專利名稱：炭疽致死因子結(jié)構(gòu)域(LFn)與炭疽水腫因子結(jié)構(gòu)域(EFn)的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種融合蛋白及其應(yīng)用，尤其 涉及炭疽致死卣子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)與炭疽水腫因子的保護(hù)性抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)的融合蛋白及其用于炭疽毒素的中和。
背景技術(shù)：
炭疽毒素包括兩種A-B型毒素，每種都有不同的催化部分，既水腫因子(EF， edema factor)和致死因子(LF, lethal factor)。兩個(gè)催化部分共享一個(gè)結(jié) 合的B部分，保護(hù)性抗原(PA， protective antigen)，結(jié)合后的完整毒素稱為 水腫毒素(ET, edema toxin)和致死毒素(LT， lethal toxin)。炭疽對機(jī)體 的傷害主要是由于ET和LT的共同作用。ET和LT進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用的過程如下 首先是PA與細(xì)雄表面受體(ATR， anthrax toxin rec印tor)在細(xì)胞表面結(jié)合， 隨后furin蛋白酶就將PA降解成20kD和63kD的兩個(gè)組分。PA63在細(xì)胞膜表面形成 七聚體，炭疽致死因子和炭疽水腫因子結(jié)合在PA七聚體上，經(jīng)過受體介導(dǎo)的內(nèi) 吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與底物接觸從而發(fā)揮其毒性作用。
根據(jù)以上的炭疽毒素進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)理，人們設(shè)計(jì)了不同的炭疽毒素抑制劑， 分別將毒素作用過程中涉及的不同分子作為耙標(biāo)，從而阻斷毒素的作用，保護(hù)細(xì) 胞免受毒素的攻擊。
LFn是炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)致死因子與炭疽保護(hù)性 抗原的結(jié)合。LFn由炭疽致死因子的1-263位殘基組成。EFn是炭疽水腫因子的 保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié).構(gòu)域，負(fù)責(zé)水腫因子與炭疽保護(hù)性抗原的結(jié)合。EFn由炭疽水 腫因子的1-254位殘基組成。重組表達(dá)的LFn和EFn仍然具有結(jié)合炭疽保護(hù)性抗原的能力，但對細(xì)胞無毒性作用。LFn和EFn能夠與炭疽致死因子和炭疽水腫 因子競爭結(jié)合炭疽保護(hù)性抗原，具有作為競爭性毒素抑制劑的潛力。但實(shí)驗(yàn)顯 示，它們的毒素抑制活性非常低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在LFn和EFn的基礎(chǔ)上，提供一種具有更強(qiáng)炭疽毒素抑制 (中和)活性的LFn與EFn的融合蛋白。
本發(fā)明的LFn與EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(LFn)和炭疽水腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)或上述二區(qū)的功能 同等物。
所述的功能同等物是指在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯?，對融合蛋白部分?基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。
在本發(fā)明所指的融合蛋白中，可以是炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (LFn)的第一區(qū)位于融合蛋白的N-末端，炭疽水腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(EFn)的第二區(qū)位于融合蛋白的C-末端。也可以是炭疽水腫因子的保護(hù)性抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)的第二區(qū)位于位于融合蛋白的N-末端，炭疽致死因子的保 護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)的第一區(qū)位于融合蛋白的C-末端。這兩種情況對融 合蛋白的毒素中和活性沒有太大的影響。
為了使融合蛋白的兩部分盡可能的減少互相干擾，融合蛋白的兩個(gè)部分之間 設(shè)置連接肽，連接肽的通式是(Gly Gly Gly GlySer) n， n為1-10的整數(shù)。
編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。
該序列包括與炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基序列相同 的第一區(qū)和與炭疽水腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基序列相同的第
4二區(qū)的融合蛋白的DNA序列。其中第一區(qū)與炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域氨基酸殘基序列相同，第二區(qū)與炭疽水腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨 基酸殘基序列相同，中間設(shè)有(Gly Gly Gly GlySer) 3連接肽的編碼序列。 攜帶融合蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體(圖l)和工程菌。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn等。將上 述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)得到工程菌BL21 (DE3) -pET21a-LFnEFn和BL21 (DE3) -pET21a-27LFnEFn。
本發(fā)明的應(yīng)用。
本發(fā)明將LFn和EFn通過一段(Gly Gly Gly GlySer) 3的柔性Linker序列
融合在一起，，建的融合蛋白經(jīng)過細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)和毒素攻毒的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測， 結(jié)果顯示其具有的毒素中和活性較單體有很大的提高(圖3)，可以有效中和炭
疽毒素的作用。


圖1.含融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn的構(gòu)
建示意圖2.本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)純化圖.
圖2-l:融合蛋白LFn/EFn的表達(dá)純化。1，未誘導(dǎo)全菌；2、誘導(dǎo)全菌；3、 離子交換純化產(chǎn)物；4、 Ni柱和凝膠過濾產(chǎn)物。5、蛋白Marker (kDa)
圖2-2:融合蛋白27LFn/EFn的表達(dá)純化。1,未誘導(dǎo)全菌；2、誘導(dǎo)全菌； 3、離子交換純化產(chǎn)物;4、 Ni柱和凝膠過濾產(chǎn)物。5、蛋白Marker (kDa)
5圖3.本發(fā)明融合蛋白的細(xì)胞保護(hù)活性圖；
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l: LFn編碼序列的擴(kuò)增
使用PCR方法從質(zhì)粒pAS22-LF(本研究室構(gòu)建)擴(kuò)增出炭疽致死因子的保護(hù) 性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼序列，所用的引物L(fēng)F5和LFn3-Linker使用DNA合成 儀合成，引物L(fēng)Fn5的5'端添加了 Nde I的酶切位點(diǎn)，弓嗽LFn3-Linker的5， 端添加了 BamHl的酶切位點(diǎn)和編碼(Gly Gly Gly GlySer) 3連接肽的編碼序列。
LF5: 5， -aaccatatggcgggcggtcatggtgatgta-3， LFn3-Linker:
5' -aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccacc卿gcccccgccacccc--gttgatctttaagttcttd
100 u 1的PCR反應(yīng)體系中加入1 u 1的Vent DNA聚合酶(NEB)， 20 u M的 LF5和LFn3-Linker各2 u 1 ， 2. 5mM的dNTP加入8 w 1 ， 10 X PCR反應(yīng)緩沖液加 入10u l.PCR的反應(yīng)條件為94"預(yù)變性5分鐘，94。C變性30秒，5rC退火30 秒，72"延伸30秒，然后回到預(yù)變性，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。 通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶，然后將目的條帶切下，純化。 實(shí)施例2: 27LFn編碼序列的擴(kuò)增
27LFn是指去除了 N端27個(gè)氨基酸殘基的LFn。使用PCR方法從質(zhì)粒 pAS22-LF(本研究室構(gòu)建)擴(kuò)增出炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼 序列，所用的引物25LFn5和LFn3-Linker使用DNA合成儀合成，引物L(fēng)Fn5的5， 端添加了 Nde I的酶切位點(diǎn)，引物L(fēng)Fn3-Linker的5，端添加了 BaraH I的酶切位 點(diǎn)和編碼(Gly Gly Gly GlySer) 3連接肽的編碼序列。27LJRn5: 5' - aaccatatgcgaaataagiacacaggaagagc _3， LFn3-Linker:
5' -aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccaccagagcccccgccacccc--gttgatctttaagttcttc-3'
100ii 1的PCR反應(yīng)體系中加入lu 1的Vent DNA聚合酶(NEB)， 20y M的LF5 和LFn3-Linker各2 u 1 ， 2. 5mM的dNTP加入8 U 1 ， 10XPCR反應(yīng)緩沖液加入10 iil.PCR的反,條件為94。C預(yù)變性5分鐘，94。C變性30秒，5rC退火30秒， 72'C延伸30秒，然后回到預(yù)變性，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。通過 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶，然后將目的條帶切下，純化。 實(shí)施例3: EFn編碼序列的擴(kuò)增
使用PCR方法從質(zhì)粒pAS22-EF(本研究室構(gòu)建)擴(kuò)增出炭疽致死因子的保護(hù) 性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼序列，所用的引物L(fēng)F5和LFn3-Linker使用DNA合成 儀合成，弓l物L(fēng)Fn5的5，端添加了 Nde I的酶切位點(diǎn)，弓l物L(fēng)Fn3-Linker的5， 端添加了XhoI的酶切位點(diǎn)。
EF5: 5， ， aacggatccatgaatgaacattacactgELgagtgatattaaeiag -3， LFn3-Linker: 5， - aacctcgagaccttctttcttcaaactttcacttattttc -3，
100u 1的PCR反應(yīng)體系中加入In 1的Vent DNA聚合酶(NEB)， 20iiM的 LF5和LFn3-Linker各2 1， 2. 5mM的dNTP加入8 u 1， IOXPCR反應(yīng)緩沖液加 入10 u 1. PCR的反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘，94。C變性30秒，5(TC退火30 秒，72'C延伸30秒，然后回到預(yù)變性，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。 通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶，然后將目的條帶切下，純化。
實(shí)施例4:連接肽為(Gly Gly Gly GlySer) 3時(shí)LFn/EFn融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。取2U g的LFn的使用實(shí)施例1中引物擴(kuò)增得到的LFn編碼序列，設(shè)置50 w 1的雙酶切體系，具體如下2 u g的LFn編碼序列，5 ii 1的NEB酶切反應(yīng)緩 沖液2， 2 w 1的Nde I禾Q 2ii 1的BaraH I ， 0. 5y 1的100XBSA,加雙蒸水至總 體積50ul， 37'C水浴中反應(yīng)IO小時(shí)。10小時(shí)后使用凝膠回收試劑盒(BBI) 純化LFn編碼序列的雙酶切產(chǎn)物。
取800ng的pET21a (Novagen公司)載體，設(shè)置50y 1的雙酶切體系，具 體如下800ng的pET21a載體，5 u 1的NEB酶切反應(yīng)緩沖液2， 2 u 1的Nde I 禾口 2y 1的BaraH I ， 0. 5w 1的IOOXBSA，加雙蒸水至總體積50y 1， 37。C水浴 中反應(yīng)10小時(shí)。10小時(shí)后使用0. 6%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，然后將 目的條蒂切下，'凝膠回收試劑盒(BBI)純化pET21a的雙酶切產(chǎn)物。
連接反應(yīng)取3 ix 1經(jīng)過純化的pET21a的Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物，加 入5 u 1經(jīng)過純化的LFn的Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物，1 y 1的T4 DNA連接酶 (TaKaRa)和1 y 1的10XT4 ■連接酶反應(yīng)緩沖液，16。C水浴中連接13小時(shí).
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ZW5"，然后挑取克隆送公司測序(感受態(tài)"#5"的 制備方法及轉(zhuǎn)化方法依照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"第二版所述。J.薩姆布魯克著)。 所得重組質(zhì)粒命名為pET2la-LFnLinker。
取2 ti g的使用實(shí)施例3中引物擴(kuò)增得到的EFn編碼序列，設(shè)置50 w 1的雙 酶切體系，'具體如下2 u g的EFn編碼序列，5 u 1的NEB酶切反應(yīng)緩沖液2， 2 li 1的Xho I和2 ii 1的BamH I ， 0. 5 u 1的IOOXBSA，加雙蒸水至總體積50 u 1， 37。C水浴中反應(yīng)10小時(shí)。10小時(shí)后使用0. 6%的瓊脂糖凝膠電泳夢離酶切產(chǎn)物， 然后將目的條帶切下，凝膠回收試劑盒(BBI)純化EFn編碼序列的雙酶切產(chǎn)物。
取800ng的pET21a-LFnLinker載體，設(shè)置50 y 1的雙酶切體系，具體如下 800ng的pET2la—LFnLinker載體，5 n 1的NEB酶切反應(yīng)緩沖液2， 2 u 1的Xho
8I禾口 2u 1的BamH I ， 0. 5u 1的100XBSA，加雙蒸水至總體積50iU， 37。C水 浴中反應(yīng)IO小時(shí)。10小時(shí)后使用0.6%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，然后 將目的條帶切下，凝膠回收試劑盒(BBI)純化pET21a-LFnLinker的雙酶切產(chǎn)物。
連接反應(yīng)取3u 1經(jīng)過純化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I雙酶切 產(chǎn)物，力B入5 u 1經(jīng)過純化的EFn的Xho I和BamH I雙酶切產(chǎn)物，1 P 1的T4 DNA 連接酶(TaKaRa)和1 w 1的10XT4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，16"C水浴中連接 13小時(shí).
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌/W5"，然后挑取克隆送公司測序(感受態(tài)5ffiT"的 制備方法及轉(zhuǎn)化方法依照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"第二版所述。J.薩姆布魯克著)。 所得重組質(zhì)粒命名為pET21a-LFnEFn。
實(shí)施例5:'連哮肽為(Gly Gly Gly GlySer) 3時(shí)27LFn/EFn融合蛋白表達(dá)載體
的構(gòu)建。
取2y g的27LFn的使用實(shí)施例2中引物擴(kuò)增得到的LFn編礙序列，設(shè)置50 w 1的雙酶切體系，具體如下g的27LFn編碼序列，5u 1的NEB酶切反應(yīng) 緩沖液2， 2u 1的Nde I禾Q 2w 1的BamH I ， 0. 1的100XBSA，加雙蒸水至 總體積50yl， 37'C水浴中反應(yīng)10小時(shí)。10小時(shí)后使用凝膠回收試劑盒(BBI) 純化LFn編碼序列的雙酶切產(chǎn)物。
連接反應(yīng)取3 u 1經(jīng)過純化的pET21a的Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物(實(shí) 施例4)，》卩入5y 1經(jīng)過純化的27LFn的Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物，1 u 1的 T4 DNA連接酶'(TaKaRa)禾Ci 1 ii 1的10XT4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，16。C水浴 中連接13小時(shí).
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，然后挑取克隆送公司測序(^受態(tài)Top10的制備方法及轉(zhuǎn)化方法依照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"第二版所述。J.薩姆布魯克著)。 所得重組質(zhì)粒命名為pET21a-27LFnLinker。
取800ng的pET21a-27LFnLinker載體，設(shè)置50 P 1的雙酶切體系，具體如 下800ng的pET21a-27LFnLinker載體，5u 1的NEB酶切反應(yīng)緩沖液2, 1 的Xho I和2 li 1的BamH I ， 0. 5 u 1的IOOXBSA，加雙蒸水至總體積50 U 1， 37 'C水浴中反應(yīng)10小時(shí)。10小時(shí)后使用0. 6%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物， 然后將目的條帶切下，凝膠回收試劑盒(BBI)純化pET21a-LFnLinker的雙酶 切產(chǎn)物。
連接反應(yīng)取1經(jīng)過純化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I雙酶切 產(chǎn)物，力口入5 u 1經(jīng)過純化的EFn的Xho I和BamH I雙酶切產(chǎn)物(實(shí)施例4)， 1 li 1的T4 DNA連接酶(TaKaRa)和1 y 1的10XT4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，16 'C水浴中連接13小時(shí).
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌/W5a，然后挑取克隆送公司測序(感受態(tài)ZW5"的 制備方法及轉(zhuǎn)化方法依照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"第二版所述。J.薩姆布魯克著)。 所得重組質(zhì)粒命名為pETMa-"LFnEFn。
實(shí)施例6: LFn/EFn和27LFn/EFn融合蛋白融合蛋白的表達(dá)純化。
將所獲得的pET21a-LFnEFn和pET21a-27LFnEFn質(zhì)粒轉(zhuǎn)化￡ 瓜i7 (Novagen公司)感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)制備方法同Zffi ")。工程菌的誘 導(dǎo)表達(dá):挑取克隆于5ml含100 u g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C 250rpm 培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D 0. 5 0. 7，加入IPTG至終濃度l咖ol/L，在28°C 250r/m進(jìn) 行誘導(dǎo)表達(dá)6h， lOOOrpm離心5min離心收集菌體沉淀超聲(方法及參數(shù)依照超 聲儀制造商的說明)。超聲所得菌液12000g，室溫離心2rain，取上清進(jìn)行SDS-PAGE 分析，以確定重組蛋白是否表達(dá)，SDS-PAGE電泳的樣品制備方法、電泳電壓、凝膠染色和脫色的方法見"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"第二版所述。J.薩姆布魯克著。
取20ml種子液接種入裝有1L LB-Amp培養(yǎng)塞的3L錐形瓶，37。C培養(yǎng)至0D600 為0. 6左右，然后加入終濃度為0. 5mM的IPTG，將溫度降為28。C誘導(dǎo)8h后， 8000g離心獲得菌體，加入1/10體積的20ramol/LTris (pH8.0)重懸菌體，然 后超聲破碎菌體，4'C， 12000g離心10min，收集上清。在上清液中添加咪唑和 NaCl至終濃度為50隱ol/L咪唑，0. 5mol/LNaCl。在AKTA-explorer上將上述超 聲溶液上Ni柱。平衡緩沖液為20咖ol/LTris0. 5mol/LNaCl 50咖ol/L咪唑pH8. 0。 上樣后使用洗脫液(20咖ol/L Tris 0. 5mol/LNaCl 0. 5mol/L咪唑pH8. 0)洗脫， 收集洗脫峰。純化蛋白經(jīng)超濾濃縮，再通過Superdex75凝膠過濾柱進(jìn)一步純化， 收集蛋白洗脫峰，得到目的蛋白。BCA法測定蛋白濃度。 實(shí)施例7:融合蛋白的細(xì)胞保護(hù)性檢測
小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1以K)4個(gè)/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)約24小 時(shí)，長至90%滿。用含有100ng/ml PA和LF的新鮮培養(yǎng)液對各樣品進(jìn)行2倍系 列稀釋，然后按順序加入潔凈96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每樣品2復(fù)孔，每孔120ul; 后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37'C孵育lh。小心地將.J774A. 1細(xì)胞培養(yǎng)上清吸去，將孵育 lh的樣品轉(zhuǎn)加于含有J774A. 1細(xì)胞的培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37'C孵育3h 后，吸出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，按100 u 1/孔加入MTT溶液(終濃度lmg/ml， 用培養(yǎng)液配制而成)，37'C孵育30min，吸出MTT溶液，每孔加入100wl鹽酸-異丙醇，作用10min，用酶聯(lián)儀測吸光度0Ds7。，結(jié)果取平行的3個(gè)孔的平均值。 結(jié)果表明融合蛋白的體外毒素中和能力較LFn和EFn單體有較大的提高。 實(shí)施例8:融合蛋白保護(hù)F344雄性大鼠免受炭疽致死毒素的攻擊。
F344雄性大鼠購自維通利華；PA、 LF由本室制備，PA、 LF和27LE均使用注 射用水進(jìn)行稀釋，每只大鼠注射40ug的PA和10wg的LF。注射體積為500ul。試劑經(jīng)由尾靜脈注入，大鼠連續(xù)觀察48小時(shí)以上。結(jié)果顯示炭疽致死毒素與重 組蛋白27LE以一定的摩爾比同時(shí)注入有保護(hù)效果，大鼠全部存活(連續(xù)觀察48 小時(shí)以上a )，當(dāng)摩爾比低于一定值時(shí)，大鼠的生存時(shí)間得到延長，但出現(xiàn)了 嚴(yán)重的肺部損傷，最終死亡。高摩爾比時(shí)，與對照相比大鼠沒有出現(xiàn)可見的中
毒癥狀。
表1:同時(shí)注射毒素和融合蛋白27LFn/EFn
組別存活數(shù)/總數(shù)存活時(shí)間
PA+LF(40ug+10ug)0/365士3min
PA+LF+8倍摩爾比27LFn/EFn0/3272士45min
PA+LF+16倍摩爾比27LFn/EFn3/348h以上
12序列表
<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 〈120〉炭疽致死因子結(jié)構(gòu)域(LFn)與炭疽水腫因子結(jié)構(gòu)域(EFn) 的融合蛋白及其應(yīng)用
〈130〉 〈160〉 8 〈210〉 1 〈211〉 789 〈212> DNA , <213> LFn <400> 1
gcgggcggtc atggtgatgt 3ggteitgcac gtaaaagaga aagaga33犯t肪agatgag 60
組aagagaa aagatgaaga acga肪taaa acacaggaag agcatttaaa gga幼tcei"tg 120
a肌cacattg teaaaatags agtsasaggg gaggasgctg tt朋a肪3ga ggc昭C3g肪 180
aagctacttg agaaagtacc atctgatgtt ttagagatgt ataaagcaat tggaggaaag 240
atatatattg tggatggtga tattacaaeia catatatctt tegaagcatt atctg肪gat 300
aagaaa肪肌taaaagacat tt3tggg犯Ei gstgctttst tacstgaaca ttatgtstst 兆O
gcaaaagaag gatatgaacc cgtacttgt8 atcca3tctt cggaeigatta tgtagaaaat 420
actgaaaagg cactgaacgt ttattatgaa ataggtaaga tattatcaag ggatatttta 480
agt肪肪ttei atcaaccats tcagaaattt ttagatgtat taaeiteiccat taaaaatgca 540
tctgattcag atggacaaga tcttttattt actaatcagc ttaaggaaca tcccacagac 600
ttttctgtag aattcttgga eic肌肪t站c肌tg3ggtac aagaagtatt tgcgaaagct 660
tttgcatatt atalcgagcc acagcatcgt gatgttttac agctttatgc accggaagct 720
tttaattaca tggataaatt taacgaacaa gaaataaatc tatccttgga agaacttaaa 780
gatcaacgg 789
〈210〉 2
〈211〉 263
〈212> PRT
〈213> LFn
〈400〉 2Ala Gly 1
Lys Asn 16
Thr Gin 31
lie Glu 46
Lys Leu 61
Ala lie 76
His lie 91
Asp lie 106
Ala Lys 121
Asp Tyr 136
lie Gly 151
Pro Tyr 166
Ser Asp 181 ' Glu His 196
Asn Glu 211
Glu Pro 226
Phe Asn 241
Leu Glu 256
Gly Lys Glu Val Leu Gly Ser Tyr Glu Val Lys Gin Ser Pro Val Gin Tyr Glu
His Asp Glu Lys Glu Gly ILeu Gly Gly Glu lie Lys Asp Thr Gin His Met Leu
Gly
5 Glu
20 His
35 Gly
50 Lys
65 Lys
80 Glu
95 Lys 110 Tyr 125 Asn 140 Leu 155 Phe 170 Gly 185 Asp 200 Glu 215 Arg 230 Asp 245 Lys 260
Asp Asm Leu Glu Val lie Ala Asp Glu Thr Ser Leu Gin Phe Val Asp Lys Asp
Val Lys Lys Glu Pro Tyr Leu Ala Pro Glu Arg Asp Asp Ser Phe Val Phe Gin
Gly
Arg
Glu
Ala
Ser
lie
Ser
Leu
Val
Lys
Asp
Val
Leu
Val
Ala
Leu
Asn
Arg 263
Met
Lys
lie
Val
Asp
Val
Glu
Leu
Leu
Ala
lie
Leu
Leu
Glu
Lys
Gin
Glu
His
10
Asp
25
Met
40
Lys
55
Val
70
Asp
85
Asp
100
His
115
Val
130
Leu
145
Leu
160
Asn
175
Phe
190
Phe
205
Ala
220
Leu
235
Gin
250
Val Glu Lys Lys Leu Gly Lys Glu lie Asn Ser Thr Thr Leu Phe Tyr Glu
Lys Glu His Glu Glu Asp Lys His Gin Val Lys lie Asn Glu Ala Ala lie
Glu Axg lie Ala Met lie L>ys Tyr Ser Tyr lie Lys Gin Gin Tyr. Pro Asn
Lys
Asn
Val
Ala
Tyr
Thr
lie
Val
Ser
Tyr
Asn
Asn
Leu
Asn
Tyr
Glu
Leu
Glu
15 Lys
30 Lys
45 Glu
60 Lys
75 Lys
90 Lys 105 Tyr 120 Glu 135 Glu 150 Gin 165 Ala 180 Lys 195 Ser 210 lie 225 Ala 240 Ser 255
14〈210> 3 〈211〉 45 〈212>廳 〈213> Linker 〈400〉 1 '
ggtggcgggg gctctggtgg cgggggctct ggtggcgggg gctct 45
〈210〉 4 〈211> 15 <212> PRT 〈213〉 Linker <400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
<210> 5 <211〉 762 〈212〉 DNA 〈213〉 EFn <400> 1
atgaatgssc attacsctgs gagtgatstt a33agaaacc ata肪3ctga aa肌aataaa 60
actga肌aag aaa組ttagi agscagtatt組83ctt3g tt肪幼c8gei stttaccaat 120
gaaactttsg ataaaataca gcsgeicac肌geictt3tt犯aaaagatacc t犯ggatgts 180
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c'ata_aggagt tacaagattt肌gtg3ag犯gag幼eiaatei gtatgsateig togaggtg肪 300
aaagttccgt ttgcatcccg ttttgtattt gaeiaagaaeiei gggaaacacc t肪attaatt 360
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tttaaag￡iga_ agctagaatt ga3t犯t3aa 3gt3t恥at3 taasttttst肪肪gaa肪t 600
ttaactgaat ttcagcatgc gttttcttta gcgttttctt attattttgc acctgaccat GGO
agaacggtat tagagttata tgcccccgac atgtttgagt atatgaataa gttagaaaaa 720
gggggatttg ag3a肪t肌g tgsaagtttg幼gaaaga^g gt 762〈210> 6 〈211〉 254 〈212〉 PRT 〈213〉 EFn 〈400〉 2
Met AsnGlu His TyrThrGluSerAsplieLysArgAsnHisLys
1 , 51015
Thr GluLys Asn LysThrGluLysGluLysPheLysAspSerlie
16202530
Asn AsnLeu Val LysThrGluPheThrAsnGluThrLeuAspLys
31354045
lie GinGin Thr GinAspLeuLeuLysLyslieProLysAspVal
46505560
Leu Glulie Tyr SerGluLeuGlyGlyGlulieTyrPheThrAsp
61657075
lie AspLeu Val GluHisLysGluLeuGinAspLeuSerGluGlu
76808590
Glu LysAsn Ser MetAsnSerArgGlyGluLysValProPheAla
91 ■', 95100105
Ser ArgPhe Val PheGluLysLysArgGluThrProLysLeulie
106110115120
lie Asnlie Lys AspTyrAlalieAsnSerGluGinSer..LysGlu
121125130135
Val TyrTyr Glu lieGlyLysGlylieSerLeuAsplielieSer
136140145150
Lys AspLys Ser LeuAspProGluPheLeuAsnLeulieLysSer
151155160165
Leu SerAsp Asp SerAspSerSerAspLeuILeuPheSerGinLys
166170175180
Phe LysGlu Lys LeuGluLeuAsnAsnLysSerlieAsplieAsn
181 ■', 185190195
Phe lieLys Glu AsnLeuThrGluPheGinHisAlaPheSerLeu
196200205210
Ala PheSer Tyr TyrPheAlaProAspHisArgThrVal..LeuGlu
211215220225<formula>formula see original document page 17</formula><210> 8 <211> 542 <212> PRT
<213> LFn/EFn FUSION PROTEIN 〈400> 2
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Ala 1
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16
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lie
46
Lys
61
Ala
76
His
91
Asp
106
Ala
121
Asp
136
lie
151
Pro
166
Ser
181
Glu
196
Asn
211
Gly Asn Gin Glu Leu lie lie lie Lys Tyr Gly Tyr Asp His Glu
Gly Lys Glu Val Leu Gly Ser Tyr Glu Val Lys Gin Ser Pro Val
Asp Glu Lys Glu Gly Leu Gly Gly Glu lie Lys Asp Thr Gin
Gly
5 Glu 20 His 35 Gly 50 Lys 65 Lys 80 Glu 95 Lys 110 Tyr 125 Asn 140 Leu 155 Phe 170 Gly 185 Asp 200 Glu 215
Asn Leu Glu Val lie Ala Asp Glu Thr Ser Leu Gin Phe Val
Lys Lys Glu Pro Tyr Leu Ala Pro Glu Arg Asp Asp Ser Phe
Arg Glu Ala Ser lie .Ser Leu Val Lys Asp Val Leu Val Ala
Met His Val Lys Glu Lys Glu
10 15 Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys
25 30 lie Met Lys His lie Val Lys
40 45 Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu
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160 165 Leu Asn Thr lie Lys Asn Ala
175 180 Leu Phe Thr Asn Gin Leu Lys
190 195 Glu Phe Leu Glu Gin Asn Ser
205 210 L>ys Ala Phe Ala Tyr Tyr lie
220 225
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Pro Asn Glu Gly Gly Glu Glu leu Leu Lys Sep Lys Ala Lys Pro Ser Ley Thr Ala
Gin Tyr Glu Ser Ser Lys Phe Leu Gly Glu Arg Lys lie Gly Glu Ser Asn Glu Pro
His Met Leu Gly Asp Glu Thr Lys Gly Leu Gly Arg Asn lie Phe Asp Asn Phe Asp
Arg 230 Asp 245 Lys 260 Gly 275 lie 290 Lys 305 Asn 320 Lys 335 Glu 350 Gin 365 Glu 380 Glu 395 Ser 410 Ser 425 Leu 440 Leu 455 Lys 465 Gin 480 His 500
Asp Lys Asp Gly Lys Phe Glu lie lie Asp Lys Thr Glu Leu Asn Leu Ser His Arg
Val Phe Gin Gly Arg Lys Thr Pro Tyr Leu Val Pro Gin Asp Leu Phe lie Ala Thr
Leu Asn Arg Ser Asn Asp Leu Lys Phe Ser Pro Lys Ser lie lie Ser Asp Phe Val
Gin Glu Gly Gly His Ser Asp Asp Thr Glu Phe Leu Lys lie Lys Gin lie Ser Leu
Leu 235 Gin 250 Gly 265 Ser 280 Lys 295 lie 310 Lys 325 Val 340 Asp 355 Glu 370 Ala 385 lie 400 Glu 415 Ser 430 Ser 445 Lys 456 Asn 470 Leu 485 Glu 505
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Ala lie Gly Asn Glu Asn Gin Glu Asp Lys Arg Asn Tyr Asp Ser Lys lie Phe Tyr
Pro Glu Asn Leu Ser Gly Glu His Lys Asn Leu Val Gin Thr lie Tyr
Leu Asn Phe lie Tyr Lys Asp Glu Lys Ser Ala
Val Ser Val Lys Glu Ser Asp Lys Glu Tyr Pro
Ala 240 Ser 255 Gly 270 Tyr 285 Lys 300 Lys 315 Gin 330 Ser 345 Glu 360 Met 375 Phe 390 Asp 405 lie 420 Leu 435 Ser 450 Leu 460 Asn 475 Tyr 490 Asp 510<formula>formula see original document page 20</formula>
權(quán)利要求
1. LFn與EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)和炭疽水腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)。
2. 根據(jù)權(quán)力要求l所述的LFn與EFn的融合蛋白，其序列特征是LFn具有序 列表中SEQ ID No 2氨基酸殘基序列，EFn具有序列表中SEQ ID No 6氮基 酸殘基序列?；蛘呤菍⑷诤系鞍字械腖Fn或EFn的氨基酸殘基在不改變?nèi)诤?蛋白特性的前提下，進(jìn)行部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的LFn與EFn的融合蛋白，其特征在于所述的炭疽水 腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)位于融合蛋白的N-末端，所述的炭 疽致宛因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)位于融合蛋白的C-末端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的LFn與EFn的融合蛋白，其特征在于所述的炭疽水 腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)位于位于融合蛋白的N-末端，所述 的炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)位于融合蛋白的C-末端。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任何一項(xiàng)所述的LFn與EFn的融合蛋白，其特征在于 所述的炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)和炭疽水腫因子的保 護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)之間設(shè)有連接肽，所述的連接肽的通式是(Gly GlyGlyGlySer) n， n為1-10的整數(shù)；其中優(yōu)選的是n為1-3的整數(shù)。特別是 n為3,時(shí)構(gòu)寧的一個(gè)具有SEQ ID No 8氨基酸序列的融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的LFn與EFn的融合蛋白在中和炭疽毒素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種炭疽致死因子結(jié)構(gòu)域(LFn)與炭疽水腫因子結(jié)構(gòu)域(EFn)的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA序列和融合蛋白的氨基酸殘基序列，含有所述編碼序列的細(xì)菌細(xì)胞；本發(fā)明的融合蛋白包括炭疽致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)和炭疽水腫因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EFn)，在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯?，該融合蛋白可以進(jìn)行部分氨基酸的替換、插入或缺失；本發(fā)明的融合蛋白的第一區(qū)和第二區(qū)之間設(shè)置通式為(Gly Gly Gly GlySer)_n(n為1-10的整數(shù))的連接肽；本發(fā)明還提供了融合蛋白的用途中和炭疽毒素。本發(fā)明的融合蛋白具有中和炭疽毒素的能力，能夠用于炭疽的治療和預(yù)防。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101503475SQ20091011951
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者孔毅榮, 徐俊杰, 董大勇, 劍 趙, 強(qiáng) 郭, 薇 陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所