔn)品的PH梯度的線性回歸曲線，來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的pi。受體表達(dá)質(zhì)粒。為表達(dá)帶標(biāo)簽表位的IR和IGF - IR，從InVitrogen獲得哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3. IZeo+,通過(guò)將編碼符合讀框的三重FLAG M2表位(Asp - Tyr - Lys -Asp - Asp - Asp - Asp - Lys)的符合讀框的寡核苷酸盒亞克隆到及麗奴廣XbaI的限制性位點(diǎn)之間，來(lái)修飾其C -末端表位標(biāo)簽。編碼IGF - IR和IR的B -同エ型的各自cDNA如先前所述(Whittaker, J.等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第 84 卷，第 5237 - 5241 頁(yè)(1987))。通過(guò)用定點(diǎn)突變?cè)谄?’端恰在終止密碼子之前引入編碼符合讀框的C-末端Gly - Ser接頭的ガ位點(diǎn),對(duì)它們進(jìn)行修飾以便亞克隆至修飾的表達(dá)載體中。受體cDNA的表達(dá)。如前所述來(lái)制備轉(zhuǎn)染用DNA。用聚こ烯亞胺在PEAK快速細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)受體cDNA。轉(zhuǎn)染后三天，當(dāng)受體表達(dá)量達(dá)最大時(shí)收集細(xì)胞。在由含有1% (v/v) Triton X - 100 和蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的 0. 15 M NaCl 和 0. IM Tris - Cl (pH8.0)組成的緩沖液中完成裂解。將裂解液在_80°C保存直至測(cè)定需要。受體結(jié)合測(cè)定。通過(guò)改良Whittaker及其同事先前闡述的微滴定板抗體捕獲測(cè)定，來(lái)實(shí)施IGF - IR和IR - B各自的結(jié)合測(cè)定。將微量滴定條板(Nunc Maxisorb)與抗-FLAG IgG (100 Ul/孔的40 U g/ml磷酸鹽緩沖鹽水溶液)在4°C下孵育過(guò)夜。如前所述進(jìn)行洗滌和封閉。通過(guò)小麥胚凝集素(WGA)色譜法來(lái)部分純化293 PEAK細(xì)胞的去垢劑裂解液，以去除受體前體裂解物，所述細(xì)胞用編碼帶C -末端FLAG -標(biāo)簽的全長(zhǎng)IR - B或IGF - IR的cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。然后將小麥胚洗出液在抗體包被的板上于室溫下孵育I個(gè)小時(shí)，以固定受體。充分洗滌去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，使用標(biāo)記的胰島素示蹤劑(125I - [TyrA14]-胰島素)或標(biāo)記的IGF - I示蹤劑(125I - Tyr31 - IGF - I)和未標(biāo)記的胰島素類似物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定如所述來(lái)實(shí)施。在同一組測(cè)定中，使用胰島素或IGF - I受體作為對(duì)照配體來(lái)測(cè)定所有的胰島素類似物。用兩-位點(diǎn)順序模型通過(guò)非線性回歸分析來(lái)分析同源競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的結(jié)合數(shù)據(jù)，以獲得胰島素和IGF - I的解離常數(shù)。用Wang的方法來(lái)分析異源競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)合數(shù)據(jù)，該方法使用精確的數(shù)學(xué)表達(dá)式來(lái)描述兩種不同配體與受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。 將本領(lǐng)域所知的胰島素類似物的代表性結(jié)合研究概述于表I。因?yàn)橐葝u素對(duì)IR(同工型B)的親和力類似于IGF - I對(duì)IGF - IR的親和力(每種情況下Kd約0. 04 nM)，第4列所給出的對(duì)IR和IGF-IR各自親和力的百分比(第2和第3列)比率，提供了對(duì)胰島素類似物的絕對(duì)特異性的估計(jì)。相對(duì)于人胰島素的特異性的標(biāo)準(zhǔn)化(第I行)提供相對(duì)特異性的估計(jì)。相對(duì)特異性大于I (小于I)表明受體結(jié)合嚴(yán)格性的增加(減小)。在該測(cè)定中，Aspmo -胰島素表現(xiàn)出對(duì)IGF- IR的親和力增加，但因?yàn)閷?duì)IR的親和力的增加更加顯著，所以相對(duì)特異性大于I。含有取代AsnA21 — Gly和B -鏈的兩個(gè)殘基延伸(ArgB31和ArgB32)的甘精胰島素(Lantus )，表現(xiàn)出對(duì)IGF - IR的絕對(duì)親和力增加，對(duì)IR的絕對(duì)親和力降低，而受體結(jié)合的相對(duì)嚴(yán)格性降低。本發(fā)明的胰島素類似物表現(xiàn)出相反的性質(zhì)對(duì)IGF - IR的絕對(duì)親和力降低，受體結(jié)合的相對(duì)嚴(yán)格性增加。表I
對(duì)照龜島素類似物的受體結(jié)合性質(zhì)1+'
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a源自平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差的誤差。b將野生型胰島素對(duì)IR的相對(duì)親和力(第2列)定義為100% ;IGF - I對(duì)IGF - IR的相對(duì)親和力(第3列)亦定義為100%。各自的絕對(duì)解離常數(shù)類似?？赏ㄟ^(guò)變體A -鏈的總化學(xué)合成來(lái)制備含有A -鏈氨基酸取代的新型聯(lián)合的胰島素A-鏈類似物。野生型B-鏈由市售人胰島素制劑經(jīng)氧化亞硫酸分解(sulfitolysis)而得；DKP B-鏈同樣由總化學(xué)合成來(lái)制備。每種情況下胰島素類似物都是經(jīng)胰島素鏈聯(lián)合之后再色譜純化而獲得。在每種情況下，通過(guò)質(zhì)譜來(lái)證實(shí)預(yù)測(cè)的分子量。合成這樣的胰島素類似物，其在位點(diǎn)A4和AS含有成對(duì)的組氨酸取代、具有或不具有用Gly取代AsnA21，其在野生型人B-鏈(SEQ. ID. NO. 3)情況下，大體如SEQ. ID. NO.4所示。這些類似物與人胰島素的性質(zhì)比較表明，A1、A8取代的總效應(yīng)為類似物對(duì)IGF - IR的親和カ降低，并且對(duì)IR的親和カ與對(duì)IGF - IR的親和カ之比増加(表2)。SEQ. ID. NO. 4 (A4和A8的成對(duì)組氨酸取代)
權(quán)利要求
1.一種治療患者的方法，所述方法包括將含有生理學(xué)上有效量的胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽的藥物制劑給予所述患者，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有胰島素A -鏈序列，所述序列含有在A4和AS的成對(duì)的組氨酸取代，任選在A21的選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的取代，并且所述藥物制劑另外含有相對(duì)濃度為至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的鋅離子。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽在pH6. 5 -7. 5時(shí)為微晶胰島素混懸液。
3.權(quán)利要求I的方法，其中將所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽在pH3.5-5時(shí)配制為透明非緩沖溶液，所述透明非緩沖溶液含有相對(duì)濃度為4 - 6個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的鋅離子、選自苯酚和間甲酚的防腐劑及賦形劑。
4.權(quán)利要求I的方法，其中將所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽配制為微晶胰島素混懸液，其經(jīng)修飾以包括4 - 6個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子。
5.權(quán)利要求I- 4中任一項(xiàng)的方法，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽通過(guò)用甘氨酸取代位點(diǎn)A21來(lái)修飾。
6.權(quán)利要求I- 4中任一項(xiàng)的方法，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽通過(guò)用丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代位點(diǎn)A21來(lái)修飾。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)延伸B -鏈以包括一個(gè)或兩個(gè)C-末端堿性殘基來(lái)修飾。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)延伸B-鏈以包括至少一個(gè)N -末端堿性殘基來(lái)修飾。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)延伸A-鏈以包括至少一個(gè)N -末端堿性殘基來(lái)修飾。
10.一種編碼胰島素A-鏈多肽的核酸，其中所述A-鏈多肽包含SEQ. ID. NO. 4。
11.一種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求10的核酸序列。
12.—種宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求11的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
13.一種藥物制劑，其在含有至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的藥學(xué)上可接受的緩沖液中包含胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有胰島素A -鏈序列，所述序列含有在A4和AS的成對(duì)的組氨酸取代，和任選在A21的選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的取代，其中所述制劑形成鋅-依賴性的長(zhǎng)效皮下貯庫(kù)。
14.權(quán)利要求13的藥物制劑，其中將所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽在pH 6. 5 - 7. 5時(shí)配制為微晶胰島素混懸液。
15.權(quán)利要求13的藥物制劑，其在pH3. 5-5時(shí)配制為透明非緩沖溶液，并進(jìn)一步含有選自苯酚和間甲酚的防腐劑及賦形劑。
16.權(quán)利要求13的藥物制劑，其中將所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽配制為經(jīng)修飾包括4 - 6個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的微晶胰島素混懸液。
17.權(quán)利要求14的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)用Gly取代位點(diǎn)A21來(lái)修飾。
18.權(quán)利要求15的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)用Gly取代位點(diǎn)A21來(lái)修飾。
19.權(quán)利要求16的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)用Gly取代位點(diǎn)A21來(lái)修飾。
20.權(quán)利要求14、15或16中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽通過(guò)用Ala、Ser或Thr取代位點(diǎn)A21來(lái)修飾。
21.權(quán)利要求13、17或20中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)延伸B -鏈以包括一個(gè)或兩個(gè)C-末端堿性殘基來(lái)修飾。
22.權(quán)利要求13、17或20中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)延伸B -鏈以包括一個(gè)或兩個(gè)N -末端堿性殘基來(lái)修飾。
23.權(quán)利要求13、17或20中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽亦通過(guò)延伸A -鏈以包括一個(gè)或兩個(gè)N -末端堿性殘基來(lái)修飾。
24.一種胰島素類似物的晶體制劑，其在含有至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的藥學(xué)上可接受的緩沖液中，其中所述胰島素類似物含有胰島素A-鏈序列，所述序列含有在A4和A8的成對(duì)的組氨酸取代，和任選在A21的取代，其中所述制劑形成鋅-依賴性的長(zhǎng)效皮下貯庫(kù)，其中所述胰島素類似物在約pH 6 - 7. 4時(shí)形成結(jié)晶混懸液。
25.權(quán)利要求I的方法，其中所述胰島素類似物在皮下注射時(shí)形成鋅-依賴性的長(zhǎng)效皮下貯庫(kù)。
26.權(quán)利要求13、17或20中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述制劑在皮下注射時(shí)形成鋅-依賴性的長(zhǎng)效皮下貯庫(kù)。
27.權(quán)利要求13、17或20中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中在無(wú)鋅制劑中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽與相同物種的野生型胰島素相比，表現(xiàn)出對(duì)I型胰島素-樣生長(zhǎng)因子受體的親和力降低，并對(duì)相同物種胰島素受體的親和力表現(xiàn)出野生型胰島素的至少20%。
28.一種藥物制劑，其在含有至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的藥學(xué)上可接受的緩沖液中包含胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有胰島素A-鏈序列，所述序列含有在A4和AS的成對(duì)的組氨酸取代、在B28的賴氨酸或天冬氨酸取代、任選在B29的脯氨酸取代和任選在A21的選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的取代，其中所述制劑形成鋅-依賴性的中效皮下貯庫(kù)。
29.一種藥物制劑，其在含有至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的藥學(xué)上可接受的緩沖液中包含胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有胰島素A-鏈序列，所述序列含有在A4和AS的成對(duì)的組氨酸取代、在B28的除半胱氨酸、賴氨酸或天冬氨酸之外的氨基酸取代、任選在B29的脯氨酸取代和任選在A21的選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的取代，其中所述制劑形成鋅-依賴性的中效皮下貯庫(kù)。
30.一種藥物制劑，其在含有至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子的藥學(xué)上可接受的緩沖液中包含兩種或多種胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽，其中至少一種胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有胰島素A-鏈序列，所述序列含有在A4和AS的成對(duì)的組氨酸取代，其中所述制劑提供混合的鋅-依賴性的長(zhǎng)效、中效和/或短效皮下貯庫(kù)。
全文摘要
一種包含胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽的藥物制劑，其中所述胰島素類似物或其生理學(xué)上可接受的鹽含有胰島素A–鏈序列，該序列含有在A4和A8的成對(duì)的組氨酸取代，并任選在A21的取代。所述制劑還含有藥學(xué)上可接受的緩沖液，所述緩沖液中含有至少約4個(gè)鋅離子/6個(gè)胰島素類似物分子。所述制劑在皮下注射時(shí)形成鋅–依賴性的長(zhǎng)效皮下貯庫(kù)。在無(wú)鋅制劑中，與其它不含HisA4和HisA8取代的相同胰島素或胰島素類似物相比，所述胰島素類似物單體表現(xiàn)出對(duì)胰島素–樣生長(zhǎng)因子受體的親和力降低，并表現(xiàn)出對(duì)相同物種胰島素受體至少20%的親和力。
文檔編號(hào)A61K38/28GK102770153SQ201180010561
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者M.維斯 申請(qǐng)人:卡斯西部?jī)?chǔ)備大學(xué)