專利名稱：奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是危害我國奶牛飼養(yǎng)業(yè)重大疾病之一。根據(jù)國內(nèi)外許多學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬是引起乳房炎的最主要病原菌之一。目前國內(nèi)乳房炎疫苗方面主要是全菌體滅活疫苗。該疫苗雖具有一定的保護(hù)力，但沒有異源菌株保護(hù)力，因而對新生菌不具有免疫預(yù)防的效果。Mackie等報(bào)道使用福爾馬林滅活后的無乳鏈球菌菌苗對奶牛無保護(hù)力。Giraudo等人采用了乳房鏈球菌和停乳鏈球菌多聯(lián)滅活苗，接種疫苗并不能顯著降低奶牛由鏈球菌引起的乳房炎的發(fā)生。奶牛中鏈球菌主要有五類無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿鏈球菌和糞鏈球菌，而其中以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌為常見病原菌。近年來，研究表明鏈球菌表面脫氫酶位于細(xì)菌表面，具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性,與血纖維蛋白溶酶結(jié)合，在疾病發(fā)展過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到重要作用，被認(rèn)為是疫苗發(fā)展的良好靶位點(diǎn)。無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌GapC在DNA和氨基酸水平上有相當(dāng)?shù)耐恍裕@就暗示了 GapC蛋白可能作為一種抗原，用于保護(hù)奶牛對抗無乳鏈球菌、停乳鏈球菌以及乳房鏈球菌感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC蛋白；第二目的是提供奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC蛋白的制備方法；第三目的是提供一種含有奶牛乳房炎鏈球菌GapC蛋白的亞單位疫苗。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一目的，本發(fā)明提供了一種奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗 GapC蛋白，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明還提供了編碼所述GapC蛋白的相應(yīng)基因，其具有SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述基因的表達(dá)載體及其宿主細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二目的，本發(fā)明提供了奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC 蛋白的制備方法，該方法包括下述步驟(1)提取牛源鏈球菌DNA序列；(2)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布序列AF375662設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出GapC基因；(3)將回收的該基因與PMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-I-Blue中，經(jīng)酶切鑒定，篩選陽性克隆，序列測定；(4)酶切pMD18-T-GapC及pQE_30質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體pQE-30-GapC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1-Blue，篩選出的陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定；(5)在大腸桿菌XL-I-Blue中獲得高表達(dá)的上述重組工程菌，隨后經(jīng)鎳柱純化后得到目的蛋白，即為GapC蛋白，分子量為38kD。其中，所述重組工程菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，其發(fā)酵培養(yǎng)的條件為37°C、pH值 7.0、裝液量20%、種齡12-1^1、轉(zhuǎn)數(shù)180-220rpm，而接種量為1% -3%0其中，擴(kuò)增GapC基因所用的引物如下所示5' -CGC IGGATCCI ATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3‘5' -GAC |GTCGAC[ AGCGATTTTTGCAAAATACTC-3‘。其中，所述PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 15min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min， 30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin。其中，所述牛源鏈球菌為停乳鏈球菌(S. dysgalactiae)。本發(fā)明還提供了含有上述GapC蛋白的亞單位疫苗，該疫苗由GapC蛋白溶液與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑按1 1混合混合乳化制成，其中GapC蛋白溶液的濃度為 3. 3mg/ml-4mg/ml0本發(fā)明還提供了上述GapC蛋白，制備所述GapC蛋白的方法在制備預(yù)防奶牛乳房炎亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明利用牛源鏈球菌GapC蛋白制備的亞單位疫苗對奶牛乳房炎常見的三種鏈球菌都具有交叉保護(hù)性，與其他疫苗相比具有更廣譜的保護(hù)性，可作為奶牛乳房炎亞單位疫苗的候選抗原。


圖1為本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增得到的GapC基因片段大小為1005bp ；圖2為本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pQE-30-GapC經(jīng)BamHI和Ml I雙酶切，獲得預(yù)期大小的兩個(gè)目的基因片段CMOObp和1005bp)；圖3為本發(fā)明所述誘導(dǎo)菌在約38kD處表達(dá)的蛋白條帶，與重組融合蛋白大小相一致；圖4為本發(fā)明所述小鼠ELISA檢測各周免疫血清效價(jià)；圖5為本發(fā)明所述奶牛ELISA檢測各周免疫血清效價(jià)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。TR-GapC蛋白為停乳鏈球菌GapC蛋白、WR-GapC蛋白為無乳鏈球菌GapC蛋白、RF-GapC蛋白為乳房鏈球菌GapC蛋白。實(shí)施例1基因工程重組菌pQE-30-GapC/XL-l-Blue的構(gòu)建以及牛源鏈球菌GapC 蛋白亞單位疫苗的制備(1)牛源停乳鏈球菌亞單位疫苗GapC基因的制備。DNA的提取取1. 5mL停乳鏈球菌培養(yǎng)物，如LS0312株，IOOOOrpm離心^iiin ；沉淀物加入 567 μ L TE,反復(fù)吹打。之后加 30 μ 1 10% SDS 和 3 μ 1 20mg/mL 的 Proteinase K,混勻，37°C水浴Ih ；加100 μ 1 5Μ NaCl，混勻，再加入80 μ 1 CTAB/NaCl，混勻。65°C水浴 IOmin ；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000rpm離心4-5min，上清液轉(zhuǎn)入一新管；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000rpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至一新管；加入0. 6體積的異丙醇，輕混，沉淀DNA 30min，12000rpm離心15min，棄上清；加入ImL 70%乙醇洗滌 DNA ； 12000rpm離心5min，棄上清，干燥，溶于50 μ L TE中。根據(jù)停乳鏈球菌GapC的DNA序列，設(shè)計(jì)上下游引物及限制性酶切位點(diǎn)，其中在上游加入BamHI酶切位點(diǎn)，下游加入Ml I酶切位點(diǎn)Pl 5' -CGCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3'Ρ2 5' -GACGTCGACAGCGATTTTTGCAAAATACTC-3'反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性15min，94°C預(yù)變性45s，56°C退火45s，72°C延伸2min， 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，得到GapC基因。將回收的GapC基因與pMD18_T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1-Blue。利用BamHI和Ml I進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選陽性的克隆，測序鑒定。測序正確后對pMD 18-T-GapC及pQE-30質(zhì)粒用BamHI和Ml I進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組載體 pQE-30-GapC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1-Blue。篩選出的陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明擴(kuò)增到了預(yù)期大小即約1005bp的目的片段，參見圖1。重組質(zhì)粒 pQE-30-GapC經(jīng)BamHI和Mil 37°C雙酶切，獲得預(yù)期大小的兩個(gè)目的基因片段CMOObp 和1005bp)，參見圖2。DNA序列經(jīng)測定，插入的GapC基因的序列正確，結(jié)果表明重組 pQE-30-GapC構(gòu)建完全正確。(2)牛源無乳鏈球菌和乳房鏈球菌亞單位疫苗GapC基因的制備。其中除擴(kuò)增的引物序列和PCR擴(kuò)增的條件不同外，其它的實(shí)驗(yàn)條件和步驟和結(jié)果同(1)中的牛源停乳鏈球菌亞單位疫苗GapC基因的制備。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布序列AF421899、AF421900設(shè)計(jì)引物。S. agalactiae、 S. uberis 引物的核苷酸序列為GapC Forward Primer (Pf) 5' -CGCGGATCCATGGTAGTTMAG TTGGTATT-3‘邊框內(nèi)序列為 BamHI 酶切位點(diǎn)。GapC Reverse Primer (Pr) 5' -GACGTCGAC AGCGATTTTTGCAAAGTACTC-3 ‘邊框內(nèi)序列為SalI酶切位點(diǎn)。S. agalactiae GapC基因 PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 S. uberisGapC 基因 PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min， 94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0實(shí)施例2 :重組菌pQE-30-GapC的誘導(dǎo)表達(dá)及GapC蛋白的純化將100 μ L pQE-30-GapC的重組菌接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素的IOmL LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，0D600約為0. 5時(shí)，吸出ImL培養(yǎng)物置于1. 5mL印pendorf管中。加入IOOmM 的誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)他。每隔Ih吸取ImL菌液，IOOOOrpm離心，棄上清，在沉淀中加入90μ L IX上樣緩沖液和IOmL IM DTT后，煮沸5min，取15 μ L用于SDS-PAGE。參見圖4。應(yīng)用Hie QlAexpressionist TM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。取過夜培養(yǎng)的5mL菌液于0. 5L含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)3h， 加入IPTG至終濃度為lmmol/L再繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心12000r/min IOmin收集菌體，反復(fù)凍融三次，稱取菌體重量，按5mL/mg加入Buffer B混勻，離心12000r/min IOmin收集上清，加入 500 μ L鎳顆粒，4°C搖床過夜，離心收集沉淀。加入Buffer C洗三次，收集沉淀加入Buffer
5E洗5-8次，收集蛋白。取15 μ L蛋白溶液，經(jīng)SDS-PAGE檢測純化效果。
與對照和蛋白質(zhì)分子量Marker相比，誘導(dǎo)菌在約38kD處有一條表達(dá)的蛋白條帶， 與重組融合蛋白大小相一致，參見圖3。將重組菌用蛋白純化系統(tǒng)The QlAexpressionist TM純化表達(dá)的重組pQE-30-GapC蛋白，用比色法測定TR-GapC、WR-GapC、RF-GapC蛋白質(zhì)濃度分別能達(dá)到3. 3mg/mL,3. 6mg/mL、^ig/mL。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果單一目的條帶，分子量約為38kDa。參見圖4。實(shí)施例3 工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化(I)TR-GapC 工程菌工程菌種子液制備溶解TR-GapC工程菌，分別劃線接種于含有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)Mh ；然后分別挑取生長良好的單菌落接種于裝有3mL含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C、190rpm培養(yǎng)16h，以滅菌的基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基作為空白對照，測定各菌液OD 600，當(dāng)菌液OD 600在1.3 1.5之間，作為一級種子。取一級種子，接種于LB液體培養(yǎng)基，370C、190rpm培養(yǎng)16h，經(jīng)檢查純粹，置2 8°C保存，作為二級種子，用于培養(yǎng)條件優(yōu)化等實(shí)驗(yàn)。停乳鏈球菌Gap C工程菌生長曲線測定將種齡IOh的TR-Gap C工程菌按1 %的接種量分別接種于含有40mL Amp抗性的 LB培養(yǎng)基的IOOmL錐形瓶，37°C、160rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，每隔一小時(shí)分別取出兩個(gè)樣品，以滅菌的含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基作為空白對照，測定每個(gè)樣本菌液的OD 600值。停乳鏈球菌Gap C工程菌發(fā)酵罐誘導(dǎo)表達(dá)將種齡為1 種子液按1 %的接種量接種于裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐進(jìn)氣口壓力為0. 25MPa，出氣口壓力為0. 05MPa,發(fā)酵罐D(zhuǎn)O控制在90 %，在37°C，350rpm 條件下連續(xù)培養(yǎng)，每隔Ih取一次發(fā)酵液，測定其OD 600值，當(dāng)基因工程菌OD 600達(dá)到0. 6 時(shí)，按0. 1 %的量加入IPTG，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后在誘導(dǎo)后證后放出發(fā)酵液。(2) WR-GapC 工程菌和 RF-GapC 工程菌工程菌種子液制備、停乳鏈球菌Gap C工程菌生長曲線測定與程菌發(fā)酵罐誘導(dǎo)表達(dá)所用的條件和步驟同TR-GapC工程菌。實(shí)施例4 奶牛乳房炎全菌體滅活疫苗制備(1) S. agalactiae> S. dysgalactiae> S. uberis將S. agalactiae LSO3IO 株，S. dysgalactiae LSO3I2 株，S. UberisSDO3O6 株接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基中，37°C恒溫箱培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)Mh。采用平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。加入終濃度為0.4% (ν/ν)的甲醛溶液，37°C振蕩培養(yǎng)滅活36h ；取200 μ L菌液涂布于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，確定滅活效果。將滅活菌液用PBS 離心洗滌3次，調(diào)整菌液濃度至1 X 101(lCFU/mL。稀釋好的菌液加入1/5體積的鋁膠佐劑制備S. agalactiae、S. dysgalactiae、S. uberis全菌體滅活疫苗。按常規(guī)方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)。Q)GapC重組蛋白亞單位疫苗的制備分別取TR-feipC(3. 3mg/mL)、WR-GapC(3. 6mg/mL)、RF-GapC(4mg/mL)的蛋白溶液 5mL與弗氏完全佐劑5mL按1 1混合，乳化制備IOmL重組蛋白亞單位疫苗，供一免使用。同時(shí)取 TR-GapC(3. 3mg/mL) ,WR-GapC(3. 6mg/mL) ,RF-GapC(4mg/mL)的蛋白溶液各 5mL 與弗氏不完全佐劑5mL按1 1混合，乳化制備IOmL重組蛋白亞單位疫苗，供二免或三免使用。 制備的疫苗在4°C臨時(shí)保存。實(shí)施例5 小鼠免疫試驗(yàn)及保護(hù)力試驗(yàn)取健康小鼠150只，隨機(jī)分為15組，每組10只，分別為TR-GapC、WR-GapC、RF-GapC 亞單位疫苗免疫組，S. agalactiae、S. dysgalactiae、S. uberis全菌體滅活疫苗免疫組以及對照組。蛋白免疫組采用腹腔注射0. 2mL(100yg蛋白)亞單位疫苗，間隔三周，用同樣方法及劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。全菌體免疫組采用皮下多點(diǎn)注射0. 2mL(20億個(gè)菌)滅活疫苗，間隔三周，用同樣方法及劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在一免后開始每周進(jìn)行一次割尾采血，采集后血液 37°C恒溫箱中放置池，于4°C冰箱放置過夜后，析出的透明、淡黃色上清液即為抗血清。離心后分裝，于_70°C保存。采用間接ELISA檢測血清抗體。對GapC亞單位疫苗免疫組、滅活苗組及對照組通過腹腔注射的方法，分別用60億菌無乳鏈球菌、20億菌停乳鏈球菌、80億菌乳房鏈球菌菌株攻毒，攻毒后每日觀察小鼠死亡情況。結(jié)果表明三組GapC亞單位疫苗免疫組加強(qiáng)免疫3周后，IgG效價(jià)水平達(dá)到最高值。 ELISA檢測TR-GapC亞單位疫苗各周免疫血清效價(jià)，反映抗體消長水平，參見圖4。結(jié)果表明二免后抗體效價(jià)有明顯提高，隨著時(shí)間推移，抗體效價(jià)快速上升，二免三周達(dá)到高峰。用無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌在二免后21d對三組亞單位疫苗及對照組進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示三組亞單位疫苗組均產(chǎn)生了較好的免疫保護(hù)效果，尤其停乳鏈球菌免疫效果最好。 參見表1。而未免疫的對照組小鼠在一周內(nèi)全部死亡。表1免疫小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC蛋白，其特征在于，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述GapC蛋白的基因。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
4.制備權(quán)利要求1所述GapC蛋白的方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)提取牛源鏈球菌DNA序列；(2)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布序列AF375662設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出GapC基因；(3)將回收的該基因與PMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-I-Blue中，經(jīng)酶切鑒定，篩選陽性克隆，序列測定；(4)酶切pMD18-T-GapC及pQE_30質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體pQE-30-GapC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL-1-Blue，篩選出的陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定；(5)在大腸桿菌XL-I-Blue中獲得高表達(dá)的上述重組工程菌，隨后經(jīng)鎳柱純化后得到目的蛋白，即為GapC蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述重組工程菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，其發(fā)酵培養(yǎng)的條件為溫度37°C、pH值7.0、裝液量20%、種齡12-1 、轉(zhuǎn)數(shù) 180-220rpm、接種量為 1% -3%0
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增GapC基因所用的引物如下所示，5 ‘ -CGC IGGATCC丨 ATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3 ‘5 ‘ -GAC lGTCGAC丨 AGCGATTTTTGCAAAATACTC-3 ‘。
7.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 15min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0
8.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，牛源鏈球菌為停乳鏈球菌 (S. dysgalactiae) 0
9.含有權(quán)利要求1所述GapC蛋白的亞單位疫苗。
10.權(quán)利要求1所述GapC蛋白在制備預(yù)防奶牛乳房炎亞單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種奶牛乳房炎鏈球菌亞單位疫苗GapC蛋白及其制備方法和應(yīng)用，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明利用牛源鏈球菌GapC蛋白制備的亞單位疫苗對奶牛乳房炎常見的三種鏈球菌都具有交叉保護(hù)性，與其他疫苗相比具有更廣譜的保護(hù)性，可作為奶牛乳房炎亞單位疫苗的候選抗原。
文檔編號A61K39/09GK102304174SQ20111027093
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者于立權(quán), 周玉龍, 崔玉東, 張軍, 朱戰(zhàn)波, 朱洪偉, 楊玉英, 柳強(qiáng), 王鶴, 車車 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)