專利名稱：使用哺乳動(dòng)物β防御素的炎性腸病的治療的制作方法
使用哺乳動(dòng)物β防御素的炎性腸病的治療本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年07月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980136343. 8 (國際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/EP2009/059253)、名稱為“使用哺乳動(dòng)物β防御素的炎性腸病的治療”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。涉及序列表本申請(qǐng)含有呈計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過提述并入本文中。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過施用哺乳動(dòng)物β防御素而預(yù)防與治療炎性腸病。背景人防御素在許多其它元件中，先天免疫的關(guān)鍵組分為個(gè)別顯示相當(dāng)大選擇性但集體能夠快速殺死廣譜的細(xì)菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更為突出，且其有可能由所有多細(xì)胞生物體產(chǎn)生。在人類中，優(yōu)勢AMP為防御素。人防御素為陽離子小肽，基于其三個(gè)分子內(nèi)半胱氨酸二硫鍵之拓?fù)鋵W(xué)可分為α-防御素及β-防御素。α-防御素可進(jìn)一步細(xì)分為首先自嗜中性粒細(xì)胞顆粒分離的α-防御素 (ΗΝΡ1-4)及由Paneth細(xì)胞在小腸隱窩中表達(dá)的α -防御素(HD5及HD6)。β -防御素主要由多種組織及器官中的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，所述組織及器官包括皮膚、氣管、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、腎、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成員為hBDl_3。 然而，使用多種生物信息學(xué)工具，已在人基因組中注釋了幾乎40個(gè)編碼推定β -防御素同源物的開放閱讀框。一些人防御素是組成型產(chǎn)生的，而其它是由促炎性細(xì)胞因子或外源微生物產(chǎn)物誘導(dǎo)的。已經(jīng)越來越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有寬范圍的免疫調(diào)節(jié)/替代性質(zhì)。所述性質(zhì)包括誘導(dǎo)多種趨化因子及細(xì)胞因子、趨化活性及細(xì)胞凋亡活性，誘導(dǎo)前列腺素、組胺及白細(xì)胞三烯釋放，抑制補(bǔ)體，通過鐸樣受體(toll-like receptor)信號(hào)傳導(dǎo)刺激樹突細(xì)胞成熟，以及刺激由嗜中性粒細(xì)胞的病原體清除。此外，人防御素也在傷口愈合、上皮及成纖維細(xì)胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管發(fā)生(vasculogenesis) 中起作用。有越來越多的人防御素在許多感染性及炎性疾病中發(fā)揮重要作用的證據(jù)。發(fā)炎和 /或感染皮膚中通常觀察到人防御素之過表達(dá)，很可能是因?yàn)橛晌⑸锝M分或內(nèi)源性促炎性細(xì)胞因子局部誘導(dǎo)。在牛皮癬(psoriasis)中，hBD2及hBD3過于充足，且在患有尋常痤瘡(acne vulgaris)或淺表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受損上皮中觀察到hBD2的顯著上調(diào)。另一方面，異位性/特應(yīng)性皮炎(topic dermatitis)與hBD2及 hBD3的下調(diào)相關(guān)?；啬c克羅恩氏病(Crohn' s disease)與HD5及HD6的缺陷表達(dá)相關(guān)， 且在結(jié)腸中的克羅恩氏病中，hBD2-4的表達(dá)下調(diào)。
細(xì)胞因子細(xì)胞因子為來自高級(jí)真核生物的小的分泌多肽，其負(fù)責(zé)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且影響其它細(xì)胞之生長、分裂和功能。它們是有效的多效性多肽，其例如經(jīng)由相應(yīng)受體充當(dāng)局部或全身性細(xì)胞間調(diào)控因子，且因此在許多生物過程(如免疫、發(fā)炎及造血)中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞因子由多樣細(xì)胞類型產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/ 單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。TNF-α涉及多種生理病原性過程且可如在宿主防御中具有保護(hù)性或如在自體免疫中具有有害性。TNF-α為關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，其引發(fā)且維持發(fā)炎反應(yīng)，且已證明TNF-a 失活在下調(diào)與自體免疫疾病相關(guān)之炎性反應(yīng)中是重要的。感染后，巨噬細(xì)胞大量分泌 TNF-α且TNF-α通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生粘附分子及通過產(chǎn)生作為趨化細(xì)胞因子之趨化因子來介導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞募集(recruitment)至感染部位。TNF-α有助于活化白血球及其它炎性細(xì)胞且增加損傷組織內(nèi)之血管滲透性。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突細(xì)胞產(chǎn)生，但也可由多種其它細(xì)胞類型產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括淋巴樣細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪組織、成纖維細(xì)胞及神經(jīng)元組織。當(dāng)前的抗炎藥通過與TNF- α結(jié)合且因此阻止TNF- α向細(xì)胞表面上TNF- α之受體傳導(dǎo)信號(hào)來阻斷TNF-α之作用。該類型之阻斷具有某些嚴(yán)重的副作用，其中一些為感染，如肺結(jié)核、敗血癥及真菌感染且可能使癌癥發(fā)病率增加。IL-10，也稱為人細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，也作為抗炎細(xì)胞因子是免疫調(diào)控的關(guān)鍵參與者。該細(xì)胞因子由數(shù)種細(xì)胞類型產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞及肥大細(xì)胞。該細(xì)胞因子在免疫調(diào)控及發(fā)炎作用中具有多效性效應(yīng)。其下調(diào)促炎性細(xì)胞因子、由Thl/Thl7細(xì)胞分泌之細(xì)胞因子、MHC第II類Ag及共刺激分子于抗原呈遞細(xì)胞上的表達(dá)。IL-10也由稱為調(diào)控T細(xì)胞(Tregs)之T細(xì)胞群體分泌。 所述細(xì)胞不阻止最初T細(xì)胞活化；相反，其抑制持續(xù)反應(yīng)且阻止慢性和潛在破壞性的反應(yīng)。 在周邊中，一些T細(xì)胞被抗原及IL-10或TGF-β誘導(dǎo)成為Tregs。IL-10誘導(dǎo)之Tregs為 ⑶4+/⑶25+/R)xp3-且稱為Trl細(xì)胞。所述細(xì)胞通過分泌IL-10抑制免疫反應(yīng)。最近研究已公開在鑒定 ι17細(xì)胞時(shí)T細(xì)胞效應(yīng)子譜系之多樣化大于Thl/Th2/Treg。已顯示該亞群在先前歸因于Thl系之?dāng)?shù)種自體免疫疾病(如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬及多發(fā)性硬化)中呈病原性。由Thl7分泌之細(xì)胞因子也被IL-10下調(diào)，且阻斷TNF通過使Thl7細(xì)胞失活而預(yù)防牛皮癬。IL-10之總體活性為抗炎性，且已在數(shù)個(gè)動(dòng)物研究中顯示預(yù)防發(fā)炎及損傷，然而因?yàn)镮L-10施用途徑及其生物半衰期方面的困難，所以臨床IL-10治療仍然不足。炎性腸病炎性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)定義為來源模糊的慢性、復(fù)發(fā)性腸發(fā)炎。IBD指兩種不同的病癥克羅恩氏病與潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativec0litiS，UC)。兩種疾病似乎皆由于在腸中的炎性反應(yīng)之過度活化。此炎性級(jí)聯(lián)(cascade)被認(rèn)為通過促炎性細(xì)胞因子之作用與淋巴細(xì)胞亞組之選擇性活化而永存。在患有IBD的患者中，腸之內(nèi)襯之潰瘍與發(fā)炎導(dǎo)致腹痛、腹瀉、和直腸出血之癥狀。潰瘍性結(jié)腸炎在大腸中發(fā)生，而在克羅恩氏病中，疾病可涉及整個(gè)GI道以及小腸與大腸。對(duì)于大多數(shù)的患者而言，IBD為慢性病況，其癥狀持續(xù)數(shù)月至數(shù)年。其在年輕成人最常見，但可于任何年齡發(fā)生。其在世界各地發(fā)現(xiàn)，但于工業(yè)化國家(例如美國、英國、與北歐)最常見。其在猶太裔人口中特別常見且在發(fā)生率也有種族差異。IBD之臨床癥狀為間歇性直腸出血、狹窄性腹痛、體重喪失與腹瀉。 IBD之診斷基于臨床癥狀，使用鋇灌腸，但直接可視化(乙狀結(jié)腸鏡或結(jié)腸鏡)為最精確的測試。長期IBD為結(jié)腸癌之風(fēng)險(xiǎn)因子，且治療IBD可涉及藥物治療與手術(shù)。有些患UC的患者僅在直腸具有疾病(直腸炎)。其它患UC的患者具有限于直腸與鄰近的左結(jié)腸的疾病(直腸乙狀結(jié)腸炎)。又其它者具有整個(gè)結(jié)腸之UC(普遍性IBD)。 UC之癥狀一般在患有更廣泛疾病(較大部分的結(jié)腸牽涉疾病)者更嚴(yán)重。對(duì)于具有限于直腸的疾病(直腸炎)或限于左結(jié)腸之末端的UC(直腸乙狀結(jié)腸炎)的患者，預(yù)后比具有全結(jié)腸UC者佳。使用口服藥物治療或灌腸的短暫周期性治療可能已足夠。在所述具有更廣泛疾病者，來自發(fā)炎腸的血液喪失可導(dǎo)致貧血，且可能需要以鐵補(bǔ)給或甚至輸血治療。罕見地，當(dāng)發(fā)炎變得非常嚴(yán)重時(shí)，結(jié)腸可劇烈地膨脹成大尺寸。此病況稱為毒性巨結(jié)腸?；加卸拘跃藿Y(jié)腸的患者有發(fā)燒、腹痛與膨脹、脫水與營養(yǎng)失調(diào)而極端不健康。除非患者因藥物治療而快速改善，通常需要手術(shù)以預(yù)防結(jié)腸破裂?？肆_恩氏病可于胃腸道之所有區(qū)域發(fā)生。在此疾病中，胃腸道由于發(fā)炎阻塞且纖維化在大多數(shù)患者中發(fā)生。肉芽腫與瘺管形成為克羅恩氏病之常見并發(fā)疾病進(jìn)展結(jié)果包括靜脈內(nèi)出血、手術(shù)與結(jié)腸造口術(shù)。IBD可通過藥物而治療。最常用以治療IBD的藥物為抗發(fā)炎藥物，如水楊酸鹽。水楊酸鹽制備物已有效治療輕度至中度疾病。當(dāng)藥物長期使用時(shí)，其等也可減少疾病爆發(fā)之頻率。水楊酸鹽之實(shí)例包括柳氮磺吡啶、奧沙拉秦、和美沙拉秦。所有此等藥物皆以口服以高劑量給予以實(shí)現(xiàn)最大治療利益。此等藥物并非沒有副作用。當(dāng)以高劑量服用時(shí)，柳氮磺吡啶可造成胃不適，且一些水楊酸鹽制備物已被報(bào)導(dǎo)會(huì)罕見地造成輕度腎臟發(fā)炎。皮質(zhì)類固醇在治療IBD中比水楊酸鹽更有潛力且更快速起作用，但潛在地副作用對(duì)將皮質(zhì)類固醇用于具有更嚴(yán)重疾病的患者造成限制。皮質(zhì)類固醇之副作用通常于長期使用發(fā)生。其等包括使骨骼變細(xì)且使皮膚變薄、感染、糖尿病、肌肉消耗、使臉變圓、精神病混亂、與(罕見發(fā)生)髖關(guān)節(jié)破壞。在不對(duì)水楊酸鹽或皮質(zhì)類固醇反應(yīng)的IBD患者中，則使用抑制免疫系統(tǒng)的藥物。 免疫抑制劑之實(shí)例包括硫唑嘌呤與6-巰嘌呤。用于此情況的免疫抑制劑幫助控制IBD且允許逐漸減少或排除皮質(zhì)類固醇。然而，免疫抑制劑使患者免疫缺損且易受許多其它疾病影響。用于研究IBD的廣為認(rèn)可的模型之一為DSS結(jié)腸炎小鼠模型，如于Kawada等 “Insights from advances in research of chemically inducedexperimental models of human inflammatory bowel disease", World J.Gastroenterol. , Vol. 13 (42), pp. 5581-5593 (2007)；以及 Wirtz 與 Neurath "Mouse models of inflammatory bowel disease”，Advanced Drug DeliveryReviews, Vol. 59 (11), 1073-1083 (2007)中所述。明顯地，有對(duì)于能夠預(yù)防與治療IBD的藥劑之巨大需要。使用人防御素治療炎性腸病引人關(guān)注的是，小腸中的克羅恩氏病與潘納斯細(xì)胞(Paneth cell) α -防御素HD5 及HD6之水平降低相關(guān)，而結(jié)腸中的克羅恩氏病與β -防御素hBD2及hBD3之產(chǎn)生減少相關(guān)(Gersemarm等，2008 ；Wehkamp等，2005)。此外，已有力地證明克羅恩氏病之發(fā)病機(jī)制中
5涉及腸微生物區(qū)(Swidsinski等，200 。所述研究人員通過使用熒光原位雜交顯示在活性克羅恩氏病中，觀察到粘膜相關(guān)且具侵襲性之細(xì)菌之急劇增加，而正常小腸上皮及大腸上皮中無所述細(xì)菌。這些觀察結(jié)果一起合并成一個(gè)假設(shè)，該假設(shè)表明在健康人中，沿腸上皮屏障之適當(dāng)水平之防御素起作用以控制腔內(nèi)(luminal)細(xì)菌之組成及數(shù)目且使其不粘附及入侵粘膜而觸發(fā)發(fā)炎(Wang等，2007)。另一方面，在能力不足以產(chǎn)生保護(hù)性水平之分泌防御素的人中，抗微生物防御與腔內(nèi)細(xì)菌之間的平衡會(huì)改變。結(jié)果，這使得細(xì)菌入侵基礎(chǔ) (underlying)腸組織，從而誘導(dǎo)炎性狀態(tài)，而這又可能發(fā)展成克羅恩氏病。基于該假設(shè)，WO 2007/081486公開了數(shù)種人防御素在炎性腸病之治療中之用途。 發(fā)明者提出以使防御素在腸腔中之適當(dāng)位置釋放之配制物形式經(jīng)口向克羅恩氏病患者施用的防御素將減少入侵細(xì)菌之?dāng)?shù)目，重建正常上皮屏障功能且因此降低炎性疾病之嚴(yán)重性。根據(jù)WO 2007/081486，防御素之功能在于直接靶向且殺死腔中之細(xì)菌，從而阻止其入侵上皮組織。即，防御素完全起抗感染化合物作用。關(guān)于W0/2007/081486，令人驚訝的是胃腸外施用之hBD2能夠降低小鼠中DSS誘導(dǎo)之結(jié)腸炎的嚴(yán)重性，因?yàn)橥ㄟ^使用該施用途徑，肽從未遇到腔內(nèi)細(xì)菌。另外，我們此處顯示hBD2之作用為減小由PBMC分泌之促炎性細(xì)胞因子TNFa、IL-I β及IL-23之水平。已知這些細(xì)胞因子是許多炎性疾病包括炎性腸病中的關(guān)鍵參與者。多于十年已知的是，除抗微生物功能外，防御素也具有多種免疫調(diào)節(jié)功能。然而，大部分關(guān)于人防御素之免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)之著作描述其主要具有促炎性或免疫增強(qiáng)功能(參見例如，Niyonsaba 等，2007 ；Bowdish 等，2006 ；Lehrer, 2004)。因此，確實(shí)出乎意料的是胃腸外施用之hBD2能夠降低炎性腸病中的疾病嚴(yán)重性。 首先，當(dāng)胃腸外施用時(shí)，hBD2決不會(huì)到達(dá)腸腔從而遇到參與誘導(dǎo)疾病之有害細(xì)菌。此外，基于大部分公開之文獻(xiàn)，如此處所提供之著作中所觀察到的，將預(yù)期進(jìn)入血流之防御素將誘導(dǎo)促炎性而非抗炎性反應(yīng)。發(fā)明詳述定義EM:如本文所用之術(shù)語“防御素”系指本領(lǐng)域的技術(shù)人員公認(rèn)屬于抗微生物肽之防御素類別之多肽。為確定多肽是否為根據(jù)本發(fā)明之防御素，可通過使用免費(fèi)可用之 HMMER軟件包將氨基酸序列與PFAM數(shù)據(jù)庫之隱馬爾可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)比較。PFAM防御素家族包括例如防御素-1或“哺乳動(dòng)物防御素”(登錄號(hào)PF00323)及防御素2或防御素β或“ β防御素”(登錄號(hào)PF00711)。本發(fā)明之防御素屬于β防御素類。β防御素類之防御素享有共同的結(jié)構(gòu)特征，如半胱氨酸模式。根據(jù)本發(fā)明之防御素之實(shí)例包括人β防御素1 (hBDl ；參見SEQ ID NO :1)、人β 防御素2(hBD2 ；參見SEQ ID N0:2)、人β防御素3 (hBD3 ；參見SEQ ID NO』)、人β防御素4_4 ；參見SEQ ID NO 4)及小鼠β防御素3(mBD3 ；參見SEQ ID NO 6)。同一性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”描述。就本發(fā)明而言，通過使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS =The EuropeanMolecularBiology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 :276-277 ;http:// emboss, org)，優(yōu)選3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度。使用之任選參數(shù)為缺口開放罰分(10)、缺口延伸罰分(0.5)及EBL0SUM62 (BL0SUM62 之EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記之“最長同一性”之輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性且如下計(jì)算(相同殘基X100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中之缺口總數(shù))。就本發(fā)明而言，通過使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS =The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，同上；http://emboss. org)、優(yōu)選3· 0· 0版或更新版本之Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970， 同上)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度。使用之任選參數(shù)為缺口開放罰分(10)、缺口擴(kuò)展罰分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4之EMBOSS版本)取代矩陣。使用 Needle標(biāo)記之“最長同一性”之輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性且如下計(jì)算(相同脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中之缺口總數(shù))。經(jīng)分離多肽如本文所用之術(shù)語“經(jīng)分離變體”或“經(jīng)分離多肽”系指自來源分離之變體或多肽。在一方面中，如SDS-PAGE所測定的，變體或多肽為至少純，優(yōu)選至少5% 純，更優(yōu)選至少10 %純，更優(yōu)選至少20 %純，更優(yōu)選至少40 %純，更優(yōu)選至少60 %純，甚至更優(yōu)選至少80%純，且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文中表示含有按重量計(jì)至多10%、 優(yōu)選至多8 %、更優(yōu)選至多6 %、更優(yōu)選至多5 %、更優(yōu)選至多4 %、更優(yōu)選至多3 %、甚至更優(yōu)選至多2%、最優(yōu)選至多且甚至最優(yōu)選至多0. 5%與之天然或重組相關(guān)之其它多肽物質(zhì)的多肽制備物。因此，優(yōu)選基本上純的多肽按制備物中所存在之總多肽物質(zhì)之重量計(jì)為至少92 %純，優(yōu)選至少94 %純，更優(yōu)選至少95 %純，更優(yōu)選至少96 %純，更優(yōu)選至少97 %純， 更優(yōu)選至少98 %純，甚至更優(yōu)選至少99 %純，最優(yōu)選至少99. 5 %純且甚至最優(yōu)選100 %純。 本發(fā)明之多肽優(yōu)選呈實(shí)質(zhì)上純的形式。此可例如通過由眾所周知之重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。哺乳動(dòng)物β防御素本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治療炎性腸病(如潰瘍性結(jié)腸炎和/或克羅恩氏病)中的醫(yī)藥用途。治療優(yōu)選與降低所治療組織中之TNF-α活性相關(guān)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6中之任一氨基酸序列具有至少 80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO 4中之任一氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素由人β防御素 1(SEQ ID NO :1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID NO :2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)、人 β 防御素4(SEQ ID N0:4)、人β防御素4之變體(SEQID NO 5)和/或小鼠β防御素3(SEQID NO 6)組成。在一甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素由人β防御素 KSEQ ID Ν0:1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID Ν0:2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO 3)和 / 或人 β 防御素4(SEQID NO 4)組成。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO :2之氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO 2)組成。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效變體組成。優(yōu)選地，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素由人β防御素1、人β 防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效變體組成。更優(yōu)選地，本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素由人β防御素2及其功能等效變體組成。本發(fā)明之哺乳動(dòng)物β防御素也稱為優(yōu)選實(shí)施方案之化合物。在本發(fā)明之上下文中，哺乳動(dòng)物(例如人)β防御素之“功能等效變體 (functionally equivalent variant) ”為對(duì)炎性腸病展現(xiàn)與親本哺乳動(dòng)物(例如人)β防御素大致相同之功效的經(jīng)修飾哺乳動(dòng)物(例如人)β防御素。優(yōu)選地，其也展現(xiàn)與哺乳動(dòng)物(例如人)β防御素大致相同之對(duì)TNF-α活性之功效。根據(jù)本發(fā)明，哺乳動(dòng)物(例如人)β防御素之功能等效變體與哺乳動(dòng)物(例如人) β防御素氨基酸序列相比可包含1-5個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選1-4個(gè)氨基酸修飾，更優(yōu)選1-3個(gè)氨基酸修飾，最優(yōu)選1-2個(gè)氨基酸修飾且尤其1個(gè)氨基酸修飾。術(shù)語“修飾”在本文中意指哺乳動(dòng)物(例如人)β防御素之任何化學(xué)修飾。修飾可為氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸側(cè)鏈之置換；或在氨基酸序列中使用具有類似特性之非天然氨基酸。詳言之，修飾可為酰胺化，如C-末端酰胺化。優(yōu)選地，氨基酸修飾是性質(zhì)上較不重要的，其為不顯著影響多肽之折疊和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；單缺失；氨基-或羧基-末端小延伸；至多約20-25個(gè)殘基之小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而有利于純化之小延伸，如多聚組氨酸標(biāo)記、抗原表位或結(jié)合域。保守取代的實(shí)例為在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸和甲硫氨酸)組內(nèi)的取代。通常不改變比活的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常發(fā)生的交換為 Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/^er、Ala/Gly、Ala/Thr、kr/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。
能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)來鑒定哺乳動(dòng)物β防御素中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，TNF-α活性之抑制)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見 Hilton 等，1996，J. Biol. Chem. 271 4699-4708 必需氨基酸的身份(identity)也可由分析與相關(guān)于哺乳動(dòng)物β防御素之多肽的同一性來推斷。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 ；WO 95/17413 ；或 WO 95/2洸25 公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示 (例如，Lowman 等，1991,Biochem. 30 :10832-10837 ；美國專利 5，223，409 號(hào)；WO 92/06204) 和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 :127)。本發(fā)明之多肽之N-末端延伸可合適地由1至50個(gè)氨基酸、優(yōu)選2-20個(gè)氨基酸、 尤其3-15個(gè)氨基酸組成。在一實(shí)施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一實(shí)施方案中，N-末端延伸包含如下文進(jìn)一步定義之kex2或kex2_樣切割位點(diǎn)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，N-末端延伸為包含至少兩個(gè)Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸殘基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途已發(fā)現(xiàn)人β防御素2在小鼠中于10-天右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)性結(jié)腸炎模型中顯著地減輕疾病參數(shù)之嚴(yán)重性；因此顯示作為用于治療炎性腸病(如潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩氏病)的藥物的強(qiáng)活性。本發(fā)明因此提供治療炎性腸病的方法，該治療包含向需要該治療之受試者胃腸外施用有效量之例如藥物組合物形式之哺乳動(dòng)物β防御素，如人β防御素2。也提供的是哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素2)，其用于制造胃腸外施用的藥物；及哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素2)之用途，其用于制造胃腸外施用的藥物，例如藥物組合物。治療包括治療已有疾病或病癥以及預(yù)防(prophylaxis (prevention))疾病或病癥。在一具體實(shí)施方案中，治療使得所治療組織中誘導(dǎo)之TNF-α活性降低，優(yōu)選 TNF-α活性降低且IL-10活性增加。哺乳動(dòng)物β防御素可治療性用于組合物中，所述組合物經(jīng)配制用于經(jīng)由任何常規(guī)途徑施用，常規(guī)途徑包括腸內(nèi)(例如經(jīng)頰、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸)、胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、 顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))或局部(例如，表皮、鼻內(nèi)或氣管內(nèi))。在其它具體實(shí)施方案中，本文中描述之組合物可作為持續(xù)釋放植入物之一部分施用。在另外的其它實(shí)施方案中，可利用提供冷凍干燥物穩(wěn)定性之適當(dāng)賦形劑將優(yōu)選實(shí)施方案之組合物配制為冷凍干燥物，且接著復(fù)水。含有哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素)之藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法，例如由混合、造粒、包覆、溶解或凍干過程制造。優(yōu)選具體實(shí)施方案之藥物組合物包含哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素)及藥學(xué)上可接受之載劑和/或稀釋劑。哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素)優(yōu)選在藥物組合物中以有效治療炎性腸病，優(yōu)選具有對(duì)患者可接受之毒性之量使用。對(duì)于該治療，適當(dāng)劑量當(dāng)然依賴于例如所使用之本發(fā)明化合物之化學(xué)性質(zhì)及藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)、個(gè)體宿主、施用模式及接受治療之病狀之性質(zhì)及嚴(yán)重性而變化。然而，一般而言，為在較大哺乳動(dòng)物，例如人中獲得令人滿意的結(jié)果， 指示每日劑量優(yōu)選為約0. OOlg至約1. 5g、更優(yōu)選約0. Olg至1. Og ；或約0. OOlmg/kg體重至約20mg/kg體重，優(yōu)選約0. 01mg/kg體重至20mg/kg體重，更優(yōu)選約0. lmg/kg體重至約 10mg/kg體重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分開的劑量施用。優(yōu)選具體實(shí)施方案之化合物可以通常使用之類似施用模式及類似劑量向較大哺乳動(dòng)物，例如人施用。在某些具體實(shí)施方案中，優(yōu)選具體實(shí)施方案之藥物組合物可包括哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素)，其量取決于施用途徑為每單位劑型約0. 5mg或更少至約1500mg 或更多，優(yōu)選約 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8 或 0. 9mg 至約 150、200、250、300、350、400、450、500、600、 700、800、900 或 lOOOmg，且更優(yōu)選約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25mg 至約 30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些實(shí)施方案中，比以上所提及之更低或更高的劑量可為優(yōu)選的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)臐舛燃皠┝?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知藥學(xué)上可接受之載劑和/或稀釋劑。對(duì)于配制成液體溶液之組合物，可接受之載劑和/或稀釋劑包括鹽水及無菌水，且可任選地包括抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑及其它常見添加劑。組合物也可配制成丸劑、膠囊、顆粒劑、片劑(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固體溶液、懸浮液、分散液、固態(tài)分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、 凝膠、糊狀物、吸入劑粉末、泡沫、酊劑、唇膏、滴劑、噴霧劑或栓劑的形式)。配制物可含有 (除哺乳動(dòng)物β防御素及其它任選之活性成分外)載體、填充劑、崩解劑、流動(dòng)調(diào)節(jié)劑、糖及甜味劑、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓之鹽、緩沖劑、稀釋劑、分散劑及表面活性劑、粘合劑、潤滑劑和/或如本領(lǐng)域已知之其它藥物賦形劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)一步以適當(dāng)方式且根據(jù)公認(rèn)操作法(如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro 編，Mack Publishing 公司，Easton，PA 1990 中描述之操作法)配制哺乳動(dòng)物β防御素。哺乳動(dòng)物β防御素(如人β防御素)可單獨(dú)使用或與一種、兩種或更多其它藥物化合物或藥物物質(zhì)和/或一或多種藥學(xué)上可接受之賦形劑之組合療法使用。體外合成哺乳動(dòng)物β防御素可使用如本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法通過體外合成制備。多種商業(yè)合成裝置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自動(dòng)合成儀。通過使用合成儀，可用非天然氨基酸、尤其D-異構(gòu)物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-異亮氨酸)、非對(duì)映異構(gòu)物、具有不同長度或官能團(tuán)之側(cè)鏈等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制備方式將由適宜性、經(jīng)濟(jì)性、所需純度等確定?？商峁┡c包含便于鍵聯(lián)的官能團(tuán)之多種肽或蛋白質(zhì)之化學(xué)連接，所述官能團(tuán)對(duì)于酰胺或經(jīng)取代胺形成(例如還原胺基化)而言為胺基，對(duì)于硫醚或二硫化物形成而言為硫醇基，對(duì)于酰胺形成而言為羧基等。如果需要，在合成期間或表達(dá)期間可向肽中引入多個(gè)允許與其它分子或表面連接之基團(tuán)。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，組氨酸用于連接于金屬離子復(fù)合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其類似物。也可根據(jù)重組合成之常規(guī)方法分離且純化哺乳動(dòng)物β防御素或其功能等效物。裂解物可由表達(dá)宿主制備，且裂解物可使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術(shù)純化。具體地，本發(fā)明還涉及如下方面1. 一種哺乳動(dòng)物β防御素在制造用于胃腸外施用治療炎性腸病的藥物中的用途。2.根據(jù)項(xiàng)1的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素是皮下或靜脈內(nèi)施用的。3.根據(jù)項(xiàng)1-2中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素以約0. OOlmg/kg體重至約10mg/kg體重，優(yōu)選約0. 01mg/kg體重至約10mg/kg體重的每日劑量施用。4.根據(jù)項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素為人β防御素。5.根據(jù)項(xiàng)1-4中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO=U SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。6.根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)的用途，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。7.根據(jù)項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。8.根據(jù)項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素為人β防御素2。9.根據(jù)項(xiàng)1-8中任一項(xiàng)的用途，其中在所治療之組織中TNF-α活性降低。10. 一種治療炎性腸病的方法，該方法包括向需要所述治療的受試者胃腸外施用有效量的哺乳動(dòng)物β防御素。11.項(xiàng)10的方法，其中該有效量有效降低所治療組織中的TNF-α活性。12.項(xiàng)10的方法，其中該人β防御素是皮下或靜脈內(nèi)施用的。13.項(xiàng)10的方法，其中該哺乳動(dòng)物β防御素以約0. 001mg/kg體重至約10mg/kg 體重，優(yōu)選約0. 01mg/kg體重至約10mg/kg體重之每日劑量施用。14.項(xiàng)10的方法，其中該哺乳動(dòng)物β防御素為人β防御素。15.項(xiàng)10的方法，其中該哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。16.項(xiàng)10的方法，其中該哺乳動(dòng)物β防御素與SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。17.項(xiàng)10的方法，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。本發(fā)明由下列實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明之范圍。 實(shí)施例在測試hBD2之免疫調(diào)節(jié)功效的期間，意外地觀察到hBD2具有巨大的抗炎潛力。此處，我們已顯示hBD2在小鼠中于治療由口服施用右旋糖酐硫酸鈉(DSS)所誘導(dǎo)的炎性腸病(結(jié)腸炎)具有顯著的功效。我們也已顯示hBD2具有下調(diào)TNF-α的潛力。實(shí)施例1人β防御素2之產(chǎn)生重組產(chǎn)生hBD2。將編碼hBD2之合成DNA片段(DNA 2. 0)克隆入pET_32(+)表達(dá)載體(Novagen)中。所得質(zhì)粒編碼翻譯融合肽，該翻譯融合肽含有N-末端硫氧還蛋白部分，繼之以his-標(biāo)記、腸激酶裂解位點(diǎn)且最后為hBD2肽。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli) 菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨芐青霉素之TB-甘油中將該菌株之過夜培養(yǎng)物稀釋100 倍且在37°C生長至0D600為約8且用0. 5mM IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，此后通過離心收集細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)方案在Ni-NTA珠^IAGEN)上純化his標(biāo)記之trx_hBD2融合肽。隨后將his-標(biāo)記純化融合肽過夜透析于腸激酶緩沖劑(50mM tris-HCKpH 7. 5) UmM CaCl2)中，且用腸激酶裂解以釋放成熟hBD2。使用Source 15S基質(zhì)(Amersham Biosciences)由陽離子交換層析進(jìn)一步純化hBD2肽。使用MALDI-T0F質(zhì)譜驗(yàn)證hBD2之修正分子量。使用相同方案產(chǎn)生mBD3(參見實(shí)施例7)。隨后使用與LC-MS及NMR光譜學(xué)偶聯(lián)之胰蛋白酶消化驗(yàn)證hBD2分子之適當(dāng)折疊及二硫橋拓?fù)鋵W(xué)。由制備型RP-HPLC在低pH值移除內(nèi)毒素，且由LAL測定(EndosafeKTA2)測定內(nèi)毒素含量且發(fā)現(xiàn)該水平低于測定之檢測限(0.05EU/mg)。為確定低于內(nèi)毒素測定之檢測限之水平不能刺激PBMC，作以極有效脂多糖(大腸桿菌，0111 :B4，Sigma L4391)刺激之滴定曲線。極低水平之該LPS(0.06ng/ml)能夠刺激PBMC產(chǎn)生可檢測之細(xì)胞因子。實(shí)施例210天右旋糖酐硫酸鈉(dextran sodium sulphate, DSS)誘導(dǎo)之結(jié)腸炎小鼠模型以下研究之目的在于確定人β防御素2在經(jīng)口施用右旋糖酐硫酸鈉(DSS)而誘導(dǎo)之急性(10天)炎性腸病(結(jié)腸炎)小鼠模型中的抗炎活性。DSS結(jié)腸炎小鼠模型為研究炎性腸病之公認(rèn)模型，如在Kawada等，“ hsights from advances in research of chemically induced experimental modelsof human inflammatory bowel disease，，,World J. Gastroenterol.,第 13 卷(42),第 5581-5593 頁 (2007)；禾口 Wirtz 及 Neurath,"Mouse models of inf lammatorybowel disease，，, Advanced Drug Delivery Reviews，第 59 卷(11)，1073-1083 (2007)中所述。材料測試項(xiàng)目人β防御素2(hBD2)；參見以上實(shí)施例1。甲潑尼龍21-半琥珀酸鹽(“潑尼松龍”)PBS 緩沖劑(GIBCO)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中使用雄性C57BL/6小鼠(Harlan Interfauna Iberica, Barcelona, Spain), 因?yàn)槠錇橐炎C明當(dāng)經(jīng)10天施用2% DSS于飲用水中的溶液時(shí)產(chǎn)生顯著結(jié)腸發(fā)炎的物種及性別。魅由尾巴上的數(shù)字及字母代碼鑒定動(dòng)物。另外，由指示動(dòng)物數(shù)目及性別、測試項(xiàng)目代碼或名稱、劑量水平、施用途徑、處理時(shí)間、組編號(hào)、研究代碼及研究指導(dǎo)者之名字的顏色編碼卡鑒定各籠。體重
12
研究起始當(dāng)天，動(dòng)物之平均體重為22. 4士0. 16g。適應(yīng)(檢疫)研究起始之前最少7天，在與主要研究相同之條件下。翅到達(dá)時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分開且安置于具有不銹鋼蓋之聚碳酸酯籠(E型，Charles River, 255 X 405 X 197mm)中。根據(jù)性別以每籠5只動(dòng)物將動(dòng)物分組安置于具有控制之溫度(22士2°C )、光照 (12/12小時(shí)光照/黑暗)、空氣壓力、空氣更新次數(shù)及相對(duì)濕度(30-70% )之動(dòng)物房中。所有籠底面上均具有Ig屑(Lignocel 3-4 ；HarIan Interfauna Iberica, Spain) 作為褥草(litter)。食物及水讓所有小鼠自由取食干燥粒狀標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物膳食(Teklad Global 2014 ；Harlan Interfauna Iberica, Spain)。于瓶中提供可自由取得的水。周期性分析供應(yīng)至動(dòng)物房內(nèi)之自來水以檢查其組成且檢測可能的污染物(化學(xué)物質(zhì)及微生物)。設(shè)備及材料設(shè)備· Sartorius BP 2100 型動(dòng)物天平 手術(shù)解剖設(shè)備· Eppendorf 5415C 離心
·尼康(Nikon)Eclipse E600FN 顯微鏡· Hook & Tucker儀器旋轉(zhuǎn)混合器· IKA UltraiTurrax 均質(zhì)機(jī)· Sartorius BP 221S 型分析天平.ELISA 微板讀取器(Labsystems Multiskan EX)材料及試劑·無菌拋棄式注射器(Iml) 無菌蝴蝶型25G輸液器·麻醉劑(開他敏(Ketamine)/甲苯噻嗪(Xylazine))·局部麻醉乳膏(EMLA, Astra Zeneca)·右旋糖酐硫酸鈉 30，000-50，OOODa(MP Biomedicals)·磷酸鹽緩沖鹽水(PBS ；Sigma)·中性緩沖福爾馬林(VWR) 牛血清白蛋白(Sigma)·蛋白酶抑制劑混合物(Sigma) 小鼠 TNF-α ELISA 套組(GE Healthcare)實(shí)驗(yàn)方案研究設(shè)計(jì)將動(dòng)物分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。各組由10只雄性動(dòng)物組成
13
A組用對(duì)照媒劑(PBQ (靜脈內(nèi))處理B 組用 hBD2 (0. lmg/kg，靜脈內(nèi))處理C組用hBD2(lmg/kg，靜脈內(nèi))處理D 組用 hBD2(10mg/kg，靜脈內(nèi))處理E組用甲潑尼龍(lmg/kg，口服)處理以隨機(jī)方式將動(dòng)物分配至所有實(shí)驗(yàn)組中。各籠中最多安置5只小鼠(根據(jù)指令 86/609/EEC)。在到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)及施用測試項(xiàng)目之前稱重所有動(dòng)物。測試物質(zhì)之施用通過使用無菌針Q5G)以5ml/kg體重之給藥體積以緩慢推注形式經(jīng)由尾部靜脈靜脈內(nèi)施用對(duì)照媒劑及hBD2。動(dòng)物連續(xù)10天每天(每M小時(shí))接受一次劑量之相應(yīng)測試項(xiàng)目(hBD2、潑尼松龍或?qū)φ彰絼?。以5ml/kg體重之給藥體積以lmg/kg之劑量經(jīng)口給予潑尼松龍，給藥方案與hBD2 相同。實(shí)驗(yàn)稈序誘導(dǎo)結(jié)腸炎通過用2% DSS補(bǔ)充飲用水7天在小鼠中誘導(dǎo)結(jié)腸炎。第1天，稱重所有小鼠且根據(jù)其實(shí)驗(yàn)組加以標(biāo)記。使各籠之飲用瓶裝滿DSS溶液， 確保所有瓶蓋適當(dāng)安裝且沒有一個(gè)堵塞。第3天，排空瓶中之任何剩余溶液且再用新鮮DSS溶液裝滿。第5天，再次重復(fù)該程序。第8天，舍棄任何剩余溶液且用高壓滅菌水更換。2天后，即第10天，處死動(dòng)物。臨床評(píng)定(疾病活性指數(shù))每日臨床評(píng)定DSS-處理的動(dòng)物，根據(jù)以下參數(shù)計(jì)算驗(yàn)證臨床疾病活性指數(shù) (DAI)糞便稠度、直腸出血存在與否及體重減輕，該指數(shù)在0至4范圍內(nèi)
權(quán)利要求
1.哺乳動(dòng)物β防御素在制備用于口服施用以治療炎性腸病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述哺乳動(dòng)物β防御素以約0.001mg/kg體重至約 10mg/kg體重，優(yōu)選約0. 01mg/kg體重至約10mg/kg體重的每日劑量施用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素為人β防御素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素與SEQIDNO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素與SEQIDNO 2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動(dòng)物β防御素為人β防御素2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中在所治療之組織中TNF-α活性降低。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于使用哺乳動(dòng)物β防御素治療炎性腸病。更具體地，本發(fā)明涉及通過施用哺乳動(dòng)物β防御素而預(yù)防與治療炎性腸病以及哺乳動(dòng)物β防御素在制備用于口服施用以治療炎性腸病的藥物中的用途。優(yōu)選地，該哺乳動(dòng)物β防御素為人β防御素，并以約0.001mg/kg體重至約10mg/kg體重的每日劑量施用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102247591SQ20111016318
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者伯吉特.安德森, 卡羅琳.S.布林奇, 坦賈.M.R.凱爾, 托馬斯.克魯澤, 澤倫.凱拉爾夫, 珀?duì)?H.邁金德 申請(qǐng)人:諾維信阿德寧生物技術(shù)公司