專利名稱：：當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法，屬于對藥品進(jìn)行質(zhì)量控制的
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：當(dāng)飛利肝寧制劑是采用民間傳統(tǒng)治療肝炎藥物當(dāng)藥和七十年代從西德引種植物水飛薊制備而成的純天然藥物，具有清利濕熱、益肝退黃之功效，主要用于治療濕熱郁蒸而致的黃膽、急性黃膽型肝炎、傳染性肝炎、慢性肝炎等癥(臨床發(fā)現(xiàn)還可治療高脂血癥和脂肪肝)，其療效確切可靠，無副作用。其中的"當(dāng)飛利肝寧膠囊"刊登在中國局頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十七冊上，已在臨床上應(yīng)用多年，取得了較滿意的治療效果。目前的質(zhì)量控制主要依據(jù)的是國家衛(wèi)生部頒《中藥成方制劑》第十七冊第99頁中當(dāng)飛利肝寧膠囊標(biāo)準(zhǔn)WS3-B—3199"98，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有當(dāng)飛利肝寧膠囊存在質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)簡單，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制的缺點，在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，用該質(zhì)量控制方法不能有效控制該制劑的質(zhì)量，從而將影響其臨床療效。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，是提供一種當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法。本發(fā)明針對原有當(dāng)飛利肝寧膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)簡單，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制的缺點，對本制劑的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究，擬訂了在鑒別當(dāng)藥齊墩果酸基礎(chǔ)上增加了對當(dāng)藥中龍膽苦苷的薄層鑒別和水飛薊中水飛薊賓的薄層色譜鑒別，提高了當(dāng)飛利肝寧制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，該質(zhì)量控制方法可有效地控制當(dāng)飛利肝寧制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，從而保證了該制劑的臨床療效。本發(fā)明所述的當(dāng)飛利肝寧制劑是這樣構(gòu)成的處方水飛薊900g、當(dāng)藥950g制法以上二味，取水飛薊破碎，去油后，照流浸膏劑與浸膏劑項下的滲漉法(中國藥典一部附錄IO),以80%乙醇為溶劑.緩緩滲漉.收集漉液，減壓回收乙醇，濃縮成膏，得水飛薊總黃酮，粉碎成細(xì)粉，備用；當(dāng)藥900g分別以959L75%及50%乙醇進(jìn)行梯度提取，濾過，合并濾液，濃縮至稠膏狀，加入剩余當(dāng)藥細(xì)粉50g，干燥.制成干浸膏，粉碎成細(xì)粉；取該細(xì)粉與水飛薊總黃酮細(xì)粉，加入適量輔料，按照常規(guī)制劑方法制成包括片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸劑在內(nèi)的各種劑型。本發(fā)明所述的當(dāng)飛利肝寧制劑還可以是這樣構(gòu)成的處方水飛薊1200g、當(dāng)藥1267g。制法以上二味，取水飛薊壓榨去油，破碎，照流浸膏劑與浸膏劑項下的滲漉法(中國藥典一部附錄I0),以80%乙醇為溶劑，緩緩滲漉，收集漉液。回收乙醇，減壓濃縮成相對密度為1.201.25(60°C)的稠膏，減壓干燥得水飛薊提取物.粉碎成細(xì)粉，備用。當(dāng)藥12008加95%乙醇侵泡0.5小時，回流提取2小時，濾過、藥渣加75%已醇，回流提取2小時，濾過，再加50%乙醇，回流提取2小時，濾過，合并濾液，濃縮至對密度為1.2~1.3(80"C)稠膏，加入剩余當(dāng)藥細(xì)粉67g，干燥得干膏，粉碎成細(xì)粉，取細(xì)粉與水飛薊提取物細(xì)粉及淀粉，混勻，制粒，加入微粉硅膠適量，壓制成1000片，包薄膜衣，即得。本當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法，所述制劑包括片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸劑，所述鑒別包括對制劑中當(dāng)藥所含齊敦果酸，還包括對制劑當(dāng)藥中龍膽苦苷、水飛薊所含水飛薊賓的薄層色譜鑒別。當(dāng)藥中齊敦果酸的鑒別方法是以齊敦果酸對照品為對照，以氯仿丙酮=515:0.5~1.5為展開劑的薄層色譜法。當(dāng)藥中龍膽苦苷的鑒別方法是以龍膽苦苷對照品為對照，以氯仿甲醇:水=1030:310:0.11.5為展開劑的薄層色譜法。水飛薊的水飛薊賓的鑒別方法是以水飛薊賓對照品為對照，以氯仿丙酮甲酸=615:1.52.5:0.30.8為展開劑的薄層色譜法。所述鑒別方法包括以下項目的部分或全部(l)取本制劑或其內(nèi)容物，加入乙醇回流提取，濾過，濾液作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加乙醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層扳上，以氯仿丙酮=515:0.51.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%磷鉬酸乙醇溶液.在105。C烘至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)取本制劑或其內(nèi)容物，加入甲醇超聲處理，濾過，濾液作為供試品溶液；另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇水=1030:3~10:0.11.5為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取本制劑或其內(nèi)容物，加醋酸乙酯超聲處理，濾過，濾液作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，取上述兩種溶液，分別點于同一硅膠H薄層板上，以氯仿:丙酮甲酸=615:L52.5:0.30.8為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。更具體的鑒別方法包括以下項目的部分或全部(1)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加無水乙醇25ml，回流提取30分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加無水乙醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層扳上，以氯仿:丙酮-515:0.51.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%磷鉬酸乙醇溶液.在105。C烘至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加甲醇25mL，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇水=1030:310:0.11.5為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。(3)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加醋酸乙酯25ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以氯仿丙酮甲酸=615:L52.5:0.3~0.8為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1~5%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。本制劑中水飛薊所含水飛薊賓的含量測定是以水飛薊賓對照品為對照，以甲醇水:0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液-810:8~10:0.52.5(用0.2mol/L磷酸調(diào)PH值至4.0)為流動相的高效液相色譜法。本制劑中當(dāng)藥所含龍膽苦苷的含量測定是以龍膽苦苷對照品為對照，以甲醇:水=1040:6090為流動相的高效液相色譜法。經(jīng)研究申請人發(fā)現(xiàn)，采用以下質(zhì)量控制方法將更容易控制這種制劑的質(zhì)量，更有利于保證制劑的臨床療效性狀對于片劑內(nèi)容物為褐黃色，味苦；對于膠囊劑內(nèi)容物為黃褐色粉末，味苦；對于軟膠囊劑內(nèi)容物為含有少量懸浮固體浸膏的黃色油狀液體；氣微，味苦；對于滴丸劑本品為棕色的滴丸；氣微，味苦；鑒別(1)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加無水乙醇25ml，回流提取30分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取齊墩果酸對照品，加無水乙醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層扳上，以氯仿丙酮=9:l為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105。C烘至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加甲醇25mL，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇水=10:3:0.3為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g,加醋酸乙酯25ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照中國藥典薄層色譜法試驗，取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以氯仿:丙酮甲酸=12:2:0.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；檢査本片劑、膠囊劑、軟膠囊劑或滴丸劑應(yīng)分別符合中國藥典片劑、膠囊劑、軟膠囊劑或滴丸劑項下有關(guān)規(guī)定。含量測定(1)水飛薊賓采用高效液相色譜法測定，色譜柱為C18柱；甲醇水:0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液=10:10:1(用0.2mol/L磷酸調(diào)PH值至4.0)為流動相；檢測波長為288nm;理論塔扳數(shù)按水飛薊賓峰計算應(yīng)不低于3000;精密稱取經(jīng)105t干燥至恒重的水飛薊賓對照品10mg，置25ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率250W頻率50KHz)20分鐘表，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取膠囊劑裝量差異和滴丸劑重量差異項下的內(nèi)容物或片劑20片，片劑除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流提取60分鐘，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，以水飛薊賓兩峰面積之和計算，即得；本制劑各劑型含水飛薊以水飛薊賓(C2sH2A。)計片劑每片不得少于8.9mg;滴丸劑每丸不得少于3.9mg;膠囊劑每粒不得少于3，9mg;軟膠囊劑每粒不得少于3.9mg;(2)龍膽苦苷的含量測定采用高效液相色譜法，色譜柱為C18柱，甲醇水=20:80為流動相；檢測波長為270nm;理論扳數(shù)按龍膽苦苷峰計算應(yīng)不低于5000;精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.1mg的溶液，即得對照品溶液。取水飛薊賓含量測定項下的細(xì)粉1.5g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50ml，稱定重量，超聲處理(功率250w、頻率50KHz)30分鐘，放冷，稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量。搖勻，離心，精密吸取上清液25ml，蒸干，殘渣用50%甲醇溶液超聲使之溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，用0.45ura微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液5ul與供試品溶液10ul，注入液相色譜儀，測定，即得；本制劑各劑型含當(dāng)藥以龍膽苦苷(d6H2A)計片劑每片不得少于l.2mg;滴丸劑每丸不得少于1.2mg;膠囊劑每粒不得少于1.2mg;軟膠囊劑每粒不得少于l.2mg。為了確保本發(fā)明的質(zhì)量控制方法科學(xué)、合理、可行，本申請人對方法中各藥品的鑒別和含量測定方法進(jìn)行了研究，具體試驗資料如下-一、龍膽苦苷的薄層鑒別研究由于當(dāng)藥中含有龍膽苦苷，因此參考《現(xiàn)代實用中藥質(zhì)量控制技術(shù)》書收載的龍膽苦苷的薄層鑒別，采用硅膠GF254薄層板，用展開劑(氯仿甲醇水=30:10:1)對當(dāng)飛利肝寧膠囊中的龍膽苦苷進(jìn)行鑒別，經(jīng)實驗研究結(jié)果采用展開劑(氯仿甲醇水=10:3:0.3)為展開劑，展開，晾干，在紫外光燈(254nm)下觀察，檢驗多批當(dāng)飛利肝寧膠囊樣品，均成陽性，陰性對照試驗也未見干擾，證明本方法可行。龍膽苦苷Rf值適中；斑點之間分離好。二、水飛薊賓的薄層譜鑒別的研究供試品溶液的制備方法一取藥物，研細(xì)，加甲醇，加熱回流30分鐘，濾過，取濾液作為供試品溶液；同法制備缺水飛薊陰性對照。供試品溶液的制備方法二取藥物，研細(xì)，加醋酸乙酯，超聲處理10分種，濾過，取濾液作為供試品溶液；同法制備缺水飛薊陰性對照。展開劑的選擇分別以甲苯乙酸乙酯甲酸不同比例的混合溶液；氯仿丙酮甲酸不同比例的混合溶液為展開劑。薄層板的選擇將樣品分別點于以硅膠G薄層板；以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，展開。結(jié)果選用方法二，采用方法二制備供試品溶液，以氯仿丙酮甲酸=615:1.52.5:0.30.8為展開劑，在以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，展開，分離度好，且方法重現(xiàn)性好，斑點顯色清晰，Rf值適中，且陰性對照無干擾。最佳展開劑為氯仿丙酮甲酸=12:2:0.5。三、水飛薊賓含量測定方法研究系方中水飛薊所含有效成分的含量測定水飛薊賓的含量測定方法參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布"益肝靈片"試行標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)編號WS-11361(ZD-1361)-2002)收載的高效液相色譜法。正文選用的是C18系列色譜柱，以高效液相色譜法對水飛薊賓進(jìn)行含量測定。1.色譜條件的選擇色譜柱以十八烷基硅垸鍵合硅膠為填料，GeminiC18柱(4.6X250mm，5um);流動9相甲醇水0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液-10:10:1)(用O.2mol/L磷酸調(diào)pH值至4.0);檢測波長288nm;柱溫35'C;流速0.8ml/min;理論塔板數(shù)按水飛薊賓峰計算不低于3000。此條件下，水飛薊賓能與其它組分達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于2。陰性對照無干擾。2.供試品溶液的制備由于水飛薊總黃酮中的主要成分為水飛薊賓，因此，成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以水飛薊賓為測定指標(biāo)，來控制其水飛薊的含量。由于水飛薊溶于丙酮、醋酸乙酯及甲醇等有機(jī)溶劑，但丙酮易揮發(fā)，不易操作，因此我們考察醋酸乙酯和甲醇作為供試液制備的提取溶媒，參考"益肝靈片"供試液制備方法超聲提取30分鐘，結(jié)果采用醋酸乙酯作為提取溶媒比用甲醇提取溶媒，其色譜圖分離效果好，雜質(zhì)峰少，但醋酸乙酯提取效率不如甲醇，因此確定以甲醇作為供試液制備的提取溶媒。經(jīng)以甲醇作為供試液制備的提取溶媒，考察回流提取30分鐘、60分鐘，結(jié)果測得30分鐘和60分鐘水飛薊賓的含量變化不大，但相對60分鐘高一些，因此確定回流提取60分鐘為易，結(jié)果見表l。表l不同超聲時間的比較(n=3)超聲時間含量(mg/g)30min26.060min26.5優(yōu)選后的制備方法供試品溶液制備取本品膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流提取60分鐘，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。3.方法學(xué)研究3.l線性關(guān)系考察精密稱取水飛薊賓對照品適量，加甲醇超聲溶解，并采用逐級稀釋得到412.8ug/ml，82.56ug/ml，33.024ug/ml的一系列濃度梯度的對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液，各5ul、lOul,按擬定質(zhì)量控制方法的色譜條件進(jìn)樣測定。以水飛薊賓兩個峰面積積分值和為縱坐標(biāo)(Y)，水飛薊賓對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程Y=3415906X—89919.26，r=999972水飛薊賓進(jìn)樣量在O.165-4.128ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.2.精密度試驗精密吸取同一對照品溶液10ul和供試品貯備液10ul，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別計算的水飛薊賓與異水飛薊賓峰面積和的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。表2精密度試驗結(jié)果次數(shù)對照品水飛薊賓兩峰面積和RSD(%)樣品水飛薊賓兩峰面積和RSD(%)127041501923642227195531938426327454610,8319351580.564273840619296265276215219527183.3穩(wěn)定性試驗精密吸取同一水飛薊賓對照品溶液，分別于0、4、6、8、12和16小時，吸取10ul分別注入液相色譜儀中，測定峰面積，其試驗結(jié)果見表3。表3水飛薊賓的峰面積穩(wěn)定性試驗結(jié)果放置時間(h)04681216水飛薊賓兩峰面積和270415027662992788598278074827993902798987從試驗結(jié)果可知，供試液放置16小時，水飛薊賓對照品溶液峰面積基本穩(wěn)定。3.4重復(fù)性試驗平行取同批當(dāng)飛利肝寧膠囊5份，分別按供試品溶液制備方法制得樣品供試液。精密吸取各樣品供試液10ul進(jìn)樣，計算水飛薊賓的含量及相對標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果其相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.37%，見表4。表4重復(fù)性試驗結(jié)果次數(shù)取樣量(g)水飛薊賓含量(mg/g)平均含量(mg/g)RSD(%)10.111426.520.112526.330.110326.926.41.3740.110726.450.113625.93.5回收率試驗采用加樣回收法，取已知水飛薊賓含量26.4mg/g的樣品，分別添加水飛薊賓對照品，按上述色譜條件測定，以下式計算回收表，結(jié)果表明本法具有良好的回收率，結(jié)果見表5。測得水飛薊量一-樣品水飛薊含量水飛薊賓回收率(%)=---------------------------------X100%添加對照品量表5回收率試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>四、龍膽苦苷含量測定方法研究1.流動相的選擇流動相l(xiāng):以乙腈水不同比例的混合溶液為流動相；流動相2:以甲醇水不同比例的混合溶液為流動相。流動相3:以甲醇水乙腈不同比例的混合溶液為流動相。結(jié)果以甲醇或乙腈水=1090:9010為流動相，陰性樣品色譜圖在龍膽苦苷峰位置處；干擾，特別是在甲醇水=20:80流動相條件下，龍膽苦苷與其它色譜峰分離最好。2.供試品溶液制備方法研究方法一取藥物約1.5g各3份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加水50ml，稱定重量，第一份超聲處理15分鐘、第二份超聲處理30分鐘、第三份超聲處理45分鐘(功率250W頻率50KHz),放冷，分別稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，分別精密吸取上清液各25ml，蒸干，殘渣用50%甲醇溶液超聲使溶解，分別轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45ixm)濾過，即得。方法二取藥物約1.5g各3份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入25ml50%甲醇，第一份超聲處理15分鐘、第二份超聲處理30分鐘、第三份超聲處理45分鐘(功率250W頻率50KHz)，放冷，分別稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，濾過，分別精密吸取續(xù)濾液5ml，用5(m甲醇定容至10ml，作為供試品溶液。分別吸取上述供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，按正文色譜條件，依法測定，結(jié)果見表6。表6不同提取方法考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>依據(jù)試驗結(jié)果，優(yōu)選提取方法一提取30分鐘，作為龍膽苦苷含量測定的供試品溶液制備方法。3、方法學(xué)考察3.l精密度試驗精密吸取同一對照品溶液(0.1220mg/ml)，重復(fù)進(jìn)樣5次，計算得龍膽苦苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表7:RSD為0.03W。表7實驗次數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>試驗結(jié)果表明，該方法精密度較好。3.2穩(wěn)定性試驗同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12小時，吸取10ul分別注入液相色譜儀中，測定峰面積，試驗結(jié)果見表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果表明，供試品溶液在12小時內(nèi)穩(wěn)定3.3重復(fù)性試驗平行取同一批號當(dāng)飛利肝寧制劑6份，分別按供試品溶液制備方法制得樣品供試液，精密吸取各樣品供試液10ul進(jìn)樣，計算龍膽苦苷的含量及相對標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果見表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。3.4回收率試驗采用加樣回收法(按l:l加入)，取己知龍膽苦苷含量4.78mg/g的樣品約0.3g，精密稱定，分別精密加入龍膽苦苷對照品溶液((14.920—10)各lml,其它按本發(fā)明含量測定項下供試品溶液制備方法及色譜條件測定，按以下公式計算回收率，結(jié)果見表io。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>試驗結(jié)果表明，龍膽苦苷的平均加樣回收率在95%~105%之間，加樣回收良好。具體實施例方式實施例一本當(dāng)飛利肝寧膠囊的質(zhì)量控制方法包括處方水飛薊900g當(dāng)藥950g制法以上二味，取水飛薊破碎，去油后，照流浸膏劑與浸膏劑項下的滲漉法(中國藥典一部錄IO)，以80%乙醇為溶劑.緩緩滲漉.收集漉液，減壓回收乙醇，濃縮成膏，得水飛薊總黃酮，粉碎成細(xì)粉，備用當(dāng)藥900g分別以95X、75%及50%乙醇進(jìn)行梯度提取，濾過，合并濾液，濃縮至稠膏狀，加入剩余當(dāng)藥細(xì)粉50g，干燥.制成干浸膏，粉碎成細(xì)粉，取細(xì)粉與水飛薊總黃酮細(xì)粉及輔料適量，混勻，制粒，裝入膠囊，即得。性狀本品為膠囊劑，內(nèi)容物為褐黃藥粉末；味苦。鑒別(1)取本品內(nèi)容物2g，加無水乙醇25ml回流提取30分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取齊墩果酸對照品，加無水乙醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層包譜法(中國藥典一部錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層扳上，以氯仿-丙酮(9:1)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%磷鉬酸乙醇溶液.在105。C烘至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。(2)取本品內(nèi)容物2g，加甲醇25ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇水=10:3:0.3為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。檢査應(yīng)符合膠囊劑項下有關(guān)的各項規(guī)定(中國藥典一部附錄1U。含量測定(1)水飛薊賓的含量測定采用高效液相色譜法(中國藥典一部附錄VID)測定，色譜柱為C18柱；以甲醇水0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液-10:10:1(用0.2mol/L磷酸調(diào)PH值至4.0)為流動相；檢測波長為288nm;理論塔扳數(shù)按水飛薊賓峰計算應(yīng)不低于3000。對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105OC干燥至恒重的水飛薊賓對照品10ml，置25ml量瓶中，加甲醇1520ml超聲使溶器，并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備取本品裝量差異項下內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流提取60分鐘，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，以水飛薊賓兩峰面積之和計算，即得。本品每粒含水飛薊以水飛薊賓(C2sH2A。)計，不得少于3.9mg。(2)龍膽苦苷的含量測定照高效液相色譜法(中國藥典一部附錄VID)測定色譜柱為C18柱；甲醇水=20:80為流動相；檢測波長為270hm。理論扳數(shù)按龍膽苦苷峰計算應(yīng)下低于5000。對照品溶液的制備精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.1mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取水飛薊賓含量測定項下的細(xì)粉1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50ml，稱定重量，超聲處理30(功率250w頻率50KHz)分鐘，放冷，.稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量。搖勻.離心，精密吸取上清液25ml，蒸干，殘渣用50%甲醇溶液超聲使之溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加50%甲醇至刻度。搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液5ul與供試品溶液10ul，注入液相色譜儀，測定，即得。本品每粒含當(dāng)藥以龍膽苦苷計，不得少于1.2mg。實施例二本片劑的質(zhì)量控制方法包括處方水飛薊1200g當(dāng)藥1267g性狀本品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯竭黃色；味苦。鑒別(1)取本品，除去薄膜衣，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加無水乙醇25ml，回流提取30分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取齊墩果酸對照品.加無水乙醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄VIB)試驗.吸取取上述兩種溶渡各5ul，分別點于同一硅膠薄層板上，以氯防丙酮=9:l為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105'C烘至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。(2)取本品，除去薄膜衣，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加甲醇25ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各10u1，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇:水=10:3:0.3為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。(3)取本品，除去薄膜衣，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加醋酸乙酯25ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各5u1，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H寧層板上，以氯仿丙酮甲酸=12:2:0.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。檢査應(yīng)符合片劑項下有關(guān)的各項規(guī)定(中國藥典一部附錄ID)。含量測定(1)水飛薊賓的含量測定照高效液相色譜法(中國藥典一部附錄VID)測定色譜柱為C18柱；以甲醇水:0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液(10:10:l)(用0.2mol/L磷酸調(diào)pH值至4.0)為流動相；檢測波長為288nM。理論板數(shù)按水飛薊賓峰計算應(yīng)不低于3000。對照品溶液的制備:精密稱取經(jīng)105'C干燥至恒重的水飛薊賓對照品10mg，置25mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率250w頻率50KHz)20分鐘，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備取本品20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定.置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流提取60分鐘，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量.搖習(xí)，濾過.即得。測定法分別精密吸取對照品溶液洪試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，以水飛薊賓兩峰面積之和計算，即得，本品每片含水飛薊以水飛薊賓及異水飛薊賓計，不得少于8.9mg.(2)龍膽苦苷的含量測定照高效液相色譜法(中國藥典一部附錄VID)測定色譜柱為C18柱；甲醇:水=20:80為流動相；檢測波長為270nm。理論扳數(shù)按龍膽苦苷峰計算應(yīng)不低于5000。對照品溶液的制備精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.1mg的溶液,即得。供試品溶液的制備取水飛薊賓含量測定項下的細(xì)粉1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50ml，稱定重量，超聲處理30(功率250w頻率50KHz)分鐘，放冷，稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量。搖勻.離心，精密吸取上清液25ml，蒸干，殘渣用50%甲醇溶液超聲使之溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加50%甲醇至刻度。搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液5ul與供試品溶液10ul，注入液相色譜儀，測定，即得。本品每片含當(dāng)藥以龍膽苦苷計，不得少于1.2mg。實施例三本軟膠囊的質(zhì)量控制方法包括性狀本品為棕色的軟膠囊，內(nèi)容物為含有少量懸浮固體浸膏的黃色油狀液體；氣微，味苦。18檢查應(yīng)符合膠囊劑項有關(guān)的各項規(guī)定(中國藥典2005年版附錄IL)鑒別應(yīng)符合其項下規(guī)定(同實施例一鑒別項下內(nèi)容)含量測定應(yīng)符合其項下規(guī)定(同實施例一含量測定項下內(nèi)容)本軟膠囊劑每粒含水飛薊以水飛薊賓(C2晶A。)計不得少于3.9mg。含當(dāng)藥以龍膽苦苷(d6H加a)計不得少于l.2mg。實施例四本滴丸的質(zhì)量控制方法包括性狀本品為棕色的滴丸；氣微，味苦。鑒別應(yīng)符合其項下規(guī)定(同實施例一鑒別項下內(nèi)容)檢査應(yīng)符合滴丸劑項下的各項規(guī)定(中國藥典2005年版附錄IK)含量測定應(yīng)符合其項下規(guī)定(同實施例一含量測定項下內(nèi)容)本滴丸劑每丸含水飛薊以水飛薊賓(C2晶A。)計不得少于3.9mg。含當(dāng)藥以龍膽苦苷(C16H2A)計不得少于1.2mg。權(quán)利要求1.一種當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法，所述制劑包括片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸劑，所述鑒別包括對制劑中當(dāng)藥所含齊敦果酸，其特征在于還包括對制劑當(dāng)藥中龍膽苦苷、水飛薊所含水飛薊賓的薄層色譜鑒別；當(dāng)藥中龍膽苦苷的鑒別方法是以龍膽苦苷對照品為對照，以氯仿∶甲醇∶水＝10～30∶3～10∶0.1～1.5為展開劑的薄層色譜法；水飛薊賓的鑒別方法是以水飛薊賓對照品為對照，以氯仿∶丙酮∶甲酸＝6～15∶1.5～2.5∶0.3～0.8為展開劑的薄層色譜法。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述當(dāng)飛利肝寧制劑的的鑒別方法，其特征在于所述鑒別方法包括以下項目的部分或全部(l)取本制劑或其內(nèi)容物，加入乙醇回流提取，濾過，濾液作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加乙醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層扳上，以氯仿丙酮=515:0.5~1.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1~5%磷鉬酸乙醇溶液.在105。C烘至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)取本制劑或其內(nèi)容物，加入甲醇超聲處理，濾過，濾液作為供試品溶液；另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇水=1030:310:0.11.5為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取本制劑或其內(nèi)容物，加醋酸乙酯超聲處理，濾過，濾液作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，取上述兩種溶液，分別點于同一硅膠H薄層板上，以氯仿丙酮甲酸=615:1.52.5:0.30.8為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法，其特征在于更具體的鑒別方法包括以下項目的部分或全部(1)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加無水乙醇25ml，回流提取30分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加無水乙醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層扳上，以氯仿丙酮=515:0.51.5為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%磷鉬酸乙醇溶液.在105t烘至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加甲醇25mL，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每l邁l含lmg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以氯仿甲醇水=1030:310:0.11.5為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉2g，加醋酸乙酯25ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以氯仿丙酮甲酸=615:1.52.5:0.3~0.8為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。全文摘要本發(fā)明是申請?zhí)枮?00610022692.5的發(fā)明專利申請的分案。是涉及一種當(dāng)飛利肝寧制劑的鑒別方法，所述鑒別包括對制劑中水飛薊所含水飛薊賓和當(dāng)藥所含齊敦果酸和龍膽苦苷的薄層色譜鑒別。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明加入了當(dāng)藥中龍膽苦苷、水飛薊中水飛薊賓的鑒別控制，所采用的方法專屬性強(qiáng)、精密度高，重現(xiàn)性好，回收率高，提高了當(dāng)飛利肝寧制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，從而保證了該制劑的臨床療效。文檔編號A61P1/16GK101669987SQ20091020493公開日2010年3月17日申請日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者朱林波,彥李,秦方云申請人:四川美大康藥業(yè)股份有限公司