專利名稱：用于鑒別接種對(duì)抗布魯氏菌的疫苗的動(dòng)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于預(yù)防醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域，并且涉及開發(fā)和使用基因修飾的布魯氏菌(Brucella spp.)活疫苗，以及開發(fā)和使用允許鑒別已經(jīng)接種的動(dòng)物以及被布魯氏菌強(qiáng)毒株感染的動(dòng)物的直接和間接診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)是從動(dòng)物傳染給人的疾病。在動(dòng)物體內(nèi)，布魯氏菌感染引起流產(chǎn)、不育、生產(chǎn)降低以及動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品貿(mào)易的限制，這是具有經(jīng)濟(jì)影響的動(dòng)物衛(wèi)生問題。此外，該細(xì)菌是從感染動(dòng)物傳染給人的，由此導(dǎo)致虛弱以及通常致殘的疾病，沒有對(duì)抗該細(xì)菌的疫苗，并且針對(duì)頻繁復(fù)發(fā)的延長(zhǎng)期它的治療需要高劑量抗生素。因此，布魯氏菌是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。已經(jīng)顯示的是人布魯氏菌病的患病 率與動(dòng)物布魯氏菌病的患病率直接地相關(guān)聯(lián)。因此，在缺少用于人類的疫苗下，預(yù)防該疾病必然需要控制動(dòng)物體內(nèi)的感染。在大多數(shù)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的背景中，用于控制布魯氏菌病的唯一可行的辦法是通過基于接種農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的計(jì)劃(程序)，通過大規(guī)模接種計(jì)劃(程序)或通過用于接種、診斷和屠宰感染動(dòng)物的計(jì)劃(程序)(Blasco 1997. Preventive VeterinaryMedicine 31:275-283)。針對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病的參照疫苗是用于牛的流產(chǎn)布魯氏菌(B. abortus) S19 (光滑菌株)以及用于綿羊和山羊的馬爾他布魯氏菌(B.meliteniiORevl (光滑菌株)(0ΙΕTerrestrial Manual, 2009-chapters 2. 4. 3. and2. 7. 2.-)。兩者都是活的減毒株，無(wú)佐劑，具有生產(chǎn)和獲得的低成本，以及對(duì)抗反芻動(dòng)物體內(nèi)野生株(用于人類感染的主要來(lái)源)感染的高效性。然而，該技術(shù)的缺點(diǎn)是在接種疫苗之后它們產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不能與在被野生株強(qiáng)烈感染之后誘導(dǎo)的情況區(qū)別開。為了解決這個(gè)問題，已經(jīng)做出了許多科學(xué)努力。一個(gè)策略在于發(fā)展布魯氏菌的粗糙菌株(rough strain) (R),由于缺少脂多糖(LPS)的O鏈(一種已知的布魯氏菌致病因子以及用于測(cè)試感染的血清學(xué)診斷的主抗原)，這些菌株導(dǎo)致可用作活疫苗的減毒株，這些菌株未顯著地干擾血清學(xué)診斷測(cè)試。在此背景下，在90年代，開發(fā)了(通過傳代培養(yǎng))具有R顯型的自發(fā)性突變體(稱為流產(chǎn)布魯氏菌RB51) (Schurig etal. , 1991. Veterinary Microbiology, 28:171-188)。菌株 RB51 目前正用于一些國(guó)家中對(duì)抗牛布魯氏菌病，存在有爭(zhēng)議的結(jié)果。由于缺少“O”抗原，RB51和從在不同脂多糖合成途徑方面在基因上良好表征的(Gonzalez et al. , 2008. PLoS One, 3 (7) :e2760)布魯氏菌病馬爾他種衍生的R變異體的集合都降低了在病毒干擾的血清學(xué)診斷方面的干擾問題。然而，已經(jīng)顯示的是R疫苗沒有解決這個(gè)問題，因?yàn)樗鼈兘o予的對(duì)抗野生型感染的保護(hù)比參照疫苗流產(chǎn)布魯氏菌S19和布魯氏菌馬耳他種Revl低得多(Moriy0n et al. , 2005. VeterinaryResearch, 35:1-38, Barrio et al.，2009. Vaccine, 27:1741-1749)。因此，重要的是具有(獲得)基因修飾的衍生疫苗流產(chǎn)布魯氏菌S19和布魯氏菌馬耳他種Revl以及通過直接和間接診斷法(血清學(xué))使已經(jīng)免疫接種的動(dòng)物與患有病毒感染的動(dòng)物區(qū)別開的相關(guān)診斷測(cè)試。
存在廣泛多樣的熒光蛋白GFP (綠色熒光蛋白)，這些蛋白是依賴于所使用的表達(dá)系統(tǒng)以可變的熒光數(shù)量和強(qiáng)度產(chǎn)生的。GFP蛋白已經(jīng)廣泛地用于分子和細(xì)胞生物學(xué)中用于基因標(biāo)記和檢測(cè)微生物(包括布魯氏菌，Celli et al. , 2003. Journal of ExperimentalMedicine, 198(4) :545_556)、細(xì)胞、質(zhì)體、重組蛋白以及用于嚴(yán)格的科學(xué)目的的其他部分。還開發(fā)了免疫印跡型免疫測(cè)試(Rajasekaran et al. , 2008. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 74(22) :7051-7055)以及夾心ELISA用于檢測(cè)和定量在微生物、細(xì)胞以及組織中表達(dá)的多種 GFP 蛋白(Cell Biolabs, Inc. ;Cell Signaling Technology, Inc.)。還存在用于在細(xì)菌(例如大腸桿菌(Clontech Laboratories))或表皮葡萄球菌(Franke etal. , 2007. Journal of Microbiological Methods 71:123-132)中鑒別對(duì) GFP 蛋白進(jìn)行編碼基因的特異性變異體的PCR型分子診斷測(cè)定法。Walsh和同事(Walsh et al. , 2000. Journal of General Virology, 81, 709-718)提出了 GFP作為獸醫(yī)疫苗標(biāo)志物的可能用途。然而，他們未能將它適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)于牛瘟病毒中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的諸位發(fā)明人說(shuō)明了流產(chǎn)布魯氏菌S19的衍生菌株(原型疫苗S19-GFPp)如何能夠以穩(wěn)定方式表達(dá)GFP，而不改變參照菌株S19的微生物學(xué)或生物學(xué)特征(減毒作用以及對(duì)抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)感染的療效)，以及還有如何能夠誘導(dǎo)通過可以區(qū)別已經(jīng)免疫接種的宿主以及用布魯氏菌強(qiáng)毒株感染的那些宿主的特異性血清學(xué)試驗(yàn)可檢出的抗-GFP抗體應(yīng)答。他們還說(shuō)明了能夠特異性鑒別已經(jīng)用表達(dá)GFP蛋白的新疫苗免疫的動(dòng)物的血清學(xué)診斷的間接ELISA法。因此，本發(fā)明的第一方面涉及穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)、能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)可與通過參考疫苗菌株誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比較的免疫應(yīng)答，還產(chǎn)生可通過特異性血清學(xué)方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株在開發(fā)藥物中的用途；或可替代地，穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)并且能夠在宿主體內(nèi)誘發(fā)可與通過參考疫苗菌株誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比較的免疫應(yīng)答，還產(chǎn)生可通過特異性血清學(xué)方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株，用于作為藥物的用途。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該藥物是疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)、能夠在宿主體內(nèi)誘發(fā)可與通過參考疫苗菌株誘導(dǎo)的情況相比較的免疫應(yīng)答，并且還產(chǎn)生可通過特異性血清學(xué)方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株在開發(fā)用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)預(yù)防或治療布魯氏菌病藥物中的用途；或可替代地，穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)、能夠在宿主體內(nèi)誘發(fā)可與通過參考疫苗菌株誘導(dǎo)的情況相比較的免疫應(yīng)答，并且還產(chǎn)生可通過特異性血清學(xué)方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株，用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)布魯氏菌病。在此，布魯氏菌是指可以定義為在分類學(xué)上屬于細(xì)菌域(domain)的變形菌門α變形菌綱根瘤菌目布魯氏菌科布魯氏菌屬的任何細(xì)胞生物體。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指真核生物域(domain)的后生動(dòng)物界索動(dòng)物門有頭動(dòng)物亞門顎口動(dòng)物超綱哺乳動(dòng)物綱的任何生物。反芻動(dòng)物是指屬于勞亞獸超目反芻亞目的任何哺乳動(dòng)物。并且牛、綿羊以及山羊是指可以歸類為屬于?？频娜魏尾溉閯?dòng)物。由多管水母(維多利亞多管水母、多管水母、A. forskalea)產(chǎn)生的綠色突光蛋白GFP是在可見光譜的綠色區(qū)域中發(fā)射生物發(fā)光的蛋白。在本發(fā)明的上下文中，還通過核苷酸或多核苷酸序列來(lái)定義GFP，該序列是編碼GFP蛋白的序列，并且該序列可以包括源自以下的數(shù)個(gè)變異體a)編碼包括SEQ ID NO: I的氨基酸序列的多肽的核酸分子，b)其互補(bǔ)鏈與a)多核苷酸序列雜交的核酸分子，c)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并其序列與a)和/或b)不同的核酸分子，d)編碼多肽的核酸分子，該多肽包括與SEQ ID NO: I至少80%、90%、95%、98%或99%一致的氨基酸序列，其中由所述核酸編碼的多肽具有GFP蛋白的活性以及結(jié)構(gòu)特征。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該布魯氏菌菌株屬于流產(chǎn)布魯氏菌。在本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該布魯氏菌菌株是從參考菌株流產(chǎn)布魯氏菌 S19 衍生的菌株(0ΙΕ Terrestrial Manual, 2009-Chapter 2.4.3·-)。在另一個(gè)優(yōu) 選實(shí)施方式中，該布魯氏菌菌株屬于馬爾他布魯氏菌。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該布魯氏菌菌株是從參考菌株馬爾他布魯氏菌Revl衍生的菌株(0ΙΕTerrestrial Manual, 2009-Chapter 2. 7. 2.-)?！傲鳟a(chǎn)布魯氏菌S19”或“流產(chǎn)布魯氏菌bv. lstr. S19”是由John Buck博士于1923年發(fā)現(xiàn)的自發(fā)減毒株，自從二十世紀(jì)三十年代早期以來(lái)它被世界范圍地用作有效疫苗用來(lái)預(yù)防動(dòng)物體內(nèi)的布魯氏菌病并且是舉世公認(rèn)的用于控制牛布魯氏菌病的參考疫苗(0ΙΕ Terrestrial Manual, 2009-chapter 2. 4. 3.-)。原種批次可在美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA,國(guó)立獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(National Veterinary Services Laboratories) , NVSL-, 1800DaytonRoad, Ames, Iowa 50010,美國(guó))以及在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)的OIE的布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室(VLA, ffeybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, United Kingdom)得到。該菌株還稱為 NCTC 8038 (http://www. broadinstitute. org/annotation /genome /brucella_group /GenomeDescriptions.html)?！榜R爾他布魯氏菌Revl”，“馬爾他布魯氏菌bv. lstr. Rev. I”是稱為NCCBV4a (http ://www.broadinstitute.org/annotation/genome/brucella_group/GenomeDescriptions. html)的菌株，它是自發(fā)減毒的并且通過與鏈霉素依賴性相關(guān)聯(lián)的連續(xù)自發(fā)突變以及隨后反轉(zhuǎn)該依賴性從強(qiáng)毒株馬爾他布魯氏菌6056獲得(Herzberg and Elberg 1953.Journal of Bacteriology 66:585-599;Herzberg andElberg 1953. Journal of Bacteriology 66:600-605·)。自從五十年代以來(lái)，Revl菌株已經(jīng)在世界范圍內(nèi)用作唯一有效疫苗用來(lái)預(yù)防小型反芻動(dòng)物體內(nèi)的布魯氏菌病，并且舉世公認(rèn)為該參考疫苗能夠控制牛和山羊的布魯氏菌病(0ΙΕ TerrestrialManual, 2009-chapter 2. 7. 2. -)。Revl的原種批號(hào)可在AFSSA的OIE的布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室(94706Maisons_Alfort，F(xiàn)rance)以及在歐洲藥典(European Pharmacopoeia) (BP907, 67029Strasbourg Cedex I,法國(guó)(France))得到。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物是反芻動(dòng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物是牛，并且甚至更優(yōu)選地屬于?；蛏窖騺喛?。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包括表達(dá)GFP蛋白的布魯氏菌菌株，以及優(yōu)選地藥學(xué)上可接受載體的組合物，以下稱為“本發(fā)明組合物”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該布魯氏菌菌株屬于流產(chǎn)布魯氏菌(物種)。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該布魯氏菌菌株是從流產(chǎn)布魯氏菌S19衍生的菌株。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,布魯氏菌菌株屬于馬爾他布魯氏菌。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，布魯氏菌菌株是從馬爾他布魯氏菌Revl衍生的菌株。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物是疫苗。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包括佐劑。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，包括表達(dá)GFP蛋白的布魯氏菌菌株的本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包括另一種活性成分?？梢耘渲票景l(fā)明的組合物用于以現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種方式施用到動(dòng)物，并且更優(yōu)選地哺乳動(dòng)物體(包括反芻動(dòng)物)內(nèi)，用作免疫原。這些免疫原還可以在動(dòng)物體內(nèi)，并且更具體地在哺乳動(dòng)物體內(nèi)用作疫苗，或用于在其中在抗體生產(chǎn)中產(chǎn)生應(yīng)答。為了配制這類組合物，使免疫學(xué)有效量的布魯氏菌菌株與適合施用于哺乳動(dòng)物(包括人類)體內(nèi)的生理學(xué)可接受的載體相混合。因此，本發(fā)明的組合物可以在無(wú)菌水溶液中或在生物流體例如血清中存在，但不限于此。這些水溶液可以是緩沖的或非緩沖的并且具有另外的活性或非活性組分。另外的組分包括用于調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度的鹽類，防腐劑類包括但不限于抗微生物劑類、抗氧化劑類、螯合劑類等，以及營(yíng)養(yǎng)物類包括但不限于葡萄糖、右旋糖、維生素以及礦物質(zhì)?？商娲兀梢灾苽湟怨腆w形式施用的活性成分。該活性成分可以與多種惰性載體或賦形劑結(jié)合，包括但不限于粘合劑類例如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑類例如淀粉或乳糖； 分散劑類例如海藻酸或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑類例如硬脂酸鎂、助流劑類例如膠體二氧化硅；甜味劑類例如鹿糖或糖精；或調(diào)味劑類例如胡椒薄荷或水楊酸甲酯。本發(fā)明的組合物能夠以多種形式(包括但不限于腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、結(jié)膜、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、口腔、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚給藥)施用到動(dòng)物體內(nèi)，包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選反芻動(dòng)物，并且甚至更優(yōu)選屬于?；蛏窖騺喛?。得到治療有效量的劑量取決于動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物的多種因素(例如年齡、體重、性別、生理狀態(tài)-例如懷孕或哺乳狀態(tài)-免疫系統(tǒng)的耐受情況)。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白，產(chǎn)生希望效果的(產(chǎn)生免疫性以及抗GFP抗體)布魯氏菌的數(shù)量。可以用于這類組合物中的“佐劑”和“藥學(xué)上可接受的載體”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在此，術(shù)語(yǔ)“藥物”是指用于在人類和動(dòng)物體內(nèi)預(yù)防、診斷、緩解、治療或治愈疾病的任何物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，它涉及包括穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白的布魯氏菌菌株的組合物，并且該菌株能夠產(chǎn)生對(duì)抗布魯氏菌病的免疫性以及抗GFP的抗體，或涉及包括穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白的布魯氏菌的組合物以及藥學(xué)上可接受的載體和/或另外地一種佐劑，該組合物能夠產(chǎn)生對(duì)抗布魯氏菌病的免疫性以及抗GFP的抗體。因此術(shù)語(yǔ)藥物包括疫苗。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指用于建立免疫系統(tǒng)對(duì)疾病應(yīng)答的抗原性組合物或制劑。它是指一旦進(jìn)入體內(nèi)就通過產(chǎn)生抗體引起免疫系統(tǒng)應(yīng)答的抗原制劑，并且生成免疫記憶,產(chǎn)生永久性或暫時(shí)性免疫性。在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指雖然本身不具有抗原性作用單抗原刺激免疫系統(tǒng)增加其對(duì)疫苗應(yīng)答的試劑。雖然不限于下面各項(xiàng)，鋁鹽“磷酸鋁”和“氫氧化鋁”是在疫苗中兩種最常用的佐劑。還抗原使用其他物質(zhì)(例如鯊烯)作為佐劑。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“活性要素”、“活性物質(zhì)”、“藥學(xué)上活性物質(zhì)”、“活性成分”或“藥學(xué)上活性成分”是指在診斷、治愈、緩解、治療、或預(yù)防疾病方面提供潛在藥理學(xué)活性或另一種不同作用的任何組分，或它影響了人體或其他動(dòng)物的結(jié)構(gòu)或功能。該術(shù)語(yǔ)包括在制備藥物中促進(jìn)化學(xué)改變并且以預(yù)見改變的形式存在于其中的那些組分，該改變的形式提供特異性活性或效果。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于鑒別用本發(fā)明菌株或組合物接種的哺乳動(dòng)物的方法，以下稱為“本發(fā)明方法”，包括a)從哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得分離的生物樣品，b)在分離的哺乳動(dòng)物生物樣品中檢測(cè)編碼GFP蛋白的gfp基因，或它們的表達(dá)產(chǎn)物的存在。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物是反芻動(dòng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物是牛、綿羊或山羊，并且甚至更優(yōu)選地屬于牛和山羊亞科?！胺蛛x的生物樣品”包括但不限于通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法獲得 的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、組織和/或生物流體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該分離的生物樣品是生物流體，例如但不限于奶、精液、精液流體、陰道排出物、結(jié)膜排出物、血液、血漿或血清。更優(yōu)選地，該生物流體是血清。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該分離的生物樣品是在哺乳動(dòng)物的血液、乳汁、精液、陰道排出物或結(jié)膜分泌物中找到的細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，它包括細(xì)胞或組織。用于在分離的生物樣品中檢測(cè)gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物存在的多種方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。在此“gfp基因的表達(dá)產(chǎn)物”包括但不限于GFP蛋白例如對(duì)抗所述蛋白或抗原由哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的兩種抗-GFP抗體。因此，在本發(fā)明這個(gè)方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在分類的哺乳動(dòng)物生物樣品中檢測(cè)gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物的存在是通過檢測(cè)抗GFP蛋白的抗體(抗GFP抗體)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。檢測(cè)抗GFP抗體可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)例如但不限于通過免疫測(cè)定法或免疫組織化學(xué)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該免疫測(cè)定法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法或ELISA?？乖蛎庖咴悄軌蛲ㄟ^活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生適當(dāng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖ǔ５厥堑鞍谆蚨嗵恰Ｖ挥挟?dāng)與蛋白或多糖結(jié)合時(shí)，脂類和核酸才是抗原性的。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含與GFP蛋白(抗原)特異性結(jié)合(免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。存在免疫球蛋白的五個(gè)主要同型或類別IgM、IgD、IgG、IgA 以及 IgE。術(shù)語(yǔ)“抗-GFP抗體”是指能夠與GFP蛋白反應(yīng)，與GFP蛋白變異體或其片段反應(yīng)的抗體，其條件是所述變異體或片段是功能上等效的。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)抗GFP抗體是指免疫球蛋白 G (IgG)ο如在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“免疫測(cè)定”是指基于抗體與抗原偶聯(lián)反應(yīng)的任何分析技術(shù)。現(xiàn)有技術(shù)中已知的免疫測(cè)定法的實(shí)例是但不限于免疫印跡、酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)、線性免疫測(cè)定(LIA)、放射性免疫測(cè)定(RIA)、免疫熒光、x_譜圖或蛋白或脂多糖芯片(LPS)。如所述，在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該免疫測(cè)定法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法或 ELISA (Enzyme-Linked TmmunoSorbent Assay)。ELISA 是基于這種假設(shè)即抗原將免疫試劑(抗原或抗體)固定在固體支持物上，然后使該系統(tǒng)與包含可以結(jié)合到標(biāo)志物化合物上的互補(bǔ)試劑的流體相接觸。存在不同類型的ELISA :直接ELISA，間接ELISA以及夾心ELISA。
本發(fā)明的諸位發(fā)明人說(shuō)明了能夠鑒別已經(jīng)用新疫苗原型S19-GFPp接種的動(dòng)物并且將它們與用布魯氏菌強(qiáng)毒株感染的那些動(dòng)物區(qū)分開的血清學(xué)診斷的方法。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該ELISA是間接ELISA，并且甚至更優(yōu)選地它包括下面步驟(a)用至少該GFP蛋白、所述蛋白的變異體、或其片段包被(涂覆,coating)固體支持物；(b)在允許至少抗該GFP抗原的抗體與其變異體或片段形成免疫復(fù)合物的條件下 用從哺乳動(dòng)物體內(nèi)得到的生物學(xué)樣品孵化來(lái)自前面步驟的浸潰的支持物；以及(c)與二抗一起孵化，該二抗識(shí)別偶聯(lián)或結(jié)合到標(biāo)志物分子上的抗GFP抗原的抗體。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物化合物”是指能夠產(chǎn)生允許檢測(cè)抗GFP抗體的生色、生熒光、放射性和/或化學(xué)發(fā)光信號(hào)的化合物。該標(biāo)志物化合物是選自下列，包括放射性同位素類、酶類、熒光團(tuán)類或能夠與另一種分子結(jié)合或檢測(cè)和/或直接定量的任何分子。該標(biāo)志物化合物可以通過另一種化合物直接地或間接地結(jié)合到抗體上。直接結(jié)合的標(biāo)志物化合物的實(shí)例是，但不限于，酶類例如堿性磷酸酶或過氧化物酶，放射性同位素類例如32P或35s，熒光團(tuán)類例如熒光素、若丹明或它們的衍生物類，或金屬顆粒類，用于對(duì)應(yīng)地通過比色法、放射性自顯影、熒光測(cè)定法、或金相學(xué)直接檢測(cè)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在分離的哺乳動(dòng)物生物樣品中檢測(cè)gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物的存在是通過紫外照射所述樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，在分離的哺乳動(dòng)物生物樣品中檢測(cè)gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物的存在是通過熒光顯微術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在分離的哺乳動(dòng)物生物樣品中檢測(cè)gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物的存在是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于鑒別用本發(fā)明菌株或組合物免疫的哺乳動(dòng)物的“試劑盒”，包括用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的適當(dāng)裝置。所述試劑盒可以包含使用上文中所述方法中任何一種對(duì)于分析在分離的哺乳動(dòng)物生物樣品中存在gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物所必要的所有那些試劑，例如但不限于GFP蛋白的特異性抗體，或二抗或陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照。該試劑盒還可以包括但不限于緩沖劑類、蛋白提取溶液類、用于防止污染的試劑類、蛋白降解抑制劑類等。在通過涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的情況中，它可以包含，但不限于，引物、探針以及對(duì)于確定gfp基因或其表達(dá)產(chǎn)物的存在所必要的所有試劑。該試劑盒還可以包括但不限于使用緩沖劑、聚合酶、用來(lái)獲得其最佳活性的輔因子、用于防止污染的試劑等。另一方面，該試劑盒可以包括所有支持物裝置以及用于將它投入實(shí)踐以及優(yōu)化所需要的容器。優(yōu)選地，該試劑盒進(jìn)一步包括用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的說(shuō)明書。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在此可互換地使用，是指任何長(zhǎng)度核苷酸的聚合物形式，核糖核苷酸(RNA)和脫氧核糖核苷酸(DNA)兩者。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”、“肽”、“寡肽”、“多肽”以及“蛋白”在此可互換地使用，并且是指化學(xué)或生物化學(xué)修飾的任何長(zhǎng)度氨基酸的聚合物形式。貫穿本說(shuō)明書以及權(quán)力要求書，詞語(yǔ)“包括”以及它的變化不旨在排除其他技術(shù)特征、添加劑、組分或步驟。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，部分地從本說(shuō)明書以及部分地從本發(fā)明的實(shí)踐本發(fā)明的其他目標(biāo)、優(yōu)點(diǎn)以及特征將變得清楚。下面實(shí)例和附圖是作為舉例說(shuō)明來(lái)提供的并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。


圖I.在胰蛋白酶解酪蛋白大豆瓊脂平板中新疫苗-GFPp S19以及親本疫苗S19的生長(zhǎng)，在Bio-Rad生產(chǎn)的“Gel Doc”設(shè)備中在用紫外光照射，并且用適當(dāng)?shù)臑V光片(520DF30nm, Bio Rad) (A)或在熒光顯微鏡中(B)進(jìn)行顯影。圖2.與強(qiáng)毒株流產(chǎn)布魯氏菌2308相比較在新疫苗S19_GFPp中ery區(qū)域(低分子量)的PCR擴(kuò)增。圖3.在感染之后I小時(shí)，在用新疫苗S19-GFPp或用親本菌株S19感染的HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外細(xì)菌比率。這些HeLa以200CFU/細(xì)胞來(lái)感染并且I小時(shí)之 后，按照前面說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)方案(Chaves-Olarte et al. , 2002. Cellular Microbiology4(10) :663-675)用若丹明和FITC通過雙重免疫熒光進(jìn)行固定和標(biāo)記。圖4.在感染后48小時(shí)在HeLa細(xì)胞以及RAW 264. 7巨噬細(xì)胞中新疫苗S19-GFPp以及親本菌株S19的復(fù)制。以200CFU/細(xì)胞來(lái)感染細(xì)胞并且按照前面說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)確定CFU/mL的數(shù)量(Chaves-Olarte et al. , 2002. CellularMicrobiology 4 (10):663-675;CelIi et al.,2003.Journal of ExperimentalMedicine, 198(4):545-556)。圖5.在鼠類模型中新疫苗S19-GFPp以及親本菌株S19的脾動(dòng)力學(xué)。用IxlO5CFU的新疫苗S19-GFPp或親本菌株S19來(lái)腹膜內(nèi)地接種30只小鼠的組。在感染后第7、14、25、40以及60天，按照前面說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)方案(Sangari et al.，1998.Vaccine, 16 (17) : 1640-1645)將來(lái)自每組的6只小鼠處死用來(lái)確定每個(gè)疫苗菌株CFU/脾的數(shù)量并且構(gòu)建脾繁殖的相應(yīng)曲線。圖6.在用新疫苗S19-GFPp免疫的BALB/c小鼠體內(nèi)的保護(hù)測(cè)定。用IxIO5CFU新疫苗S19-GFPp或親本菌株S19皮下地免疫6只小鼠的組。作為對(duì)照，用無(wú)菌PBS來(lái)接種一組小鼠。在60天之后，用5x104CFU參考強(qiáng)毒株流產(chǎn)布魯氏菌對(duì)2308所有小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)地腹膜內(nèi)感染并且2周后，處死用來(lái)對(duì)每個(gè)脾2308的CFU數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。用S19-GFPp接種的動(dòng)物顯示與通過參考疫苗S 19所顯示相類似水平的保護(hù)。圖7.在用新疫苗S19-GFPp以及親本菌株S19免疫的小鼠體內(nèi)對(duì)抗布魯氏菌LPS的抗體應(yīng)答。在未免疫的小鼠(對(duì)照)體內(nèi)以及在免疫之后第7、14、25以及60天在用IxIO5CFU新疫苗S 19_GFPp或親本菌株S19腹膜內(nèi)免疫的小鼠體內(nèi)得到血清樣品。將這些血清1/200稀釋于PBS中并且在405nm下以通常地用于診斷動(dòng)物布魯氏菌病的抗LPS的間接ELISA來(lái)測(cè)量它們的光密度(0D)。圖上每個(gè)點(diǎn)表示基于來(lái)自不同小鼠5個(gè)血清的平均值。所有動(dòng)物都產(chǎn)生抗布魯氏菌LPS的抗體。圖8在獲得重組蛋白GST-GFP的鼠體內(nèi)確定純度和免疫原性。A)通過親和性純化的重組蛋白GST-GST在SDS-PAGE中顯示單一條帶。B)在小鼠體內(nèi)用作免疫原的GST-GFP蛋白誘導(dǎo)了抗GFP抗體。用對(duì)抗10yg/30yLGFP(孔G)的單特異性血清的連續(xù)稀釋液(孔2至32)進(jìn)行免疫擴(kuò)散反應(yīng)，并且作為對(duì)照，僅使用PBS (孔_)。沉淀?xiàng)l帶顯示在小鼠體內(nèi)得到的抗-GFP免疫血清顯示1/16的滴度。圖9.使用來(lái)自先前用重組蛋白GST-GFP免疫的小鼠(a)或綿羊(b)的血清發(fā)展的ELISA-GFP中標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖10.在來(lái)自用新S19-GFPp疫苗或參考疫苗S19接種的小鼠的血清中抗GFP的抗體應(yīng)答強(qiáng)度。根據(jù)相對(duì)于對(duì)照樣品陽(yáng)性率百分比(陽(yáng)性血清的OD/血清樣品的ODX 100)計(jì)算出每個(gè)個(gè)別血清的反應(yīng)強(qiáng)度。每個(gè)點(diǎn)表示基于來(lái)自不同小鼠10個(gè)血清的平均值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例下面將通過由諸位發(fā)明人所完成的測(cè)定對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。I-流產(chǎn)布魯氏菌S19的熒光疫苗衍生物原型(S19-GFPp)的開發(fā)

通過用編碼GFP的質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔對(duì)參照疫苗流產(chǎn)布魯氏菌S19 (從法國(guó)AFSSA的OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室得到)進(jìn)行基因修飾。所使用的質(zhì)粒是從質(zhì)粒pBBRMCS-2衍生的pBBR-2-gfp,它包含卡那霉素耐受性插入片段(Kovach et al. , 1995. Gene. Vol166:175-176)以及具有處于Iac啟動(dòng)子控制下的編碼GFP基因的插入片段。已知的是這種質(zhì)粒構(gòu)成型地(constitutively)生產(chǎn)GFP,而不整合到布魯氏菌染色體中(Celli etal. , 2003. Journal of Experimental Medicine, 198(4):545-556)。2. _S19_GFPp的遺傳以及微生物學(xué)表征2. I.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是細(xì)菌S19-GFPp發(fā)出可通過用紫外光直接照射培養(yǎng)物并且隨后用適當(dāng)?shù)臑V光片對(duì)其進(jìn)行顯影(圖1A)或通過在熒光顯微鏡下觀察感染的組織或滲出物(圖1B)而檢測(cè)的熒光。因此，質(zhì)粒pBBR-2-gfp允許以適當(dāng)比例在布魯氏菌中表達(dá)GFP使得在分離之后可能視覺地鑒別新疫苗S19-GFPp。2.2.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是GFP蛋白在布魯氏菌中的表達(dá)未改變細(xì)菌培養(yǎng)物中S19的克隆大小以及階段、或它的典型細(xì)菌學(xué)特征。為此，通過在氟化3天之后在瓊脂平板上獲得的克隆測(cè)量直徑來(lái)確定克隆大小。平行地，通過在斜光照明的透鏡中并且用結(jié)晶紫-草酸鹽溶液使用泛濫技術(shù)染色來(lái)觀察細(xì)菌生長(zhǎng)從而確定克隆階段(Alton et al. 1988. Techniquesfor the brucellosis laboratories. In. INRA(Ed.)，Paris, France, 1988，190pp)。另外，使用用于鑒別以及分型布魯氏菌的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)得到的新菌株進(jìn)行微生物學(xué)分析。簡(jiǎn)言之，通過測(cè)試過氧化氫酶、氧化酶、脲酶以及吖啶黃素凝集來(lái)進(jìn)行屬水平的鑒定。對(duì)于種水平的鑒定，使用對(duì)細(xì)菌噬菌體Tb、Wb、Iz以及R/C靈敏度的測(cè)試。最后，對(duì)于生物變種水平的分型使用凝集測(cè)試，其中在瓊脂平板上進(jìn)行單特異性血清抗-A和抗-M以及生長(zhǎng)測(cè)試并且瓊脂補(bǔ)充有10%無(wú)菌牛血清(瓊脂-s; Seromed, Biochrom)包含標(biāo)準(zhǔn)濃度的染料(20 μ g/mL硫堇、20 μ g/mL品紅以及100 μ g/mL番紅；Panreac)、抗生素(5UI/mL青霉素；Sigma)以及赤蘚醇(lmg/mL ；Merck)。在37° C下在需氧氣氛中，并且平行地在具有10%C02的氣氛中將包含具有或不具有不同濃度的所有這些產(chǎn)品的瓊脂以及瓊脂-S (對(duì)照平板)的平板孵育 2-4 天(Alton et al. 1988. Techniques for the brucellosis laboratories. In. INRA (Ed.), Paris, France, 1988, 190pp)。2. 3.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是在菌株S19-GFPp中攜帶gfp基因質(zhì)粒的結(jié)合以及活性兩者在它體外以及體內(nèi)活化之后是穩(wěn)定的。在這個(gè)方面，實(shí)現(xiàn)在瓊脂平板上將菌株S19-GFPp連續(xù)傳代，并且在數(shù)個(gè)連續(xù)傳代之后，在瓊脂平板以及補(bǔ)充有卡那霉素的瓊脂(用作質(zhì)粒標(biāo)志物的抗生素)中進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。其結(jié)果是，觀察到在兩種培養(yǎng)基中CFU的數(shù)量是類似的并且觀察到所有S19-GFPp CFU保持熒光，表明在體外十二次傳代之后在流產(chǎn)布魯氏菌S19中GFP質(zhì)粒的結(jié)合以及活性是穩(wěn)定的。在從細(xì)胞培養(yǎng)物中四個(gè)連續(xù)傳代以及在前面用S19-GFPp接種的小鼠組織中三個(gè)連續(xù)傳代(參見下面顯示的生物學(xué)表征研究)中分離細(xì)菌之后進(jìn)行同樣試驗(yàn)，表明甚至在體內(nèi)、在細(xì)胞培養(yǎng)物以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體(小鼠)內(nèi)細(xì)菌活化之后在流產(chǎn)布魯氏菌S19中GFP質(zhì)粒的結(jié)合和活性是穩(wěn)定的。在-80° C或-20° C下在50%甘油中冷凍之后在流廣布魯氏囷S19中編碼GFP蛋白的質(zhì)粒保持穩(wěn)定，表明所有恢復(fù)的克隆在融化之后放射熒光。2. 4.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是菌株S19-GFPp保持流產(chǎn)布魯氏菌S19的典型基因型，保留在基因ery中702個(gè)bp (堿基對(duì))的特征性缺失(低分子量條帶，圖2)并且有可能從流產(chǎn)布魯氏菌的強(qiáng)毒株中區(qū)別疫苗菌株S19 (高分子量條帶，圖2)。
3.-在廣泛用于實(shí)驗(yàn)性布魯氏菌病的細(xì)胞以及動(dòng)物模型(小鼠)體內(nèi)S19-GFPp的生物學(xué)表征。3. I.在細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)的是3.1.1.-新疫苗S19-GFPp具有附著以及內(nèi)化到人上皮HeLa細(xì)胞中的能力，這些細(xì)胞實(shí)質(zhì)上與參考疫苗相同(圖3)。3.1.2.-新疫苗S19-GFPp在HeLa細(xì)胞中以及在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力實(shí)質(zhì)上與親代菌株S19相同(圖4)。3.2.在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)的是3.2.1.-新疫苗S19-GFPp在小鼠體內(nèi)具有減毒作用，它實(shí)質(zhì)上與典型疫苗S19相同(圖5)，表明所使用的gfp基因表達(dá)未改變典型親本疫苗的脾動(dòng)力學(xué)(繁殖以及持久性能力)。3. 2. 2.-新疫苗S19-GFPp提供了保護(hù)作用，這實(shí)質(zhì)上與在小鼠模型中典型親本疫苗所提供的相同(圖6)，表明GFP表達(dá)未消除典型親本疫苗S19的有效性。3.2.3.-通過對(duì)抗 LPS 的常規(guī)的間接 ELISA (Marin et al. , 1999.Clinical&Diagnostic Laboratory Immunology 6(2):269-272)測(cè)量的，由新疫苗S19-GFPp誘導(dǎo)的，對(duì)抗流產(chǎn)布魯氏菌LPS抗原的抗體應(yīng)答，與通過典型疫苗S19產(chǎn)生的相類似(圖7)。這表明新疫苗S19-GFPp保持其免疫原性特性的完整性。3. 2. 4.-在布魯氏菌S19-GFPp疫苗菌株中表達(dá)的GFP在動(dòng)物體內(nèi)是高免疫原性的。在免疫接種之后用S19-GFPp免疫的所有小鼠都產(chǎn)生了對(duì)GFP的特異性抗體持續(xù)至少90天，其中在于此說(shuō)明的ELISA-GFP原型中陽(yáng)性率約40% (在統(tǒng)計(jì)上大于陽(yáng)性對(duì)照所顯示的)。4.-用于檢測(cè)在免疫小鼠體內(nèi)由S19-GFPp產(chǎn)生的抗體的間接ELISA的設(shè)計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)化(ELISA-GFP)。4.1.首先，根據(jù)前面所述的實(shí)驗(yàn)方案對(duì)重組GFP蛋白(GST-GFP)進(jìn)行表達(dá)以及純化(Harlow and Lane 1988. Antibodies: a laboratory manual. 1st. Ed. Cold SpringHarbor Laboratory, NY p. 179-179)。簡(jiǎn)言之，在具有質(zhì)粒pGEX-GFP的大腸桿菌XLl-藍(lán)色系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白GST-GFP，通過親和層析法對(duì)它進(jìn)行純化并且通過丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)它的純度進(jìn)行確定(圖8A)。4.2.隨后，按照常規(guī)的免疫實(shí)驗(yàn)方案在小鼠體內(nèi)得到抗GFP的對(duì)照血清。為此，施用具有弗氏完全佐劑的100 μ g GST-GFP蛋白的注射劑，緊接著以一周的間隔用具有弗氏非完全佐劑的GST-GFP蛋白進(jìn)行2次連續(xù)的免疫。進(jìn)行免疫持續(xù)數(shù)周直至證實(shí)用GST-GFP免疫的動(dòng)物血清在對(duì)抗純GFP蛋白的凝膠免疫擴(kuò)散中顯示沉淀?xiàng)l帶(圖SB)。這些對(duì)照抗體顯示與任何布魯氏菌抗原無(wú)交聯(lián)反應(yīng)(結(jié)果未顯示)。另外，按照常規(guī)免疫實(shí)驗(yàn)方案在綿羊體內(nèi)得到抗GFP的對(duì)照血清。為此，注射具有弗氏完全佐劑的IOOyg GST-GFP蛋白，緊接著以兩周間隔用具有弗氏非完全佐劑的GST-GFP蛋白進(jìn)行5次連續(xù)免疫。進(jìn)行免疫持續(xù)2個(gè)月直至證實(shí)用GST-GFP免疫的動(dòng)物血清在對(duì)抗純GFP蛋白的凝膠免疫擴(kuò)散中顯示沉淀?xiàng)l帶(結(jié)果未顯示)。這些對(duì)照抗體顯示與任何布魯氏菌抗體無(wú)交聯(lián)反應(yīng)(結(jié)果未顯示)。4. 3.為了對(duì)能夠在綿羊血清中以及接種有新疫苗S19-GFPp的小鼠血清中特異性檢測(cè)對(duì)抗GFP蛋白的抗體的間接ELISA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(ELISA-GFP)，步驟如下
4. 3. I.用包含在一個(gè)體積100 μ L/孔處于PBS (PBST，Sigma)中的O. 01%吐溫20緩沖液中的I μ gGST-GFP/孔包被96孔板Immunolon II (Nunc Co.)的多個(gè)板。用粘性塑料(Sigma)覆蓋這些孔板并且在37° C下孵育2小時(shí)同時(shí)攪拌，緊接著在4° C下不攪拌另外孵育15小時(shí)。最后，將30%甘油添加到各孔中，用粘性塑料覆蓋這些孔板并且在-20° C下冷凍直至使用。4. 3. 2.為了用小鼠血清建立校準(zhǔn)曲線，在部分4. 3. I中所述的孔板允許在室溫下融化并且用包含處于PBS(PBST-BSA)中O. 01%吐溫以及O. 1%脫脂牛白蛋白的溶液洗滌4次。然后，一式三份地添加處于1/300至1/60000間來(lái)自在部分4. 2.中所述小鼠的抗-GFP免疫血清的lOOyL/孔稀釋劑。作為陰性對(duì)照，使用來(lái)自無(wú)布魯氏菌小鼠的常規(guī)血清，并且使用PBS作為空白。在25° C下將這些孔板孵育I小時(shí)同時(shí)攪拌，用PBST-BSA洗滌4次，添加對(duì)抗小鼠IgG(H+L)偶聯(lián)到過氧化物酶(HRP)上的偶聯(lián)物(從兔體內(nèi)得到的);如前面所述第二次將它們孵育(在25° C下I小時(shí)，同時(shí)攪拌)并且洗滌(4次)，并且最后添加ABTS過氧化物酶底物(Sigma)。在ELISA酶標(biāo)儀中在405nm波長(zhǎng)下完成在每孔中產(chǎn)生的OD讀數(shù)并且如圖9. a.中所示建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。4. 3. 3.為了用綿羊血清建立校準(zhǔn)曲線，在部分4. 3. I中所述的孔板允許在室溫下融化并且用包含處于PBS(PBST-BSA)中O. 01%吐溫以及O. 1%脫脂牛白蛋白的溶液洗滌4次。然后，一式三份地添加處于1/59至1/128000之間的在點(diǎn)4. X中所述來(lái)自綿羊的抗-GFP免疫血清的100 μ L/孔稀釋液。關(guān)于陰性對(duì)照，使用來(lái)自無(wú)布魯氏菌免疫的常規(guī)血清，并且將PBS用作空白。在37° C下將這些孔板孵育I小時(shí)同時(shí)攪拌，用PBST洗滌4次；將蛋白G-過氧化物酶(Sigma)添加到處于pH 7. 2PBS中1:2000的稀釋液中；如前所述第二次將它們孵育(在25。C，I小時(shí)，同時(shí)攪拌)并且洗滌(4次)，并且最后添加ABTS過氧化物酶底物(Sigma)。在ELISA酶標(biāo)儀中在405nm波長(zhǎng)下完成在每個(gè)孔中產(chǎn)生的CD的讀數(shù)并且如圖9. b.中所示建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.3.4.為了確定在用新疫苗接種的小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的抗GFP抗體應(yīng)答的強(qiáng)度，使用來(lái)自用新疫苗S19-GFPp或來(lái)自未標(biāo)記的親本菌株S19的疫苗接種(IxIO5CFU/小鼠，腹膜內(nèi)地)的小鼠體內(nèi)的“問題”血清，并且在免疫之后3至14周之間對(duì)動(dòng)物周期性地取血(圖10)。關(guān)于陽(yáng)性對(duì)照，使用如在部分4. 2.中說(shuō)明的血清，并且關(guān)于陰性對(duì)照，使用在部分4. 3. 2中說(shuō)明的那些。所有這些血清以1/200的比例稀釋于PBST中并且如下完成ELISA-GFP :如在部分4. 3. 2中所述對(duì)在部分4. 3. I中所述的孔板進(jìn)行洗滌；然后添加100 μ I/孔的上述血清(1/200稀釋)或100μ I/孔的PBS (作為反應(yīng)的空白)，并且最后，如4. 3. 2中所述對(duì)這些孔板進(jìn)行處理。相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照血清(100%陽(yáng)性)和空白樣(0%陽(yáng)性)的光密度(OD4tl5=O. 9)計(jì)算出每個(gè)單獨(dú)血清的陽(yáng)性率百分比。用S19-GFPp接種的所有動(dòng)物顯示抗GFP的強(qiáng)烈血清學(xué)反應(yīng)(約40%陽(yáng)性；圖10)而用菌株S19接種的動(dòng)物行為類似于無(wú)布魯氏菌的那些(陰性對(duì)照)，無(wú)對(duì)抗GFP蛋白的反應(yīng)(圖10)?？傊@項(xiàng)工作顯示可以在布魯氏菌疫苗菌株中表達(dá)GFP蛋白而不改變親本菌株的生物學(xué)特性，同時(shí)在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)可與由其他布魯氏菌菌株誘導(dǎo)的清楚地區(qū)別開的血清學(xué)應(yīng)答?？梢酝ㄟ^對(duì)抗在該親本體內(nèi)發(fā)展的GFP的間接ELISA來(lái)鑒別對(duì)抗GFP蛋白產(chǎn)生的抗體。此外，該gfp基因結(jié)合到布魯氏菌體內(nèi)提供了視覺鑒定(通過紫外光或熒光顯微鏡) 以及分子鑒定(通過PCR擴(kuò)增該gfp基因；PCR-GFP)兩者從細(xì)菌培養(yǎng)物以及組織樣品、滲出物或動(dòng)物流體發(fā)展的布魯氏菌疫苗菌株。
權(quán)利要求
1.表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的布魯氏菌菌株在開發(fā)藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的布魯氏菌菌株在開發(fā)用于預(yù)防哺乳動(dòng)物體內(nèi)布魯氏菌病的藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株屬于流產(chǎn)布魯氏菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株是從參照株流產(chǎn)布魯氏菌S19衍生的菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株屬于馬爾他布魯氏菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株是從參照株馬爾他布魯氏菌Revl衍生的菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是反芻動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述反芻動(dòng)物屬于牛亞科。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述反芻動(dòng)物屬于山羊亞科。
10.包括根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的布魯氏菌菌株的組合物。
11.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的組合物，進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10-11中任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物是疫苗。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包括佐劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包括另一種活性成分。
15.用于鑒別用根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述組合物治療的哺乳動(dòng)物的方法，包括 a.獲得從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的生物樣品， b.在從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的生物樣品中檢測(cè)gfp基因或它的表達(dá)產(chǎn)物的存在。
16.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的用于鑒別治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的生物樣品是生物流體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用于鑒別治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的生物樣品是細(xì)胞或組織。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的用于鑒別治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中在從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的生物樣品中檢測(cè)gfp基因的表達(dá)產(chǎn)物是通過檢測(cè)抗-GFP抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于鑒別治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中檢測(cè)所述抗-GFP抗體是通過免疫測(cè)定法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中所述免疫測(cè)定法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELI SA)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中所述ELISA測(cè)定法是間接ELISA。
22.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中檢測(cè)所述gfp基因或它的表達(dá)產(chǎn)物是通過紫外光實(shí)現(xiàn)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求15-17以及22中任一項(xiàng)所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中檢測(cè)所述gfp基因或它的表達(dá)產(chǎn)物是通過熒光顯微術(shù)實(shí)現(xiàn)的。
24.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動(dòng)物的方法，其中檢測(cè)所述gfp基因或它的表達(dá)產(chǎn)物是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)的。
25.用于鑒別用根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的菌株或組合物治療的哺乳動(dòng)物的試劑盒，包括用于實(shí)現(xiàn)根據(jù)權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)所述的鑒別方法的適當(dāng)裝置。
26.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的鑒別試劑盒，包括用于檢測(cè)所述抗-GFP抗體的適當(dāng)裝置。
27.根據(jù)權(quán)利要求25-26中任一項(xiàng)所述的鑒別試劑盒，包括具有序列SEQID N0:2以及SEQ ID NO:3 的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的布魯氏菌菌株在制備用于預(yù)防哺乳動(dòng)物體內(nèi)布魯氏菌病的藥物中的用途，涉及對(duì)抗布魯氏菌病的疫苗，以及涉及用于鑒別已經(jīng)施用所述疫苗的哺乳動(dòng)物的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明方法是免疫測(cè)定法，并且更優(yōu)選地它是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。
文檔編號(hào)A61K39/10GK102781468SQ201080063027
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者卡泰麗娜·古茲曼韋里, 卡洛斯·洽孔迪亞茲, 埃德加·莫雷諾羅布萊斯, 埃斯特班·查維斯奧拉特, 比阿特麗斯·阿莫雷納扎巴爾扎, 瑪麗亞·格里洛多爾賽特, 達(dá)米安·德安德烈斯卡拉 申請(qǐng)人:哥斯達(dá)黎加國(guó)立大學(xué), 哥斯達(dá)黎加大學(xué), 納瓦拉公立大學(xué), 西班牙高等科研理事會(huì)